一、针对软骨组织工程研究发展的几点思考（论文文献综述）
程施瑞[1]（2020）在《基于静息态脑岛功能网络研究针刺对膝骨性关节炎患者的中枢作用机制》文中研究表明目的:对比观察针刺和塞来昔布治疗膝骨性关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）患者脑岛功能连接网络的变化,探讨针刺治疗KOA的部分中枢作用机制特点。方法:1.计算机检索Pub Med、Web of Science、EMBASE、Cochrane Library databases、中国期刊全文数据库（China National Knowledge Infrastructure,CNKI）、万方数据库（VF database）、维普中文科技期刊数据库（Chongqing VIP）、中国生物医学文献数据库（Chinese Biomedical Medical database,CBM）中针灸治疗膝骨性关节炎的临床随机对照研究文献,采用数据挖掘技术对针灸治疗膝骨性关节炎常用穴进行统计,分析针灸治疗膝骨性关节炎的用穴规律,为针刺治疗膝骨性关节炎的中枢作用机制研究提供选穴参考。2.纳入98例KOA患者及76例健康受试者（Healthy Subjects,HS）,采用静息态功能磁共振成像（resting state Functional Magnetic Resonance Imaging,rs-f MRI）技术,基于种子点的功能连接度（Functional Connectivity,FC）分析方法,以脑岛前腹侧区、前背侧区、中部和后部为种子点,对比KOA患者与HS静息状态下双侧脑岛功能连接度差异,将临床疼痛相关量表评分（Visual Analog Scale,VAS）与双侧脑岛功能网络进行相关性分析,以明确KOA患者双侧脑岛功能连接变化特征,为探讨针刺治疗KOA的中枢机制提供参考。3.采用随机、对照的临床研究方法,将72例符合要求的KOA患者随机分为针刺组和塞来昔布组。针刺组患者每日接受1次针刺治疗,5次为一个疗程,疗程间休息2天,共治疗2个疗程,合计10次。塞来昔布组患者每日口服塞来昔布200mg,共治疗2周。以VAS和西安大略麦克马斯特骨关节炎指数（Western Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis index,WOMAC）为临床疗效评价指标,采用f MRI技术,以脑岛前腹侧区、前背侧区、中部和后部为种子点,使用功能连接度分析方法,对比针刺组、塞来昔布组KOA患者组内和组间静息状态脑岛功能连接度变化及差异,并将VAS评分变化值与KOA患者治疗前后脑岛功能连接度变化进行相关性分析,观察针刺治疗对KOA患者脑岛功能连接网络的变化特点,探讨针刺治疗KOA的部分中枢作用机制。结果:1.本研究共纳入了635条文献,结果显示排名前十的腧穴依次为犊鼻、膝眼、阳陵泉、血海、梁丘、足三里、阴陵泉、阿是穴、鹤顶、膝阳关,运用频次合计4084次。足阳明胃经腧穴选用频次最高,占比31.68%。膝关节局部选穴最为常见,占比高达87.93%。2.膝骨性关节炎患者静息态脑岛功能连接度特征与健康受试者相比,KOA患者脑岛FC升高的区域有:前扣带回、中扣带回、额叶、中央后回;KOA患者脑岛FC降低的区域有:后扣带回、丘脑。KOA患者脑岛与右侧额中回、双侧中央后回FC和VAS评分呈显着负相关（r<-0.3,P<0.05）;KOA患者脑岛与右侧额上回、额下回FC和VAS评分呈显着正相关（r>0.3,P<0.05）。3.针刺与塞来昔布治疗对膝骨性关节炎患者静息态脑岛功能连接度的影响（1）针刺与塞来昔布治疗膝骨性关节炎患者的临床疗效评价66例KOA患者完成了试验,针刺组、塞来昔布组各33例。组内比较:与治疗前相比,两组患者的VAS评分、WOMAC总分及疼痛、僵硬、功能活动三个亚表评分、焦虑自评量表（SAS）和抑郁自评量表（SDS）评分均显着降低（P<0.05）,两组患者的生活质量量表（SF-12）评分显着提高（P<0.05）。组间比较:两组KOA患者治疗后的VAS、WOMAC总分及疼痛、僵硬、功能活动三个亚表、SAS、SDS和SF-12评分组间比较无统计学差异（P>0.05）;两组治疗前后变化值组间比较均无统计学差异（P>0.05）。（2）针刺治疗对KOA患者静息态脑岛功能连接度的影响特征针刺组:针刺治疗后,KOA患者双侧脑岛与前扣带回、中扣带回、额叶FC降低。患者脑岛与左侧前扣带回FC变化和VAS评分改善值呈显着负相关（r=-0.49,P<0.05）;患者脑岛与右侧中扣带回、左侧额中回、双侧额下回FC变化和VAS评分改善值呈显着正相关（r>0.3,P<0.05）。塞来昔布组:塞来昔布治疗后,KOA患者双侧脑岛与中央后回、额叶FC降低。患者脑岛与右侧额上回、双侧额下回、右侧中央后回、左侧额中回FC变化和VAS评分改善值呈显着正相关（r>0.3,P<0.05）。组间比较:经过2周的治疗后,针刺组KOA患者脑岛与双侧额中回、双侧额下回三角区、右侧额下回眶区、右侧额下回脑盖区FC变化较塞来昔布组患者下降更为明显。结论:1.针刺能够改善KOA患者的疼痛、僵硬症状,缓解患者焦虑、抑郁情绪,提高患者的生活质量,其疗效与塞来昔布相当。2.KOA患者双侧脑岛与前/中扣带回、额叶、中央后回、丘脑等脑区存在功能连接度异常。调节KOA患者脑岛与认知控制、注意力、情绪等功能相关的额叶、前扣带回静息态功能连接,可能是针刺特异于塞来昔布治疗KOA的重要中枢作用机制特点。
薛志鹏[2]（2020）在《基于核心指标集的中医药治疗股骨头坏死疗效评价方法的建立与验证》文中研究表明背景股骨头坏死的中医药治疗方案已经在相关的共识和指南中得到推荐,尤其是早中期的优势更加明显。但是,中医药治疗股骨头坏死的疗效评价方法却较混乱且标准不一,不同文献报道的疗效可能会得到相反的结果,缺乏较为一致的、系统的疗效评价方法,进一步导致了临床与科学研究可重复性不高,且疗效之间难以横向比较,降低了原始研究之间的数据利用,不利于中医药的循证发展及为证据决策提供高质量证据。核心指标集理念的提出可以有效的解决临床实践中疗效评价结局指标选择的问题,它规范了特定疾病或特定病种必须测量的最小结局指标集合,既能有效的简化试验方案的设计,降低实施过程中的偏倚风险,又能增强临床研究的实用性。基于此,我们将核心指标集理念引入中医药治疗股骨头坏死的疗效评价中,开展股骨头坏死中医临床研究核心指标集的构建工作,形成临床可行性高的疗效评价方法并对其进行信度、效度、反应度的临床验证,旨在规范中医药治疗股骨头坏死的疗效评价,提高原始研究的数据利用和向证据决策转化时的质量。研究目的1基于核心指标集“最重要、标准化、共识性”的理念,建立与临床实践密切相关的中医药治疗股骨头坏死的疗效评价方法;2通过横断面及前瞻随访研究,对疗效评价方法中的临床评价指标进行验证;3通过横断面和回顾性研究,对疗效评价方法中的影像评价指标进行验证。方法1基于核心指标集的中医药治疗股骨头坏死疗效评价方法的建立首先,通过文献的系统评价,检索2015年—2017年中英文数据库股骨头坏死的临床试验研究文献,提取原始文献中的结局指标,并进行规范化术语表达,按结局指标类别进行分类,形成原始结局指标清单;其次,设计德尔菲问卷调查,通过两轮德尔菲医师问卷和一轮患者问卷对结局指标的重要性进行评价,筛选,集中,获得关键利益相关群体对于中医药治疗股骨头坏死结局指标选择的意见与观点;最后,通过面对面的共识会议,确定最终构成核心指标集的结局指标及测量方法,形成中医药治疗股骨头坏死的疗效评价方法。2疗效评价方法的临床评价指标验证通过横断面及前瞻随访研究,以2018年9月—2019年12月因实际病情需要自愿采用中医药多途径治疗的231例股骨头坏死患者为研究对象,采集其治疗前及治疗后3个月的临床评价指标的得分,髋关节Harris评分及测量所需时间,对临床评价指标的效标效度、反应度进行验证。3疗效评价方法的影像评价指标验证影像评价指标的验证分为两部分:（1）一致性验证:通过横断面研究,收集2018年9月—2019年12月纳入的231例（231髋）患者的X线,对其进行等距抽样,选择6名骨科医师进行观察者间一致性和同一观察者的复测一致性验证;（2）影像评价指标动态观察:回顾2018年—2019年已接受人工关节置换,且置换前进行保关节治疗至少2年的病例X线片进行动态观察,由一名高级职称医师对股骨头形态、坏死面积及骨关节炎发生程度的变化进行评分,观察其动态变化并探索置换前的X线片与人工关节置换的关系。结果1 基于核心指标集的中医药治疗股骨头坏死疗效评价方法的建立1.1 形成原始结局指标清单本研究共检索中、英文数据库文献共11697篇文献,去除重复文献3828篇,通过阅读题目及摘要,剔除综述、病案报道、动物实验等不符合要求文献,对1207篇文献进行全文阅读,最终纳入411篇文献符合要求的文献。对提取的149个结局指标按照症状体征评价,远期结局,生活质量,影像学评价,安全性事件,中医指标评价,满意度评价,理化指标评价,住院时间评价,手术相关评价10个类别进行分类,形成原始结局指标清单,并依据原始清单设计临床医师和患者的德尔菲问卷。1.2 关键利益相关群体的德尔菲调查两轮临床医师问卷调查:第一轮共发放问卷73份,回收67份,回复率为91.8%。采用Likert评分9分制对每项结局进行评价,将重要性评分均值≥4分的结局指标反馈给专家,共27个,包括VAS评分、关节活动度、行走距离、X线股骨头形态、关节置换率、Harris评分、影像稳定率（综合X线、CT、MRI）、股骨头生存时间、MRI坏死范围、X线股骨头坏死面积、X线骨关节炎发生程度、中医证候积分、跛行、行走能力、SF-36量表、ARCO分期改变、BMD、不良反应、总胆固醇、甘油三酯、MRI骨髓水肿、Harris评分优良率、并发症、血浆粘度、有效率、成骨细胞计数、破骨细胞计数,且有20个结局指标的变异系数CV>15%,说明专家评分离散度较大;协调系数检验W=0.255（χ2=495.411,p<0.000）,说明专家协调系数一般,对于结局指标的评分较不一致;第二轮调查开始前反馈第一轮结果,参照专家意见,调整问卷结构,继续调查。共发放问卷73份,回收60份,回复率为82.2%。根据50%的专家认为该结局指标非常重要（7—9分）且重要性评分均值≥7分的原则,共8个结局指标作为潜在核心结局指标进入共识会议阶段,包括VAS评分、关节活动度、行走距离、X线股骨头形态、关节置换率、X线股骨头坏死面积、X线骨关节炎发生程度和中医证候积分。其中,变异系数CV均<15%,说明专家评分的离散度较小;且专家的协调系数W=0.504（χ2=237.995,p<0.000）,一致性较好。患者问卷共调查103位,排名前10位的结局指标包括疼痛、关节活动、行走距离、跛行、影像学表现、上下楼梯、关节畸形、穿鞋袜、日常生活、扶拐。1.3共识会议确定疗效评价方法共识会议共两轮,第一轮投票共6个结局指标纳入核心指标集:VAS评分关节活动度、行走距离、X线股骨头形态、X线股骨头坏死面积和X线骨关节炎发生程度;第二轮投票确定了测量标准和计分方式,形成了疗效评价方法:包括临床评价指标和影像评价指标两部分,临床评价指标总分10分,包括VAS评分（0—10分,系数0.5）,屈曲度数（0—10分,系数0.3）和行走距离（0—10分,系数0.2）,分数越高,代表临床症状和体征越严重;影像评价指标总分10分,采用X线作为依据,包括股骨头形态（塌陷程度测量,0—3分,系数1）,坏死面积（囊变范围测量,0—3分,系数1）和骨关节炎发生程度（K-L分级测量,0—4分,系数1）,分数越高,代表股骨头坏死的影像学表现越严重。2临床评价指标验证纳入2018年9月—2019年12月的231例经过中医药多途径治疗的无需辅助工具的股骨头坏死患者,其中单侧发病148例,双侧发病且一侧稳定无症状83例,男151例,女80例,平均病程31.87±41.51月,年龄45.24±13.64岁。2.1效度检验通过与Harris评分的对比,治疗前后临床评价指标的屈曲分数与Harris评分的关节活动度分数的spearman相关系数为-0.644、-0.768,说明两者具有较强的负相关关系;临床评价指标中的行走分数与Harris评分的关节功能分数,治疗前后的spearman相关系数为-0.825、-0.753,说明两者具有较强的负相关关系;临床评价指标总分与Harris评分治疗前后的pearson相关系数分别-0.782、-0.767,与VAS评分的相关系数分别为0.663、0.768,说明治疗前后总分与Harris评分具有较强的负相关关系,与VAS评分具有较强的正相关关系。2.2反应度检验通过对临床评价指标中行走距离分数、VAS评分、屈曲度数和总分的治疗前后对比,治疗后行走距离评分降低,行走距离增加（p<0.000）;VAS评分降低,疼痛减轻（p<0.000）;屈曲度数评分降低,屈曲度数增加,活动范围增大（p<0.000）;总分降低,整体症状和体征明显改善（p<0.000）。Harris评分疼痛、关节功能、关节活动度与总分治疗后分数均明显提高（p<0.000）,说明患者症状体征改善明显,两评分表现出了一致的变化。计算VAS评分、屈曲度数和临床指标总分进行治疗前后变化值,效应量和标准化反应均数的计算,得出其效应量分别为2.43,0.86,1.96,标准化反应均数分别为2.01,0.91,2.12,不论是分项还是临床指标总分间均具有较好的反应度。3影像评价指标验证3.1一致性验证对2018年9月—2019年12月纳入的231例单髋的X线片中抽样获得的47张进行独立性评价。统计不同医师间对于股骨头形态、坏死面积和骨关节炎发生程度的Kendall’s W系数分别为0.864、0.714和0.727,表明不同医师间具有较高的一致性;6位医师经过2周后再次对同一批编号的X线片进行影像指标独立性评价。统计同一医师对于股骨头形态、坏死面积和骨关节炎发生程度3个指标重复测量的加权kappa值,均在0.7以上水平,同样具有较高的一致性。3.2影像评价指标动态观察回顾2018年—2019年在我科接受人工关节置换的股骨头坏死患者,且置换前曾接受保髋治疗至少2年的20髋的X线片进行动态评分,随着随访时间延长,股骨头形态的塌陷程度越严重（p<0.000）;股骨头坏死的囊变范围缩小（p<0.000）,骨关节炎严重程度逐渐增加（p<0.000）。置换前最后一次影像评价总分平均值为5.95±0.887分,股骨头形态平均值2.85±0.366分,坏死面积平均值0.15±0.366分,骨关节炎发生程度平均值2.95±0.759分,即说明一般影像塌陷超过4mm,囊变区域几乎修复,骨关节炎发生在3级及以上程度,建议从影像学考虑人工关节置换。结论1 本研究基于核心指标集理念,通过混合研究方法,文献系统评价,临床医师和患者关键利益相关群体的德尔菲调查和最终的面对面共识会议,建立了中医药治疗股骨头坏死的疗效评价方法,分为临床评价指标和影像评价指标,临床评价指标包括VAS评分,屈曲度数和行走距离;影像评价指标采用髋关节X线片,包括股骨头形态、坏死面积和骨关节炎发生程度。2经过横断面及前瞻随访研究,证明了临床评价指标各分项与总分间具有良好的效度和反应度,且操作时间短,结局指标选择及权重系数设置合理,建议作为中间指标,用于近期或较短测量时点的疗效评价。3经过不同观察者间和同一观察者的重复测量,影像评价指标各项内容显示出较高的一致性,证明其用于评价中医药治疗股骨头坏死的疗效准确可靠。且从影像学角度为人工关节置换的选择提供了客观依据。因此,建议作为次要终点结局指标进行动态观察或较长观察周期内的疗效评价。
张琪[3]（2020）在《基于外泌体microRNA表达研究针刺治疗膝骨性关节炎的机制》文中提出目的:通过对比膝骨性关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）患者针刺治疗前后血清外泌体micro RNA表达的变化,筛选与针刺效应相关的关键micro RNA。比较文献报道的micro RNA与本次研究发现的micro RNA的差异,并根据筛选到的关键micro RNA进行体外实验,研究其对软骨细胞增殖与凋亡的影响,以期探索针刺治疗KOA的潜在调节机制。方法:1.利用文献计量可视化软件Citespace与VOSviewer对KOA micro RNA相关研究进行文献挖掘,筛选目前研究中的热点micro RNA及主要靶点;2.共纳入KOA患者40例和健康受试者17例,将KOA患者随机分为针刺治疗组与等待治疗组。针刺治疗组选择鹤顶、内膝眼、犊鼻、血海、梁丘、阴陵泉、阳陵泉、足三里进行针刺治疗,每周3次,隔天治疗1次,周末休息2天,连续治疗4周,共12次。等待治疗组在针刺干预同时期不进行干预,待4周后再给予患者针刺治疗。所有KOA患者分别于入组0周和入组4周采用西部安大略麦克马斯特大学骨关节炎指数可视化量表（Western Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis index,WOMAC评分）、SF-12生活质量量表对针刺疗效进行评定。3.各组中分别选取15例进行micro RNA研究,其中10例进行高通量测序,5例用于后期RT-PCR验证实验。KOA患者血样分别在入组0周、4周后进行采集;健康受试者血样于入组0周时采集。收集血清后,超速离心法离心,分离血清外泌体,透射电镜下观察所分离的外泌体形态;Western Blot检测外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、CD81表达情况;纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）技术对外泌体进行粒径分析,以鉴定外泌体。采用small RNA测序技术对分离的外泌体中的micro RNA进行高通量测序。根据P<0.05,差异倍数、表达丰度高的原则,筛选差异表达micro RNA。通过将KOA患者与健康受试者血清外泌体micro RNA的差异表达谱、针刺组治疗前后的血清外泌体micro RNA的差异表达谱、等待治疗组4周前后血清外泌体micro RNA的差异表达谱作韦恩图,筛选出针刺治疗KOA的关键micro RNA。对所筛选出的micro RNA进行RT-PCR检测,以验证测序的准确性。并通过Target Scan和mi RDB对所筛选的针刺治疗KOA的关键micro RNA进行靶基因预测;用GO与KEGG分析进一步明确靶基因相关功能与信号通路。4.基于文献研究、高通量测序及RT-PCR验证的结果,选择软骨细胞作为后续研究的目的细胞,提取并培养乳鼠软骨细胞,通过免疫组化、免疫荧光及甲苯胺蓝染色对其进行细胞鉴定后,分别用所筛选到的micro RNA 338-3p inhibitor、micro RNA 15b-3p mimic对软骨细胞进行转染,用脂多糖刺激软骨细胞模拟细胞炎症,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:1.KOA micro RNA研究文献挖掘结果:共检索到850篇文章,涉及骨关节炎mi RNA的研究从2007年开始出现,总体呈递增趋势;该领域内研究的热点micro RNA有:mi R-140、mi R-146、mi R-26、mi R-34、mi R-27、mi R-181、mi R-193、mi R-30、mi R-233、mi R-206。这些mi RNA的主要作用靶点在于软骨细胞的增殖与凋亡。2.针刺治疗KOA患者的疗效结果:针刺组四周治疗后,WOMAC总分、WOMAC疼痛评分有所降低,差异有统计学意义（P<0.05）;WOMAC僵硬评分、WOMAC功能评分、SF-12 PCS、SF-12 MCS改变不明显,差异无统计学意义（P>0.05）。等待治疗组四周后,WOMAC总分、WOMAC疼痛评分、WOMAC僵硬评分、WOMAC功能评分、SF-12 PCS、SF-12 MCS评分差异无统计学意义（P>0.05）。3.血清外泌体micro RNA表达的研究结果:KOA患者与健康受试者相比,共有207个差异表达的血清外泌体micro RNA,其中上调104个,下调103个;其中,hsa-mi R-490-3p与WOMAC疼痛评分呈负相关;hsa-mi R-1255b与WOMAC疼痛评分呈正相关。针刺组治疗前后相比,共有65个差异表达的外泌体micro RNA,其中上调32个;下调33个。等待治疗组经四周观察期后与基线比较,共有76个差异表达的micro RNA,其中上调43个;下调33个。4.针刺治疗KOA下调的mi RNA为:hsa-mi R-504-3p、hsa-mi R-1915-3p、hsa-mi R-103a-2-5p、hsa-mi R-887-3p、hsa-mi R-1228-5p、hsa-mi R-34c-3p、hsa-mi R-3168、hsa-mi R-518e-3p、hsa-mi R-1296-5p、hsa-mi R-338-3p、hsa-mi R-199b-5p;针刺治疗KOA上调的mi RNA为:hsa-mi R-514a-3p、hsa-mi R-4440、hsa-let-7f-5p、hsa-mi R-15b-3p。其中mi R-338-3p、mi R-15b-3p为文献中报道的mi RNA。5.RT-PCR验证结果:hsa-338-3p在KOA患者中的表达升高（P=0.332）,经过等待观察期后无明显变化（P=0.647）,针刺治疗后降低（P=0.149）,但差异无统计学意义（P>0.05）。hsa-199b-5p在KOA患者中的表达升高（P=0.305）,经过等待观察期后无明显变化（P=0.536）,针刺治疗后仍表现出升高（P=0.252）,差异均不具有统计学意义（P>0.05）。has-mi R-15b-3p在KOA患者中的表达升高（P=0.003）,差异有统计学意义;分别经过等待观察期及针刺后均略有降低（P=0.083,P=0.661,）,但差异不具有统计学意义（P>0.05）。hsa-mi R-1296-5p在KOA患者中的表达升高（P<0.001）,差异有统计学意义;在分别经过等待观察期及针刺后均有降低（P=0.024,P=0.015）,差异有统计学意义。hsa-mi R-3168在KOA病人与健康受试者中无明显差异（P=0.923）,经过等待观察期及针刺后略有上升（P=0.1736,P=0.881,）,差异均无统计学意义。6.生物信息学结果:对mi R-338-3p、mi R-15b-3p、mi R-199b-5p、mi R-1296-5p靶基因预测显示,mi RDB与Targetscan预测的交集共有262个靶基因。对262个预测靶基因进行KEGG pathyway富集分析共37条通路,主要涉及细胞凋亡、B细胞受体、胆碱能突触、多巴胺能神经突触、癌症等生化代谢途径,以及MAPK、TNF、m TOR、PI3K-Akt、Wnt、B细胞受体、HIF-1、AMPK、Erb B等通路;GO富集分析,主要参与调节RNA代谢过程、DNA模板化、核酸酶复合代谢、核酸模板转录、RNA生物合成过程等。7.mi R-338-3p inhibitor转染后软骨细胞增殖明显增加,差异有统计学意义（P<0.001）;mi R-338-3p inhibitor转染后软骨细胞凋亡率略有降低,差异无统计学意义（P>0.05）。mi R-15b-3p mimic转染后软骨细胞增殖力略微上升,差异无统计学意义（P<0.001）;mi R-15b-3p mimic转染后软骨细胞凋亡率降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:1.通过对KOA mi RNA的文献研究发现,该领域以软骨细胞为核心,主要涉及细胞增殖、凋亡及软骨形成等机制。2.临床研究显示KOA患者经针刺治疗后可有效缓解KOA患者关节疼痛;3.KOA患者与健康人血清外泌体测序发现,KOA患者与健康人血清外泌体mi RNA表达谱存在差异,其中上调表达的104个,下调表达的103个。针刺治疗可调节KOA患者血清外泌体mi RNA表达,其中mi R-338-3p、mi R-15b-3p、mi R-199b-5p、mi R-3168、mi R-1296-5p可能是针刺治疗KOA作用的关键mi RNA;进一步的生物信息学分析初步发现,针刺可能通过影响MAPK通路及细胞凋亡等途径发挥治疗作用。4.通过体外细胞学实验验证发现,mi R-338-3p可促进软骨细胞增殖,mi R-15b-3p可抑制软骨细胞凋亡,提示这可能是针刺治疗KOA的机制之一。
张龙早[4]（2019）在《二氧化碳激光灸与艾灸犊鼻穴治疗膝骨关节炎模型大鼠的疗效比较》文中研究表明【目的】比较CO2激光灸和传统温和灸对KOA（Knee Osteoarthritis）模型大鼠的治疗效应,初步探讨CO2激光灸、传统温和灸治疗KOA的可能机制,为CO2激光灸治疗KOA提供科学依据。【方法】应用随机数字法将健康雄性SD大鼠分成空白对照组7只、KOA模型组7只、激光灸组8只和温和灸组9只共4组。除空白对照组在膝关节内注射等量0.9%生理盐水之外,其余3组均采用碘醋酸钠（MIA）诱发的大鼠膝骨关节炎动物模型。模型复制成功后,激光灸组和温和灸组分别给予CO2激光灸或温和灸犊鼻穴,每日1次,每次10min,共治疗6次。分别于造模前1d、造模24小时后,治疗2次、4次和6次后,检测大鼠辐射热刺激缩足反应潜伏期、机械刺激缩足反射阈值。6次治疗、测痛完成后,取大鼠外周血,酶联免疫吸附测定法检测去甲肾上腺素（NE）、白介素17（IL-17）浓度;取大鼠膝关节,常规固定、切片,苏木精-伊红HE染色,显微镜下观察软骨形态的变化并进行OARSI评分。【结果】1.各组大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期测定结果比较:造模前各组大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期均无统计学显着差异;造模后KOA模型组、激光灸组和温和灸组大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期均较空白对照组显着变短（均P<0.01）,3组大鼠之间无统计学显着差异（P>0.05）;治疗2次后,激光灸组、温和灸组大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期均显着长于KOA模型组（分别P<0.01、P<0.05）,而与空白对照组无统计学显着差异（P>0.05）。治疗4次后,CO2激光灸组大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期显着大于KOA模型组（P<0.01）,而与盐水空白组无统计学显着差异（P>0.05）,传统温和灸组大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期与KOA模型组没有显着差异（P>0.05）,与盐水空白组也无统计学显着差异（P>0.05）;治疗6次,CO2激光灸组大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期与KOA模型组没有显着差异（P>0.05）,与盐水空白组也无统计学显着差异（P>0.05）,传统温和灸组大鼠的辐射热刺激缩足潜伏期显着低于盐水空白组（P<0.05）,而与KOA模型组相比没有统计学显着差异（P>0.05）。2.各组大鼠OARSI评分结果比较:CO2激光灸组和温和灸组的OARSI评分均低于KOA模型组,其中CO2激光灸组和KOA模型组的评分差异有统计学意义（均P<0.05）;CO2激光灸组的OARSI评分也显着低于传统温和灸组（P<0.05）。3.各组大鼠外周血中NE浓度结果比较:盐水空白组、KOA模型组、CO2激光灸组和传统温和灸组的NE浓度比较均无统计学显着差异（均P>0.05）。4.各组大鼠外周血中IL-17浓度结果比较:盐水空白组、KOA模型组、CO2激光灸组和传统温和灸组的IL-17浓度比较均无统计学显着差异（均P>0.05）。【结论】CO2激光灸和温和灸均能显着延长KOA模型大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期、缓解疼痛。两种灸法均为膝骨关节炎的有效疗法,值得临床推广应用。
龚年金[5]（2019）在《基于温法理论探讨温肺化纤汤预处理对H2O2诱导小鼠肺间充质干细胞氧化损伤保护作用机制研究》文中提出1目的在国医大师洪广祥教授治肺不远温的学术思想指导下,探讨IPF的中医病因病机,总结温法在IPF治疗中的具体运用,并由此归纳温法治疗IPF的循证医学证据;通过实验研究,建立H2O2诱导的小鼠肺间充质干细胞的氧化损伤模型,检测温肺化纤汤预处理后相关通路上的蛋白分子,揭示温肺化纤汤抗氧化的分子机制。2方法2.1理论探讨搜集关于IPF的相关中医经典文献,阐释中医历代名家对IPF的认识;结合国医大师治肺不远温的学术思想,阐释温法在IPF治疗中的具体运用和温肺化纤汤的临床疗效;搜集现代关于温法治疗IPF的临床研究资料,进行温法治疗IPF的系统性评价。2.2实验研究2.2.1细胞建模取三只健康C57BL/6小鼠,脱颈处死后获取小鼠肺间充质干细胞。通过流式细胞术对第10代小鼠肺间充质干细胞进行表型鉴定和细胞周期检测;并进行成脂、成骨及成软骨诱导分化。使用H2O2（100,200,400,600,800,1000μM）作用于小鼠肺间充质干细胞6小时,用MTT检测细胞活力。2.2.2细胞分组及给药将小鼠肺间充质干细胞以8×104/ml种植于96孔板或六孔板,细胞贴壁生长24小时后,将细胞孔分为对照组,模型组,温肺化纤汤低、中、高剂量预处理组进行给药:（1）对照组:加入培养液24小时后,吸弃培养液,加入新鲜培养液继续培养6小时;（2）模型组:加入培养液24小时后,吸弃培养液,加入含有H2O2（800μM）的培养液处理6小时;（3）温肺化纤汤低、中、高剂量组:加入含有温肺化纤汤（100、200、400μg/ml）的培养液24小时后,吸弃培养液,加入含有H2O2（800μM）的培养液处理6小时。2.2.3检测指标2.2.3.1显微镜下观察细胞形态及成脂油红染色、成骨茜素红染色和成软骨阿尔新蓝染色;流式细胞术检测细胞表面抗原Sca-1、CD54、CD45、CD44、CD11b和细胞周期。2.2.3.2通过MTT法检测细胞活力;使用相关试剂盒检测各组细胞的LDH、SOD和MDA水平。2.2.3.3使用Hoechst凋亡染色和流式细胞学检测细胞凋亡;Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-3的表达;RT-PCR检测各组细胞Bax、Bcl-2和Cytochrome C的mRNA表达。2.2.3.4使用流式细胞术检测各组细胞的ROS及线粒体膜电位;Western blot检测各组细胞抗氧化通路蛋白分子Akt、p-Akt、c-Nrf2、n-Nrf2及HO-1的表达;RT-PCR检测各组细胞Nrf-2和HO-1的mRNA表达。3结果3.1理论探讨IPF的中医病因病机与脏腑亏虚,痰瘀互结,壅塞肺络密切相关,其中气阳虚弱、寒凝痰瘀、外感寒湿占据着重要地位,这也是IPF使用温法治疗的基础。温肺化纤汤是温法治疗IPF的经验方,该方集温阳、散寒、化瘀于一体,是治肺不远温学术思想的智慧结晶。通过对温法治疗IPF的临床研究系统性分析发现,与单纯西药治疗相比,温法治疗IPF能有效提高总有效率、明显改善咳嗽、喘息等中医主要症候,改善肺功能,提高生活质量,同时避免长期口服激素带来的毒副作用。合理辨证使用温法治疗IPF是值得探讨和推广的治疗策略。3.2实验研究3.2.1小鼠肺间充质干细胞（mLMSCs）的分离提取、纯化鉴定及诱导分化结果小鼠肺间充质干细胞在镜下观察呈现纺锤状、梭状,类似于纤维细胞。细胞生长曲线呈现典型S形,即静止期、倍增期和平台期;成脂诱导分化后,细胞镜下呈现红色。成骨诱导分化后,钙化结节与染料结合而镜下呈现橘红色。成软骨诱导分化后,软骨细胞与阿尔新蓝结合镜下呈现蓝色。细胞周期显示大部分细胞处于静止期,少部分细胞处于分裂增殖期;流式细胞术检测表明细胞的表型为Sca-1+/CD54+/CD44+/CD45-/CD11b-。3.2.2温肺化纤汤对H2O2氧化损伤mLMSCs保护作用初步评价不同浓度的温肺化纤汤（50、100、200、400、800μg/ml）处理小鼠肺间充质干细胞24小时,与对照组相比,除800μg/ml组外（P<0.05）,其余各组的细胞存活率无明显差异（P>0.05）。不同浓度的过氧化氢（200、400、600、800、1000μM）处理小鼠肺间充质干细胞6小时,与对照组相比,除200μM组外（P>0.05）,其余各组的细胞存活率呈剂量依赖性下降。（P<0.05,P<0.01）。不同浓度的温肺化纤汤（100、200、400μg/ml）处理小鼠肺间充质干细胞24小时,再用H202（800μM）处理6小时,结果表明,与对照组相比,模型组细胞存活率显着降低（P<0.01）。与模型组相比,温肺化纤汤低、中、高剂量组均可以提高细胞存活率（P<0.01）;与正常对照组相比,模型组的LDH、MDA显着升高,SOD显着降低（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组LDH、MDA显着下降,SOD显着上升（P<0.01）。3.2.3温肺化纤汤对H2O2诱导mLMSCs细胞凋亡的影响Hoechst凋亡染色结果表明,对照组中的mLMSCs细胞核呈蓝色,分布均匀,基本未见凋亡坏死的固缩细胞核。模型组中的mLMSCs可见颜色发白的固缩细胞核,甚至可见致密浓染的碎块状细胞核。温肺化纤汤的预处理组明显减少凋亡细胞,并与温肺化纤汤的浓度呈现正相关性;流式细胞学检测细胞凋亡率表明,与正常对照组相比,模型组细胞凋亡率显着升高（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组的细胞凋亡率则显着下降（P<0.01）。与正常对照组相比,模型组Bcl-2/Bax比值显着降低（P<0.01）,Cleaved caspase-3显着提高（P<0.01）,BaxmRNA、Cytochrome CmRNA相对表达量显着升高,Bcl-2mRNA相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组的Bcl-2/Bax比值显着升高（P<0.01）,Cleaved caspase-3显着降低（P<0.01）,Bcl-2mRNA相对表达量显着升高,BaxmRNA、Cytochrome CmRNA相对表达量显着降低（P<0.05,P<0.01）;与低剂量组相比,温肺化纤汤的中、高剂量组的Bcl-2/Bax比值显着升高（P<0.01）,Cleaved caspase-3显着降低（P<0.01）,Bcl-2mRNA相对表达量显着升高（P<0.01）,BaxmRNA、Cytochrome CmRNA相对表达量显着降低（P<0.01）。3.2.4温肺化纤汤抗氧化作用机制探讨与正常对照组相比,模型组ROS生成量显着升高（P<0.01）,线粒体膜电位明显下降（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组ROS生成量则显着下降（P<0.01）,线粒体膜电位明显升高（P<0.01）;与低浓度组相比,温肺化纤汤中、高浓度组ROS生成量明显减少（P<0.01）,线粒体膜电位明显升高（P<0.01）。JC-1染色后各组在荧光显微镜下观察,对照组红色荧光和绿色荧光视野合并后基本呈现红色荧光,可见散在少许绿色荧光。模型组视野合并后可见大量绿色荧光。通过温肺化纤汤低、中、高浓度预处理后,各处理组视野合并后的绿色荧光逐渐减少,红色荧光逐渐增多。与正常对照组相比,模型组p-Akt/t-Akt比值、c-Nrf2、n-Nrf2及HO-1表达无明显差异（P>0.05）,Nrf-2mRNA、HO-1mRNA相对表达量显着升高（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组的p-Akt/t-Akt比值、c-Nrf2、n-Nrf2及HO-1表达量显着升高（P<0.01）,Nrf-2mRNA、HO-1mRNA相对表达量显着升高（P<0.01）;与低剂量相比,温肺化纤汤的中、高剂量组的p-Akt/t-Akt比值、c-Nrf2、n-Nrf2及HO-1表达显着升高（P<0.01）,Nrf-2mRNA、HO-1mRNA相对表达量显着升高（P<0.01）。4结论基于温法创制的温肺化纤汤可以显着提高细胞活力,减少LDH、MDA生成、增强SOD活性,抑制ROS产生,修复细胞线粒体膜电位,逆转细胞凋亡,从而改善小鼠肺间充质干细胞由H2O2诱导的氧化损伤。其机制可能与激活Akt蛋白磷化,促进Nrf-2核转位,上调HO-1蛋白表达从而正向调控Akt/Nrf-2/HO-1信号通路有关。
闫语多[6]（2017）在《MiRNA-19a和miRNA-19b对梅花鹿鹿茸组织中TGF-βRⅡ调控作用的研究》文中研究表明鹿茸是雄性梅花鹿额骨顶部能够每年周期性脱落与再生的骨质器官,也是哺乳动物中唯一脱落后可完全再生的附属器官。其以惊人的速度每年完全再生一次而不发生任何癌变,这在哺乳动物中是绝无仅有的。因此,鹿茸也就成为了一种研究器官再生及癌症治疗的理想医学模型。鹿茸的周期性发育受到多种因素的调控,包括生长因子、激素、光照和温度等。MicroRNA（mi RNA）是真核生物基因组非编码区转录加工生成的内源性小分子单链非编码RNA,具有局部发夹结构,广泛存在于包括单细胞藻类在内的所有真核生物中,其结构在生物进化过程中表现出了高度的保守性。miRNA与mRNA的3,UTR结合后能够在不影响靶基因mRNA转录的前提下抑制其翻译。超过半数以上的哺乳动物蛋白质非编码区基因受到miRNA的调控。有研究表明,miRNA能够通过调控鹿茸细胞中相关生长因子的表达进而调控鹿茸细胞的增殖。Ⅱ型转化生长因子受体（TGF-βRⅡ）是TGF-β通路中的一种高亲和力受体,其负责接收并传递信号,是一种磷酸化蛋白。mi RNA-17-92基因簇是脊椎动物中一类保守的基因簇,其包含mi RNA-17-3p、mi RNA-17-5p、mi RNA-18a、miRNA-19a、miRNA-19b、miRNA-20a、miRNA-92a等7个成员。有研究表明,miRNA-17-92基因簇对TGF-β通路的信号传递会产生显着影响。但是,目前国内外关于梅花鹿miRNA-17-92基因簇对TGF-βRⅡ的转录调控作用的研究尚未见报道。本研究采集分离梅花鹿鹿茸软骨组织并进行体外细胞培养及软骨细胞的鉴定,利用TargetScan和miRanda两种生物信息学软件联合分析TGF-βRⅡ的3’端非编码区部分序列（3’UTR）,预测能够与其相互作用的miRNA。根据课题组前期制备的梅花鹿鹿茸miRNA芯片对miRNA-17-92基因簇成员进行分析,筛选出在鹿茸顶端软骨及间充质两种组织中差异表达显着的mi RNA。合成TGF-βRⅡ的3’端非编码区序列（3’UTR）,并构建TGF-βRⅡ基因3’UTR野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测以验证miRNA靶基因。再将人工合成的miRNA模拟物转染鹿茸软骨细胞,MTT法检测转染miRNA模拟物后软骨细胞体外增殖速率的变化;Western blot分析梅花鹿TGF-βRⅡ蛋白的相对表达水平及miRNA对IGF-1、TGF-β2等其它细胞生长因子表达的影响。鹿茸软骨细胞鉴定结果表明:成功反转录了梅花鹿软骨特异性基因ColX部分序列,序列长度为1771bp,与GeneBank中报道的梅花鹿ColX基因序列相似性为99%,结合对软骨细胞形态的观察比较,软骨细胞鉴定成功,分离的细胞可以用于后续实验。软件分析结果表明:miRNA-19a和miRNA-19b在TGF-βRⅡ的3’UTR上存在结合位点,鹿茸miRNA芯片分析结果表明:miRNA-19a和miRNA-19b在鹿茸顶端不同组织中存在差异表达,说明mi RNA-19a和miRNA-19b可能会对该mRNA的表达发挥一定影响。为了进一步探讨miRNA-19a和mi RNA-19b对梅花鹿鹿茸TGF-βRⅡ的转录调控作用及其与鹿茸细胞生长的关系,成功构建了含有miRNA-19a和miRNA-19b结合位点的TGF-βRⅡ基因3’UTR野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体。荧光素酶活性检测结果显示:与阴性对照组相比,转染了野生型质粒和两种miRNA的细胞荧光素酶活性明显降低,而转染突变型质粒和两种miRNA的细胞组荧光素酶活性无明显变化。这一结果证明:TGF-βRⅡ是受miRNA-19a和miRNA-19b调控的靶基因,与前期预测结果一致。MTT法和western bloting结果显示,鹿茸软骨细胞的体外增殖受到抑制,TGF-βRⅡ蛋白及IGF-1和TGF-β2等其它细胞生长因子的相对表达水平下降,且呈时间依赖性。
万义文[7]（2016）在《基于股四头肌有限元模型的推拿揉法生物力学参数研究》文中进行了进一步梳理目的：采用ZTC-Ⅰ智能推拿手法参数测试系统采集不同推拿流派揉法力学参数,利用MRI及有限元软件建立股四头肌三维有限元模型,以股四头肌三维有限元模型为载体,模拟推拿揉法在模型上的应力、应变情况,分析不同流派揉法力学参数的异同,为特色推拿手法的传承、教学及规范化研究提供数据支持。方法： 1、揉法力学参数数据采集、分析：采用ZTC-I智能推拿手法参数测试系统采集罗才贵教授、何洪阳教授、彭趣思医师的拇指揉法、大鱼际揉法及掌根揉法的力学参数,并分析各自频率、时间周期及三个方向（Z：垂直、X：水平左右、Y：水平前后）的最大压力值、最小压力值等参数的异同；2、股四头肌三维有限元模型的建立与验证：采用GE Discovery MR 750 3.0T磁共振扫描仪获取健康受试者股四头肌MRI图像,利用Mimics、Geomagic studio、Netfabb Studio、Visual Studio 及 MATL B软件等有限元软件结合股四头肌生物力学特性参数,建立股四头肌三维有限元模型。对模型分别施予2N至40N,步长为2的载荷,对结果进行分析以验证有限元计算程序；在相同载荷与边界条件下,将股四头肌有限元模型应力、位移计算结果与体外实验生物力学研究结果相对比以验证模型的有效性；3、揉法对股四头肌模型应力、应变研究：将采集到的三位测试者揉法实际力学数据进行分析整理,利用计算机数据编程模拟,拟合成计算机力学函数数据,以髌骨上缘5cm,髌骨内侧缘往内旁开2cm（相当于血海穴的位置）为中心点、方向与作用部位垂直、时长为60s、作用面积根据每种揉法每位测试者手的实际接触面积为准,具体分为以下：罗才贵教授、何洪阳教授、彭趣思医师,拇指揉法、大鱼际揉法、掌根揉法范围分别为2×2cm、2×4cm、3×6cm; 2×2cm、2×4cm、3×6cm; 1.5×1.5cm、2×3cm、2.5×5cm九种工况,以血海穴作为观察点,在整个模拟揉法过程中观察该点的应力、应变情况。结果：1、1.1罗才贵教授拇指揉法：频率：165次/min；时间周期：0.36±0.00s；Z峰值（单位：Kg）：0.00±0.00；Z谷值：0.00±0.00；X峰值：0.3±0.02；X谷值：-0.30±0.05；Y峰值：0.37±0.02；Y谷值：-0.71±0.02；罗才贵教授大鱼际揉法：频率：175次/min;时间周期：0.34±0.01s；Z峰值：0.0-0.00；Z谷值：0.00±0.00；X峰值：0.37±0.02；X谷值：-0.44±0.02；Y峰值：0.44-4-0.02；Y谷值：-0.64±0.10；罗才贵教授掌根揉法：频率：178次/min；时间周期：0.3-0.01s；Z峰值：0.00±0.00；Z谷值：0.0±0.00；X峰值：0.37±0.02；X谷值：-0.49±0.08；Y峰值：0.64±0.02；Y谷值：-0.89±0.14；罗才贵教授三种揉法频率基本相近,完成一个揉法所需的时间比较平均（波形稳定）,差异无统计学意义：三种揉法Z轴压力都近乎为0；X、Y峰值、谷值压力差异显着。1.2何洪阳教授拇指揉法：频率：112次／min；时间周期：0.52±0.01 s；Z峰值：0.17±0.01；Z谷值：0.0±0.00；X峰值：0.16±0.02；X谷值：-0.09±0.03；Y峰值：0.10±0.02；Y谷值：-0.16±0.01；何洪阳教授大鱼际揉法：频率：115次／min;时间周期：0.53±0.01s；Z峰值：1.12±0.09;Z谷值：0.91±0.05；X峰值：0.2±0.02；X谷值：-0.24±0.19；Y峰值：0.30±0.02；Y谷值：-0.24±0.19；何洪阳教授掌根揉法：频率：114次／mmin；时间周期：0.53±0.01s；Z峰值：2.09±0.07；Z谷值：1.58±0.07;X峰值：0.15±0.02；X谷值：-0.28±0.06；Y峰值：0.4±0.05；Y谷值：-0.87±0.03；何洪阳教授三种揉法频率基本相近,完成一个揉法所需的时间比较平均（波形稳定）,差异无统计学意义；三种揉法Z、X、Y轴峰值、谷值压力差异显着。1.3彭趣思医师拇指揉法：频率：55次／min;时间周期：1.09±0.01s；Z峰值：0.98±0.02；Z谷值：0.05±0.02；X峰值：0.22±0.02；X谷值：-0.3±0.02;Y峰值：0.21±0.10；Y谷值：-0.85±0.05；彭趣思医师大鱼际揉法：频率：53次／min；时间周期：1.13±0.01s；Z峰值：2.58±0.10；Z谷值：1.10±0.08；X峰值：1.35±0.02；X谷值：-0.37±0.02；Y峰值：1.37±0.04；Y谷值：-1.7±0.03；彭趣思医师掌根揉法：频率：52次／min时间周期：1.15±0.01s；Z峰值：3.08±0.12；Z谷值：1.18±0.11；X峰值：1.15±0.02；X谷值：-0.16±0.02；Y峰值：0.95±0.12；Y谷值：-1.51±0.02；彭趣思医师三种揉法频率基本相近,完成一个揉法所需的时间比较平均（波形稳定）,差异无统计学意义；三种揉法Z、X、Y轴峰值、谷值压力差异显着。三位不同流派测试者三种揉法之间力学参数比较差异极显着（P<0.01）,但各自揉法频率、时间周期、压力值均比较稳定。2、本研究中所建立的正常人股四头肌三维有限元模型共使用了194张MRI图像,共包括13291个点,39867个边,26578个三角形,1个壳。体积881.7707cm3,面积680.2908cm2。在相同载荷下,该模型压缩-位移曲线、应力-应变曲线均与相关文献中的生物力学实验研究结果相似。3、3.1罗才贵教授拇指揉法模型最大应力（单位：KPa）：76.67±7.46;最大应变（单位：mm）：0.80±0.01：罗才贵教授大鱼际揉法模型最大应力：70.00±6.30；最大应变：0.70±0.02：罗才贵教授掌根揉法模型最大应力：97.33±5.94；最大应变：0.98±0.13。三种揉法对比差异显着。3.2何洪阳教授拇指揉法模型最大应力：19.97±1.15；最大应变：0.37±0.02；何洪阳教授大鱼际揉法模型最大应力：145.15±2.13；最大应变：1.00±0.11；何洪阳教授掌根揉法模型最大应力：230.00±4.70；最大应变：1.98±0.13。三种揉法对比差异显着。3.3彭趣思医师拇指揉法模型最大应力：106.87±4.46；最大应变：0.85±0.03；彭趣思医师大鱼际揉法模型最大应力：288.68±5.69；最大应变：2.48±0.14；彭趣思医师掌根揉法模型最大应力：337.23±4.76；最大应变：3.48±0.19。三种揉法对比差异显着。三种流派揉法之间最大应力、最大应变对比均差异显着。结论：1、三位不同流派测试者的三种揉法频率稳定、压力值大小各有不同,反映了各自的临床推拿特色；2、本研究所构建的正常人股四头肌三维有限元模型反映了股四头肌的解剖形态及生物力学特性。该有限元模型具有有效性,能够应用于不同流派揉法生物力学参数的研究；3、三个流派揉法股四头肌有限元模拟下的应力-应变与载荷在一定程度内成正比关系,验证了三个流派揉法的力学参数特点,为特色推拿手法的传承、教学及规范化提供了有力的依据,为手法基础研究提供一个更好的思路和方法。
邱亦江[8]（2016）在《骨痹颗粒治疗膝骨关节炎肾虚络痹证的临床探析与实验研究》文中指出目的：通过观察骨痹颗粒对KOA大鼠软骨细胞病理组织学和血清中SOD、MDA、NO、IL-1β的影响,以探求骨痹颗粒治疗KOA的作用机制,为深入研究提供帮助；通过对骨痹颗粒治疗典型KOA案例的探析,进一步说明其有效性及安全性,为本药后续广泛应用于临床奠定基础。方法：将40只SD大鼠经改良Hulth法进行手术复制大鼠KOA模型,并采用随机分组分成模型组、阳性对照组（塞来昔布胶囊组）、骨痹颗粒低剂量组、骨痹颗粒中剂量组、骨痹颗粒高剂量组,各8只；另正常组和假手术组（各8只）不造模。术后各组大鼠连续1周予肌肉注射8×104U青霉素（1 mL/kg）,进行抗感染治疗。抗感染治疗1周后,每日驱赶迫使各组大鼠活动1次,每次时间为30 min,总共需持续8周。同时术后第2日,予相对应药物进行每组大鼠灌胃给药,给药量按照人与动物体表面积等效剂量进行换算,正常组、模型组和假手术组不予骨痹颗粒灌胃,予相对应量的0.9%Nacl灌胃,总共需持续给药8周。8周后,于颈总动脉处采血,离心取血清后并按照各指标测试盒使用说明操作后,计算出各组中SOD、MDA、NO、IL-1β的含量。病理观察标本取各组大鼠右侧股骨内踝关节软骨,使用10%甲醛溶液固定,将软骨病理切片经HE染色,待专业病理学人员观察。结果：骨痹颗粒可改善大鼠膝关节软骨损伤评分,有效地防止关节软骨的损伤,保护关节软骨和滑膜的正常形态。观察骨痹颗粒对KOA大鼠血清中SOD、MDA、NO、IL-1β的含量的影响显示,与模型组比较,骨痹颗粒中剂量组和骨痹颗粒高剂量组中SOD含量明显增加（P<0.01）,而MDA、NO的含量在骨痹颗粒中剂量组中明显降低（P<0.01）。另骨痹颗粒各剂量组中IL-1β含量与模型组相比较而言均明显减少（P<0.05）。阳性对照组和骨痹颗粒各剂量组对大鼠SOD、MDA、NO、IL-1β含量的影响无统计学差异（P>0.05）。结论：实验研究结果可见,骨痹颗粒具有明显增多体内SOD含量,加强自身清除MDA、NO的能力,减少机体内IL-1β释放,进而有效保护软骨细胞免受损伤,改善软骨细胞病理组织学形态,促进软骨细胞增殖和基质修复,阻止病情进一步发展的作用。临床上骨痹颗粒具有明显的抗炎止痛作用,能有效地减轻患者膝关节疼痛症状,促进膝关节功能的恢复,高安全性地改善患者生活质量。
卢泽平[9]（2014）在《人前列腺间充质干细胞的生物学特性及其多分化潜能研究》文中认为引言：人类组织间充质干细胞（hMSCs, human mesenchymal stem cells）是一类非造血系的基质或间充质祖细胞,它可以自我更新并分化成为多种不同的间质组织,包括骨、脂肪、肌肉以及软骨,其中从骨髓中提取的hMSCs又叫骨髓基质细胞。近年来由于人们发现它有和胚胎干细胞类似的多分化潜能,同时在体外实验中易于提取和扩增,以及它潜在的医疗和科研价值,已经引起了研究者们广泛的关注。在本研究的实验构思中本研究相信其中前列腺基质细胞在良性前列腺增生和前列腺癌中提供了肿瘤发生、发展以及治愈过程中的生态位和细胞微环境。同时基质细胞在局部形成了一个内皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞以及成骨细胞的前体池,该前体池或许包含了最原始的间充质干细胞,即本研究假设出的多潜能基质细胞人前列腺间充质干细胞（hPMSCs, human prostate-derived mesenchymal stem cells）。相对于前列腺上皮干细胞的相关研究本研究对hPMSCs它的生物特性依然比较模糊,甚至hPMSCs这一名称在内外文献中尚未见报道。这可能是由于本研究发现和分离hPMSCs的方法不同,分离后对hPMSCs的处置不同,以及hPMSCs尚无可以作为金标准的特异的细胞分子表面标志物,加之来源于不同病患和不同部位的hPMSCs自身也存在差异,最后还有研究hPMSCs分化潜能的诱导途径也不一致,导致hPMSCs这一概念由于过于混沌而尚未建立起来。因此目前国内外尚无人在这一领域发表成果。本研究的实验对象和目的正是探索和研发从人良性前列腺增生组织基质分离人类前列腺间充质干细胞的方法,从而鉴定出它们独有的生物学特性。希望通过本研究使本研究从hMSCs中衍生出“前列腺间充质干细胞hPMSCs"的概念,从而探索出一条研究前列腺肿瘤发生、诊断和治疗的途径并丰富人组织来源间充质干细胞的概念。实验目的：通过本实验本研究期待解释以下科学问题：1)证实人前列腺hPMSCs的存在并鉴定出人前列腺hPMSCs基本生物学特性。2)通过从以下各种分选方式得到的人前列腺间充质单核细胞亚群,贴壁粘附法人前列腺间充质单核细胞亚群,免疫磁珠阳性分选单一抗原CD105, CD133和CD271人前列腺间充质单核细胞亚群各自分别建立起单一纯化的人前列腺hPMSCs,同时摸索出其标准的体外培养条件。3)研究和比较各hPMSCs亚群向内胚层成骨细胞以及脂肪细胞和外胚层神经细胞分化的潜能。4)通过实验证实CD133和CD271单克隆阳性分选的hPMSCs可以作为理想的前列腺疾病研究临床和科研的种子细胞,表面抗原CD133和CD271也就是分离人前列腺间充质干细胞最有效率的表面标志物。同时为人前列腺来源的hPMSCs的培养和体外干细胞活性的维持提供实验方法和依据,为研究hPMSCs与前列腺肿瘤的发生,发展以及治疗奠定基础。材料和方法：本实验以接受了前列腺电切术后（TURP）病人增生的前列腺组织标本,所有标本的获取均得到了英国爱丁堡大学医学伦理学委员会的认证。获取的前列腺组织标本经过Percoll液（d=1.073g/m1）提取出了hPMNCs细胞混悬液之后并培养扩增到第一代之后,hPMNCs被分成了3份（3/5,1/5和1/5）,其中的3/5本研究平均的分成了3份,这3份前列腺单核细胞本研究分别用CD105、CD133和CD271单克隆抗体阳性免疫磁珠进行分选,而其余的一个1/5本研究直接用粘附贴壁法分选出了PA前列腺单核细胞亚群,另一个1/5本研究直接将它培养到第三代作为对照细胞株。通过以上的处理本研究分别获得了5个亚群的细胞,之后本研究将分选出的各细胞亚群接种在T75培养瓶内,给予完全培养基CCM （Complete Culture Medium）培养到第三代（P3）。为了保持对照实验结果评估的一致性,本研究将所有五个前列腺间充质干细胞分选亚群（前列腺单核细胞亚群,PA前列腺单核细胞亚群以及单克隆抗体阳性CD105、CD133和CD271阳性亚群）在体外培养到第三代（P3）。通过不同的分选流程得到了可稳定传代的以下五个细胞亚群：贴壁粘附法人前列腺间充质单核细胞亚群,免疫磁珠分选单一抗原CD105,CD133和CD271和人前列腺间充质单核细胞亚群并分别对它们的生物特性进行了系统性的研究,并同时探讨了它们在体外向内胚层成骨细胞以及脂肪细胞和外胚层神经细胞分化的潜能（通过比较各亚群茜素红S和油红0染色能力以及免疫荧光照相和PCR分析）,各部分的实验方法概要如下：成纤维细胞样克隆生成单位计数（Colony forming units-Fibroblast,CFU-F）：为了测定该五个亚群间充质干细胞形成成纤维样集落克隆的能力,以上五个细胞亚群均消化后重新种植在成纤维细胞样克隆生成培养液MACS NH CFU-F Medium （Miltenyi Biotec Co, Germany, order no130-091-676）中9天并被种植在1%凝胶镀膜过的六孔板内。在第9天六孔板被以蒸馏水漂洗,之后以甲醇固定并且用结晶紫细胞染液进行大体染色同时克隆形成单位被计数统计（成纤维集落克隆形成单位的能力代表了非造血系干细胞其生长以及分化的能力）。流式细胞仪检测（Flow Cytometry,FCM）:这四个细胞亚群的膜表面标志物,本研究使用BD公司生产的鼠抗人细胞膜抗体,其中特异性的间充质干细胞抗体包括CD73、CD44、CD105、CD90和CD166以及造血系干细胞膜表面标志物CD14,CD34以及CD45。总的来说本研究将1×105个细胞洗脱下来并在黑暗中在4。C孵育30mins。孵育后的细胞被重新漂洗同时使用Coulter FACS XL-MCL流式细胞仪进行检测。成骨分化诱导：为了揭示间充质干细胞成骨分化的能力本研究从以上各亚群的1×105个前列腺间充质干细胞中分别置于德国美天旎生物公司的非造血系成骨分化培养液（Miltenyi Biotec, Germany,order no.130-091-678）的6孔板中。所有这些细胞每3天换液1次并连续培养四周,本研究从第9天开始可以观察到为了评价各亚群成骨分化的能力培养板,首先以磷酸盐缓冲溶液漂洗干净之后在每孔中滴入4%多聚甲醛两mins进行固定,最终以蒸馏水洗净。培养板在茜素红染液中漂染一mins,最终以乙醇溶液清洗干净从而获得生成的磷酸钙结节（红色）并进行美国Dynex公司MRX（?）酶标仪OD值读取。成脂分化诱导：为测定以上各的亚群细胞成脂分化潜能,本研究在六孔板中分别放入1×105个洗脱下的细胞,将细胞更换非造血系成脂分化培养液（130-091-677）。所有细胞每周换液两次并连续培养四周,之后以油红将细胞中的脂滴进行染色,洗脱后以美国Dynex公司MRX（?）II酶标仪进行0D值读取比较其各组成脂分化能力。神经分化诱导：为了检测CD271单克隆抗体阳性分选亚群向神经分化的潜能,1×105个细胞被平均的种植于12孔板。同时种植后给予更换成非造血系N2B27培养液（Stem Cell Sciences Co, USA, Catalogue Number:SCS-SF-NB-02）先预培养48小时,以保证细胞对分化培养液的适应。之后本研究在更换的N2B27培养液中加入NGF（神经生长因子,30ng/m1）,FGF-b（纤维母细胞生长因子-b,20ng/m1）以及RA（全反式维甲酸,0.5ug/m1）。在培养的48及72小时后将每组中的一个培养板分别进行荧光染色固定从而测它们表达GFAP以及NESTIN的表达,其表达的效率本研究通过荧光染色显微镜来观察。荧光染色处置中,本研究先将培养板以磷酸盐缓冲溶液清洗,之后使用4%的甲醛溶液中固定5mins,最终以蒸馏水漂洗干净。染色阶段,第一步细胞被固定并且用非特异性蛋白进行阻滞。第2部两个抗体被分别的加入到之上不同亚群的培养孔中。最终细胞都与荧光标记的第二级抗体共同作用30mins从而将目的基因蛋白在荧光显微镜下标识出来。实验结果：在此研究中本研究综合评价了五个细胞亚群：①未纯化的前列腺基质单核细胞hPMNCs。②粘附贴壁法分选得到的hPMSCs。③细胞表面标志物CD105阳性前列腺基质单核细胞CD105-hPMSCs。④细胞表面标志物CD133阳性前列腺基质单核细胞CD133-hPMSCs。⑤细胞表面标志物CD271阳性前列腺基质单核细胞CD271-hPMSCs。通过对以上五个细胞亚群之间以下等项目的比较：（1）细胞生长特性。（2）成纤维细胞样克隆生成单位（Colony forming units-Fibroblast,CFU-F）的效率比较。（3）对各细胞亚群间充质干细胞相关标志物表达（CD105,CD166, CD34, CD271, CD73, CD105, CD45, CD14）的测定。（4）比较以上五个细胞亚群它们成脂、成骨、成神经体外分化的潜能以及效率。结果罗列如下：免疫磁珠分选结果：经过本研究的实验证实了免疫磁珠体外纯化人前列腺间充质单核细胞中CD105,CD133和CD271阳性细胞亚群的可行性,本研究取良性前列腺增生患者前列腺电切标本并制备单细胞悬液,采用免疫磁珠分选法分选出CD105,CD133和CD271阳性细胞亚群,并在镜下使用台盼蓝细胞染色观察分选前后的细胞活力,并用流式细胞测定纯化前后CD105,CD133和CD271的阳性表达率。本研究发现通过免疫磁珠单克隆抗体分选后所得CD105细胞纯度为（97.3±1.86）%,通过免疫磁珠单克隆抗体分选后所得CD133细胞纯度为（88.3±3.06）%通过免疫磁珠单克隆抗体分选后所得CD271细胞纯度为（89.5±1.8）%。纯化前后的间充质细胞活力无统计学差异（P>0.05）。因此本研究得出结论,应用CD105,CD133和CD271作为hPMSCs的分子表面标志及德国美天旎生物公司（Miltenyi Biotec Co, Germany）的免疫磁珠分选系统可从人良性前列腺增生患者前列腺电切标本直接分选得到高纯度的CD105,CD133和CD271阳性前列腺间充质干细胞,同时该分选系统处理的细胞活力在分选中不受影响。通过显微镜下细胞形态学观察：本研究分选出的5个hPMSCs前列腺间充质干细胞亚群均具有人类组织间充质干细胞基本的生物学特性,在显微镜下大多数细胞呈现小梭形,核仁明显,其中细胞核较大,而且混杂的扁平的细胞极少。本研究在体外给予10%胎牛血清FBS加α-MEM培养,在细胞生长到80%融合时传代,其各亚群细胞在体外传代35pd,生长状态仍然良好。当细胞融合接近100%时呈现旋涡状或平行排列。本研究取第三代的hPMSCs来绘制细胞生长曲线,经计算其对数生长期倍增时间约为26±2.3小时。成纤维细胞样克隆生成单位结果：本研究将分选出的五个前列腺间充质干细胞亚群分别培养在六孔板内,用德国美天旎生物公司非造血系成纤维细胞样克隆生成培养液培养9天。结果本研究观察到免疫磁珠分选得到的CD271和CD133阳性亚群获得了最多的成纤维细胞样克隆生成单位（Colony forming units-Fibroblast, CFU-F）数,分别是51±7.31and76±10个集落生成,它们的克隆集落数与MNC相比多了3倍以上而且CD271和CD133它们的融合速度也远远快于其他三个细胞亚群。流式细胞术结果：本研究分选出的hPMSCs高表达间充质基质细胞表面标志而不表达造血系的表面标志。流式细胞仪检测体外扩增第3代的细胞,结果显示它们均不表达CD14,CD45,而高表达CD73,CD90,CD105,CD166,以及表达基质细胞的分子标志CD44,不表达造血干细胞的分子标志CD34,也不表达CD45和CD14。hPMSCs成骨和成脂分化：本研究取P3代的各亚群hPMSCs细胞在德国美天旎生物公司（Miltenyi Biotec Co,Germany）的成脂和成骨分化液中分别培养28天和9天后观察其内的脂滴和该结节形成并且通过油红0和茜素红染色后洗脱进行定量比较,本研究发现结果和它们的增殖能力一致,CD271和CD133亚群的成脂和成骨能力远高于其他三个亚群。在本研究的实验中CD271阳性免疫磁珠分选hPMSCs亚群可在体外诱导分化为外胚层的神经干细胞和神经胶质细胞。体外诱导神经细胞的条件是N2B27培养液中添加3Ong/ml的β-NGF,20ng/ml的FGF-b和0.5ng/ml的RA。在培养48小时后细胞形态学发生改变,一些细胞的胞质收缩,细胞体内向外伸出双极和多极的长突出。在有些细胞中可以观察到生长锥以及丝突样的结构,免疫组化荧光结果显示分化后的细胞表达神经祖细胞特异性的标志物GFAP和Nestin。本研究应用荧光抗原标记的方法通过免疫荧光显微镜观察到GFAP和Nestin荧光染色阳性细胞,同时通过聚合酶链式反应PCR（Polymerase Chain Reaction）发现神经分化细胞表达GFAP和Nestin,以上这些细胞形态学改变和免疫检测结果表明本研究培养的hPMSCs同样可以在合适的条件下分化成为神经胶质细胞和神经元细胞。同时本研究观察到经过以上诱导出的神经细胞在两周后仍然有60%以上的存活率。本研究使用PCR的方法研究在新鲜获得的CD271阳性免疫磁珠分选亚群成神经分化后表达神经祖细胞早期的特异性标志物（Nestin）和晚期特异性标志物（GFAP）的水平,本研究发现在CD271阳性亚群中CD271和以上两个特异性标志物均有表达而且有价值的是这两个标志物在对照组（未分化组）中均无表达。总之本研究所获得的前列腺间充质干细胞在体外诱导条件具有向内胚层成骨细胞以及脂肪细胞和外胚层神经细胞分化的潜能。综合实验的结果证实本研究培养的前列腺间充质细胞可以被称为前列腺间充质干细胞（hPMSCs）。1)在液氮冻存12个月后复苏测试,冻存的HphMSCs生长状态良好,镜下是均一的小梭形CFU-F显示克隆形成能力仍然很高。2)它们高表达间充质干细胞的各细胞表面分化抗原,而且不表达造血系干细胞的细胞表面分化抗原。3)它们在体外诱导条件可以向内胚层成骨细胞以及脂肪细胞和外胚层神经细胞分化的潜能（通过比较各亚群茜素红S和油红0染色的能力）。由于以上三项均符合本研究对于人组织间充质干细胞的要求,所以本研究认为本研究得到的前列腺基质提取细胞可以被称为前列腺间充质干细胞（hPMSCs）.统计学处理：所有细胞增殖的数据,细胞克隆形成单位,以及相关抗体阳性表达率,0D值读数本研究均通过均数加减标准差x±s进行纳入。各细胞亚群之间的不同本研究进行学生T检验,多组均数间比较进行单因素方差分析,其中方差不齐数据进行非参数检测。所有的统计学分析结果应用SPSS11.5统计软件进行分析（芝加哥,美国）。P<0.05被认为有统计学意义。结论和讨论：本研究第一次综合利用了hPMSCs的密度离心法获得了前列腺间充质单核细胞hPMNCs,利用贴壁生长特点获得了贴壁粘附法人前列腺间充质单核细胞亚群PA-hPMSCs,用改进了的免疫磁珠分选法建立了单一纯化的人前列腺间充质干细胞hPMSCs细胞系,免疫磁珠分选CD105,CD133以及CD271单克隆阳性细胞亚群,这五个细胞亚群在体外可以长期稳定增殖并保持分化潜能。本研究的实验结果第次证实了在人前列腺中同样存在人类组织间充质干细胞,它的生长特性类似骨髓干细胞和胎盘干细胞。而且本研究得到的前列腺hPMSCs在经过多次传代或者长期冻存后依然可以维持他旺盛的生长并依然可以分化成神经细胞、成骨细胞和脂肪细胞。至今最常用最经典的是Friedenste.A.J.（1970）和Gronthos.S.（2003）等研究者在体外培养的一些贴壁粘附法分离出的基质细胞可以有克隆集落样生长即可以获得成纤维细胞样克隆生成单位（Colony forming units-Fibroblast, CFU-F）,通过进一步研究他们发现这样获得的细胞是混杂细胞系,其中只有一部分从克隆株团中针挑出的培养细胞可以有间充质干细胞杨的多分化潜能,即PA-hPMSCs.就像其他提纯法获得的间充质干细胞,通过粘附贴壁法只可以从人组织中分理出比较混杂的包含间充质干细胞的多个细胞系,通过对这一经典方法获取的细胞和其他分选方式得到的细胞亚群的对比试验本研究期待了解它的基本生物特征。在本研究我们一一比较了对不同分选机制下得到的五个hMSCs亚群不同的增殖活性和分化潜能,本研究的数据揭示了应用不同的分选机制得到的前列腺hMSCs表达不同的生长能力、分化潜能以及不同水平的分化抗原表达,通过阳性分选机制得到的CD271和CD133亚群它们的克隆形成能力是其他亚群的三倍,而且它们的增殖速度也远远快于其他三个亚群,这一可能的机制是因为这两个细胞亚群中细胞的异质性最低,细胞谱系比较单一,这一建议干细胞的活性也许有可能会被其他混杂细胞所抑制。同时低密度种植对于间充质干细胞的增殖很有好处揭示也许细胞过早的融合会导致接触抑制。但在培养过程中本研究发现与初始P0代提纯的CD271单克隆抗体阳性分选亚群和CD133单克隆抗体阳性分选亚群,它们中CD271和CD133的表达在传到第三代的时候将会大量丢失。可能的解释是CD271和CD133阳性分选细胞可以通过分化出CD271和CD133阴性细胞得以保存自身的干细胞活性。通过本研究在体外长期培养获得的数据本研究发现CD271单克隆抗体阳性分选亚群和CD133单克隆抗体阳性分选亚群包含有最少的造血系细胞混杂,通过CD45的流式细胞仪检测发现其表达最低的阳性率（分别为1.66%和2.17%）。而CD105相对HPMNC和PA-hPMSCs有中间水平的CD45表达（4.39%）,也许这种CD45的低表达可以解释CD271单克隆抗体阳性分选亚群和CD133单克隆抗体阳性分选亚群在本研究中最高的增殖活性和分化潜能。综合以上两点因此本研究认为作为人前列腺间充质干细胞理想的分离和鉴定表面标志物是应该能最大程度的代表那些极少存在于基质中的同时又基本上不表达造血系细胞表面标志物的那些多潜能干细胞,本研究的研究结果表明通过免疫磁珠单克隆富选下的CD271和CD133表达阳性亚群是所有目前已知选项中拥有最强自我增殖能力和分化能力的前列腺间充质干细胞亚群。作为前列腺间充质干细胞研究的前沿对干细胞分选和培育的金标准的建立迫在眉睫,本研究的研究展示了对于人前列腺间充质干细胞从人的阳性前列腺增生良性术后标本这一免疫磁珠为基础的目的基因标志分选方法是可行的,本研究的数据显示CD271即低亲和力神经生长因子受体（Low affinity nerve growthfactor receptor,LNGFR）以及CD133可以作为可行的分选标志物来富集人前列腺间充质干细胞。在最后本研究所使用的这项方法亦可完全被复制到分选前列腺癌间充质干细胞中去。本研究同样显示了通过CD133和CD271单克隆阳性分选的hPMSCs可以作为理想的前列腺疾病研究临床和科研的种子细胞,并为人前列腺hPMSCs的培养和体外干细胞活性的维持提供了实验方法和依据,为研究hPMSCs与肿瘤研究奠定了基础。
高燕[10]（2013）在《三水白虎汤抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的作用靶点研究》文中研究说明研究背景类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎症为中心病理的自身免疫病,其突出病理特点是滑膜增生并侵蚀关节软骨和骨质,最终导致关节破坏畸形。RA滑膜成纤维细胞（fibroblast-like synoviocyte, FLS）大量增生并伴随大量炎症细胞浸润和新生血管形成是滑膜增生的基础,而RA-FLS增生的机制主要有二类,一是受多种致炎因子所驱动的炎症性增生（被动性增生）,这其中肿瘤坏死因子-a（TNF-a）起到主要作用；二是由于RA-FLS本身的细胞生物学特点发生改变,生长周期调控机制障碍,出现类似肿瘤样转化的转化细胞特征所致（主动性增生）。RA-FLS与正常人和其它关节炎滑膜细胞相比,其生物学特点产生了明显的转化细胞特征。RA的治疗目标近年来已逐渐集中到真正阻断滑膜增生和骨质侵蚀方向,即所谓阻断病情进展。近年来针对致炎因子所致的被动性增生治疗靶点的生物制剂研究取得了较多成果,当前广泛应用的TNF-a拮抗剂能显着控制RA的症状,并部分阻断滑膜增生进程；IL-1拮抗剂已经在临床上用于RA的治疗,还在临床试验阶段的如IL-6、IL-17拮抗剂也显示出良好的治疗效果。同时处于实验阶段的转基因治疗方法即是以抑制或阻止RA-FLS主动性增生为目标,也已显示出良好的治疗效果。如转染fasl及fas相关性死亡决定蛋白（FADD）、NF-kb抑制蛋白（IkappaB）基因、阴性突变型原癌基因raf和myc等能诱发滑膜细胞大量凋亡,滑膜增生和软骨侵蚀显着受抑,甚至滑膜组织消失。类风湿关节炎属于中医“痹病”、“历节”范畴。活动期中医病机主要是湿热痹阻、痰凝血瘀。根据上述病机以及我们多年的临床经验,研制了三水白虎汤,由《千金》犀角散《广济》白虎方化裁而来,主要药物有其药物组成有：生地、水牛角、丹皮、寒水石、知母、青蒿泄热透毒；虎杖、苡仁、白芥子、独活、细辛除湿消肿；桑枝、鸡血藤、蜈蚣、全蝎、地龙、南蛇藤、甘草通络止痛。全方共奏清热透毒、除湿消肿、通络止痛之功效。该方目前在我科广泛应用于RA、OA、成人Still’s病以及少年类风湿关节炎（包括系统型及少关节类型）活动期的治疗,并取得了不错的临床治疗效果。一直以来,我们对该方进行了一系列的研究,从既往的药理结果分析,该方的作用机制无疑是多途径、多层次干预RA免疫炎症的反应的多个环节。既能抗炎镇痛、又能抑制免疫,同时还有一个重要的作用是抑制滑膜成纤维细胞的增殖。三水白虎汤抑制RA-FLS增生的途径可能既能抑制炎症驱动的被动增生,又能抑制RASFs因转化而出现的主动增生。根据我们前述的研究结果,三水白虎汤抑制被动增生的作用靶点可能主要是抑制了TNF-a的生成,并抑制了TNF-α下游信号传导分子NF-kβ和p38MAPK信号通路。但复方中药的药理作用具有多靶点性,三水白虎汤抑制RA-FLS主动增生及被动性增生的其它靶点仍未明。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生,细胞代谢等过程的整体而全面的认识,蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同,对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。蛋白质组学技术是基于蛋白质组学研究而发展起来的研究蛋白质生物化学性质的一系列新兴技术,通过在蛋白水平上对机体在生理和病理状态下蛋白质表达的不同以及对相关蛋白进行分类鉴定,进而从蛋白质水平上阐明疾病的发生、发展及转归的机制。通过将混合物中的蛋白质分离出来,再对这些不同蛋白质进行鉴定和比较,从而确定其浓度差异和（或）转录后修饰的差异。蛋白组学研究中的三大支撑技术为双向电泳、生物质谱、计算机图像分析与大规模数据处理技术。蛋白质组学技术的应用为RA的研究提供了一个新的手段。近几年来,国内外学者应用双向凝胶电泳（2-DE）和质谱技术对RA患者血清、血浆、滑液、滑膜组织及滑膜细胞进行蛋白质表达的种类和含量的研究,获得RA患者与健康对照人群间差异表达的蛋白质,并对某些蛋白进行了功能分析,从而推测RA早期诊断的可能生物标志。蛋白质组学这一研究手段在国内的复方中药药理研究中已有诸多报道,利用该技术对中药复方进行多靶点的高通量筛选,可以将中药复方的多组分、多靶点、多途径特点与蛋白质表达相关联。另一方面通过蛋白质表达谱的差比性分析,还可以揭示中药复方的作用靶点、作用环节和作用过程,发现复方中的有效成分及各成分间的协同关系,进一步实现复方的优化组合。一系列的研究成果对我们利用蛋白质组学技术开展对复方三水白虎汤治疗RA的药理研究具有重要借鉴意义。同时在试图阐述中药治疗RA的改善病情作用机理的实验研究中,既往有不少工作观察了中药及复方对体外滑膜细胞培养、多种细胞因子以及信号传导通路的影响,但这些作用更多只是结果,并不是真正的药物作用靶点。本项目首次以筛选三水白虎汤作用于RA滑膜细胞的靶点蛋白为目标。同时鉴于复方中药的药理作用具有多靶点性,这也是复方中药药理研究的难点,为了缩小筛选范围,本研究围绕SSBH抑制RA-FLS增生这一重要药理环节来寻找靶点,这样既突出了SSBH的优势,又大大增加了技术上的可行性。本研究通过三水白虎汤含药血清干预类风湿关节炎（RA）、骨关节炎（OA）患者的关节滑膜成纤维细胞,观察该方对细胞增殖抑制情况,同时通过检测培养细胞上清中IL-6、IL-17水平及双向凝胶电泳结合质谱技术分析含药血清干预后FLS蛋白表达图谱,并筛选出与正常对照的差异表达蛋白质点,寻求该方抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的作用靶点,进一步探讨该方治疗类风湿关节炎的作用机制。第一章三水白虎汤对关节炎滑膜成纤维细胞增殖的影响研究目的观察三水白虎汤（SSBH）含药血清对体外培养的滑膜成纤维细胞（FLS）增殖的影响,探讨SSBH治疗RA的作用机制。材料和方法滑膜组织来自南方医院脊柱骨科收治行膝关节置换术确诊的RA、OA患者共6例（每组3例）。组织块培养法收集RA、OA患者的关节FLS,体外培养传代,并通过倒置显微镜、流式细胞术、免疫细胞化学染色等方法进行鉴定。取3-6代细胞,MTT法连续检测不同浓度（10%-30%）的含药血清干预不同时间（24、48、72h）后对FLS增殖的影响,并绘制细胞生长曲线。以来氟米特和生理盐水含药血清作对照。统计学处理：采用SPSS13.0软件进行分析,用均数加减标准差（x±s）表示,多组间均数的比较采用One Way ANOVA单因素方差分析,多组间均数的两两比较采用Bonferroni法。a=0.05。结果1.FLS的原代培养采用组织块培养法2-3d后见长梭型FLS从组织块边缘游走生长,并逐渐增多呈放射状,一周后细胞生长迅速,约2-3W长满培养瓶底的70%-80%。2.FLS的鉴定在倒置显微镜下,所培养（RA、OA）细胞形态符合成纤维细胞的形态特征,呈纺锤状、星形或梭形,部分可呈大多角形。细胞核边界清楚,呈卵圆形,位于细胞的中间,核仁清晰。Vimentin、CD68免疫细胞化学染色结果显示Vimentin染色阳性,胞浆内见大量棕黄色颗粒,CD68染色阴性。流式细胞术检测FLS CD55+细胞百分率为（98.44±2.29）%。3.MTT法检测FLS的增殖率MTT结果显示SSBH含药血清可呈剂量和时间依赖性抑制RA、OAFLS的增殖。不同浓度（10%～30%）的SSBH干预FLS72h后,RA-FLS细胞增殖抑制率分别为11.7%、42.9%、42.7%（p<0.001）；OA-FLS细胞增殖抑制率分别为24.9%、47%、48%（p<0.001）；20%的含药血清干预FLS不同时间（24、48、72h）后,RA-FLS细胞增殖抑制率分别为11.3%、28.4%、42.9%（p<0.001）；OA-FLS细胞增殖抑制率分别为11.7%、33.9%、47%（p<0.001）。不同浓度（10%～30%）的来氟米特（LEF）干预FLS72h后,RA-FLS细胞增殖抑制率分别为9.9%、39%、38%（p<0.001）；OA-FLS细胞增殖抑制率分别为26.8%、40%、40.8%（p<0.001）；20%的来氟米特（LEF）干预FLS不同时间（24、48、72h）后,RA-FLS细胞增殖抑制率分别为15.5%、22.3%、39%（p<0.001）; OA-FLS细胞增殖抑制率分别为11.2%、26.1%、40%（p<0.001）。无论是来源于RA还是OA, SSBH和LEF含药血清作用于滑膜成纤维细胞48h后即表现出对细胞增殖的显着抑制作用,72h达到高峰。对两种来源的FLS, LEF与SSBH含药血清的抑制效率大致相当（p>0.05）。结论中药复方三水白虎汤能有效抑制关节炎滑膜成纤维细胞的增殖,这可能是该方治疗类风湿关节炎的作用机制之一。第二章三水白虎汤对关节炎滑膜成纤维分泌IL-6、IL～17的影响研究目的观察三水白虎汤（SSBH）含药血清对体外培养的关节炎（RA、OA）患者滑膜成纤维细胞（FLS）分泌IL-6、IL-17的影响,探讨该方治疗类风湿关节炎的作用机制。材料和方法组织块培养法收集RA、OA患者的关节FLS,体外培养传代,取3～6代细胞,加入20%含药血清培养72h后收集各培养细胞上清液,以来氟米特和生理盐水含药血清作对照。ELISA法检测上清液中IL-6、IL-17的水平。操作严格按照试剂盒操作说明进行。最后于全自动酶标仪读取A450值,根据标准反应曲线求得样品IL-6、IL-17的水平。统计学处理：采用SPSS13.0软件进行分析,用均数加减标准差（x±s）表示,α=0.05。结果SSBH和来氟米特（LEF）均可显着抑制RA-FLS上清液中IL-17的含量,与生理盐水（NS）对照组比较有显着性差异（p<0.001）；但SSBH与LEF两组比较没有显着差异（p>0.05）。SSBH与LEF对RA-FLS上清液中的IL-6含量却无显着影响（p>0.05）。SSBH含药血清对OA-FLS的IL-6和IL-17分泌量均未见明显影响（p>0.05）。结论中药复方三水白虎汤能显着抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞分泌IL-17,这可能是该方治疗类风湿关节炎的药理机制之一。第三章三水白虎汤抑制关节炎滑膜成纤维细胞增殖的蛋白质组学研究研究目的应用蛋白质组学技术分析三水白虎汤（SSBH）含药血清对体外培养的关节炎（RA、OA）滑膜成纤维细胞（FLS）蛋白表达差异并对差异蛋白加以鉴定,以期探寻SSBH抑制FLS增殖所表现出功能特性的分子基础,进一步探讨该方治疗类风湿关节炎的作用机制。材料和方法组织块培养法收集RA、OA患者的关节FLS,体外培养传代,取3～6代细胞,加入20%SSBH含药血清培养,以加入生理盐水制备的血清作对照,培养72h后,提取细胞总蛋白,用双向凝胶电泳（2-DE）分离细胞总蛋白,凝胶经银染显色和图像数据分析识别差异蛋白位点；将这些差异点进行胶内原位酶解及利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行鉴定。结果RA患者和对照组FLS的2-DE图谱分别显示出833、859个蛋白质点。OA患者和对照组FLS的2-DE图谱分别显示出936、968个蛋白质点。对二者相互匹配的蛋白质点进行差异分析,以差异量大于3倍的表达量为准,在RA-FLS中初步筛选出16个差异表达的蛋白质斑点,其中表达上调和高丰度表达的蛋白有7个,下调表达的9个。在OA-FLS中初步筛选出24个差异表达的蛋白质斑点,其中表达上调和高丰度表达的蛋白有11个,下调表达的13个。将这些差异点进行MALDI-TOF-MS分析,成功鉴定出26个点,其中在RA-FLS中,SSBH下调Centrosomal（中心体蛋白）；GSS（谷胱甘肽合成酶蛋白）；Microtubule-associated serine/threonine-protein（微管相关性丝氨酸/苏氨酸蛋白）；Desmoplakin（桥粒斑蛋白）；Interleukin-3receptor（IL-3受体蛋白）；DST（肌动蛋白结合蛋白）；Exocyst （泡外蛋白）；Centrosome-associated（中心体关联蛋白）；上调Protein OS-9; Sorcin（抗药蛋白）；Interleukin-1receptor antagonist（IL-1受体拮抗蛋白）等蛋白的表达。在OA-FLS中,SSBH下调Sulfatase-modifying factor2（硫酸酯酶修饰因子2）; Coiled-coil domain-containing protein（卷曲螺旋包含域蛋白）；Desmoplakin （桥粒斑蛋白）；Centromere-associated（着丝粒相关蛋白）；Sickle tail protein homolog（镰刀尾蛋白同系物）；acidic ribosomal（酸性核糖体蛋白）；上调Myosin-Ic （肌球蛋白-Ic）; RABGAP1L （Rab蛋白GTP酶激活蛋白1）; Centrosomal （中心体蛋白）；Rootletin（小根蛋白）；inosine triphosphate pyrophosphatase（肌苷焦磷酸酶）；Myosin-Ⅲa（肌球蛋白Ⅲa）；Translocon-associated protein subunit delta （易位子相关蛋白亚基）；dioxygenase（双加氧酶）；Coiled-coil domain-containing（卷曲螺旋域包含蛋白）等蛋白的表达。结论三水白虎汤含药血清干预关节炎滑膜成纤维细胞后,11个蛋白在RA滑膜成纤维细胞中表达明显变化,15个蛋白在OA滑膜成纤维细胞中表达明显差异。这些蛋白涵盖结构蛋白、信号转导相关蛋白、信号分子、细胞代谢相关蛋白质等,我们推测这些分子中部分可能与三水白虎汤抑制滑膜成纤维细胞增殖有关,可能是该方治疗类风湿关节炎的作用机制之一。
二、针对软骨组织工程研究发展的几点思考（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、针对软骨组织工程研究发展的几点思考（论文提纲范文）
（1）基于静息态脑岛功能网络研究针刺对膝骨性关节炎患者的中枢作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1.研究背景 |
| 1.1 膝骨性关节炎是老龄化中国社会的重要公共卫生问题之一 |
| 1.2 针刺治疗膝骨性关节炎历史悠久,安全有效,但科学作用机制尚不明确 |
| 1.3 以疼痛调控中枢重点脑区-脑岛的功能连接为切入点,探讨针刺治疗膝骨性关节炎的中枢作用机制切实可行 |
| 2.研究目标 |
| 3.研究内容 |
| 3.1 针灸治疗膝骨性关节炎用穴规律与分析 |
| 3.2 膝骨性关节炎患者静息态脑岛功能网络特征 |
| 3.3 针刺对比塞来昔布治疗KOA患者脑岛功能网络特征 |
| 第一部分 针灸治疗膝骨性关节炎用穴规律与分析 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究方法 |
| 2.1 文献检索 |
| 2.2 文献筛选 |
| 2.3 数据提取 |
| 2.4 数据分析 |
| 3.研究结果 |
| 3.1 文献纳入情况 |
| 3.2 腧穴频次分析 |
| 3.3 腧穴归经分析 |
| 3.4 腧穴部位分析 |
| 3.5 腧穴配伍关联分析 |
| 4.研究小结 |
| 第二部分 膝骨性关节炎患者静息态脑岛功能网络研究 |
| 1.研究设计 |
| 1.1 研究设计类型 |
| 1.2 样本量估算 |
| 1.3 对照设计 |
| 2.研究对象 |
| 2.1 受试者来源 |
| 2.2 KOA患者 |
| 2.3 健康受试者 |
| 3.研究方法 |
| 3.1 研究设备与材料 |
| 3.2 观察指标 |
| 3.3 静息态BOLD-f MRI数据采集 |
| 3.4 数据分析 |
| 3.5 研究质量控制 |
| 3.6 伦理委员会审批及临床试验注册 |
| 3.7 研究流程图 |
| 4.研究结果 |
| 4.1 膝骨性关节炎患者与健康受试者的基线分析 |
| 4.2 膝骨性关节炎患者与健康受试者脑岛功能连接网络的差异 |
| 4.3 脑岛功能连接度与临床病情指标的相关性分析 |
| 第三部分 针刺对比塞来昔布治疗膝骨性关节炎患者脑岛功能网络研究 |
| 1.研究设计 |
| 1.1 研究设计类型 |
| 1.2 样本量计算 |
| 1.3 随机方法 |
| 1.4 对照设计 |
| 1.5 盲法设计与实施 |
| 2.研究者对象 |
| 2.1 脱落标准 |
| 2.2 中止标准 |
| 3.研究方法 |
| 3.1 研究设备及材料 |
| 3.2 干预措施 |
| 3.3 观察指标 |
| 3.4 静息态BOLD-f MRI数据采集 |
| 3.5 数据分析 |
| 3.6 研究质量控制 |
| 3.7 伦理委员会审批及临床试验注册 |
| 3.8 研究流程图 |
| 4.研究结果 |
| 4.1 针刺与塞来昔布治疗膝骨性关节炎的临床疗效评价 |
| 4.2 针刺与塞来昔布治疗膝骨性关节炎患者脑岛功能网络的差异 |
| 4.3 依从性评价 |
| 4.4 合并用药情况 |
| 4.5 不良反应报告 |
| 讨论 |
| 1.针刺治疗膝骨性关节炎安全有效,但中枢作用机制不明 |
| 1.1 膝骨性关节炎的中医认识 |
| 1.2 膝骨性关节炎的西医认识 |
| 1.3 膝骨性关节炎是针灸治疗的优势病种,但中枢作用机制不明 |
| 2.关于研究方案设计的探讨 |
| 2.1 对照组的设立 |
| 2.2 针刺选穴的依据 |
| 2.3 针刺治疗方案的选择 |
| 2.4 临床观察指标的选择 |
| 3.功能磁共振技术是针刺中枢机理研究的重要手段 |
| 3.1 功能磁共振技术应用于针刺中枢机理研究的优势 |
| 3.2 功能连接度分析方法的选择 |
| 3.3 脑岛种子点的选择 |
| 4.针刺与塞来昔布治疗膝骨性关节炎的临床疗效异同 |
| 5.疼痛调控通路功能紊乱是膝骨性关节炎的重要中枢病理特征 |
| 5.1 疼痛调控通路的发现 |
| 5.2 中枢疼痛调控通路异常是膝骨性关节炎疼痛的重要病理机制 |
| 6.大脑岛叶功能网络异常是膝骨性关节炎重要的中枢病理特征 |
| 6.1 脑岛的解剖位置与生理功能 |
| 6.2 脑岛是中枢疼痛调控网络中的重要脑区 |
| 6.3 脑岛功能网络异常是膝骨性关节炎的重要中枢病理特征 |
| 7.调节脑岛-ACC及前额叶功能网络的异常是针刺治疗膝骨性关节炎的潜在作用机制 |
| 7.1 针刺与塞来昔布对膝骨性关节炎患者脑岛功能连接的影响存在差异 |
| 7.2 调节脑岛与前额叶、中央后回功能网络异常可能是塞来昔布治疗KOA的部分中枢作用机制 |
| 7.3 以脑岛为节点,实现对前扣带回、前额叶功能网络的调节可能是针刺治疗KOA的重要中枢机制 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 问题和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件1 临床疗效评价相关量表 |
| (1)视觉模拟评分表 |
| (2)WOMAC量表 |
| (3)焦虑自评量表 |
| (4)抑郁自评量表 |
| (5)SF-12量表 |
| 附件2 文献综述 针刺治疗膝骨性关节炎患者的机制研究概况 |
| 参考文献 |
| 附件3 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（2）基于核心指标集的中医药治疗股骨头坏死疗效评价方法的建立与验证（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 综述一 核心指标集的研究概况、方法学及中医临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 股骨头坏死流行病学、诊治与疗效评价研究现状 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于核心指标集理念的中医药治疗股骨头坏死疗效评价方法的建立 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 构建中医药治疗股骨头坏死的结局指标清单 |
| 1.2 德尔菲法实施 |
| 1.3 共识会议过程 |
| 1.4 形成中医药治疗股骨头坏死的疗效评价方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 中医药治疗股骨头坏死结局指标清单 |
| 2.2 德尔菲调查问卷结果 |
| 2.3 共识会议 |
| 2.4 中医药治疗股骨头坏死疗效评价方法 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中医药治疗股骨头坏死核心指标集构建的必要性 |
| 3.2 基于核心指标集理念的股骨头坏死疗效评价方法的质量与价值 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 股骨头坏死疗效评价方法的临床评价指标验证 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 分期标准 |
| 1.4 中医辨证分型标准 |
| 1.5 纳入标准 |
| 1.6 排除标准 |
| 1.7 试验类型设计 |
| 1.8 样本量计算 |
| 1.9 治疗方案 |
| 1.10 观察时间节点 |
| 1.11 观察指标及采集方法 |
| 1.12 统计分析 |
| 1.13 伦理审查 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 效度检验 |
| 2.3 反应度检验 |
| 2.4 录入时间 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中医药治疗股骨头坏死临床评价指标的意义 |
| 3.2 中医药治疗股骨头坏死临床评价指标的效度分析 |
| 3.3 中医药治疗股骨头坏死临床评价指标的反应度分析 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第三部分 股骨头坏死疗效评价方法的影像评价指标验证 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 一般资料 |
| 1.3 评价方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 一致性评价 |
| 2.2 影像评价指标动态观察 |
| 3 讨论 |
| 3.1 影像评价指标的一致性分析 |
| 3.2 影像评价指标的动态观察分析 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附件 |
（3）基于外泌体microRNA表达研究针刺治疗膝骨性关节炎的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 针刺治疗KOA临床疗效确切,但其机制尚不明确 |
| 1.2 从外泌体开展KOA机制研究具有重要意义 |
| 1.3 针刺可能通过外泌体miRNA发挥治疗作用 |
| 2 研究内容 |
| 第一部分 KOA miRNA相关研究现状及热点分析 |
| 1 技术路线图 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 文献检索 |
| 2.2 Citespace与VOSviewer分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 骨关节炎miRNA相关研究的文献发表量 |
| 3.2 骨关节炎miRNA相关研究的国家、研究机构合作网络 |
| 3.3 骨关节炎miRNA相关研究文献共被引情况 |
| 3.4 骨关节炎miRNA研究领域的关键词共现网络 |
| 第二部分 针刺治疗KOA的临床疗效及其主要影响的miRNA |
| 1 技术路线图 |
| 2 实验仪器与材料 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.2 PCR引物 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 临床研究方法 |
| 3.2 外泌体miRNA研究方法 |
| 3.3 生物信息学分析方法 |
| 3.4 统计学处理方法 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 基线资料 |
| 4.2 针刺组4周前后组内比较 |
| 4.3 等待治疗组4周前后组内比较 |
| 4.4 血清外泌体鉴定 |
| 4.5 KOA患者与健康受试者差异表达的miRNA |
| 4.6 针刺组四周前后差异表达的miRNA |
| 4.7 等待治疗组四周前后差异表达的miRNA |
| 4.8 KOA患者差异miRNA与WOMAC疼痛评分的相关性分析 |
| 4.9 针刺作用关键miRNA筛选 |
| 4.10 RT-PCR验证 |
| 4.11 靶基因预测 |
| 4.12 GO富集分析 |
| 4.13 KEGG pathway分析 |
| 第三部分 针刺作用的关键miR-338-3P、miR-15B-3P对软骨细胞的影响 |
| 1 技术路线图 |
| 2 实验仪器与试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 软骨细胞原代提取 |
| 3.2 软骨细胞传代、冻存与复苏 |
| 3.3 Ⅱ型胶原免疫组化与免疫荧光 |
| 3.4 软骨细胞甲苯胺蓝染色 |
| 3.5 细胞转染 |
| 3.6 CCK8细胞增殖检测 |
| 3.7 流式细胞仪凋亡检测 |
| 3.8 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 软骨细胞培养 |
| 4.2 细胞的鉴定 |
| 4.3 软骨细胞转染 |
| 4.4 LPS刺激软骨细胞 |
| 4.5 转染后细胞增殖情况 |
| 4.6 转染后细胞凋亡情况 |
| 讨论 |
| 1 对膝骨关节炎的认识 |
| 1.1 中医对膝骨关节炎的认识 |
| 1.2 现代医学对KOA的认识 |
| 2 针刺治疗KOA疗效肯定,能从多方面发挥对KOA的治疗作用 |
| 2.1 针刺治疗KOA的临床研究疗效确切 |
| 2.2 针刺治疗KOA穴位的选择 |
| 2.3 针刺治疗KOA的机理研究 |
| 3 外泌体MIRNA可能是针刺治疗KOA的作用靶点之一 |
| 3.1 外泌体主要特性与研究方式 |
| 3.2 外泌体miRNA为疾病诊断与治疗提供了可能 |
| 3.3 血清外泌体miRNA可用于OA的临床诊断 |
| 3.4 对外泌体miRNA的调节是针刺治疗KOA途径之一 |
| 4 MIRNA在骨关节炎中的作用 |
| 4.1 miRNA参与KOA病理进程 |
| 4.2 骨关节炎miRNA研究热点 |
| 4.3 骨关节炎研究中的热点miRNA分子 |
| 5 针刺作用的关键外泌体MIRNA对KOA影响的可能途径 |
| 5.1 针刺可能通过MAPK信号通路对KOA进行调节 |
| 5.2 miR-338-3p、miR-15b-3p在KOA中可能的作用机制 |
| 5.3 基于针刺效应筛选的外泌体miRNA的应用前景 |
| 5.4 本研究与同类型研究相比的优势与缺陷 |
| 结论 |
| 创新与特色 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件一:文献综述 膝骨关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二:骨关节炎miRNA研究领域中关键词共现网络miRNA词频表 |
| 附件三:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（4）二氧化碳激光灸与艾灸犊鼻穴治疗膝骨关节炎模型大鼠的疗效比较（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 膝骨性关节炎 MIA 模型制备 |
| 2.2 干预方法 |
| 2.2.1 CO_2激光灸参数 |
| 2.2.2 犊鼻穴取穴 |
| 2.2.3 治疗方法 |
| 2.3 实验取材 |
| 2.4 观察指标及检测方法 |
| 2.4.1 大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期测定 |
| 2.4.2 大鼠电子机械刺激缩足反射阈值测定 |
| 2.4.3 大鼠外周血(血浆)去甲肾上腺素(NE)浓度酶联免疫吸附测定步骤 |
| 2.4.4 大鼠外周血(血清)白介素17(IL-17)浓度酶联免疫吸附测定步骤 |
| 2.4.5 大鼠膝骨关节脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋及切片 |
| 2.4.6 石蜡切片苏木精-伊红HE染色 |
| 2.5 实验流程图 |
| 3.实验数据统计 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 各组不同时间点大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期测定结果 |
| 4.2 各组不同时间点大鼠电子机械刺激缩足反射阈值测定结果 |
| 4.3 各组 OARSI 评分结果 |
| 4.4 各组大鼠外周血(血浆)中去甲肾上腺素(NE)浓度测定结果 |
| 4.5 各组大鼠外周血(血清)中白介素 17(IL-17)浓度测定结果 |
| 5.讨论与分析 |
| 5.1 中医对膝关节骨性关节炎的认识 |
| 5.2 灸法治疗膝骨关节炎 |
| 5.3 膝骨关节炎动物模型 |
| 5.4 实验结果分析 |
| 5.4.1 CO_2激光灸和温和灸均可缩短KOA模型大鼠的辐射热刺激缩足反应潜伏期 |
| 5.4.2 其他疗效指标结果分析 |
| 5.4.3 CO_2激光灸和温和灸对KOA模型大鼠NE、IL-17 的作用 |
| 6.结论 |
| 7.不足和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表的论文 |
| 附录B 综述 灸法对膝骨关节炎的临床疗效及实验研究概况 |
| 参考文献 |
（5）基于温法理论探讨温肺化纤汤预处理对H2O2诱导小鼠肺间充质干细胞氧化损伤保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 注释表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 理论探讨 |
| 引言 |
| 第一节 特发性肺间质纤维化的病因病机及辨证论治概述 |
| 1 脏腑虚衰为本虚 |
| 2 痰瘀互结为标实 |
| 3 小结 |
| 第二节 治肺不远温思想在IPF治疗中的运用 |
| 1 治肺不远温学术思想概述 |
| 2 治肺不远温在IPF治疗中的具体运用 |
| 3 温肺化纤汤临床验案分析 |
| 第三节 温法治疗IPF的系统性评价及meta分析 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 GRADE证据质量分级 |
| 4 讨论 |
| 第二章 实验研究 |
| 引言 |
| 第一节 小鼠肺间充质干细胞(mLMSCs)的分离提取、纯化鉴定及诱导分化实验 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 温肺化纤汤对H2O2 氧化损伤mLMSCs保护作用初步评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 温肺化纤汤对H2O2 诱导mLMSCs细胞凋亡的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四节 温肺化纤汤抗氧化作用机制探讨 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化应激对间充质干细胞氧化损伤作用研究概述 |
| 1 间充质干细胞的生物学特征 |
| 2 氧化/抗氧化机制简述 |
| 3 氧化应激对间充质干细胞的影响 |
| 4 抗氧化预处理可以提高间充质干细胞的存活能力 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 答辩委员会名单 |
| 作者简介 |
（6）MiRNA-19a和miRNA-19b对梅花鹿鹿茸组织中TGF-βRⅡ调控作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 梅花鹿茸发育及再生机制的研究进展 |
| 1.2 转化生长因子β信号通路的研究进展 |
| 1.3 鹿茸组织中miRNA的研究进展 |
| 第二章 梅花鹿鹿茸顶端组织软骨细胞的培养与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 miRNA1792 基因簇与TGF-β通路调控关系的验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 miRNA1792 基因簇对鹿茸细胞增殖的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）基于股四头肌有限元模型的推拿揉法生物力学参数研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 推拿揉法力学参数的测定 |
| 1 研究设备 |
| 1.1 ZTC-I智能推拿手法参数测试系统 |
| 1.2 计算机工作站 |
| 2 研究对象——测试者的选择 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 ZTC-I智能推拿手法参数测试系统简介 |
| 3.2 揉法力学参数数据采集及存储 |
| 3.3 揉法力学参数数据分析与统计 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 峨眉伤科疗法流派三种揉法力学参数 |
| 4.2 骨伤推拿流派三种揉法力学参数 |
| 4.3 小儿推拿流派三种揉法力学参数 |
| 4.4 三个流派三种揉法力学参数对比 |
| 小结 |
| 第二部分 股四头肌三维有限元模型的建立与验证 |
| 1 股四头肌三维有限元模型的建立 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究结果 |
| 2 股四头肌三维有限元模型的验证 |
| 2.1 有限元计算程序的验证 |
| 2.2 股四头肌有限元模型的验证 |
| 小结 |
| 第三部分 揉法对股四头肌模型应力、应变研究 |
| 1 研究设备 |
| 1.1 研究模型 |
| 1.2 计算机工作站 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 分组情况 |
| 2.2 分析指标及测量方法 |
| 2.3 统计分析方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 峨眉伤科疗法流派揉法应力、应变 |
| 3.2 骨伤推拿流派揉法应力、应变 |
| 3.3 小儿推拿流派揉法应力、应变 |
| 3.4 三个流派揉法应力、应变对比 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1 中医学对推拿揉法的认识 |
| 2 揉法与手法手法“十字决” |
| 2.1 揉法与手法之“持久” |
| 2.2 揉法与手法之“有力” |
| 2.3 揉法与手法之“均匀” |
| 2.4 揉法与手法之“柔和” |
| 2.5 揉法与手法之“深透” |
| 3 模拟揉法工况说明及生物力学分析 |
| 4 三种流派揉法特点 |
| 5 有限元模型研究意义 |
| 5.1 软组织建模方法 |
| 5.2 肌肉的生物力学特性 |
| 5.3 软组织建模国内外研究现状 |
| 5.4 有限元模型的验证 |
| 5.5 有限元分析法原理及其优劣 |
| 5.6 本研究所建立股四头肌三维有限元模型的特点及意义 |
| 6 推拿作用力量化与规范化的思考 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件1：综述 |
| 参考文献 |
| 附件2：在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（8）骨痹颗粒治疗膝骨关节炎肾虚络痹证的临床探析与实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 现代医学对KOA的认识 |
| 1.1 现代医学对KOA病因及发病机制的认识 |
| 1.2 现代医学对KOA治疗的认识 |
| 2. 祖国医学对KOA的认识 |
| 2.1 祖国医学对KOA病名及病因病机的认识 |
| 2.2 祖国医学对KOA治疗的认识 |
| 第二部分 临床探析 |
| 1. 典型病例 |
| 2. 按语 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1. 实验研究的材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验指标检测 |
| 1.4 实验数据统计学处理 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 KOA大鼠膝关节软骨病理组织学观察 |
| 2.2 KOA大鼠血清中SOD、MDA、NO、IL-1β的含量 |
| 第四部分 讨论 |
| 1. 补肾养血,蠲痹通络大法的确立 |
| 1.1 病机探讨 |
| 1.2 药物组成与组方方义 |
| 1.3 药物组方特色 |
| 2. 临床疗效探析 |
| 3. 骨痹颗粒对大鼠SOD、MDA、NO、IL-1β的影响及分析 |
| 4. 问题与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）人前列腺间充质干细胞的生物学特性及其多分化潜能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 技术路线图 |
| 目录 |
| 前言 |
| 缩略词表 |
| 第1部分 人前列腺间充质干细胞的生物学特性 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 免疫磁珠分选结果 |
| 1.2.2 培养中细胞形态学变化 |
| 1.2.3 细胞增殖曲线绘制结果 |
| 1.2.4 hPMSCs培养老化现象 |
| 1.2.5 成纤维细胞样克隆生成单位(CFU-F)结果 |
| 1.2.6 细胞表面分化抗原检测结果 |
| 1.2.7 统计学处理 |
| 1.3 第1部分结果图表 |
| 1.4 第1部分实验结论以及讨论 |
| 1.4.1 关于hPMSCs的原代培养 |
| 1.4.2 前列腺hPMSCs细胞膜表面标志物测定 |
| 1.4.3 前列腺间充质干细胞培养与细胞老化 |
| 1.4.4 成纤维样细胞克隆形成实验(CFU-F) |
| 1.4.5 前列腺间充质干细胞hPMSCs的冻存 |
| 1.4.6 第1部分实验结论 |
| 第2部分 人前列腺间充质干细胞的多分化潜能研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 成骨诱导分化结果 |
| 2.2.2 hPMSCs诱导成脂分化结果 |
| 2.2.3 hPMSCs神经诱导分化结果 |
| 2.2.4 统计学处理 |
| 2.3 第2部分实验图表 |
| 2.4 第2部分实验结论和讨论 |
| 2.4.1 第2部分实验讨论 |
| 2.4.2 第2部分实验结论 |
| 3 结论和讨论 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 hPMSCs的分离与纯化 |
| 3.3 hPMSCs的细胞形态 |
| 3.4 hPMSCs的特异性膜表面分化抗原 |
| 3.5 hPMSCs的多分化潜能 |
| 3.6 hPMSCs的未来展望 |
| 3.6.1 hPMSCs的潜在优势 |
| 3.6.2 hPMSCs的临床前研究思路 |
| 3.6.3 对hMSCs的展望 |
| 3.7 对hPMSCs的研究小结 |
| 3.8 科研创新点与不足 |
| 3.8.1 本研究的创新点 |
| 3.8.2 本研究中存在的不足 |
| 4 综述(走近间充质干细胞) |
| 4.1 引言 |
| 4.2 发现间充质干细胞 |
| 4.3 培养间充质干细胞 |
| 4.4 标记间充质干细胞 |
| 4.5 间充质干细胞与免疫抑制 |
| 4.6 多变的间充质干细胞 |
| 4.7 临床前的间充质干细胞 |
| 4.7.1 MSCs与肝脏修复 |
| 4.7.2 MSCs与骨修复 |
| 4.7.3 MSCs与与软骨重建 |
| 4.7.4 MSCs与心血管疾病 |
| 4.7.5 MSCs与神经系统修复 |
| 4.7.6 MSCs与干细胞移植 |
| 4.7.7 MSCs参与基因生物治疗 |
| 4.8 肿瘤和间充质干细胞 |
| 4.8.1 肿瘤发生和MSCs |
| 4.8.2 MSCs与肿瘤迁徙 |
| 4.8.3 MSCs与肿瘤微环境 |
| 4.9 总结与展望 |
| 4.9.1 MSCs的科学问题 |
| 4.9.2 展望未来 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）三水白虎汤抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的作用靶点研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 类风湿关节炎概述 |
| 2 三水白虎汤抑制RA滑膜增生的疗效、药理作用及干预机制 |
| 3 蛋白质组学技术及其在RA研究中的应用 |
| 第二章 SSBH对FLS增殖的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 SSBH对FLS分泌IL-6、IL-17的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 FLS的蛋白质组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 基金资助情况 |
四、针对软骨组织工程研究发展的几点思考（论文参考文献）
- [1]基于静息态脑岛功能网络研究针刺对膝骨性关节炎患者的中枢作用机制[D]. 程施瑞. 成都中医药大学, 2020(01)
- [2]基于核心指标集的中医药治疗股骨头坏死疗效评价方法的建立与验证[D]. 薛志鹏. 中国中医科学院, 2020(12)
- [3]基于外泌体microRNA表达研究针刺治疗膝骨性关节炎的机制[D]. 张琪. 成都中医药大学, 2020
- [4]二氧化碳激光灸与艾灸犊鼻穴治疗膝骨关节炎模型大鼠的疗效比较[D]. 张龙早. 上海中医药大学, 2019(03)
- [5]基于温法理论探讨温肺化纤汤预处理对H2O2诱导小鼠肺间充质干细胞氧化损伤保护作用机制研究[D]. 龚年金. 江西中医药大学, 2019(01)
- [6]MiRNA-19a和miRNA-19b对梅花鹿鹿茸组织中TGF-βRⅡ调控作用的研究[D]. 闫语多. 吉林农业大学, 2017(02)
- [7]基于股四头肌有限元模型的推拿揉法生物力学参数研究[D]. 万义文. 成都中医药大学, 2016(05)
- [8]骨痹颗粒治疗膝骨关节炎肾虚络痹证的临床探析与实验研究[D]. 邱亦江. 南京中医药大学, 2016(02)
- [9]人前列腺间充质干细胞的生物学特性及其多分化潜能研究[D]. 卢泽平. 兰州大学, 2014(01)
- [10]三水白虎汤抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的作用靶点研究[D]. 高燕. 南方医科大学, 2013(03)