一、炭疽杆菌致病因子的研究进展（论文文献综述）
赵璇竹[1]（2021）在《苹果炭疽叶枯病菌单羧酸转运蛋白CgMCT1的功能分析》文中提出苹果炭疽叶枯病主要由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）引起的一种真菌病害。该病原菌既侵染苹果叶片,又侵害果实,常造成树体早期大量落叶,严重削弱树势。被侵染的果实,在接近成熟时开始发病,造成采收前大量落果。苹果炭疽叶枯病菌致病分子机理的深入研究不仅有助于了解其致害本质,也为植物病害的防治策略提供重要的参考信息。目前,苹果和胶胞炭疽菌全基因组测序的完成为苹果炭疽叶枯病菌致病机制研究提供了契机。本文通过筛选T-DNA插入突变体库,鉴定了1个苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因CgMCT1。通过基因敲除、荧光示踪、亚细胞共定位等分子生物学技术和手段,结合表型分析、病理组织结构观察系统分析了CgMCT1在苹果炭疽叶枯病菌生长发育和致病过程中的功能,获得了主要研究结果如下:本研究从苹果炭疽叶枯病菌T-DNA插入突变体库中,筛选出一株致病力缺失的突变菌株（N7）。通过hiTail-PCR方法对T-DNA插入位点右翼序列进行了克隆和序列比对分析,发现T-DNA插入突变体标记的基因编码一个假定的单羧酸转运蛋白（Monocarboxylate transporter,MCT）,本研究将该基因命名为CgMCT1。CgMCT1的转录产物有两种可变剪切,分别命名为MctS1和MctS2,两种剪切产物功能一致。基因敲除、互补、表型分析结果表明,Δcgmct1突变体影响苹果炭疽叶枯病菌营养生长、色素沉积以及分生孢子形成。定量检测（q RT-PCR）和荧光示踪试验结果表明CgMCT1在菌丝、分生孢子、芽管和附着胞中均有表达。其中,分生孢子中的表达量最高。CgMCT1含有典型的跨膜结构域。CgMCT1-Tag RFP与MTS-e GFP共定位结果表明,CgMCT1定位于线粒体。CgMCT1不介导5种单羧酸化合物（乳酸、丙酮酸、醋酸、草酸和柠檬酸）的吸收。然而,在添加外源乳酸的MM培养基培养下,CgMCT1被诱导上调表达。这些结果推测CgMCT1位于线粒体上,参与乳酸的跨膜转运。Δcgmct1突变体对苹果叶片致病性完全丧失。Δcgmct1突变体侵染的寄主细胞内活性氧（ROS）异常积累,说明CgMCT1基因缺失导致的致病性缺陷可能与寄主抗病基因介导的防卫反应有关。由此,表明CgMCT1在苹果炭疽叶枯病与寄主植物互作中影响了病原菌的生长,导致了病原菌调控寄主ROS的能力下降。综上所述,本文阐明了单羧酸转运蛋白CgMCT1在苹果炭疽叶枯病菌的生长、发育、产孢以及致病性过程中生物学功能。研究结果有助于推进人们对单羧酸转运蛋白功能的认识,研究成果为炭疽菌新型防治药剂的开发提供了靶位点。
阿茹娜[2]（2021）在《山茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的鉴定》文中研究表明茶树（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）是我国重要的经济作物之一,炭疽病是茶树上的重要病害,广泛发生于我国各大产茶地区,给茶叶的质量和产量都带来一定的危害。侵染茶树的炭疽菌种类较多,山茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae是其中的优势种,发病范围较为广泛。本研究构建了山茶刺盘孢菌的突变体库,筛选出致病性缺陷菌株,并对相关基因进行了敲除,为探究山茶刺盘孢菌的致病机制奠定了基础。取得的主要研究结果如下:1、本论文采用农杆菌介导的遗传转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）构建了容量为1312的山茶刺盘孢菌T-DNA插入突变体库,随机挑选部分转化子进行PCR验证,结果皆为阳性。2、对突变体库中400个突变体进行致病性检验,筛选出一株致病性降低的突变体。3、通过TAIL-PCR扩增插入位点的侧翼序列,通过生物信息学分析证明插入突变位点靠近编码依赖于α-酮戊二酸的黄嘌呤双加氧酶的基因CcxanA。4、针对CcxanA基因构建了敲除载体并转入农杆菌,通过ATMT方法在山茶刺盘孢菌中对该基因进行定向敲除,并通过抗性筛选和PCR验证,得到了敲除突变体ΔCcxanA。该突变体生长后期较野生型产生更多黑色菌丝,生长速率与野生型相比无显着差异。突变体产孢量较野生型显着降低,分生孢子形态较野生型更长。5、致病性验证结果表明,CcxanA基因的缺失会使山茶刺盘孢菌的致病性显着降低,说明CcxanA基因可能与山茶刺盘孢菌的致病相关。6、通过验证ΔCcxanA对胁迫的响应发现,在Na Cl浓度为5%时,对ΔCcxanA的抑制率较野生型有显着差异。在不同浓度下ΔCcxanA对H2O2的敏感性都显着高于野生型。说明CcxanA基因可能与山茶刺盘孢菌对H2O2的敏感性相关。本研究表明,CcxanA基因可能与山茶刺盘孢菌的生长形态、致病性以及活性氧抗性相关。
张玲艳,宋丽丽,贾伟娟,王学理[3]（2020）在《炭疽芽孢杆菌的研究进展》文中指出炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）简称炭疽杆菌,可引起人畜共患传染病炭疽（Anthrax）,该菌主要感染牛、羊等家畜,感染人的概率较低。近年来,我国许多地区均有炭疽病的发生,给我国养殖业带来了巨大的经济损失。文章主要就炭疽芽孢杆菌的生物学特性、毒力因子、致病机理、检测方法等进行综述,以期为该病的深入研究提供参考。
张凇[4]（2020）在《果生炭疽菌效应蛋白CfCE92功能及互作靶标筛选》文中指出果生炭疽菌严重危害多种经济作物。引起金冠系苹果品种炭疽叶枯病（GLS）,造成早期落叶和果实斑点,严重影响苹果产量和品质。已知炭疽菌效应蛋白可以通过影响寄主免疫反应促进寄主感病,为炭疽菌重要致病因子。但目前对果生炭疽菌致病机理目前了解很少。实验室前期从果生炭疽菌筛选鉴定出一个效应蛋白Cf CE92,本研究拟对其致病中的功能进行系统研究,取得以下主要结果:1. 用果生炭疽菌野生型和ΔCf CE92突变体分别接种嘎啦叶片,24 h后提取RNA,进行转录组测序、基因预测与注释,共获得52.41G数据,注释45116个基因。差异分析获得突变体和野生型2370个差异表达基因,其中显着上调310个基因。通过Pathway富集分析可以看出,在乙醛酸和二羧酸代谢途径、黄酮生物合成途径、半乳糖代谢途径、氨基糖和核苷酸糖代谢、甘油脂代谢和MAPK信号转导等6个通路显着富集。2. MAPK信号通路在生物体内能够介导细胞的生长发育及分裂分化等多种生理变化,并参与病理过程。在MAPK信号通路中富集到了7个基因,包括2个脱落酸受体、PR1a、PR3、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶、类乙烯反应转录因子和WRKY29。对PR1a、PR3、WRKY29进行了q RT-PCR分析,结果表明突变体比野生型的基因表达水平均显着上调。3. 黄酮类化合物是植物体内重要次生代谢产物,在植物防御中具有重要作用。在黄酮生物合成途径中富集到3个基因:查尔酮合酶、查尔酮异构酶、类莽草酸邻羟基肉桂酰转移酶,q RT-PCR分析显示ΔCf CE92比野生型的表达水平均显着上调。4. 代谢组分析2’,3,4,4’,6’-五羟基查耳酮、7,4’-二羟基黄酮、甘草素、柚皮素、根皮素、根皮苷和乔松素等7种黄酮类化合物显着上调。体外验证显示,7种化合物在PDA培养基中对果生炭疽菌的生长均具有抑制效果,结果表明五羟基查尔酮(EC50=36.6 mg/L)抑制作用最高,柚皮素（143.4 mg/L）与7,4’-二羟基黄酮（150.9 mg/L）抑制作用次之。这些结果表明Cf CE92在侵染过程中可以通过抑制防御相关通路基因的表达抑制抗菌代谢产物的合成。5. 效应蛋白Cf CE92互作靶标筛选:烟草瞬时表达Cf CE92,结果显示Cf CE92定位于烟草细胞质和细胞核。用酵母双杂交技术在果生炭疽菌侵染叶片c DNA文库中进行靶标蛋白筛选,得到68个候选靶标蛋白。利用酵母体内验证显示核苷二磷酸蛋白激酶（NDPK）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、亮氨酸拉链蛋白（GILZ）在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上生长且变蓝。进一步运用双分子荧光技术（BIFC）显示Cf CE92与NDPK可以在细胞核中共表达。这些结果表明,Cf CE92与植物防卫反应相关基因NDPK存在直接互作关系。本研究表明Cf CE92在侵染过程中可以通过抑制防御相关通路基因的表达,进而抑制病程相关蛋白及抗菌产生代谢产物的合成。筛选到与果生炭疽菌效应蛋白Cf CE92互作的宿主靶标蛋白NDPK。推测Cf CE92通过与NDPK互作抑制寄主防卫反应促进其致病。本研究初步揭示了效应蛋白Cf CE92的致病机理,为进一步探究果生炭疽菌致病机制奠定基础,也为开发新农药提供了靶标。
吴诗媛[5]（2019）在《基于组学技术的枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌和褐腐菌的影响及应用研究》文中提出枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种抑菌活性强、抑菌谱广、安全无毒害的生防细菌。由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的荔枝炭疽病和褐腐菌（Monilinia fruticola）引起的桃褐腐病是造成荔枝和桃果实采后损失的重要原因。本论文以枯草芽孢杆菌CF-3作为目标菌,以荔枝炭疽菌和桃褐腐菌作为供试病原菌。通过转录组学和蛋白组学技术分析了枯草芽孢杆菌CF-3产生的挥发性有机物质（VOCs）对果蔬采后病原真菌炭疽菌和褐腐菌的抑制作用,从基因和蛋白水平揭示了CF-3 VOCs抑制两种采后病原真菌的分子机制;并通过对果实生理生化指标的分析研究了CF-3 VOCs联合热处理对荔枝和桃果实采后病害的防控作用,为生防菌的精准开发利用奠定了理论基础。主要结论如下:1)通过高通量测序的方法,分析了CF-3的VOCs及其主效成分2,4-二叔丁基苯酚处理对炭疽菌的影响。从转录组数据可看出,LC vs LK组（CF-3 24 h发酵液处理炭疽菌vs空白对照处理炭疽菌）中有2320个差异表达基因,L24 vs LK组（2,4-二叔丁基苯酚vs空白对照）获得了2918个差异表达基因,其中有1030个共有的差异表达基因。这些差异表达基因充分参与了细胞的生物过程、分子功能和细胞组分;通过KEGG通路富集分析了差异基因参与的相关通路,主要富集在氨基酸的生物合成通路和碳代谢通路中,其中LC vs LK组主要富集在苯丙氨酸代谢通路及丙氨酸通路,L24 vs LK组主要富集在氨基糖和核苷酸糖代谢和脂肪酸代谢通路。2)通过TMT技术分析了CF-3的VOCs及其主效成分2,4-二叔丁基苯酚处理对炭疽菌的影响。从蛋白组数据可看出,LC vs LK组共鉴定出565个差异表达蛋白,L24 vs LK组共鉴定出831个差异表达蛋白。通过KEGG通路注释分析了差异蛋白质参与的相关代谢通路,发现处理对炭疽菌不同代谢途径产生了明显的影响,主要包括能量代谢、脂质代谢、次生代谢物的生物合成（LC vs LK）、氨基酸代谢（LC vs LK）和其他氨基酸的代谢等,对其他通路中的翻译、信号转导、运输和分解代谢等也产生明显的影响。故CF-3 VOCs和2,4-二叔丁基苯酚可能通过影响炭疽菌基本的物质代谢和能量代谢相关蛋白来抑制其生长。3)通过高通量测序的方法,分析了CF-3的VOCs处理对褐腐菌的影响。从转录组数据可看出,TK vs TC组（CF-3 24 h发酵液处理褐腐菌vs空白对照处理褐腐菌）获得了1602个差异表达基因。通过对差异表达基因进行分类和富集分析可知,其主要富集在抗生素的生物合成、淀粉和蔗糖代谢及氨基酸的生物合成等通路;碳水化合物的运输和新陈代谢、能量产生和转换为显着分类,故VOCs可能通过影响褐腐菌本身碳水化合物和能量代谢的相关途径来抑制其生长。4)通过TMT技术分析了CF-3的VOCs对褐腐菌的影响。从蛋白组数据可看出,TK vs TC组鉴定出1008个差异蛋白,这些差异表达蛋白充分参与了细胞的生物学过程、分子功能和细胞组分。对差异表达蛋白进行富集分析可知,其主要富集在次生代谢物的生物合成、碳代谢、翻译和抗生素的生物合成等通路。5)将CF-3 VOCs和热处理技术相结合,研究了联合处理对荔枝和桃果实上两种病原真菌的影响。结果表明,经过联合处理可显着降低荔枝和桃果实的腐烂指数,更好的保持果实失重率、可溶性固形物含量和桃果实的硬度、成熟度,保持水果的质量;过氧化物酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶这四种抗氧化相关酶的酶活均显着高于空白对照组和其他处理组,苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶这三种抗病相关酶的酶活均显着高于空白对照组和其他处理组;CF-3 VOCs联合热处理可以优势互补,更好的激活果实体内的抗氧化保护系统和抗病性酶系统,以防止植物细胞受到氧化伤害,同时更有效的抵御病原真菌的入侵。
杜清春,董珊珊,丁奕博,张艳,李伟,王鹏[6]（2019）在《快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价》文中指出为建立一种能快速鉴定炭疽杆菌的检测技术,本研究根据炭疽杆菌染色体上的TJHP和BA5345 2个靶点,分别设计4对引物和2个探针,对10份已知浓度的炭疽杆菌DNA和阴性对照菌株DNA进行检测,将浓度最大的炭疽杆菌DNA进行10倍倍比稀释,用于检测4对引物及其探针的灵敏度,并选出2个针对TJHP和BA5345靶点的特异性强及灵敏度高的引物和探针进行重复性实验。结果显示,4对引物及其探针特异性较强,FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物的灵敏度为4.513×10-5 ng/μL;该荧光定量PCR方法重复性好（t=1.178,P=0.332）。FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物及其探针可用于炭疽杆菌感染初期的快速筛查以及临床辅助诊断。
张贝[7]（2018）在《橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的筛选》文中研究指明胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是橡胶树炭疽病的主要病原真菌。为了寻找新的防控策略,有效防治橡胶树炭疽病,探究橡胶树胶孢炭疽菌的致病机理具有重要意义。病原菌T-DNA插入突变体的构建是筛选病原菌致病因子的有效手段。本研究优化了根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌真菌转化体系,构建了胶孢炭疽菌的T-DNA插入突变体库,并对突变库进行了致病性筛选,具体结果如下:1.由于胶孢炭疽菌对潮霉素不敏感而对氯嘧磺隆较为敏感,我们以pCAMBIA1300载体为骨架,用氯嘧磺隆抗性基因（SUR）替代了其中的潮霉素抗性基因（Hyg）,构建了以氯嘧磺隆为抗性筛选标记的双元载体pCAMBIA1300-SUR。2.为了获得充足的胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体转化子,我们从农杆菌菌株的选用、乙酰丁香酮（AS）预培养和共培养的浓度、胶孢炭疽菌孢子浓度以及共转化时间等几个方面对根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系进行优化。结果表明,在乙酰丁香酮（AS）浓度为100 umol/L时,使用OD600=0.8的AGL-1农杆菌菌株与浓度为106个/mL的胶孢炭疽菌孢子进行共转化48 h,转化效率最高,可使转化效率达到480个转化子/106个孢子。3.基于以上体系,我们构建了一个库容量为861的橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库。随机挑选部分转化子进行PCR验证,结果均为阳性。表型检测结果发现,有2个突变体菌株（T003和T062）生长速度明显慢于野生型菌株,1个突变体菌株（T261）的菌落菌丝体明显比野生型的稀疏,8个突变体菌株对橡胶树叶片的致病力明显减弱,其中2个菌株（T734和T735）达极显着水平。4.通过hiTAIL-PCR技术,扩增出T734和T735突变体菌株的T-DNA插入位点侧翼序列。通过与胶孢炭疽菌野生型菌株基因组进行序列比对,确定了 T-DNA在基因组上的位置:突变体T734的T-DNA插入位点在scaffold7的514205处;T735的 T-DNA 插入在 scaffold242 的 21791 处。5.进一步对插入位点处序列在GenBank上进行同源搜索,发现突变体T735的T-DNA插入位点在一个编码FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域蛋白（FAD binding domain）基因（XM007286226）的上游 175bp 处。该基因全长 1336bp,本研究中命名为CgFADBP。半定量RT-PCR显示T-DNA的插入导致T735突变株CgFADBP基因表达上调。6.分别构建过表达CgFADBP基因的胶孢炭疽菌突变株和胶孢炭疽菌的CgFADBP基因敲除突变株用于进一步的功能验证分析。目前已经完成CgFADBP基因敲除突变株的构建。
吴高兵[8]（2010）在《炭疽芽胞杆菌保护性抗原的体外分子改良与抗毒素及疫苗筛选》文中认为炭疽是一种由炭疽芽胞杆菌引起的人畜共患、高致死性传染病。自然情况下,病原菌主要感染牛、羊等家畜造成农牧业的损失,感染人的几率较低。然而,炭疽芽胞易于生产和释放、难以杀灭等特点使其成为恐怖袭击和生物战争中的首选生物武器,由此引发的炭疽病不仅剥夺无辜者的生命,更引起巨大的社会恐慌。因此,研究炭疽致病机理,开发炭疽诊断技术和防治策略,不仅是畜牧业健康发展的需求,长远来看,更是维护国家生物安全的战略需求。炭疽芽胞杆菌的致病因子包括由聚γ谷氨酸组成的外荚膜和细菌毒素。细菌毒素是起主导作用的毒力因子,属于AB型的二元毒素,其组成包括B成份保护性抗原（PA）和A成份水肿因子（EF）及致死因子（LF）。PA的功能是识别并结合特异细胞表面受体,并介导转运LF/EF到细胞内。LF是一种锌离子依赖型的金属蛋白酶,能够特异性地切割有丝分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）。EF是一种钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶,能催化ATP形成cAMP。在体内,LF/EF在PA的介导下被转运到胞质内,修饰相应的底物。LF和EF的联合作用最终导致患者出现系统的炭疽症状直至死亡。本研究通过体外分子进化技术,筛选具有显性抑制活性的PA突变体,并在此基础上解析PA的结构与功能,同时开发新型的炭疽毒素抑制剂和更高效安全的炭疽疫苗。主要研究内容和结果概括如下：1.炭疽水肿因子的重组表达,纯化与活性分析本研究首先将编码EF的基因cya克隆到表达载体pGEX-6p-1上,以E. coli BL21-CodonPlus （DE3）-RIL为表达宿主菌,28℃条件下,用0.2 mM IPTG诱导6小时,发现EF主要以可溶的形式表达,这为在非变性条件下纯化EF提供了条件。进一步的利用还原性谷胱甘肽亲和树脂纯化了EF, SDS-PAGE分析表明获得的EF纯度较高。环腺苷酸（cAMP）分析表明,当用水肿毒素（EdTx:1μg/mLPA+1μg/mLEF）处理CHO-K1细胞后,胞内的cAMP相对于未处理的细胞提高了300倍,表明本纯化的EF具有很好的生物活性。2.保护性抗原的体外分子进化与显性抑制突变体的筛选鉴定PA对LF/EF的运输能力依赖于七聚体（prepore）和跨膜通道（pore）的形成。有研究表明,PA某些位点的突变子仍能够与野生型PA聚合形成prepore,但这种prepore不能形成具有运输功能的pore。我们将这种能够抑制野生型PA功能的突变体定义为显性抑制（dominant-negative, DN）突变体。本研究通过体外分子进化技术获得了得到了四个新的DN突变体：V377E,T380S,I432C和N435C。体外功能分析表明,这四个突变体不影响PA的激活,PA与LF的结合和prepore的形成,但能够阻断prepore形成pore,这表明氨基酸残基V377,T380,I432和N435在PAprepore向pore转化过程中发挥了关键作用。体外显性抑制活性检测表明,当四个突变体（mPA）与野生型PA （wPA）的剂量比高于2：1时,能够完全抑制致死毒素（LeTx）对RAW 264.7细胞的毒杀作用；其中V377E和N435C表现出较高的毒素抑制活性,当V377E或N435C与PA的比例为1：1时,即可完全抑制LeTx的细胞毒性。小鼠保护试验表明,将与PA等量的V377E或N435C和5×LD50的LeTx混合后静脉注射小鼠BALB/c,小鼠能够完全存活,说明V377E或N435C在体内也具有很好的抗毒素活性。这些新的DN突变体不仅可以作为一种潜在的抗毒素药物进行深入地开发,同时也为更透彻地解析PA的结构与功能提供了信息。3一种单成份炭疽双靶点抗毒素和三价疫苗的构建和评估PA与细胞表面受体结合后首先被弗林类蛋白酶切割激活释放N端20kDa的片段（PA20）,剩余C端63 kDa的片段（PA63）形成多聚体并负责转运LF或EF至细胞内。本研究首先将能干扰炭疽毒素复合体形成的致死因子结合功能域（LFn）与PA融合形成LFn-PA,体外细胞毒性分析表明LFn-PA能够被furin酶切激活形成有功能的LFn-PA20和PA63,其中LF-PA20能够抑制LF与PA63的结合,进而抑制PA63介导的细胞毒性。在此基础上,结合之前的报道：显性抑制突变体（DPA）激活后形成的DPA63能够掺入到野生型PA63形成杂合七聚体并阻断野生型PA63对LF或EF的转运,我们将具有显性抑制活性的PA突变体F427D融合到LFn的C端形成LFn-DPA。细胞水平抗毒素活性分析表明,LFn-DPA对致死毒素抑制活性相对于DPA高出3倍,其对应的半抑制浓度（IC50）分别是0.4 nM和1.3 nM；对水肿毒素的抑制活性相对于DPA高出2倍,其IC50分别是4.1 nM和8.3 nM。体内试验表明LFn-DPA能够完全保护BALB/c小鼠免遭5×LD50炭疽致死毒素的攻击。此外,我们对LFn-DPA作为炭疽疫苗应用的潜力做了初步的评估。结果表明,相对于野生型的PA, LFn-DPA能够激发机体产生更强的抗PA的抗体反应。同时,LFn-DPA能够激发机体产生抗LF和EF的抗体,而PA不具备此免疫特性。攻毒试验表明LFn-DPA免疫后的小鼠能够完全存活下来。因此,LFn-DPA也可以作为一种更安全高效炭疽三价疫苗。本研究首次开发了一种单成份双靶点抗毒素,并证实该抗毒素也可作为一种三价的炭疽疫苗,这为联合炭疽治疗和预防提供了思路。
任静晓[9]（2010）在《炭疽杆菌A16R免疫蛋白质组学的研究》文中研究说明炭疽是由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis, BA）引起的一种烈性人畜共患传染病。由于炭疽芽孢易于大量培养、极难被杀灭、可通过气溶胶途径传播,并且引起的吸入性肺炭疽死亡率较高等特点,所以长期以来一直被某些国家认为是首选的生物战剂。自美国“911”事件发生后,BA研究再次成为世界各国关注的热点。而预防炭疽最有效的方法是疫苗,所以炭疽疫苗的研究成为目前研究的热点,而从BA中筛选具有免疫原性的蛋白质则是疫苗设计的关键。本研究采用蛋白质组学研究方法,大规模筛选BA营养体和芽孢蛋白中可能存在的免疫原性蛋白质,这将为我们深化炭疽芽孢杆菌的认识,以及检测、诊断炭疽芽孢杆菌与对炭疽的早期治疗提供靶标。主要研究结果如下：以BA A16R菌株为实验菌株,采用固态培养,在含有200 mL的LB固态培养基的罗氏瓶内进行培养,先放于37℃的培养箱内正置一天后,再倒置于30℃培养箱内培养10-15 d,用4℃灭菌纯水清洗培养基表面,8000r／min离心10 min收集芽孢,直至复红美兰染色观察芽孢纯度达到98%为止。然后将收集的芽孢用2 mL的4℃灭菌纯水重悬,稀释涂板计数,得到芽孢浓度为5.5×109CFU／mL。以收集纯化的芽孢免疫4只新西兰大白兔,首次家兔腹股沟免疫,间隔14d后耳静脉免疫2次,后来采用皮下多点免疫,且免疫相隔7d,共免疫5次,以间接ELISA测定血清效价达到12800。免疫印迹实验验证了,所制备的血清可以与炭疽蛋白发生反应,所以制备出的血清为下一步筛选具有免疫原性的蛋白点提供了材料。采用超声裂解方法分别制备BAA16R菌株的营养体和芽孢蛋白样品,蛋白样品经双向电泳分离,电转膜后,用上述制备的多克隆抗体进行免疫印迹。然后将双向电泳的考马斯亮蓝染色胶图与免疫印迹曝光图匹配比对,找出匹配的蛋白点后,进行胶内酶切和质谱鉴定。结果表明,BA的营养体蛋白样品中有86个具有免疫原性的蛋白点,BA的芽孢蛋白样品中有13个具有免疫原性的蛋白点。在这些免疫原性的蛋白点中,19种蛋白质在以前的文献中被报导外,其他的蛋白质均未见报道。本研究结果为BA新疫苗的研发提供了新线索。
檀根甲[10]（2009）在《采后苹果与炭疽菌的相互作用及病害控制机理研究》文中提出果实采后腐烂是一个全球性问题,已引起世界范围的极大关注。苹果炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）是苹果上的主要病害,引致苹果采后腐烂严重。本文从从保护生态环境和农业可持续发展的角度出发,以苹果采后炭疽病为研究对象,利用物理的、化学的、生物的和农业的无污染防除技术及分子鉴定诊断技术,逐步组建苹果采后炭疽病可持续控制的病害防御体系。分别开展了苹果炭疽菌生物学特性研究,利用离子束生物工程和磁生物工程技术诱变的枯草芽孢杆菌和苹果炭疽菌低毒性菌株防治苹果采后炭疽病的控病效果和作用机制研究,与环境相容好、高效、低毒、使用安全、对仓储苹果无污染,不影响外观和风味的新农药、新剂型和使用技术研究,品种抗病性鉴定及不同苹果品种对炭疽病菌的抗性生理生化机制和苹果炭疽菌致病机制研究,苹果炭疽菌的快速分子鉴定和检测及苹果炭疽病的早期诊断。主要研究结果如下:1.苹果炭疽菌生物学特性研究结果表明,苹果采后炭疽菌营养生长的温度范围为10℃～35℃,最适温为28℃。菌丝致死温度为40℃5d,分生孢子在40℃下培养11天后,仍具有萌发能力。分生孢子萌发以25℃最佳,芽管伸长以30℃最适。液体培养,30℃时菌丝生长量最大。RH＜80%时菌丝不能生长,RH＞80%时菌丝生长速率差异不大。分生孢子的萌发对湿度要求严格,仅在自由水和有水膜的情况下萌发。pH为3～11范围内均可营养生长,pH 2～11范围内孢子均可萌发。液体培养条件下,适合营养生长的pH范围为4～9,且在此范围差异不明显。在一定范围内,酸性条件下孢子萌发率较碱性条件下萌发率高。在一定温、湿度条件下,苹果贮藏过程中炭疽病的发展曲线为不对称S型,用冈珀茨模型（Gompertzmodel）进行曲线拟合,模型拟合度达到极显着水平。2.苹果炭疽菌的分子鉴定和检测结果表明,两株病原菌Cg-1和Cg-2的ITS序列相似性达100%;二者与胶孢炭疽菌的相似性极高,达99.8%;与炭疽菌其它7个种的相似性相对较低,只有83.1%—98.5%;与不同属的镰刀菌相似性最低,为68.9%。因此可以明确苹果炭疽菌应属于胶孢炭疽菌。经序列比对发现,苹果炭疽菌的18S rDNA 3’端比GenBank已登陆的2个胶孢炭疽菌多出一段379 bp的序列,将去除379 bp的苹果炭疽菌rDNA序列与其它胶孢炭疽菌相比,序列相似性高达96.6%。根据这一特有片段设计特异性引物,结果仅能从苹果炭疽菌中扩增出1232 bp的特异性条带。用苹果炭疽菌接种离体苹果,以接种发病的病组织总DNA为模板,利用引物CgF1/ITS4进行PCR扩增,同样可以扩增出1232 bp的特异性条带,而健康苹果组织DNA中未能扩增出任何条带,表明该方法可用于苹果炭疽菌的鉴定和快速检测。3.苹果采后炭疽病的化学防治及控病机理研究结果表明,丙环唑、苯氧菌酯、扑海因、苯醚甲环唑和氟硅唑抑菌作用较强,代森锰锌抑菌作用较弱。药剂间对孢子萌发率和芽管伸长抑制率差异显着,其中扑海因、氟硅唑对孢子萌发有抑制作用,抑制率分别为42.6%、48.3%。代森锰锌、丙环唑几乎无抑制孢子萌发的作用,孢子萌发率为99.3%、98.2%。但丙环唑对芽管伸长能较好的抑制。活体试验表明:丙环唑、苯氧菌酯、嘧菌酯防效较好,其中丙环唑的防效达到100%。药剂不同作用方式的试验结果说明:浸果处理明显好于喷雾。混剂以多菌灵+代森锰锌（9∶1,7∶3）抑菌效果为最好,抑制菌丝生长的共毒系数达到692.426、593.020。活体试验表明:混剂以多菌灵+代森锰锌（9∶1、7∶3）防效为最好。4.钙盐对苹果炭疽病菌的抑制作用结果表明,CaCl2、Ca（NO3）2·4H2O和Ca（H2PO4）2对菌丝生长有一定的影响。Ca2+浓度为900μg/ml时,对菌丝生长影响较小,Ca2+浓度高于1000μg/ml时能较好地抑制菌丝生长,Ca2+浓度低于600μg/ml时有促进菌丝生长的趋势。CaCl2、Ca（NO3）2·4H2O和Ca（H2PO4）2不能抑制分生孢子的萌发。钙盐对芽管伸长的抑制作用,当Ca2+浓度大于900μg/ml时Ca（NO3）2·4H2O、CaCl2和Ca（H2PO4）2的抑制率分别为13.10%、45.75%和46.09%;当浓度继续增大时,浓度处理之间的抑制作用差异不显着。当浓度小于600μg/ml时,对芽管的伸长反而有一定的促进作用。5.苹果采后炭疽病生物防治及控病机理的研究结果表明,利用低能氮离子对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行注入诱变,通过平板初筛出6株对苹果炭疽病菌有较好抑菌作用的菌株,经苹果果实活体测定从中筛选对苹果炭疽病有较好控病作用的菌株,从接种方式及病害发生的时间看,先接突变菌株的各处理发病时间均晚于先接病菌的处理,明显推迟发病时间,表现出较强的保护作用,低温储藏对病害发生的抑制作用更明显。以先接突变菌株后控病效果较好的菌株按储藏温度的不同分为:室温下的防治效果较好的菌株为BS80-6,14d时的防效为33.28%;低温条件下BS100-1、BS100-6、BS80-6、BS120-8的效果较好,30d时的防效分别为98.36%、95.36%、95.52%、93.52%;变温下各菌株BS80-1、BS100-1、BS120-8的效果最好,30d的防效分别为84.59%、75.15%、72.40%。突变菌株三种处理液对病菌孢子萌发抑制作用以活菌液的效果最好,其次是滤液,高压灭菌液的效果最差。经平板滤纸片法和液体共培养法测定突变菌株对病菌菌丝的破坏作用的显微镜观察结果表明,BS80-6菌株产生的抗生物质抑制孢子萌发、使苹果炭疽病菌菌丝体畸形,原生质凝集,泡囊化。同时对寄主防御酶（POD、PPO、PAL）活性的研究表明突变菌株能诱导寄主产生抗病性。6.热处理与药剂相结合、枯草芽孢杆菌滤液分别与Ca2+和苯氧菌酯配合使用的抑菌作用结果表明,热处理与药剂结合则能更好地控制病害,丙环唑和禾纹清在40℃作用下的效果最好,药剂与热处理相结合的防效大于药剂单独作用的防效。枯草芽孢杆菌的滤液分别与Ca2+和苯氧菌酯配合使用的抑菌效果明显好于单独使用Ca2+和苯氧菌酯配的效果。其中滤液与苯氧菌酯的配合使用的效果最佳,对苹果炭疽病菌的抑制效果达到58.2%。滤液与Ca2+混合使用抑制率达到32.9%,比单独使用Ca2+的抑制效果提高了27.8%。滤液和Ca2+、苯氧菌酯结合使用在苹果果实上的控制效果明显好于单独使用Ca2+、苯氧菌酯的效果。滤液与Ca2+结合控制效果提高了11.7%。7.苹果炭疽菌低毒性菌株筛选及控病作用的研究结果表明,离子注入C100-2-5低毒株和磁场处理C0.25-1-2低毒株对苹果有较好的保护作用。离子诱变的低毒性菌株对苹果炭疽病的控制效果达到55%左右。低毒性与强毒性菌株按不同比例混合接种苹果的控制效果之间的差异显着性不明显,但都与单接种的强毒菌株达到显着差异。菌株的毒性不同,引起果实体内酶的活性变化也略有不同。测定低毒菌株rDNA序列,结果表明,引物CgF/CgR均可以扩增出3156 bp的片段,且此段序列几乎没有发生变异。30条随机引物进行RAPD扩增,结果表明低毒菌株与正常菌株RAPD扩增多态性无明显区别,未能发现差异性,ISSR扩增结果表明低毒菌株与正常菌株无明显区别,20条引物未能发现差异性。8.采后苹果与炭疽菌相互作用及生理机制研究结果表明,苹果对炭疽菌抗性品种间差异极显着（P=0.01）,根据发病程度,其抗性可以分为四类:红富士感病（S）;嘎啦、乔纳金次之,中感（MS）;辽伏中抗（MR）;黄金帅果实发生过敏性坏死反应,抗病（R）。初步明确了聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纤维素酶（Cx）在该菌侵染苹果过程中起关键作用。苹果果实接种炭疽菌后β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性都被诱导提高,几丁质酶活性增幅高于β-1,3-葡聚糖酶,分别是对照的3-11倍和2-6倍。苹果感染炭疽菌后,主要防御酶过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性变化与品种抗性有明显相关性,表现出相似的趋势,抗病品种酶活始终高于感病和中感品种,接种前差异不显着,接种后差异显着,抗病品种酶活性升高幅度大,高峰出现的早,且一直保持在较高的水平。接种前,与品种病情指数呈正相关的生化因子是健康果实可溶性总糖含量,负相关的生化因子是健康果实木质素含量和绿原酸含量,其相关系数都在0.99以上,健康果实总酸含量与品种病情指数无关。
二、炭疽杆菌致病因子的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、炭疽杆菌致病因子的研究进展（论文提纲范文）
（1）苹果炭疽叶枯病菌单羧酸转运蛋白CgMCT1的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苹果炭疽叶枯病概述 |
| 1.2 炭疽菌概述 |
| 1.3 炭疽菌致病基因研究进展 |
| 1.3.1 侵染结构形成的相关致病基因 |
| 1.3.2 细胞壁降解酶的相关致病基因 |
| 1.3.3 信号传导的相关致病基因 |
| 1.3.4 细胞自噬的相关致病基因 |
| 1.3.5 炭疽毒素类 |
| 1.3.6 炭疽菌效应蛋白研究进展 |
| 1.3.7 其他的致病基因 |
| 1.4 单羧酸转运体 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 抗生素与培养基 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 苹果炭疽叶枯病菌CgMCT1 基因的克隆 |
| 2.2.2 苹果炭疽叶枯病菌CgMCT1 基因敲除载体的构建 |
| 2.2.3 苹果炭疽叶枯病菌CgMCT1 基因互补载体的构建 |
| 2.2.4 苹果炭疽叶枯病菌CgMCT1 基因致病分子机制研究 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 CgMCT1 基因的克隆 |
| 3.2 CgMCT1 基因有两种可变剪切 |
| 3.3 CgMCT1 基因参与了炭疽菌营养生长、黑色素合成及分生孢子的形成 |
| 3.4 CgMCT1 基因的时空表达分析 |
| 3.5 CgMCT1 基因不介导单羧酸盐的吸收 |
| 3.6 CgMCT1 基因的表达受外源乳酸诱导 |
| 3.7 CgMCT1 定位于线粒体 |
| 3.8 CgMCT1 基因是炭疽菌侵染寄主所必需的一个致病因子 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）山茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 茶树病害的研究现状 |
| 1.1.1 茶树炭疽病病原菌及生物学特性 |
| 1.1.2 茶树炭疽病的发生及危害 |
| 1.1.3 茶树炭疽病的防治 |
| 1.2 炭疽菌致病相关机制研究进展 |
| 1.3 根癌农杆菌介导的遗传转化及TAIL-PCR |
| 1.3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化 |
| 1.3.2 热不对称PCR |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验质粒载体 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 根癌农杆菌AGL-1 感受态的制备及转化 |
| 2.2.2 根癌农杆菌介导的遗传转化 |
| 2.2.3 DNA的提取 |
| 2.2.4 致病性分析 |
| 2.2.5 TAIL-PCR |
| 2.2.6 载体构建 |
| 2.2.7 生物学特性研究 |
| 2.2.8 生物信息学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 山茶刺盘孢菌T-DNA插入突变体库的构建 |
| 3.1.1 山茶刺盘孢菌转化子的分子验证 |
| 3.1.2 山茶刺盘孢菌突变体库的遗传稳定性 |
| 3.2 山茶刺盘孢菌突变体致病性验证 |
| 3.3 突变株T-DNA插入位点侧翼序列的克隆 |
| 3.4 致病相关基因的生物信息学分析 |
| 3.5 敲除载体的构建 |
| 3.6 敲除突变体的PCR验证 |
| 3.7 敲除突变体的形态及生长速率分析 |
| 3.8 敲除突变体的致病性分析 |
| 3.9 敲除突变体对逆境的响应 |
| 3.9.1 敲除突变体盐胁迫分析 |
| 3.9.2 敲除突变体活性氧胁迫分析 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）炭疽芽孢杆菌的研究进展（论文提纲范文）
| 1 生物学特性 |
| 1.1 形态特征 |
| 1.2 培养特性 |
| 1.3 抵抗力 |
| 2 毒力因子 |
| 2.1 荚膜 |
| 2.2 炭疽毒素 |
| 2.2.1 PA |
| 2.2.2 LF |
| 2.2.3 EF |
| 3 致病机理 |
| 4 检测方法 |
| 4.1 细菌学检测 |
| 4.2 分子生物学检测 |
| 4.3 免疫学检测 |
| 4.4 其他检测方法 |
| 5 小结 |
（4）果生炭疽菌效应蛋白CfCE92功能及互作靶标筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苹果炭疽叶枯病的发生与危害 |
| 1.2 苹果炭疽叶枯病病原 |
| 1.3 病原微生物与寄主植物互作的研究 |
| 1.3.1 植物的免疫系统 |
| 1.3.2 PAMPs触发的植物免疫反应(PTI) |
| 1.3.3 效应蛋白触发的植物免疫反应(ETI) |
| 1.4 真菌效应蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 真菌效应蛋白的定义及特点 |
| 1.4.2 真菌效应因子的研究进展 |
| 1.4.3 炭疽菌效应蛋白的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌株与质粒 |
| 2.1.2 生物学测定材料 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 试验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 供试菌株的活化 |
| 2.2.2 离体叶片和果实接种 |
| 2.2.3 转录组测序 |
| 2.2.4 qRT-PCR检测CfCE92 表达 |
| 2.2.5 黄酮类化合物抑菌试验 |
| 2.2.6 酵母双杂交 |
| 2.2.7 蛋白CfCE92烟草亚细胞定位 |
| 2.2.8 效应蛋白CfCE92与候选靶标互作验证 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 CfCE92的植物免疫抑制作用 |
| 3.1.1 CfCE92抑制寄主防卫反应的转录组分析 |
| 3.1.2 CfCE92对病程相关蛋白基因表达的影响 |
| 3.1.3 CfCE92影响类黄酮合成途径 |
| 3.2 CfCE92的寄主互作靶标筛选与亚细胞定位 |
| 3.2.1 烟草上瞬时表达的CfCE92定位于细胞核和细胞质 |
| 3.2.2 酵母双杂筛选体系的建立 |
| 3.2.3 CfCE92的候选寄主靶标筛选 |
| 3.2.4 CfCE92与候选靶标互作关系的验证 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 附录A 引物序列 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）基于组学技术的枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌和褐腐菌的影响及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题来源 |
| 1.2 果蔬采后真菌病害及控制的研究现状 |
| 1.2.1 化学防控 |
| 1.2.2 物理防控 |
| 1.2.3 生物防控 |
| 1.2.4 联合防控 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌对果蔬采后病原真菌抑制作用研究现状 |
| 1.3.1 营养和空间位点的竞争 |
| 1.3.2 诱导植物系统抗性 |
| 1.3.3 分泌抗菌物质 |
| 1.4 组学技术在控制果蔬采后真菌病害研究中的应用 |
| 1.4.1 转录组学技术在控制果蔬采后真菌病害研究中的应用 |
| 1.4.2 蛋白组学技术在控制果蔬采后真菌病害研究中的应用 |
| 1.5 立题背景 |
| 1.6 论文的研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌抑制作用的转录组学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试菌株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 枯草芽孢杆菌CF-324 h发酵液的制备 |
| 2.2.5 炭疽菌培养与处理 |
| 2.2.6 RNA提取、定量和鉴定 |
| 2.2.7 转录组测序文库的构建 |
| 2.2.8 聚类和测序 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 测序质量评估 |
| 2.3.2 转录组数据与参考基因组序列比对 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 差异表达基因GO分类 |
| 2.3.5 差异表达基因COG分类 |
| 2.3.6 差异表达基因KEGG注释分类 |
| 2.3.7 差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌抑制作用的蛋白组学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 供试菌株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 枯草芽孢杆菌CF-324 h发酵液的制备 |
| 3.2.5 炭疽菌的培养与处理 |
| 3.2.6 炭疽菌蛋白提取和定量 |
| 3.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 3.2.8 蛋白质酶解及肽段脱盐 |
| 3.2.9 TMT肽段标记与肽段分级 |
| 3.2.10 LC-MS/MS分析 |
| 3.2.11 数据库检索 |
| 3.2.12 生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 SDS-PAGE鉴定蛋白提取质量 |
| 3.3.2 蛋白质鉴定及定量结果 |
| 3.3.3 差异表达蛋白分析 |
| 3.3.4 差异表达蛋白的GO富集分析 |
| 3.3.5 差异表达蛋白的KEGG通路富集分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对褐腐菌抑制作用的转录组学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 供试菌株 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs24h发酵液的制备 |
| 4.2.5 褐腐菌的培养与处理 |
| 4.2.6 RNA提取、定量和鉴定 |
| 4.2.7 转录组测序文库的构建 |
| 4.2.8 聚类和测序 |
| 4.2.9 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 测序质量评估 |
| 4.3.2 转录本拼接 |
| 4.3.3 转录组数据与组装结果的比对 |
| 4.3.4 差异表达基因分析 |
| 4.3.5 差异表达基因GO分类 |
| 4.3.6 差异表达基因COG分类 |
| 4.3.7 差异表达基因KEGG注释分类 |
| 4.3.8 差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对褐腐菌抑制作用的蛋白组学研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 供试菌株 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.2.4 枯草芽孢杆菌CF-324 h发酵液的制备 |
| 5.2.5 褐腐菌的培养与处理 |
| 5.2.6 褐腐菌蛋白提取和定量 |
| 5.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 5.2.8 蛋白质酶解及肽段脱盐 |
| 5.2.9 TMT肽段标记与肽段分级 |
| 5.2.10 LC-MS/MS分析 |
| 5.2.11 数据库检索 |
| 5.2.12 生物信息学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 SDS-PAGE鉴定蛋白提取质量 |
| 5.3.2 蛋白质鉴定及定量结果 |
| 5.3.3 差异表达蛋白分析 |
| 5.3.4 差异表达蛋白的GO富集分析 |
| 5.3.5 差异表达蛋白的KEGG通路富集分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs联合热处理对水果采后保鲜效果的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试菌株与水果 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器设备 |
| 6.2.4 致病菌孢子悬液的制备 |
| 6.2.5 枯草芽孢杆菌CF-324h发酵液的制备 |
| 6.2.6 果实样品接菌及处理 |
| 6.2.7 果实样品取样 |
| 6.2.8 腐烂指数的测定 |
| 6.2.9 失重率和可溶性固形物的测定 |
| 6.2.10 硬度和成熟度的测定 |
| 6.2.11 酶活指标测定 |
| 6.2.12 统计学分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 VOCs联合热处理对接种炭疽菌的荔枝果实的影响 |
| 6.3.2 VOCs联合热处理对接种褐腐菌的桃果实的影响 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（6）快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 阳性菌株和阴性菌株DNA |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 设计并合成引物和探针 |
| 1.3.2 提取细菌DNA |
| 1.3.3 建立快速检测炭疽杆菌的qPCR反应体系 |
| 1.3.4 特异性检测 |
| 1.3.5 灵敏度检测 |
| 1.3.6 重复性实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性检测结果 |
| 2.1.1 阳性菌株DNA检测结果 |
| 2.1.2 传统炭疽杆菌（cap/rpo B/pag）单重荧光PCR检测结果 |
| 2.1.3 阴性对照菌株DNA检测结果 |
| 2.2 灵敏度检测结果 |
| 2.3 重复性试验结果 |
| 3 讨论 |
（7）橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 胶孢炭疽菌和橡胶树炭疽病 |
| 1.2 真菌致病机理研究进展 |
| 1.2.1 真菌侵染结构 |
| 1.2.2 胞外水解酶 |
| 1.2.3 毒素 |
| 1.2.4 效应蛋白 |
| 1.2.5 胶孢炭疽菌的致病机理研究 |
| 1.3 丝状真菌的遗传转化研究进展 |
| 1.3.1 CaCl_2-PEG介导转化法 |
| 1.3.2 基因枪法 |
| 1.3.3 电激转化法 |
| 1.3.4 限制性内切酶介导转化法 |
| 1.3.5 根癌农杆菌介导转化法 |
| 1.4 根癌农杆菌介导真菌遗传转化研究进展 |
| 1.4.1 根癌农杆菌介导真菌转化的原理 |
| 1.4.2 根癌农杆菌转化的应用 |
| 1.4.3 影响根癌农杆菌介导真菌转化效率的因素 |
| 1.5 T-DNA插入位点的鉴定方法 |
| 1.5.1 反向PCR |
| 1.5.2 接头PCR |
| 1.5.3 热不对称PCR |
| 1.5.4 高效热不对称PCR |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株及载体 |
| 2.1.2 抗生素和试剂配置 |
| 2.1.3 培养基配置 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.0 氯嘧磺隆抗性基因扩增 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶PCR产物回收 |
| 2.2.2 TA克隆 |
| 2.2.3 碱裂解法提取质粒 |
| 2.2.4 双元载体农杆菌制备方法 |
| 2.2.5 ATMT遗传转化方法 |
| 2.2.6 胶孢炭疽菌遗传转化条件的优化 |
| 2.2.7 转化子的PCR检测 |
| 2.2.8 突变体的致病力鉴定 |
| 2.2.9 突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆 |
| 2.2.10 侧翼序列分析 |
| 2.2.11 CgFADBP敲除载体的构建 |
| 2.2.12 胶孢炭疽菌原生质体转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 双元载体的改造 |
| 3.1.1 氯嘧磺隆抗性基因的扩增 |
| 3.1.2 双元载体pCAMBIA1300-SUR的构建 |
| 3.1.3 pCAMBIA1300-SUR转化不同农杆菌菌株 |
| 3.2 农杆菌介导的遗传转化体系的优化 |
| 3.2.1 不同农杆菌菌株对转化的影响 |
| 3.2.2 AS预培养浓度对转化的影响 |
| 3.2.3 胶孢炭疽菌孢子浓度和农杆菌浓度对转化的影响 |
| 3.2.4 共培养时间对转化的影响 |
| 3.2.5 AS共培养浓度对转化的影响 |
| 3.3 胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及筛选 |
| 3.3.1 胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建 |
| 3.3.2 突变体库抗性转化子的PCR鉴定 |
| 3.4 胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的表型筛选 |
| 3.5 T734和T735突变株T-DNA插入位点侧翼序列克隆与分析 |
| 3.6 T735插入位点基因半定量RT-PCR分析 |
| 3.7 CgFADBP敲除突变体的构建及致病性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 琼脂糖凝胶片段回收 |
| 附录二 大肠杆菌转化 |
| 附录三 碱裂解法提取质粒 |
| 附录四 热激法农杆菌转化 |
| 附录五 TRIzol法提取真菌RNA |
| 攻读硕士学位期间已发表论文 |
| 致谢 |
（8）炭疽芽胞杆菌保护性抗原的体外分子改良与抗毒素及疫苗筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 动物炭疽 |
| 1.2.2 人型炭疽 |
| 1.3 炭疽病的诊断 |
| 1.3.1 细菌学诊断 |
| 1.3.2 分子生物学检测 |
| 1.3.3 免疫学检测 |
| 1.3.4 化学分析检测 |
| 1.3.5 其它检测方法 |
| 1.4 炭疽杆菌致病因子 |
| 1.4.1 荚膜 |
| 1.4.2 外毒素 |
| 1.4.2.1 保护性抗原 |
| 1.4.2.2 致死因子 |
| 1.4.2.3 水肿因子 |
| 1.4.3 其它致病因子 |
| 1.5 外毒素作用机理 |
| 1.5.1 PA与受体结合 |
| 1.5.1.1 炭疽毒素受体 |
| 1.5.1.2 PA83结合ATR |
| 1.5.2 PA83激活 |
| 1.5.3 Prepore形成 |
| 1.5.4 毒素复合体形成 |
| 1.5.5 复合体进入细胞 |
| 1.5.6 LF/EF转运 |
| 1.5.6.1 跨膜通道形成 |
| 1.5.6.2 LF/EF的运输 |
| 1.5.7 LF/EF的催化作用 |
| 1.6 炭疽的预防与治疗 |
| 1.6.1 炭疽预防 |
| 1.6.2 炭疽治疗 |
| 1.6.2.1 抗菌治疗 |
| 1.6.2.2 抗毒素治疗 |
| 1.7 炭疽疫苗 |
| 1.7.1 兽用疫苗 |
| 1.7.2 人用炭疽疫苗 |
| 1.7.3 新型炭疽疫苗 |
| 1.7.3.1 新型活菌疫苗 |
| 1.7.3.2 重组AP疫苗 |
| 1.7.3.3 荚膜结合疫苗 |
| 1.7.3.4 DNA疫苗 |
| 1.8 新型抗毒素的研究 |
| 1.8.1 阻断PA结合ATR |
| 1.8.2 阻断PA的激活 |
| 1.8.3 阻断LF/EF结合PA |
| 1.8.4 阻断毒素复合体的内吞 |
| 1.8.5 阻断prepore-pore的转化 |
| 1.8.6 阻断LF/EF的转运 |
| 1.8.7 阻断LF/EF对底物的修饰 |
| 1.9 本研究的目的与意义 |
| 2 炭疽水肿因子的重组表达与纯化及活性分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株,质粒和细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基及抗生素的配置 |
| 2.1.4 主要溶液的配置 |
| 2.1.4.1 感受态制备相关溶液 |
| 2.1.4.2 质粒抽提相关缓冲液 |
| 2.1.4.3 SDS-PAGE缓冲液 |
| 2.1.4.4 Native-PAGE缓冲液 |
| 2.1.4.5 Western blot缓冲液及试剂 |
| 2.1.4.6 ELISA相关缓冲液 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 EF表达载体的构建 |
| 2.2.1.1 cya的扩增 |
| 2.2.1.2 PCR产物的纯化与酶切 |
| 2.2.1.3 PCR产物与载体的连接 |
| 2.2.1.4 E. coli DH5α感受受态细胞的制备 |
| 2.2.1.5 连接产物的转化 |
| 2.2.1.6 质粒的制备与检测 |
| 2.2.1.7 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.1.8 重组质粒的测序鉴定 |
| 2.2.2 重组EF的表达与纯化 |
| 2.2.2.1 表达宿主感受态细胞的制备 |
| 2.2.2.2 电击转化表达宿主 |
| 2.2.2.3 SDS-PAGE凝胶的制备 |
| 2.2.2.4 电泳、染色及脱色 |
| 2.2.2.5 EF表达与纯化 |
| 2.2.3 重组PA的纯化 |
| 2.2.4 重组LF的纯化 |
| 2.2.5 炭疽毒素的生物活性测定 |
| 2.2.5.1 细胞培养 |
| 2.2.5.2 PA与LF生物活性分析 |
| 2.2.5.3 EF活性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 EF表达载体的构建 |
| 2.3.2 EF的重组表达与纯化 |
| 2.3.3 PA和LF的纯化 |
| 2.3.4 炭疽外毒素的生物活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 保护性抗原的体外分子改良与筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PA突变体库的构建 |
| 3.2.1.1 KpnI酶切位点的引入 |
| 3.2.1.2 PA_K和GST-PA活性分析 |
| 3.2.1.3 Error-prone PCR法构建突变体文库 |
| 3.2.2 显性抑制突变体(DN-PA)的筛选 |
| 3.2.2.1 E.coli T7噬菌体制备 |
| 3.2.2.2 DN-PA的筛选 |
| 3.2.3 显性抑制活性分析 |
| 3.2.4 动物保护分析 |
| 3.2.5 LFn克隆,表达与纯化 |
| 3.2.5.1 LFn的克隆 |
| 3.2.5.2 LFn表达与纯化 |
| 3.2.6 DN-PA功能分析 |
| 3.2.6.1 体外胰蛋白酶切割分析 |
| 3.2.6.2 (PA63)_7-LFn形成能力分析 |
| 3.2.6.3 (PA63)_7-LFn对SDS耐受性分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PA突变体库构建 |
| 3.3.1.1 KpnI酶切位点的引入 |
| 3.3.1.2 PA_K和GST-PA活性分析 |
| 3.3.2 DN-PA的筛选 |
| 3.3.3 显性抑制活性分析 |
| 3.3.4 动物保护分析 |
| 3.3.5 LFn的克隆,表达和纯化 |
| 3.3.5.1 LFn表达载体的构建 |
| 3.3.5.2 LFn的表达和纯化 |
| 3.3.6 DN-PA功能分析 |
| 3.3.6.1 Trypsin切割分析 |
| 3.3.6.2 (PA63)_7-LFn形成能力分析 |
| 3.3.6.3 (PA63)_7-LFn对SDS耐受性分析 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 3.4.1 突变体库的构建与筛选 |
| 3.4.2 氨基酸V377,T380,I432和N435的功能 |
| 3.4.3 显性抑制突变体的应用潜力 |
| 4 一种单成份双靶点抗毒素和三价疫苗构建与评估 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 表达载体的构建 |
| 4.2.2 蛋白的表达,纯化与鉴定 |
| 4.2.2.1 融合蛋白的表达与纯化 |
| 4.2.2.2 融合蛋白Western blot鉴定 |
| 4.2.3 融合体对Trypsin敏感性检测 |
| 4.2.4 细胞毒性分析 |
| 4.2.5 体外抗毒素活性检测 |
| 4.2.6 体内抗毒素活性检测 |
| 4.2.7 动物免疫试验 |
| 4.2.8 抗体滴度检测 |
| 4.2.9 免疫小鼠攻毒实验 |
| 4.2.10 数据统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 融合体的构建 |
| 4.3.2 蛋白的表达、纯化与鉴定 |
| 4.3.3 融合体对Trypsin敏感性检测 |
| 4.3.4 细胞毒性检测 |
| 4.3.5 体外抗毒素活性检测 |
| 4.3.6 体内抗毒素活性分析 |
| 4.3.7 LFn-DPA免疫原性评估 |
| 4.3.8 LFn-DPA对小鼠的免疫保护力评估 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 LFn-DPA可作为一种双靶点炭疽抗毒素 |
| 4.4.2 LFn-DPA可作为一种三价炭疽疫苗 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 质粒图谱 |
| 附录二 研究生期间发表文章 |
（9）炭疽杆菌A16R免疫蛋白质组学的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 炭疽芽孢杆菌及其致病机理 |
| 1.1 生物学特性和流行病学 |
| 1.2 致病物质 |
| 1.2.1 荚膜 |
| 1.2.2 炭疽毒素 |
| 1.3 致病机制 |
| 2. 炭疽杆菌疫苗的研究 |
| 2.1 炭疽杆菌疫苗的研究现状 |
| 2.2 疫苗研究的问题和展望 |
| 3. 蛋白质组学简介 |
| 3.1 蛋白质组学的研究背景和意义 |
| 3.2 蛋白质组学的研究内容和技术 |
| 4. 炭疽芽孢杆菌的蛋白质组学研究 |
| 5. 本研究的目的和意义 |
| 第二章 炭疽杆菌芽孢的收集及多克隆抗体的制备 |
| 1.材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要化学试剂与器材 |
| 2. 方法 |
| 2.1 芽孢的收集和纯化 |
| 2.2 芽孢的复红美兰染色 |
| 2.3 芽孢悬液计数 |
| 2.4 动物免疫 |
| 2.5 PA-D4融合蛋白的表达 |
| 2.6 抗炭疽血清的制备及血清效价测定 |
| 2.6.1 抗血清的分离 |
| 2.6.2 间接ELISA测定血清效价 |
| 2.7 抗体特异性的检测 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 芽孢的复红美兰染色 |
| 3.2 芽孢计数 |
| 3.3 PA-D4融合蛋白的表达 |
| 3.4 抗体效价的测定 |
| 3.5 抗血清的免疫印记分析 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 炭疽杆菌A16R全菌体和芽孢免疫原性蛋白的研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要化学试剂与耗材 |
| 1.3 主要仪器与分析软件 |
| 2. 方法 |
| 2.1 细菌培养 |
| 2.2 蛋白样品的准备 |
| 2.2.1 营养体蛋白样品制备 |
| 2.2.2 芽孢蛋白的制备 |
| 2.3 双向电泳 |
| 2.3.1 蛋白样品纯化 |
| 2.3.2 等电聚焦 |
| 2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制 |
| 2.3.4 胶条的平衡与转移 |
| 2.3.5 SDS-PAGE电泳 |
| 2.3.6 考马斯亮蓝染色和脱色 |
| 2.3.7 图像扫描与分析 |
| 2.4 半干转印 |
| 2.5 免疫印迹 |
| 2.6 胶内酶切 |
| 2.7 胰酶解肽段混合物的MALDI-TOF/TOF质谱检测 |
| 2.7.1 仪器 |
| 2.7.2 点靶 |
| 2.7.3 检测 |
| 2.8 数据库查询 |
| 2.9 蛋白质表达情况的分析 |
| 2.10 预测炭疽杆菌双向电泳图中蛋白分布 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 炭疽杆菌A16R营养体蛋白的双向电泳 |
| 3.2 芽孢蛋白的双向电泳情况 |
| 3.3 免疫印迹结果 |
| 3.3.1 A16R营养体蛋白免疫蛋白质点的质谱鉴定结果 |
| 3.3.2 芽孢蛋白免疫蛋白质点的质谱鉴定结果 |
| 3.3.3 目前已经有文献报导具有免疫原性的蛋白(Emrah,2008;Chitlaru,2007;Mukhopadhyay,2009;Huang,2004;Ariel,2003;Liu,2004) |
| 3.4 所鉴定蛋白质的细胞功能分类情况 |
| 3.5 所鉴定蛋白质的细胞定位情况 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 炭疽杆菌相关的免疫原性蛋白 |
| 4.2 免疫蛋白质组学技术的优势与不足 |
| 第四章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 实验中所用仪器设备 |
| 附录2 培养基和试剂的配制 |
| 附录3 实验中所用试剂 |
| 附录4 所鉴定到的蛋白的相关信息 |
| 附录5 讨论中免疫原性蛋白点的双向电泳图和Western blotting曝光图 |
| 附录6 发表文章 |
（10）采后苹果与炭疽菌的相互作用及病害控制机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 苹果采后炭疽菌的研究进展 |
| 1.1.1 病原菌分类 |
| 1.1.2 病原菌生物学特性 |
| 1.1.3 炭疽菌的侵入结构及其过程 |
| 1.2 病原真菌致病机制 |
| 1.2.1 细胞壁降解酶 |
| 1.2.2 其他致病因子 |
| 1.3 植物抗病机制 |
| 1.3.1 植物抗病机制概述 |
| 1.3.2 真菌细胞壁降解酶 |
| 1.3.3 寄主主要防御酶 |
| 1.3.4 与寄主抗性有关的生化物质 |
| 1.4 苹果采后炭疽病控制技术 |
| 1.4.1 采前病菌的防治技术 |
| 1.4.2 贮藏方法 |
| 1.4.3 化学防治 |
| 1.4.4 生物防治 |
| 1.4.5 物理防治 |
| 1.5 苹果炭疽菌分子鉴定和检测及其致病性分子变异 |
| 1.5.1 rDNA序列差异分析 |
| 1.5.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)分析 |
| 1.5.3 限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析 |
| 1.5.4 ISSR标记 |
| 1.6 离子束生物工程学理论与实践应用简介 |
| 1.7 磁生物学理论与实践应用简介 |
| 1.8 论文的目的意义和研究内容 |
| 第二章 苹果采后炭疽菌生理生态学的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 温度对苹果炭疽菌的影响 |
| 2.3.2 湿度对苹果炭疽菌菌丝生长的影响 |
| 2.3.3 pH值对苹果炭疽菌生长的影响 |
| 2.3.4 潜伏侵染概率的测定 |
| 2.3.5 毒素的测定 |
| 2.3.6 接种方式和接种量对病害发展的影响 |
| 2.3.7 温度对病斑扩展速率的影响 |
| 2.3.8 湿度与病斑扩展速率的关系 |
| 2.3.9 接种浓度对苹果炭疽病菌潜伏(育)期的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 苹果采后炭疽病化学防治及控病机理研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杀菌剂对苹果炭疽菌菌丝生长的抑制作用 |
| 3.3.2 杀菌剂对苹果炭疽菌分生孢子萌发的影响 |
| 3.3.3 杀菌剂对苹果炭疽菌芽管伸长的影响 |
| 3.3.4 混剂对苹果炭疽病菌菌丝生长的抑制作用 |
| 3.3.5 化学药剂对苹果采后炭疽病的控制效果 |
| 3.3.6 丙环唑微胶囊剂对苹果采后炭疽病的控制效果 |
| 3.3.7 混剂对苹果采后炭疽病的控制效果 |
| 3.3.8 钙盐对苹果炭疽病防治的作用机理 |
| 3.3.9 热处理与药剂结合对苹果炭疽病的控制效果 |
| 3.3.10 生防菌与杀菌剂配合对苹果采后炭疽病的控制效果 |
| 3.3.11 不同浓度苯氧菌酯对采后苹果果实POD和PPO的诱导作用 |
| 3.3.12 不同药剂处理采后苹果果实后POD和PPO活性的变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 杀菌剂单剂对苹果采后炭疽病的防治效果 |
| 3.4.2 混剂对苹果采后炭疽病的防治效果 |
| 3.4.3 枯草芽孢杆菌与杀菌剂结合对采后苹果炭疽病的控制效果 |
| 3.4.4 钙盐防治 |
| 3.4.5 综合防治技术 |
| 3.4.6 不同药剂处理采后苹果果实后POD和PPO活性的变化 |
| 3.5 小结 |
| 3.5.1 化学农药对苹果采后炭疽病的防治效果 |
| 3.5.2 钙盐对病原菌的作用方式 |
| 3.5.3 加热与药剂结合对病害的控制 |
| 3.5.4 化学杀菌剂与生防菌配合对苹果采后炭疽病的控制效果 |
| 第四章 苹果采后炭疽病生物防治及控病机理研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 离子注入枯草芽孢杆菌高效拮抗菌的诱变与筛选 |
| 4.3.2 枯草芽孢杆菌突变菌株生长和发酵条件研究 |
| 4.3.3 突变菌株培养基的优化研究 |
| 4.3.4 突变菌株BS80-6最佳发酵条件研究 |
| 4.3.5 枯草芽孢杆菌突变菌株对苹果炭疽病菌抗病机制研究 |
| 4.3.6 突变菌株抗菌作用对寄主防御酶酶活性的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 离子注入枯草芽孢杆菌高效突变菌株的诱变与筛选 |
| 4.4.2 离子注入枯草芽孢杆菌遗传稳定性的研究 |
| 4.4.3 离子注入枯草芽孢杆菌生长和发酵条件的研究 |
| 4.4.4 枯草芽孢杆菌突变菌株对苹果炭疽病菌抗菌机制研究 |
| 4.5 小结 |
| 4.5.1 离子注入枯草芽孢杆菌的诱变与筛选 |
| 4.5.2 枯草芽孢杆菌突变菌株遗传稳定性研究 |
| 4.5.3 枯草芽孢杆菌突变菌株的生长和发酵条件研究 |
| 4.5.4 枯草芽孢杆菌突变菌株对苹果炭疽病菌抗菌机制研究 |
| 第五章 苹果炭疽菌低毒性菌株筛选及控病作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 低毒性菌株的筛选 |
| 5.3.2 低毒性菌株对苹果炭疽病的控制效果 |
| 5.3.3 苹果炭疽菌低毒性菌株的生物学特性 |
| 5.3.4 细胞壁降解酶活性 |
| 5.3.5 苹果果实防御酶活性的变化 |
| 5.3.6 可溶性总糖含量的变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 低毒菌株的筛选 |
| 5.4.2 低毒菌株和virulence菌株生物学特性的研究 |
| 5.4.3 细胞壁降解酶活性的变化 |
| 5.4.4 真菌细胞壁降解酶 |
| 5.4.5 寄主主要防御酶 |
| 5.5 小结 |
| 5.5.1 低毒菌株的筛选 |
| 5.5.2 低毒性菌株对苹果炭疽病的控制效果 |
| 5.5.3 低毒菌株和强毒菌株生物学特性的研究 |
| 5.5.4 低毒菌株和强毒菌株接种苹果引起酶活性变化的比较 |
| 5.5.5 果实中可溶性总糖的含量的变化 |
| 第六章 采后苹果与炭疽菌相互作用及生理机制研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 品种抗病性鉴定 |
| 6.3.2 苹果炭疽菌致病机制研究 |
| 6.3.3 苹果果实提取液对炭疽菌孢子萌发的影响 |
| 6.3.4 不同苹果品种对炭疽菌的抗性机制研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 苹果炭疽菌致病生理生化机制 |
| 6.4.2 不同品种苹果对炭疽菌的抗性生理生化机制 |
| 6.5 小结 |
| 6.5.1 品种抗病性鉴定 |
| 6.5.2 苹果炭疽菌致病机制研究 |
| 6.5.3 苹果果实提取液对炭疽菌孢子萌发的影响 |
| 6.5.4 不同品种苹果对炭疽菌的抗性机制研究 |
| 第七章 苹果炭疽菌分子鉴定及致病性分子变异研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 苹果炭疽菌分子鉴定和检测 |
| 7.3.2 苹果炭疽菌分子变异初步研究 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 总结 |
| 8.1 论文研究的结果总结 |
| 8.1.1 苹果采后病害的生理生态学基础的研究 |
| 8.1.2 苹果采后炭疽病化学防治及控病机理的研究 |
| 8.1.3 苹果采后炭疽病生物防治及控病机理的研究 |
| 8.1.4 苹果炭疽菌低毒性菌株筛选及控病作用的研究 |
| 8.1.5 采后苹果与炭疽菌相互作用及生理机制研究 |
| 8.1.6 苹果炭疽菌分子鉴定及致病性分子变异的研究 |
| 8.2 研究的前景 |
| 8.2.1 进行苹果炭疽病早期诊断 |
| 8.2.2 开发与环境相容好、高效、低毒、使用安全、对仓储苹果无污染,不影响外观 和风味的新农药、新剂型和使用技术 |
| 8.2.3 生物防治是控制果蔬产品采后病害的新途径 |
| 8.2.4 低毒性菌株在病害防治上的应用 |
| 8.2.5 抗病品种的利用 |
| 8.2.6 综合防治技术 |
| 8.3 论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 博士在学期间发表的论文 |
四、炭疽杆菌致病因子的研究进展（论文参考文献）
- [1]苹果炭疽叶枯病菌单羧酸转运蛋白CgMCT1的功能分析[D]. 赵璇竹. 中国农业科学院, 2021
- [2]山茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的鉴定[D]. 阿茹娜. 吉林大学, 2021(01)
- [3]炭疽芽孢杆菌的研究进展[J]. 张玲艳,宋丽丽,贾伟娟,王学理. 黑龙江畜牧兽医, 2020(15)
- [4]果生炭疽菌效应蛋白CfCE92功能及互作靶标筛选[D]. 张凇. 西北农林科技大学, 2020
- [5]基于组学技术的枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌和褐腐菌的影响及应用研究[D]. 吴诗媛. 上海大学, 2019
- [6]快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价[J]. 杜清春,董珊珊,丁奕博,张艳,李伟,王鹏. 中国动物传染病学报, 2019(04)
- [7]橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的筛选[D]. 张贝. 海南大学, 2018(08)
- [8]炭疽芽胞杆菌保护性抗原的体外分子改良与抗毒素及疫苗筛选[D]. 吴高兵. 华中农业大学, 2010(12)
- [9]炭疽杆菌A16R免疫蛋白质组学的研究[D]. 任静晓. 华中农业大学, 2010(04)
- [10]采后苹果与炭疽菌的相互作用及病害控制机理研究[D]. 檀根甲. 安徽农业大学, 2009(02)