一、核苷酸磷酸基团保护的研究（论文文献综述）
许彤[1]（2021）在《L-岩藻糖的从头合成和核苷类化合物的高效合成研究》文中进行了进一步梳理L-岩藻糖,广泛分布于海藻和树胶当中,是哺乳动物细胞中许多糖脂N-和O-连接聚糖的共同组成部分。岩藻糖及其聚糖因具有信号传导、消炎、抗癌等功能受到人们的广泛关注。为了进一步开发含L-岩藻糖的糖类药物及诊断试剂,需要足量纯净、结构明确的含L-岩藻糖的糖类化合物进行生物活性研究。L-岩藻糖为岩藻寡糖和糖缀合物的合成提供了重要的原料。目前主要通过酶法、天然产物中提取及化学合成法获得L-岩藻糖。L-岩藻糖的化学合成主要是通过其他常见单糖转化而成,面临合成路线冗长,成本昂贵,总收率低等难题,从而使得含有L-岩藻糖的聚糖的生物活性研究受到一定的限制。在本论文的第一部分工作中,我们发展了一种经济高效的从头合成L-岩藻糖的方法。利用廉价易得的L-乳酸乙酯为起始原料,通过10步反应,最终以12%的总收率成功获得L-岩藻糖。该合成路线以D-脯氨酸介导的不对称aldo1缩合反应作为关键反应构建了六碳糖骨架,以TEMPO/NCS氧化体系通过选择性氧化伯羟基为醛作为关键反应构建了目标分子中的醛基。核苷通常由碱基与核糖或去氧核糖组成,在酶代谢调节、细胞信号传导及DNA和RNA合成中起着重要作用。核苷类化合物在抗病毒、抗肿瘤方向也有着优异表现。发展合成核苷的有效方法对于了解其作用机理进而推动核苷类药物（例如抗癌药和抗病毒药）的研发至关重要。尽管已报道了一些合成核苷的有效方法,但碱基的溶解性差,亲核性低,使得嘧啶和嘌呤的N-糖苷化反应,尤其是嘌呤衍生物的N9/N7区域选择性糖苷化反应仍然具有很大的挑战性。在本论文的第二部分工作中,我们发展了一种NIS/TMSOTf促进糖基炔烯酸酯给体的N-糖苷化反应,并完成了一系列核苷类化合物的高效合成,为进一步研究其生物活性打下了基础。这种糖苷化方法具有给体制备简单、性质稳定,促进剂廉价易得,反应条件温和,反应收率较高,底物适用性广泛等优点,有望对具有重要生物活性的核苷类化合物的合成扩大应用范围。
任虹茜[2]（2021）在《基于前药策略设计具有构象动态转化的反义核酸的研究》文中进行了进一步梳理核酸药物作为目前国际上重点关注的一类新型生物技术药物,具有设计方便、应用性广、特异性强、不易产生耐药等特点。核酸药物以与疾病发展进程紧密相关的mRNA等核酸序列为靶标,由于蛋白序列编码以及碱基配对特异性,核酸药物具有“治标治本”的优点和巨大的应用前景。已上市的核酸药物种类包括si RNA、反义核酸、核酸适配体,其他核酸药物还包括核酶、sa RNA等。反义核酸作为核酸药物的重要类别,开发最为成熟。反义核酸通过反义机制调节mRNA和蛋白表达,相关机制包括与mRNA的杂交阻断翻译过程或激活RNase H使靶标mRNA降解,或与pre-mRNA上的剪接位点结合,改变成熟mRNA中的外显子含量。自1998年第1个反义药物Vitravene TM被美国FDA批准上市,2013年以来Mipomersen,Eteplirsen,Nusinersen,Tegsedi等也相继获批上市。尽管取得极大的进步,然而,由于核酸药物的负电性、酶易降解性、以及生物体内存在多重生物学屏障,导致其低效率的胞质传递,肝脏快速清除。到目前为止,核酸药物的有效递送依然是有待解决的主要问题。对核酸药物采用各种递送载体和进行化学修饰是近年来发展的主要策略。递送载体主要包括阳离子脂质、聚乙烯亚胺或脂质体制剂等,它们通过静电作用与带负电荷的寡核苷酸相互作用,在亲水性介质中自组装。这种策略将寡核苷酸压缩成聚合体,经内吞进入细胞后释放,目前已有的转染试剂包括Oligofectamine 2000（Invitrogen）,Jet PEI（Polyplus transfection）,K2（Biontex）等[1]。然而,转染试剂的潜在生物毒性等问题仍有待深入阐明。化学修饰主要是在分子水平上,通过对寡核苷酸的碱基、核糖、磷酸盐或末端进行结构修饰以改善其理化性能,此外,还包括缀合PEG等策略,实现体内长效循环和靶向性等。这些进展提供了大量独特的新生物大分子,但化学修饰也存在降低结合亲和力,带来不良反应等潜在隐患。需要指出的,在扩大修饰的组成多样性以及自组装体系的构效关系方面仍存在着重要的机遇,这些策略将进一步促进核酸药物更有效、更多样性的产品开发。寡核苷酸的治疗在临床上还处于起步阶段,与先进诊疗手段的结合也将成为未来寡核苷酸治疗的发展趋势。在分子水平上,新的功能化寡核苷酸的设计、优化是临床成功的关键,也是寡核苷酸治疗革命的核心。研究发现,核酸序列通过碱基互补配对形成的高级结构在人体内天然存在,一些具有高级构象的核酸分子,如发夹状、环状、四螺旋等,由于其特殊的构象改变（磷酸和碱基的排列和碱基堆砌作用）,得以调节理化性质,包括改善抗酶解稳定性等。基于构象带来的理化性质改变,进一步设计具有新结构特征或作用机制的核酸药物,可为相关领域的研究和应用提供全新的思路和更多的可能性,具有重要的科学价值。本研究从分子构象角度出发,融合核酸前药的设计概念,以提高酶解稳定性为目标,进行三类新结构类型的分子设计,包括:1.基于碱基识别自组装的末端发夹结构设计。2.基于碱基识别自组装的末端发夹缀合PEG结构设计。3.基于化学键连的订书结构设计。这三类新结构分子不仅具有前药基本特征即增加药物稳定性,促使药物长效化等,并且可经体内特定环境响应发生敏感键断裂转化为原药结构。1、基于碱基识别自组装的末端发夹结构设计我们以抗肿瘤反义核酸GTI-2040为模型分子,设计合成了一系列的带有可条件响应性断裂二硫键的前药型核酸分子,经溶液退火自组装成末端发夹结构。这些核酸分子具有以下两个特点:（1）末端发夹结构从空间构象上提高了核酸前药分子的耐酶解能力（2）敏感键在肿瘤高浓度谷胱甘肽还原性条件下发生断裂,分子末端发夹结构中的螺旋（茎）区由一条链回折形成碱基配对变为两条链之间的碱基配对,螺旋热稳定性（Tm）发生大幅下降（低于生理温度条件）,从而促使了反义核酸原药从之前的高级结构中解离出来,进一步与靶标结合发挥作用。我们通过一系列的酶解实验（血清、血浆、DNase I）,证实了经发夹结构保护的新结构分子显示出较天然核酸更好的抗酶解稳定性。在模拟肿瘤微环境还原条件下,所有前药分子均可发生二硫键断裂,非变性凝胶电泳实验证明可进一步解离出核酸原药序列。一个优选的分子（2）,在细胞实验和裸鼠肿瘤模型中,有效提高了抗肿瘤细胞增殖效果和体内抗实体瘤活性。2、基于碱基识别自组装的末端发夹缀合PEG结构设计我们在第一部分的结构设计工作基础之上,进一步探索了在分子发夹结构的回折末端引入短链PEG的高效合成方法和抗酶解稳定性变化。通过两种不同的合成方法,均可高效缀合PEG链。体外稳定性试验证实了发夹结构分子PEG化可进一步增加其抗酶解稳定性,体外模拟肿瘤还原条件下,两种缀合了PEG的发夹分子均可发生二硫键断裂,非变性凝胶电泳实验证明可进一步解离出核酸原药序列。3、基于化学键连的订书结构设计在本部分工作中,我们通过一种简单实用的化学方法设计了具有刺激响应特征的分子内成环的订书结构型前药反义核酸。即以两端羰基溴化物修饰的双（2-羟基乙基）二硫化物为订接分子,与核酸序列中硫代磷酸（PS）修饰的硫醇基团反应,即从两硫代位置形成核酸分子内局部或整体的成环结构。采用质谱和非变性凝胶电泳证实了订书结构的形成。体外酶解稳定性实验表明,订书结构反义核酸显示出良好的血清稳定性。订接分子中的二硫键经还原剂DTT处理发生断裂,可转化为线性核酸分子与靶标结合发挥作用。抗肿瘤细胞增殖实验表明,订书结构反义核酸相比天然序列提高了反义活性。综上,本课题从核酸分子构象角度展开设计,将经典的前药原理融合至反义核酸结构之中,设计的新分子具有独特的条件响应特征、构象动态转化、热力学释放等机制。本研究可为核酸药物的构象与稳定性关系研究提供有价值的参考,也为更多核酸分子结构设计提供了新的实践。
项晓璇[3]（2021）在《G-四链体DNA结构性质、组装及应用研究》文中提出随着人们对DNA二级结构的研究逐步加深,除了经典的双螺旋结构,越来越多的DNA结构形态被发现,其中包括G-四链体。它可由广泛分布在启动子区域和端粒上的富含鸟嘌呤的序列折叠而成,而现代仪器技术的飞速发展也使得我们能够观察到细胞内处于动态变化的G-四链体结构,并发现其与细胞周期息息相关。这种结构除了在生命科学领域扮演着重要的角色,凭借其出色的导电性能和结构刚性,吸引了各个领域工作者的目光。加之体外DNA合成技术不断成熟,人们可以设计任意想要的序列,一些被精心设计过的序列在一定的条件下便可形成具有特定图案或者功能的含有G-四链体的纳米结构,例如拥有导电前景的DNA纳米线,能够识别并抑制肿瘤细胞的DNA纳米凝胶等等,而扮演识别和治疗角色的正是AS1411这个能形成G-四链体的核酸适配体。除此之外,G-四链体还能与血红素结合形成类过氧化氢酶,催化产生化学发光变化的反应,或是和其它卟啉类分子结合产生很强的荧光,因此常被应用于生物分析当中。所以准确预测富含鸟嘌呤的DNA序列所形成结构是十分有必要的。除了已经被大家熟知的只含有G-四分体的经典G-四链体外,还有一些特殊的G-四链体,他们序列中的A,C碱基不但能够形成环状结构连接G-四分体,有时也会通过形成氢键参与到结构的形成当中,增加了结构预测的难度。基于以上研究背景,本论文从对G-四链体的结构性质研究出发,着重从以下几个方面研究了A和C碱基在不同条件下对G-四链体形成的影响,并探索了G-四链体在生物分析和纳米技术当中的应用。a.采用电喷雾质谱（ESI-MS）,紫外光谱（UV）和核磁共振波谱法（NMR）研究了末端腺嘌呤对四分子G-四链体（G4）形成和稳定性的影响。有证据表明,序列d（AGnA）（n=4或5）在酸性条件下形成了稳定的不完全的四分子G4,这与中性条件下所有鸟嘌呤都参与形成氢键的经典的四分子G4结构不同。在将d（AG4A）和d（AG5A）在酸性醋酸铵中混合之后,还出现了不同链之间随机结合的异常现象。此外,我们还在酸性条件下观察到了鸟嘌呤水解,并且水解后的DNA链也能参与到某些G4的形成中。基于以上发现,我们提出了一种在酸性条件下稳定的不完全G4的拓扑结构。本研究提供的信息将有助于了解酸性环境中可能存在的G4形态。b.根据我们已有的研究和文献的报道,A碱基和C碱基可以通过与G碱基形成氢键的方式影响G-四链体的构型。基于此,我们将从人类端粒序列上截取的d（G3TTAG3）中的TTA碱基分别替换成CAC,CTC和TAT,分别研究C和A碱基对序列结构形成的影响。和其它大部分形成四分子结构的序列相比,我们发现d（G3CACG3）这条既含有A碱基也含有C碱基的序列能够形成一种具有Na+依赖性的平行DNA纳米线。通过对其热差谱（TDS）和一维核磁谱图（1D-NMR）进行分析发现结构中可能含有GC和AG两种氢键结合方式。如果能够将d（G3CACG3）以及相关序列的具体结构解析出来,将会帮助我们弄清其形成纳米线的原因,为构建DNA纳米结构提供经验。所以我们正试图借助X射线晶体学的方法解决这一问题,但是关于晶体培养的条件还需要进一步进行优化。c.DNA凝胶凭借其优异的生物相容性,刺激响应性,可注射性以及可调控的力学性能,已经被广泛应用于生物打印,构建离子纳米孔道,细胞培养和药物传送等等。参考之前已经报道过的以Y-DNA为基础单元组装DNA凝胶的策略,我们设计了三种结构类型不同的DNA凝胶作为研究目标,发展了高灵敏的表面增强拉曼光谱法对DNA凝胶微观结构进行了分析。以铝离子为聚集剂,二氯甲烷为界面剂,将带负电的银纳米粒子吸附到DNA网络表面,大大提高了拉曼信号的强度。从谱图中不仅观察到A,G,C,T四种碱基环的呼吸振动峰,还可以观察到新形成结构的拉曼特征峰,如糖苷角和氢键的峰位变化等等,为DNA纳米结构的表征提供了新途径。d.利用双分子互锁G四链体的自发荧光特性,我们实现了无标记无毒性的DNA检测。和已经报道过的双链探针类似,这里所设计的探针包含一个单链的DNA模板链和一段与之在5’端部分互补的序列93del4T,并在3’端留下单链以识别靶DNA分子。一旦靶DNA与探针杂交,核酸外切酶Ⅲ将从钝化的3’端逐步去除模板链的核苷酸,连续释放靶DNA和93del4T序列。释放的靶DNA可以循环结合更多的探针并释放更多的93del4T,这些93del4T可以折叠成G-四链体来放大荧光信号。从而实现了根据荧光信号强度对靶DNA的定量检测。与其他方法相比,该策略简单、快速、便宜、无毒。同时也为具有自发荧光的G-四链体寻找到了新的应用价值和方向。
彭泳缙[4]（2021）在《高通量化学法DNA原位合成仪器研制》文中研究表明DNA是生命信息的载体,自从寡核苷酸的化学合成方法出现以来,寡核苷酸的合成在许多研究领域发挥着关键作用,包括药物研制（如人工抗体、生物原料药）、精准医疗（如基因诊断、基因编辑）、工业生物（如生物燃料、重要化学品的生物合成）、农业（如转基因食品、生物源食品、农作物抗病）、纳米技术（如DNA组装材料、生物基材料）、信息存储与运算等。近年来,随着这些领域的快速发展,人们对大规模寡核苷酸的合成需求不断增加,这对DNA合成仪的通量、效率和成本提出了新的挑战。对于全基因组的研究,往往需要数以十万计的不同寡核苷酸,其数量远远超出了市面上能买到的DNA合成仪的合成通量;另外,全基因组研究的痛点还有材料的成本,在目前的寡核苷酸合成方式下,其合成成本对于进行全基因组研究来说太高了。所以,目前仍需要一种高通量、低成本的寡核苷酸合成仪器,这将对基因组研究乃至整个合成生物学的发展产生重大影响。本文首次提出了一种用非接触式压电阀代替传统电磁阀的DNA合成试剂加液方式,它的出液直径远小于电磁阀出液直径,但速度却可以达到10m/s,这种小口径、高速度的特性,使得试剂更容易落到合成板上的某一个位置,即便是平台移动速度非常快,也不影响压电阀的加液精度。这些特性将有助于突破传统DNA合成仪的弊端。本文基于这种高精度的压电阀,开展了更高通量、更快速度、更低成本的化学法DNA原位合成仪器研制。1)为满足新型DNA合成仪的功能需求,模块化完成仪器的结构设计,主要包括加液模块、运动模块和核心反应单元。加液部分采用核心试剂流过压电阀、通用试剂流过电磁阀的方式,更加注重合成效率和成本;运动模块的高速X-Y轴,目的是大幅缩短合成反应的时间,四轴机械臂的采用着重解决仪器自动化、无人化的需求;核心反应单元通过精密设计和加工,目前已经达到了最高6144孔的通量,把反应单元进行阵列化叠加可以使通量轻松破万甚至十万,且同时满足高通量和高载量特性。2)对仪器的主要受力构件进行有限元分析,主要包括结构力学分析和模态仿真。计算出仪器受力和仪器振动过程中的薄弱部分,有效地验证了结构设计的合理性和安全性,并针对不合理的结构提出改进方案。3)独立进行控制电路设计和软件编写。控制部分采用Ether CAT总线动态连接运动控制卡、PC、压电阀、电磁阀、直线电机、机械臂等,已实现多个方向的点位、插补动作、所在点位检测、开关量控制、位置比较等功能。采用C#进行上位端软件开发,主要包括控制流程的内在逻辑、界面UI设计、通讯协议等。4)经过系统化的组装调试和性能验证,设计一轮完整的实验来完成DNA合成和检测流程。对合成产物进行液相、质谱,得到了与设计序列重合的片段,进一步验证了用压电阀进行高通量的DNA合成的合理性和可行性。为下一步全面实现高通量、大规模的柱法合成提供实验样机和理论依据。
王力[5]（2020）在《核碱基功能化聚合物的合成与自组装研究》文中认为核碱基功能化聚合物是一类由有机主链和核碱基侧链组成的高分子化合物,它具有类似于DNA的分子结构特征和生理特性。另外,化学家还可以通过改变其大分子骨架和核苷单元结构来调控这类聚合物的分子功能。因此,核碱基功能化聚合物的开发与发展引起了科学界的广泛关注。本文中,我们合成制备了三大系列的手性核碱基单体,然后分别通过开环复分解聚合（ROMP）、非环二烯复分解聚合（ADMET）和叠氮-炔烃环加成聚合（CuAAC）制备了光学活性核碱基功能化聚降冰片烯、烯烃桥连寡聚脱氧核苷和异二核苷聚三唑类型的核碱基功能化聚合物。具体研究内容将从以下三个方面展开论述:（1）手性基元可以用来构筑具有双螺旋自组装结构的核碱基功能化聚合物。在本文中,我们分别设计并合成了腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶功能化的光学活性降冰片烯单体,这些单体也可以通过互补的核碱基形成氢键复合物。对所得的单体及其氢键复合物进行开环复分解聚合（ROMP）之后,得到光学活性核碱基功能化聚降冰片烯。通过采用高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）检测,可以清晰地观察到光学活性腺嘌呤-胸腺嘧啶功能化聚降冰片烯自组装的双螺旋纳米结构。另外,计算机模拟和2D-NOESY实验结果还表明,这种螺旋的双链聚降冰片烯倾向于形成具有交替的腺嘌呤和胸腺嘧啶单元的共聚物。（2）区域受控制和区域不受控制的聚合模式决定了所制备的核碱基功能化聚合物的自组装形态。在本文中,我们通过非环二烯复分解聚合（ADMET）制备了两种类型的烯烃桥连寡聚脱氧核苷。首先,利用两个烯丙基单元或烯丙基和丙烯酰基单元对手性脱氧胸苷和手性脱氧腺苷的3′-OH和5′-OH进行功能化,得到相应的手性核碱基单体。然后,对制备的手性脱氧核苷单体实施ADMET聚合,分别得到了具有差E/Z选择性且区域不受控制的烯烃桥连寡聚脱氧核苷,和具有E选择性且区域受控制烯烃桥连寡聚脱氧核苷。所制备的这两种具有不同大分子结构的烯烃桥连寡脱氧核苷,分别自组装成球状纳米结构和螺旋丝状纳米结构。（3）具有1,4-区域规则的铜（Ⅰ）催化的[3+2]叠氮-炔烃环加成聚合（CuAAC）可用来制备具有交替核碱基序列的双链核碱基功能化聚合物。在本文中,我们分别设计和合成了两个叠氮-炔基功能化的手性异二核苷单体,它们均可通过自互补的核碱基形成氢键复合物。在对这些复合物进行CuAAC聚合之后,获得了两个具有交替核碱基序列的双链异二核苷聚三唑。通过透射电子显微镜（TEM）观察到,它们均可以自组装成明显的螺旋丝状纳米结构。总之,本文中我们设计并合成了三大系列的手性核碱基单体,并通过对这些手性核碱基单体采用不同的聚合方法获取了一系列的核碱基功能化聚合物。随后,通过2D1H,1H NOESY、紫外-可见吸收光谱（UV-vis）、圆二色光谱（CD）和透射电子显微镜（TEM）等技术手段研究了这些核碱基功能化聚合物的分子结构特征和自组装性质,并阐明了聚合过程中的手性传递和放大机制:当聚合链扩增方向与手性核碱基单体的手性扭转力的方向非同向时,所制备的聚合物自组装成球状纳米结构;当聚合链扩增方向与手性核碱基单体的手性扭转力的方向同向时,所制备的聚合物实现了手性核碱基单体中手性的传递和放大,并自组装成螺旋丝状纳米结构。
万健[6]（2020）在《基于喷墨打印的DNA合成技术与仪器》文中提出DNA智能制造是合成生物学的最基础层技术,依托DNA智能制造发展的DNA信息存储、基因组医学等战略新兴产业,至少对应于未来数千亿至数万亿美元的市场。高通量、高保真、低成本的DNA合成技术及其合成仪器是实现DNA智能制造的前提和基础,因此研发出一种高通量、低成本的DNA合成仪器对保障我国的生物安全具有重大意义。基于此,本论文分析了基于喷墨打印的DNA合成方法与体系,设计加工了一种基于微流控的DNA合成芯片,并搭建了一套基于喷墨打印的DNA合成仪器,开展了该合成仪器的评价与实验。论文主要工作包括如下几个方面:（1）基于喷墨打印技术的DNA合成方法的研究。本文根据DNA合成的具体要求以及喷墨打印的技术原理分析基于喷墨打印的DNA合成体系,研究了载体的表面功能化处理,喷头与合成芯片的配合控制等问题,从而论述DNA合成循环与流程。（2）DNA合成芯片的结构参数设计和加工。DNA合成芯片是DNA合成仪器的核心器件,是进行DNA高通量并行合成的反应载体,本文通过对合成芯片中液路沟道,气路沟道和薄膜层的结构尺寸进行参数仿真与模拟实验,从而确定相应的芯片结构,最后研究了芯片的制造加工与表面功能化方法。（3）基于喷墨打印技术的DNA合成仪器的设计。搭建用于DNA合成的喷墨打印仪器,包括电驱动模块、气压驱动模块、视觉监测模块、位移平台模块等,随后设计相对应的驱动控制软件,从而通过定制的喷墨打印头将DNA合成试剂按需滴送至合成芯片的反应室中,并由微阀对反应室内的试剂进行独立控制以完成整个合成循环。（4）对所搭建的基于喷墨打印的DNA合成仪器的测试与评价。首先对合成载体的表面功能化进行验证,随后是对DNA合成产物验证方法的分析实验,由于载体表面DNA合成密度较低,无法用常规的光谱方法分析,本文搭建了基于荧光原位杂交的测试系统并用以对DNA合成效果进行评价。最后分别基于手工操作与喷墨打印进行DNA合成循环,实现了完整的DNA合成流程,验证了所搭建的整体仪器的可行性。
张丹丹[7]（2020）在《蛋白质的超灵敏荧光检测方法研究》文中研究表明蛋白质是细胞及机体生物功能的主要承担者,包括复制基因组信息、调节转录、传递信号、提供结构、催化反应和运输分子。蛋白质几乎参与到机体生命活动的各个方面,并在人类的新陈代谢、生长发育和机体衰老过程中发挥重要作用。研究表明,当机体发生严重病变甚至癌变时,发挥相应功能的某些蛋白质表现出明显的表达或功能异常。因而,发展一系列能够超灵敏分析检测与肿瘤等重大疾病密切相关的蛋白质方法,对临床疾病的早期诊断、针对性治疗、药物研发筛选以及相应的分子机制研究方面大有裨益。研究发现,具有相应诊断和治疗意义的蛋白质在细胞内通常是痕量存在的,同时生物体内其它活性蛋白质对目标蛋白的检测存在干扰,因此这些蛋白质的分析检测方法要求必须具有很高的灵敏度和很好的特异性。目前,常规的蛋白质检测方法包括质谱法（Mass Spectrometry）、蛋白免疫印迹法（western blot,WB）、酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、荧光法（Fluorescence Assay）和电化学法（Electrochemical Assay）等。其中,荧光分析法以特异性强、灵敏度高和操作简单等优势得到了众多研究者的青睐。近年来,以信号扩增技术为基础构建的蛋白质高灵敏检测方法为生物样本中的蛋白质分析提供了有利手段。基于此,本研究着眼于利用信号放大技术,选择表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、Argonaute 2（Ago2）、组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase,HDAC）/蛋白酪氨酸磷酸酶1 B（protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）以及黏蛋白1（mucin 1,MUC1）为分析模型,构建了一系列新型的荧光分析生物传感器,实现蛋白质的超灵敏检测。具体的研究内容如下:1、构建一种基于目标蛋白EGFR诱导的双SDA与T7核酸外切酶辅助的信号循环放大检测荧光方法。该方法涉及两个阶段的链置换扩增（strand displacement amplification,SDA）与T7核酸外切酶（T7 exonuclease,T7 exo）辅助的酶促扩增。当目标蛋白EGFR存在时,第一个链置换扩增反应（SDA 1）在KF聚合酶和Nt.BbvCI核酸内切酶的辅助下被启动。随着SDA 1反应的进行可以启动第二个链置换扩增反应（SDA 2）,两个链置换扩增反应累计生成大量报告寡核苷酸（report probe）。同时被不断循环利用的EGFR可以循环启动SDA1和SDA2,源源不断的生成reporter probe。因此,在T7核酸外切酶作用下,大量的双链DNA Taqman probe-reporter probe不断地杂交-消化,从而产生强烈的荧光信号。该方法的检测下限低至0.16 fM,同时可以实际应用于肺癌细胞内源性EGFR的灵敏检测,实现癌2、发展了一种基于双信号放大的DNAzyme荧光生物传感器超灵敏检测Ago2。首先设计了一条可以和Ago2识别结合的指导RNA（guide RNA,gRNA）,二者结合形成的RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complexes,RSIC）,具有识别并切割底物sRNA的活性。在Ago2存在时,可以诱导底物sRNA发生切割并产生游离的RCA引物,从而触发RCA反应以生成大量的8-17 DNAzyme,最终这些8-17 DNAzyme可以循环切割信号探针达到增强荧光信号的目的。该方法的检测限为0.35 pM。此外,该方法可用于测定Ago2抑制剂,同时可以准确测定HeLa细胞提取物的内源Ago2活性,检出限为3个HeLa细胞,在Ago2相关的基础研究和临床应用中具有巨大的应用潜力。3、设计了一种基于肽模板化-纳米金（AuNPs）结构介导的荧光生物传感器,用于同时检测多种翻译后修饰（Posttranslational modification,PTM）酶活性。分别设计了多肽1FITC/biotin和多肽2 Cy5/biotin修饰的肽链,多肽1序列中赖氨酸被乙酰化修饰,多肽2序列中丝氨酸被磷酸化修饰。多肽底物通过链霉亲和素和生物素的特异性结合,能够快速自组装到AuNPs的表面。HDAC的存在可以去除多肽1中赖氨酸ε-氨基上的乙酰基,随后可被胞内蛋白酶rLys-C裂解（它特异性裂解赖氨酸残基的C端,但不能识别乙酰化的赖氨酸残基）,导致FITC标记的多肽片段从纳米传感器上解离,从而恢复FITC荧光。类似地,PTP1B的存在可促进多肽2中酪氨酸残基磷酸基的去除,随后可被蛋白酶CPY水解（它可特异性消化多肽底物C端的肽键）,导致Cy5标记的多肽片段从纳米传感器上释放,从而恢复了Cy5荧光。因此,增强的FITC和Cy5荧光可分别用于HDAC和PTP1B的准确定量。该方法灵敏度高,HDAC的检测限为28 pm,PTP1B的检测限为0.8 pM,可用于筛选PTM酶抑制剂和检测癌细胞提取物中的PTM酶。4、研发一种基于发夹锁定DNAzyme探针的纳米金（AuNPs）传感器用于细胞中蛋白质MUC1的荧光信号放大检测。该方法构建基于AuNPs的DNA马达用于检测蛋白质,DNA马达由Mg2+依赖的DNAzyme,AuNPs和DNAzyme底物3部分组成。AuNPs作为支架构成DNAzyme的三维轨道,AuNPs表面DNAzyme的高密度结合增强了DNAzyme底物在三维轨道的移动。当加入靶蛋白质MUC1并和适配体结合后,激活DNA马达系统。再加入Mg2+,发生切割反应,荧光基团释放,根据荧光强度的变化来检测蛋白质含量的高低。同时DNAzyme底物分离并与另一个DNAzyme杂交结合,不断循环可以实现信号放大。此方法实现了DNAzyme底物沿AuNPs的自主移动及对MUC1的超灵敏检测。该方法的检测限可达0.36 fg/mL,并在血清样品中展现良好的回收效率。
陈祺[8]（2020）在《拉米夫定-多酚类前药的设计、合成与抗乙肝病毒活性评价》文中研究表明乙型肝炎病毒（HBV）的感染是全球关注的公共卫生问题之一,它是引发肝癌和肝硬化最常见的原因,具有较高的发病率和死亡率。拉米夫定是获得美国FDA批准用于治疗HBV的第一代核苷类似物药物,对于HBV-DNA的复制具有很高的抑制率。然而由于长期服用产生的耐药性,以及对HBV抗原分泌的弱抑制性等问题,严重限制了拉米夫定的临床治疗效果。据报道,多酚类化合物具有抗HBV及保肝护肝作用,因此从多酚类化合物中筛选出具有抗HBV活性的成分具有良好前景。原儿茶酸是一种多酚类化合物,具有明显的抗HBV活性,且其抗HBV的作用机制与拉米夫定不同,拉米夫定-原儿茶酸联合用药在治疗乙肝方面具有不错的效果。没食子酸也是一种具有抗HBV活性的多酚类化合物,其化学结构与原儿茶酸相似。由于上述多酚类化合物极性较大且口服生物利用度较低,导致联合用药实际应用受限,因此设计合成拉米夫定与原儿茶酸、没食子酸前药对克服单独使用时之不足具有较好前景。本实验室前期研究发现拉米夫定与原儿茶酸药物组合对Hep G2.2.15细胞分泌HBV抗原与HBV-DNA复制的抑制效果,以及对HBV启动子转录活性的抑制作用等方面明显强于单用拉米夫定或原儿茶酸。本课题通过化学键将拉米夫定与多酚类化合物进行拼接,设计合成了拉米夫定-原儿茶酸以及拉米夫定-没食子酸协同前药,优化了合成路线和反应条件,而且还针对目标化合物进行了放大反应,共获得化合物2-2（0.98 g）、化合物2-3（0.44 g）、化合物3-2（50.1 mg）以及化合物3-3（101.3 mg）。通过q RT-PCR法检测了前药2-2和2-3对Hep G2.2.15细胞HBV-DNA的抑制率,通过ELISA试剂盒法检测了这两个化合物对Hep G2.2.15细胞分泌HBe Ag和HBs Ag的抑制效果。结果显示化合物2-2和2-3仍然保留了拉米夫定的体外抗HBV活性,在对HBe Ag、HBs Ag以及HBV-DNA的抑制效果方面与拉米夫定对照组没有显着差异。更多相关化合物的合成以及进一步的体内活性与口服生物利用度实验仍在进行中。
卢梅华[9]（2019）在《革兰氏阳性菌RNA降解关键酶的结构与功能研究》文中提出RNA降解体是rRNA成熟和mRNA降解过程中一个重要的酶复合体,主要由核糖核酸酶、RNA解旋酶及糖酵解酶组成。其中参与RNA降解的关键核糖核糖酸酶包括RNase E、RNase Y以及RNase J。RNase E介导了大肠杆菌等革兰氏阴性菌的RNA加工过程;RNase Y和RNase J则在革兰氏阳性菌RNA加工过程中起着至关重要的作用。研究表明RNase Y是RNase E的同功蛋白,为革兰氏阳性菌RNA降解体中的支架蛋白。RNase Y的缺失将导致革兰氏阳性菌生长速率的减慢,并同时影响细胞形态、孢子形成以及抗生素的敏感性等,与细胞中毒性基因的表达调控相关。此外,革兰氏阳性菌的RNA降解过程还依赖于RNase J核糖核酸酶,其具有核酸内切酶及5’-3’核酸外切酶活性。RNase J为酿脓链球菌生长所必需,然而其在枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌中却能够完全被敲除。关于革兰氏阳性菌中RNA降解的具体机制目前尚不清楚。本文成功地解析获得了耐辐射奇球菌RNase J（DraRNase J）与UMP及DraRNase J活性缺失点突变蛋白与6nt RNA复合体的高分辨率晶体结构并进行了相应的生化实验验证。结果表明RNase J属于β-CASP亚家族蛋白,具有保守的双金属离子（锌离子）催化反应,其活性中心的两个Zn离子介导了 OH·对RNA磷酸二酯键的亲核攻击。RNaseJ中还存有一个保守的基序,能够特异性的识别底物RNA的5’端磷酸基团,决定了其核糖核酸外切酶活性的方向性;同时,Mn离子介导了该蛋白二聚化的过程,调控了 RNase J的核酸内切酶/外切酶的活性转换。这些研究成果揭示了革兰氏阳性菌RNA成熟关键酶RNase J蛋白的催化和活性转换机制,并首次为细胞内高浓度锰离子调控RNA代谢相关酶活性提供了直接证据。此外,本文研究表明耐辐射奇球菌rnj全长基因及其C末端为细胞生长所必须,该基因的杂合突变子将导致耐辐射奇球菌生长速率减慢以及环境胁迫适应性的降低。RNase Y能够与RNase J在内的多种RNA降解体相关组分相互作用。本文在耐辐射奇球菌中敲除了编码RNase Y蛋白的my基因,并获得了纯合突变株。进一步的研究表明该突变株能够极大的敲低耐辐射奇球菌rnj基因的拷贝数,造成耐辐射奇球菌生长速率的减缓,并且显着影响其所具有的极端抗性。RNA-seq转录组测序分析结果表明rny的缺失将导致耐辐射奇球菌中代谢相关途径,离子转运相关途径以及DNA损伤响应相关蛋白转录本的富集,进一步导致耐辐射奇球菌基因组稳定性降低。此外,通过比较野生株和突变株的转录组数据,筛选出了一系列潜在的RNaseY相关操纵子,为后续的研究提供了思路。
刘月阳[10]（2019）在《含三氮唑模块以环四肽为骨架的环二核苷酸类似物的设计合成与活性评价》文中研究表明环二核苷酸（CDN）是人体天然免疫信号通路的第二信使,与干扰素基因刺激因子（STING）结合而诱导I型干扰素和相关细胞因子的产生,激活天然免疫响应。2’,3’-环鸟苷腺苷酸（cGAMP）分子中的核糖-磷酸骨架的存在,影响了分子的跨膜吸收和稳定性,同时这一结构合成比较困难,不含核糖-磷酸骨架的2’,3’-cGAMP类似物将克服这些不足。本文中,我们基于CDN/STING晶体结构及分子对接结果,设计了以环四肽为骨架的环二核苷酸类似物并对其生活活性进行评价。我们合成带叠氮基的肽骨架作为通用中间体,通过点击反应得到含三氮唑模块的新型环二核苷酸类似物。第一部分,我们以天冬氨酸为起始原料,使用多肽固相合成法将天冬氨酸连接到2-氯三苯甲基氯树脂上,依次连接4-位含叠氮基团的脯氨酸、天冬氨酸和4-位含叠氮基团的脯氨酸完成肽链的合成。之后,我们筛选了不同的缩合体系将肽链在稀溶液中分子内成环,并最终确定采用HATU/DIPEA体系。依据虚拟筛选确定合适的炔类衍生物进行点击反应得到含1,2,3-三氮唑模块的新型肽骨架环二核苷酸类似物。生物实验显示在正常浓度范围内,我们得到的环二核苷酸类似物在THP-1,RAW等细胞中均没有细胞毒性,遗憾的是,我们合成的化合物并不能激发STING-TBK1-IRF3信号通路,但是仍对今后设计合成新型环二核苷酸类似物提供了有用的信息。第二部分,我们设计合成丝氨酸-脯氨酸-丝氨酸-脯氨酸为骨架的环四肽化合物。分子对接结果显示,天冬氨酸成环的产物的对接评分比丝氨酸成环产物更好。我们以丝氨酸为起始原料,使用固相合成法完成肽链合成后使用HATU/DIPEA体系得到环四肽。在碘化亚铜催化下与不同的炔类化合物生成含1,2,3-三氮唑模块的环二核苷酸类似物。此部分的细胞实验仍在进行中。
二、核苷酸磷酸基团保护的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、核苷酸磷酸基团保护的研究（论文提纲范文）
（1）L-岩藻糖的从头合成和核苷类化合物的高效合成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 糖化学发展简史 |
| 1.2 糖类药物的发展 |
| 1.3 L-岩藻糖的研究进展 |
| 1.3.1 L-岩藻糖的简介 |
| 1.3.2 L-岩藻糖的生物活性研究进展 |
| 1.3.3 L-岩藻糖的合成研究进展 |
| 1.4 核苷类化合物的研究进展 |
| 1.4.1 核苷类化合物的简介 |
| 1.4.2 核苷类药物的研究进展 |
| 1.4.3 核苷类化合物的合成研究进展 |
| 1.5 论文选题意义及设计思路 |
| 第2章 L-岩藻糖的合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 逆合成分析 |
| 2.3 六碳糖骨架的合成 |
| 2.4 羰基的还原 |
| 2.5 目标化合物的合成 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 核苷类化合物的合成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 论文思路 |
| 3.3 糖基炔烯酸酯给体的制备 |
| 3.3.1 全苯甲酰化核糖炔烯酸酯给体的制备 |
| 3.3.2 全苯甲酰化葡萄糖炔烯酸酯给体的制备 |
| 3.3.3 全乙酰化鼠李糖炔烯酸酯给体的制备 |
| 3.4 核苷类化合物的合成 |
| 3.4.1 嘧啶类核苷化合物的合成 |
| 3.4.2 嘌呤类核苷化合物的合成 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 实验部分 |
| 4.1 L-岩藻糖的合成 |
| 4.1.1 六碳糖骨架的合成 |
| 4.1.2 羰基的还原 |
| 4.1.3 目标化合物的合成 |
| 4.2 核苷类化合物的合成 |
| 4.2.1 糖基炔烯酸酯给体的合成 |
| 4.2.2 嘧啶类核苷化合物的合成 |
| 4.2.3 嘌呤类核苷化合物的合成 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 附录一 |
| 附录二 |
（2）基于前药策略设计具有构象动态转化的反义核酸的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 寡核苷酸药物研究进展概述 |
| 1.2 寡核苷酸的结构修饰策略 |
| 1.2.1 以增加稳定性为目的的结构设计 |
| 1.2.2 以增加循环时间(改善药代动力学)为目的的结构设计 |
| 1.2.3 以增加细胞摄取和靶向性为目的的结构设计 |
| 1.2.4 多分子自组装结构设计 |
| 1.3 本课题研究工作概述 |
| 第二章 基于碱基识别自组装的末端发夹结构分子的设计与评价 |
| 2.1 结构设计 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2.2 含二硫键亚磷酰胺单体的合成 |
| 2.2.3 核酸序列的合成与纯化 |
| 2.2.4 核酸序列的鉴定 |
| 2.2.5 发夹结构核酸分子的制备 |
| 2.2.6 Tm值的测定 |
| 2.2.7 发夹结构核酸分子的非变性凝胶电泳实验(稳定性) |
| 2.2.8 发夹结构核酸分子的二硫键断裂实验 |
| 2.2.9 抗肿瘤细胞增殖实验 |
| 2.2.10 体内抗肿瘤实验 |
| 2.2.11 蛋白印迹分析 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 敏感区单体选择 |
| 2.3.2 核酸序列合成及鉴定 |
| 2.3.3 稳定性筛选(与稳定性有关的构效关系研究) |
| 2.3.4 O2的DNase Ⅰ稳定性 |
| 2.3.5 O2 热稳定性变化(Tm) |
| 2.3.6 抗肿瘤细胞活性 |
| 2.3.7 体内抗肿瘤增殖效果 |
| 2.3.8 蛋白印迹分析 |
| 2.3.9 初步安全性评价 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 基于碱基识别自组装的发夹结构缀合PEG链分子的设计与评价 |
| 3.1 结构设计 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 发夹+PEG结构核酸分子的合成与鉴定 |
| 3.3.2 发夹+PEG结构核酸分子的非变性凝胶电泳实验(稳定性) |
| 3.3.3 发夹结构+PEG化核酸分子的二硫键断裂实验 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于化学键连的订书结构分子的设计与评价 |
| 4.1 研究背景及设计思想 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 订接分子单体的合成 |
| 4.2.2 核酸序列的合成与纯化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 序列合成及纯化 |
| 4.3.2 圆二色谱结构鉴定 |
| 4.3.3 体外稳定性 |
| 4.3.4 体外药物释放 |
| 4.3.5 抗肿瘤细胞活性(A498) |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）G-四链体DNA结构性质、组装及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 DNA结构多样性 |
| 1.1.1 DNA组成及双链DNA结构特点 |
| 1.1.2 G-四链体结构特点 |
| 1.2 DNA分子在体外的应用 |
| 1.2.1 G-wire的构建和应用 |
| 1.2.2 DNA凝胶的构建和应用 |
| 1.2.3 DNA传感技术的简介 |
| 1.3 DNA结构主要研究方法 |
| 1.3.1 核磁共振波谱法(Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) |
| 1.3.2 X-射线晶体学(X-ray crystallography) |
| 1.3.3 紫外熔化温度实验 (UV melting experiment) |
| 1.3.4 圆二色谱(Circular dichroism, CD)法 |
| 1.3.5 电喷雾质谱法(Electrospray mass spectrometry, ESI-MS) |
| 1.3.6 荧光光谱法(Fluorescence spectroscopy) |
| 1.3.7 表面增强拉曼光谱法 ( Surface-enhanced Ramanspectroscopy) |
| 1.3.8 凝胶电泳法(Gel electrophoresis) |
| 1.3.9 原子力显微镜法(Atomic force microscopy,AFM) |
| 1.4 本论文主要的研究内容和选择依据 |
| 1.4.1 论文的选题依据 |
| 1.4.2 论文主要内容 |
| 1.4.3 论文研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 在酸性条件下由d(AG_nA)形成的稳定非经典G-四链体 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和样品制备 |
| 2.2.2 电喷雾质谱(ESI-MS)分析 |
| 2.2.3 紫外熔化温度测量 |
| 2.2.4 圆二色谱(CD)实验 |
| 2.2.5 核磁共振波谱(NMR)实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 结合(n-2)个阳离子的G-四链体结构 |
| 2.3.2 用紫外熔化温度实验比较四条序列形成结构的稳定性 |
| 2.3.3 CD和NMR检测溶液状态下的结构 |
| 2.3.4 含有不同长度G重复单元DNA链的结合 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 非G碱基对G-四链体和G-wire形成影响的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 DNA的合成和样品的制备 |
| 3.2.2 电喷雾质谱测试 |
| 3.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.2.4 原子力显微镜(AFM)实验 |
| 3.2.5 圆二色谱和紫外吸收光谱 |
| 3.2.6 核磁共振波谱(NMR)实验 |
| 3.2.7 核酸结晶和数据采集 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 质谱法和电泳法探究形成结构的离子依赖性 |
| 3.3.2 AFM表征大分子结构的形貌 |
| 3.3.3 CD和TDS光谱法揭示结构种类 |
| 3.3.4 NMR和XRD技术对结构进行解析 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 四链体交联的DNA凝胶的构建及其微观结构的SERS表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 DNA样品和AgDIANPs的制备 |
| 4.2.2 表面增强拉曼光谱(SERS)的检测 |
| 4.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.2.4 原子力显微镜(AFM)实验 |
| 4.2.5 动态光散射(DLS)测试 |
| 4.2.6 透射电镜(TEM)实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA凝胶的构建和表征 |
| 4.3.2 DNA凝胶的拉曼分析及增强机理研究 |
| 4.3.3 利用SERS识别DNA纳米凝胶的组装 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于(3 + 1)型互锁双分子G-四链体的自发荧光对目标DNA片段进行无标记和无染料检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 DNA探针的制备和使用 |
| 5.2.3 荧光光谱的采集 |
| 5.2.4 非变性凝胶电泳实验 |
| 5.2.5 圆二色谱(CD)实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 方法的可行性分析 |
| 5.3.2 检测目标DNA片段 |
| 5.3.3 方法的选择性 |
| 5.3.4 检测人血清中的DNA |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结和展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（4）高通量化学法DNA原位合成仪器研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 DNA化学合成 |
| 1.2.1 DNA化学合成的诞生 |
| 1.2.2 亚磷酰胺四步法化学合成 |
| 1.3 DNA合成仪器 |
| 1.3.1 DNA柱法合成仪 |
| 1.3.2 DNA芯片法合成仪 |
| 1.3.3 化学法合成DNA的成本 |
| 1.3.4 国内DNA合成仪器发展现状和技术积累 |
| 1.4 论文主要研究内容 |
| 第二章 高通量化学法DNA原位合成仪器结构设计与搭建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 整体设计方案 |
| 2.3 主要硬件结构 |
| 2.3.1 加液模块 |
| 2.3.2 核心反应区域 |
| 2.3.3 机械运动模块 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于ANSYS的结构有限元分析 |
| 3.1 ANSYS有限元分析简介 |
| 3.2 有限元分析 |
| 3.2.1 试剂瓶架的整体力学分析与模态分析 |
| 3.2.2 机架的整体力学分析与模态分析 |
| 3.2.3 翻盖机构的整体力学分析与模态分析 |
| 3.2.4 机械臂底座的整体力学分析与模态分析 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 系统总体软件设计 |
| 4.1 系统总体控制方案 |
| 4.1.1 运动控制卡 |
| 4.1.2 直线电机 |
| 4.2 系统软件开发方案 |
| 4.2.1 软件开发方法 |
| 4.2.2 软件开发环境 |
| 4.3 软件设计实现与代码编写 |
| 4.3.1 开发流程 |
| 4.3.2 需求分析 |
| 第五章 实验验证 |
| 5.1 合成实验及其验证过程中用到的仪器与试剂 |
| 5.2 实验步骤 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 仪器实物图 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）核碱基功能化聚合物的合成与自组装研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 核碱基功能化聚合物的概述 |
| 1.2.1 活性可控自由基聚合制备的核碱基功能化聚合物 |
| 1.2.2 烯烃易位聚合制备的核碱基功能化聚合物 |
| 1.2.3 内酯开环聚合制备的核碱基功能化聚合物 |
| 1.2.4 叠氮-炔烃环加成聚合制备的核碱基功能化聚合物 |
| 1.2.5 先聚合后修饰制备的核碱基功能化聚合物 |
| 1.2.6 其它聚合方法制备的核碱基功能化聚合物 |
| 1.3 核碱基功能化聚合物的应用研究 |
| 1.3.1 核碱基功能化聚合物在制备水凝胶方面的应用 |
| 1.3.2 核碱基功能化聚合物在DNA传递和药物传递方面的应用 |
| 1.3.3 核碱基功能化聚合物在制备自修复材料方面的应用 |
| 1.3.4 核碱基功能化聚合物在制备强力超分子粘合剂方面的应用 |
| 1.4 总结 |
| 1.5 选题依据及主要内容 |
| 第二章 光学活性核碱基功能化聚降冰片烯的合成与自组装 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验药品 |
| 2.2.2 实验仪器及测试条件 |
| 2.2.3 核碱基功能化的手性降冰片烯单体的合成及表征 |
| 2.2.4 单体之间的氢键识别作用 |
| 2.2.5 Job’s曲线 |
| 2.2.6 单体的紫外吸收光谱的分析 |
| 2.2.7 单体的圆二色光谱的分析 |
| 2.2.8 氢键复合物的变温核磁实验分析 |
| 2.2.9 光学活性核碱基功能化聚降冰片烯的合成及表征 |
| 2.2.10 光学活性核碱基功能化聚降冰片烯的分子量的分析 |
| 2.2.11 光学活性核碱基功能化聚降冰片烯的变温紫外吸收光谱的分析 |
| 2.2.12 光学活性核碱基功能化聚降冰片烯的变温圆二色光谱的分析 |
| 2.2.13 光学活性核碱基功能化聚降冰片烯的二维核磁的分析 |
| 2.2.14 光学活性核碱基功能化聚降冰片烯的变温核磁的分析 |
| 2.2.15 基于Benesi-Hildebrand模型的核磁滴定实验 |
| 2.2.16 光学活性核碱基功能化聚降冰片烯的透射电子显微镜的分析 |
| 2.2.17 PN-AT的计算仿真实验 |
| 2.3 总结 |
| 第三章 烯烃桥连寡聚脱氧核苷的合成与自组装研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验药品 |
| 3.2.2 实验仪器及测试条件 |
| 3.2.3 烯丙基和丙烯酰基功能化的手性脱氧核苷单体的合成及表征 |
| 3.2.4 单体之间的氢键识别作用 |
| 3.2.5 基于Benesi-Hildebrand模型的核磁滴定实验 |
| 3.2.6 烯烃桥连寡聚脱氧核苷的合成及表征 |
| 3.2.7 烯烃桥连寡聚脱氧核苷的分子量的分析 |
| 3.2.8 烯烃桥连寡聚脱氧核苷的紫外吸收光谱的分析 |
| 3.2.9 烯烃桥连寡聚脱氧核苷的变温紫外吸收光谱的分析 |
| 3.2.10 烯烃桥连寡聚脱氧核苷的变温圆二色光谱的分析 |
| 3.2.11 烯烃桥连寡聚脱氧核苷的透射电子显微镜的分析 |
| 3.2.12 OANA-3在水中的透射电子显微镜的分析 |
| 3.2.13 OANA-1的模板聚合实验 |
| 3.3 总结 |
| 第四章 交替异二核苷聚三唑的合成与自组装 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验药品 |
| 4.2.2 实验仪器及测试条件 |
| 4.2.3 叠氮-炔丙基功能化的手性脱氧核苷单体的合成及表征 |
| 4.2.4 单体之间的氢键识别作用 |
| 4.2.5 单体的紫外吸收光谱的分析 |
| 4.2.6 单体的圆二色光谱的分析 |
| 4.2.7 交替异二核苷聚三唑的合成及表征 |
| 4.2.8 交替异二核苷聚三唑的分子量的分析 |
| 4.2.9 交替异二核苷聚三唑的变温紫外吸收光谱的分析 |
| 4.2.10 交替异二核苷聚三唑的变温圆二色光谱的分析 |
| 4.2.11 交替异二核苷聚三唑的氢键识别作用 |
| 4.2.12 基于Benesi-Hildebrand模型的核磁滴定实验 |
| 4.2.13 交替异二核苷聚三唑的透射电子显微镜的分析 |
| 4.3 总结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 本文总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间的研究成果 |
（6）基于喷墨打印的DNA合成技术与仪器（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 DNA合成的意义 |
| 1.2 DNA合成的方法 |
| 1.3 DNA合成仪器的现状与发展趋势 |
| 1.3.1 柱式DNA合成仪器 |
| 1.3.2 芯片式DNA合成仪器 |
| 1.3.3 国内DNA合成仪器的现状 |
| 1.3.4 DNA合成仪器的发展趋势 |
| 1.4 本论文主要完成的工作 |
| 第2章 基于喷墨打印的DNA合成方法 |
| 2.1 亚磷酰胺化学合成法原理与流程 |
| 2.2 喷墨打印技术 |
| 2.3 基于喷墨打印的DNA合成体系 |
| 2.4 DNA化学合成方法的影响因素 |
| 2.5 本章小节 |
| 第3章 DNA合成芯片与表面功能化 |
| 3.1 DNA合成芯片的设计 |
| 3.1.1 DNA合成芯片的结构设计 |
| 3.1.2 DNA合成芯片的驱动阀膜设计 |
| 3.2 DNA合成芯片的加工 |
| 3.3 DNA合成中载体的表面功能化 |
| 3.3.1 载体的材料选择 |
| 3.3.2 载体与DNA单链的连接 |
| 3.3.3 载体表面功能化方法的选择 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于喷墨打印的DNA合成仪器 |
| 4.1 DNA合成仪器的总体设计 |
| 4.2 DNA合成仪器的模块设计 |
| 4.2.1 气动控制模块 |
| 4.2.2 电驱动模块 |
| 4.2.3 三轴位移平台与视觉观测模块 |
| 4.2.4 喷墨打印头 |
| 4.2.5 微流体控制模块 |
| 4.3 DNA合成仪器的软件控制 |
| 4.3.1 电驱动模块的软件控制 |
| 4.3.2 位移平台的软件控制 |
| 4.3.3 微流体模块的软件控制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 基于喷墨打印的DNA合成仪器的测试与评价 |
| 5.1 载体的表面功能化实验 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 载体的活化 |
| 5.1.3 载体的表面功能化 |
| 5.2 DNA合成产物的验证实验 |
| 5.2.1 基于朗伯比尔定律的光谱分析方法 |
| 5.2.2 基于荧光原位杂交技术的DNA检测方法 |
| 5.2.3 基于荧光原位杂交技术的DNA验证实验 |
| 5.3 DNA合成仪器的验证实验 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（7）蛋白质的超灵敏荧光检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质简介 |
| 1.2 蛋白质分析检测方法研究 |
| 1.2.1 基于抗原抗体的免疫分析法 |
| 1.2.2 基于特异性核酸适配体的分析法 |
| 1.2.3 基于DNA末端连接保护小分子的分析法 |
| 1.3 基于荧光信号放大的蛋白质检测技术 |
| 1.3.1 无扩增的荧光信号放大检测技术 |
| 1.3.2 基于扩增的荧光信号放大检测技术 |
| 1.4 本论文研究内容 |
| 第二章 基于SDA及 T7 外切酶介导的信号扩增用于检测表皮生长因子受体 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 DNA探针的制备 |
| 2.2.3 EGFR诱导的链置换扩增循环反应 |
| 2.2.4 荧光值的测定及数据分析 |
| 2.2.5 细胞培养和细胞提取物制备 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 EGFR检测的原理 |
| 2.3.2 方案原理的可行性验证 |
| 2.3.3 优化反应条件 |
| 2.3.4 灵敏度分析 |
| 2.3.5 特异性分析 |
| 2.3.6 实际样品分析 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 基于双信号放大的DNAZYME生物传感器超灵敏检测ARGONAUTE |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 Ago2 引发的切割反应 |
| 3.2.3 基于8-17 DNAzyme的 RCA反应 |
| 3.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.2.5 荧光值的测定及数据分析 |
| 3.2.6 抑制剂的分析 |
| 3.2.7 细胞培养和细胞提取物制备 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Ago2 检测的原理 |
| 3.3.2 方案原理的可行性验证 |
| 3.3.3 反应条件的优化 |
| 3.3.4 灵敏度分析 |
| 3.3.5 特异性分析 |
| 3.3.6 抑制剂分析 |
| 3.3.7 细胞中Ago2 的检测 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 基于肽模板化-纳米金结构介导的生物传感器用于翻译后修饰蛋白酶的同时检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 肽模板化AuNPs的制备 |
| 4.2.3 HDAC和 PTP1B酶活性的测定及数据分析 |
| 4.2.4 单分子检测和数据方法 |
| 4.2.5 细胞培养和细胞提取物制备 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 HDAC和 PTP1B酶活性分析的原理 |
| 4.3.2 可行性的验证 |
| 4.3.3 优化反应条件 |
| 4.3.4 灵敏度分析 |
| 4.3.5 特异性分析 |
| 4.3.6 动力学分析 |
| 4.3.7 抑制剂分析 |
| 4.3.8 实际样品分析 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 基于发夹锁定DNAZYME探针的AUNP传感器用于检测MUC |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 发夹锁定DNAzyme修饰AuNPs的制备 |
| 5.2.3 Mg~(2+)依赖的发夹锁定DNAzyme探针自切割循环信号放大 |
| 5.2.4 荧光光谱测量和电泳分析 |
| 5.2.5 血清样品中MUC1 的检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 MUC1 检测的原理 |
| 5.3.2 发夹锁定 DNAzyme 探针修饰的 AuNPs 的表征可行性的验证 |
| 5.3.3 方案原理可行性的验证 |
| 5.3.4 优化反应条件 |
| 5.3.5 灵敏度分析 |
| 5.3.6 特异性分析 |
| 5.3.7 实际样品分析 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）拉米夫定-多酚类前药的设计、合成与抗乙肝病毒活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 乙型肝炎病毒简介 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒的结构与生命周期 |
| 1.1.2 乙型肝炎病毒的治疗策略 |
| 1.2 抗乙肝病毒核苷(酸)类药物的研究进展 |
| 1.3 拉米夫定抗乙肝病毒的研究进展 |
| 1.3.1 拉米夫定抗乙肝病毒的作用特点 |
| 1.3.2 改进拉米夫定抗病毒不足的策略 |
| 1.4 本课题研究的目的与意义 |
| 第2章 拉米夫定-原儿茶酸前药的设计、合成与体外抗HBV活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 拉米夫定-原儿茶酸前药的合成路线 |
| 2.2.1 课题的提出 |
| 2.2.2 合成路线的设计 |
| 2.3 实验部分 |
| 2.3.1 实验仪器与试剂 |
| 2.3.2 化合物的合成与表征 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 保护基的选择 |
| 2.4.2 合成条件的筛选 |
| 2.4.3 合成路线的确定 |
| 2.4.4 拉米夫定-高原儿茶酸前药的合成 |
| 2.5 体外抗HBV活性测定 |
| 2.5.1 实验材料与仪器 |
| 2.5.2 ELISA法检测细胞上清中HBeAg、HBsAg的表达 |
| 2.5.3 qRT-PCR检测HBV DNA的表达 |
| 2.5.4 结果与分析 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 拉米夫定-没食子酸前药的设计与合成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 拉米夫定-没食子酸前药的合成路线 |
| 3.3 实验部分 |
| 3.3.1 实验仪器与试剂 |
| 3.3.2 化合物的合成与表征 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 合成路线的确定 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
（9）革兰氏阳性菌RNA降解关键酶的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 项目资助 |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 耐辐射奇球菌概述 |
| 1.1.1 耐辐射奇球菌的发现与命名 |
| 1.1.2 耐辐射奇球菌的形态特征及极端抗性 |
| 1.1.3 耐辐射奇球菌的基因组组成 |
| 1.1.4 耐辐射奇球菌DNA损伤修复的研究进展 |
| 1.1.5 耐辐射奇球菌抗氧化机制的研究进展 |
| 1.2 细菌RNA降解概述 |
| 1.2.1 革兰氏阴性菌RNA降解概述 |
| 1.2.2 革兰氏阳性菌RNA降解过程关键酶 |
| 1.2.3 革兰氏阳性菌RNA降解体的研究进展 |
| 1.2.4 革兰氏阳性菌mRNA降解途径 |
| 1.3 小结 |
| 第2章 DraRNase J的晶体结构与体外功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器和试剂 |
| 2.2.2 菌种及质粒 |
| 2.2.3 蛋白表达菌株的构建 |
| 2.2.4 DraRNase J蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.5 DraRNase J蛋白的核酸酶活性实验 |
| 2.2.6 DraRNase J晶体筛选与生长 |
| 2.2.7 晶体X射线衍射数据的收集和分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DraRNase J全长蛋白的纯化 |
| 2.3.2 DraRNase J及其与UMP复合体的结晶与结构解析 |
| 2.3.3 DraRNase J全长蛋白和各结构域的结构总览 |
| 2.3.4 DraRNase J的核酸酶反应条件的优化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 DraRNase J-RNA复合体晶体结构解析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 蛋白纯化与结晶 |
| 3.2.2 定点突变 |
| 3.2.3 DraRNase J全长蛋白及其各点突变蛋白的核酸酶活性实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DraRNase J催化中心点突变蛋白核酸酶活性 |
| 3.3.2 DraRNase J-RNA复合体结构解析 |
| 3.3.3 DraRNase J RNA结合通道及DraRNase J催化机制分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 Mn~(2+)介导的RNase J核酸酶活性转换 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株及质粒 |
| 4.2.2 DraRNase J截断蛋白及点突变蛋白的表达菌株构建 |
| 4.2.3 蛋白表达与纯化 |
| 4.2.4 DraRNase J全长蛋白、截断蛋白及各点突变蛋白的核酸酶活性。 |
| 4.2.5 突变株的构建 |
| 4.2.6 表型及生存率的测定 |
| 4.2.7 生长曲线的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Mn~(2+)及DraRNase J的C末端对蛋白二聚化及核酸酶活性的影响 |
| 4.3.2 Mn~(2+)调控的DraRNase J endo-和exo-核酸酶活性转换机制分析 |
| 4.3.3 DraRNase J表型及生长曲线 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 DraRNase Y体内外功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种与质粒 |
| 5.2.2 突变株与补偿株的构建 |
| 5.2.3 生长曲线、表型及生存率的测定 |
| 5.2.4 突变率的测定 |
| 5.2.5 电子显微镜分析突变株超微结构 |
| 5.2.6 RNA-seq及数据分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 DraRNase Y蛋白的生物信息学分析 |
| 5.3.2 突变株的构建及表型分析 |
| 5.3.3 突变率分析 |
| 5.3.4 dra_△rny细胞显微结构分析 |
| 5.3.5 RNA-seq数据分析 |
| 5.3.6 差异表达基因 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间发表论文 |
（10）含三氮唑模块以环四肽为骨架的环二核苷酸类似物的设计合成与活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环二核苷酸的发现 |
| 1.2 CDNS与 STING-TBK1-IRF3 通路 |
| 1.3 靶向STING的小分子化合物 |
| 1.3.1 环二核苷酸类似物 |
| 1.3.2 天然产物及其他靶向STING的衍生物 |
| 1.4 环二核苷酸类似物的从头合成策略 |
| 1.5 环二核苷酸类似物的骨架合成策略 |
| 1.6 CLICK反应及其在碱基类似物合成中的应用 |
| 1.6.1 基于计算化学用三氮唑模块代替碱基结构的虚拟筛选 |
| 第二章 天冬氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-脯氨酸为环四肽骨架的环二核苷酸类似物合成与生物活性研究 |
| 2.1 课题来源 |
| 2.2 实验研究的主要内容 |
| 2.3 环四肽化合物与C-DI-GMP结合的测试 |
| 2.4 结论与展望 |
| 第三章 丝氨酸-脯氨酸-丝氨酸-脯氨酸为环四肽骨架的环二核苷酸类似物合成与生物活性研究 |
| 3.1 分子对接模拟实验 |
| 3.2 树脂上先成环再切割的尝试 |
| 3.3 实验部分 |
| 3.3.1 原料的合成 |
| 3.3.2 产物的合成 |
| 3.4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、核苷酸磷酸基团保护的研究（论文参考文献）
- [1]L-岩藻糖的从头合成和核苷类化合物的高效合成研究[D]. 许彤. 华东理工大学, 2021(08)
- [2]基于前药策略设计具有构象动态转化的反义核酸的研究[D]. 任虹茜. 军事科学院, 2021
- [3]G-四链体DNA结构性质、组装及应用研究[D]. 项晓璇. 吉林大学, 2021(01)
- [4]高通量化学法DNA原位合成仪器研制[D]. 彭泳缙. 军事科学院, 2021
- [5]核碱基功能化聚合物的合成与自组装研究[D]. 王力. 东南大学, 2020(02)
- [6]基于喷墨打印的DNA合成技术与仪器[D]. 万健. 天津大学, 2020(02)
- [7]蛋白质的超灵敏荧光检测方法研究[D]. 张丹丹. 山东师范大学, 2020(08)
- [8]拉米夫定-多酚类前药的设计、合成与抗乙肝病毒活性评价[D]. 陈祺. 湖北大学, 2020(02)
- [9]革兰氏阳性菌RNA降解关键酶的结构与功能研究[D]. 卢梅华. 浙江大学, 2019(01)
- [10]含三氮唑模块以环四肽为骨架的环二核苷酸类似物的设计合成与活性评价[D]. 刘月阳. 河南师范大学, 2019(07)