一、鼠疫耶尔森菌检测技术研究进展（论文文献综述）
史艳文,王梅[1]（2021）在《鼠疫核酸诊断技术的应用概述》文中认为鼠疫是鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）借鼠蚤传播为主的烈性传染病,是广泛流行于野生啮齿类动物间的一种人畜共患的自然疫源性疾病,在历史上曾引起三次大流行,也是一种重要的生物恐怖主义病原体。鼠疫核酸诊断技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应、恒温扩增、基因测序和生物芯片技术等,本文就鼠疫核酸诊断的主要技术研究进展及应用现状综述如下。1 聚合酶链反应（PCR）1.1 普通PCR聚合酶链式反应（PCR）技术是利用特定的引物,
谢辉,祁芝珍,李翔,杨建国,赵海红,刘中凯[2]（2021）在《应用鼠疫耶尔森菌环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测1例自然携带噬菌体的旱獭脏器》文中指出目的应用鼠疫耶尔森菌环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术快速检测1例自然携带噬菌体的旱獭脏器。方法对该样本采用鼠疫细菌培养、鼠疫耶尔森菌反向间接血凝试验（reverse indirect hemagglutination test, RIHA）、鼠疫胶体金免疫层析法（colloidal gold immunochromatography, RGICA）及LAMP快速检测方法进行检测及鉴定。结果鼠疫细菌培养、RIHA及RGICA检测为阴性,LAMP方法检测结果为阳性且整个反应可在1 h之内完成,并可视化判读结果。结论 LAMP比其他3种方法敏感性高,由于鼠疫LAMP方法特异性强、敏感度高、操作简便,克服了传统鼠疫病原检验中的不足,有助于在鼠疫监测工作中及时判断疫源地的存在,应加强其在基层工作中的应用和推广。
谢辉,祁芝珍,杨晓艳,袁静,李翔,赵海红[3]（2021）在《环介导等温扩增技术检测鼠疫耶尔森菌的敏感性和特异性研究》文中进行了进一步梳理为观察环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术能否适用于我国不同疫源地鼠疫耶尔森菌所有基因组型的检测,本研究建立了一种基于3a靶序列设计特异性引物快速检测鼠疫耶尔森菌的LAMP方法。选择分离自我国11个鼠疫自然疫源地的65株野生代表性鼠疫耶尔森菌株,同时以与其近源的假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌及非近源的大肠埃希菌为对照菌株,观察其敏感性和特异性。结果显示,该LAMP方法与其他3种鼠疫耶尔森菌常规检测方法的结果一致。65株鼠疫耶尔森菌检测均为阳性,最低检出浓度为20个菌/μL;假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌及大肠埃希菌标准菌株反应均为阴性。结果提示,本研究建立的LAMP技术对检测我国各疫源地鼠疫耶尔森菌具有高度特异性,且快速简便,无需特殊仪器,可肉眼判读结果,适用于野外现场鼠疫监测中的快速检测,在偏远地区疫情防控中具有实用价值。
邴琪,李立东,赵斌,王铁峰[4]（2021）在《PCR技术在鼠疫检测中的应用现状》文中研究说明鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的一种自然疫源性人兽共患病,被我国列为法定甲类传染病之首。20世纪中叶后,鼠疫疫情在世界范围内主要表现为散发或小范围的爆发,80年后开始逐步活跃,90年代开始明显回升,被WHO列为20种重新流行的传染病之一[1]。
迟恒[5]（2020）在《食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究》文中进行了进一步梳理小肠结肠炎耶尔森菌是重要的人畜共患病原菌,可引起肠道疾病、关节炎、肠系膜淋巴结炎等肠道外综合症,对人类健康构成了严重的威胁。目前食品小肠结肠炎耶尔森菌的检测方法主要为培养法,该方法步骤繁琐且周期较长,具有一定的局限性。研制快速、准确检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌的方法,在食品加工过程检测、保障食品安全中具有重要意义。本研究在克隆表达病原菌特异性蛋白的基础上,制备其特异性多抗免疫磁珠,并将免疫磁珠富集分离技术与荧光定量PCR检测技术结合,以期实现食品中小肠结肠炎耶尔森菌特异、灵敏、快速的检测。主要进展如下:1.小肠结肠炎耶尔森菌特异致病基因的克隆、表达与纯化:在对多株耶尔森菌菌株毒力基因检测、以及小肠结肠炎耶尔森菌特异致病性外膜蛋白基因ail和ompF生物信息学分析的基础上,构建了其原核表达载体,表达并纯化了浓度为5 mg/mL重组外膜蛋白Ail与OmpF。2.免疫磁珠的制备与参数优化:将重组外膜蛋白Ail与OmpF免疫成年雄性家兔,制备效价为1:3200的多克隆抗体。利用该多克隆抗体制备免疫磁珠,并优化免疫磁珠的制备参数,结果表明当25 μL浓度为10 mg/mL抗体与1 mg粒径为1.0-2.0 μm的羧基化磁珠在室温下振荡孵育6 h时,所制备的免疫磁珠偶联效率最好;且使用0.2 mg免疫磁珠捕获101-105CFU/mL小肠结肠炎耶尔森菌时,捕获效率接近80%,对非耶尔森菌的捕获效率低于10%,证明本研究制备免疫磁珠具有良好的特异性。3.小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株的构建以及吸附纯化兔抗血清:通过对pKD46质粒抗性改造,以及重叠PCR延长转化片段同源臂至500 bp的方式,基于Red重组系统成功获得小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株。将该菌株作为OmpF蛋白特异性多抗阳性血清制备的吸收菌株,提高检测的特异性,还可以将其作为本实验的阴性对照菌株。4.免疫磁珠捕获-荧光定量PCR（IMBs-qPCR）检测小肠结肠炎耶尔森菌方法的建立:通过在线软件设计小肠结肠炎耶尔森菌foxA的特异性引物;使用该引物建立荧光定量PCR标准曲线,确定检测最低限为64 CFU/mL;再加入沙门氏菌等干扰菌株,验证本检测方法具有良好的特异性;使用IMB s-qPCR方法检测人工污染牛奶、猪肉中的小肠结肠炎耶尔森菌,在菌液浓度为103-104 CFU/mL时,捕获率大于68%。该方法与培养法相对比,具有较高的一致性,且整个流程只需要12 h,极大缩短了检测时长。综上所述,本研究表达纯化小肠结肠炎耶尔森菌重组外膜蛋白并制备其特异性多克隆抗体,利用基因敲除突变菌株吸附除去血清中非特异性抗体。应用外膜蛋白抗体偶联的免疫磁珠对食品中小肠结肠炎耶尔森菌特异性捕获,并结合灵敏、特异的荧光定量PCR技术,建立IMBs-qPCR检测方法,提供了一种快速检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌的有效备选方法。
刘婧文[6]（2019）在《乳制品和肉类中重要致病菌实时荧光重组酶聚合酶扩增（real-time RPA）快速检测技术研究》文中研究表明我国是乳制品和肉类的消费大国,其中涉及的食品微生物安全问题不容忽视。小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）和大肠埃希氏菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）是乳制品和肉类中的重要致病菌,容易引发食源性疾病,一直备受关注。传统的培养检测方法检测周期长且操作繁琐。以PCR为代表的分子生物技术虽缩短了检测周期,但难以用于市场抽查等现场检测。重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）作为新型恒温核酸扩增技术,对设备要求不高,可在常温下实现特定核酸序列扩增,扩增可通过琼脂糖凝胶电泳、结合探针等方法,5-20 min即可观察结果,能实现检测结果的快速可视化。本研究采用实时荧光RPA（real-time RPA）技术检测乳制品和肉类中的小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7。根据致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌黏附侵袭位点ail（NC＿008800.1）致病基因和大肠埃希氏菌O157:H7的rfb E基因（S83460.1）,分别进行了特异性引物和探针的设计与筛选,通过三种DNA提取方式的比较、不同RPA反应程序的优化、特异性、灵敏度、稳定性以及人工污染实验,建立了乳制品和肉类中这两种致病菌的实时荧光RPA（real-time RPA）检测方法,并在实际样品测试中得到了验证。研究结果表明:（1）在Magtration R 12GC PLUS核酸提取仪及其相应Mag DEAR DNA200（GC）试剂盒、Kurabo Quick Gene DNA提取试剂盒和天根细菌基因组DNA提取试剂盒三种试剂盒中,天根试剂盒对样品溶液中的DNA提取效果最好。此外,水煮法在real-time RPA中也有一定可行性。（2）本研究建立的real-time RPA方法在37°C恒温下20 min内即可完成检测,特异性高,对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7的目的DNA的检测限分别为0.1 ng/μL和0.01 ng/μL。（3）在稳定性实验中,选择从100 ng/μL～0.001 ng/μL系列浓度梯度的目的DNA进行平行测试。在检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌中,当DNA为0.1 ng/μL时,8个平行的阈值时间和最大荧光值的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）最低且≤7.06%。在大肠埃希氏菌O157:H7中,0.01 ng/μL及以上浓度DNA均可稳定检出。（4）致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌在奶粉和牛肉的人工污染样品中初始污染量为3CFU/25g时,培养20 h后,即可通过real-time RPA方法检出;大肠埃希氏菌O157:H7在牛奶和鸡肉中的初始污染量为4 CFU/25g时,培养9 h后即可检出。（5）采用本方法分别对20份乳制品和肉类实际样品检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7,与现有国家标准方法相比,本研究建立的real-time RPA方法与国家标准方法结果一致。综上,本研究建立的乳制品和肉类中的小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光RPA技术检测特异性强,常温检测灵敏度高,与国家标准方法检测结果一致,可大幅度缩短检测时间,可作为乳制品和肉类中小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7的快速初筛和现场检测方法,对乳制品和肉类中的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7的常温快速定性检测具有实用意义。
陈利伟[7]（2019）在《中山市神湾港区鼠形动物及其携带病原体的调查研究》文中指出目的:了解中山神湾港地区鼠形动物的种类构成、密度、季节消长、体表携带寄生虫及鼠体感染鼠源性疾病病原体情况,确定神湾港口岸鼠形动物携带病原体的基因类型和变异关系,为防控鼠传疾病的传播提供重要的数据支持。使用DNA条形码技术对鼠形动物及其体表寄生虫进行鉴定,获得该地区鼠形动物及其体表寄生虫的DNA条形码信息。方法:2017年5月-2018年6月,在神湾货运码头区及神湾游艇码头区两个监测地点,采用笼夜法捕获鼠形动物,梳刷法采集鼠体表寄生虫,进行分类及形态鉴定,同时利用DNA条形码技术进行鉴定。解剖取鼠肺、肝、脾和肾脏组织,提取鼠肺RNA及肝、脾、肾DNA,采用核酸检测方法检测7种病原微生物的携带情况,同时对阳性样品PCR产物测序及系统进化分析。结果:1.神湾港鼠形动物监测结果:共捕获鼠形动物69只,分别隶属于2目2科3属3种,臭鼩鼱58只,占84.05%,为优势种群;平均鼠密度为3.89%,鼠密度季节消长明显（0.70%7.14%）,密度高峰期出现在7-8月份及3-4月份。2.鼠形动物体表携带寄生虫情况:鼠形动物体表检出吸虱12只、适存病蚤（Nosopsyllus nicanus）2只、粒形硬蜱（lxodes granulatus）95只、螨151只,其中毒厉螨（Laelaps echidninus）3只、地里纤恙螨（Leptotrombidium deliense）148只。鼠形动物染虱率、染蚤率、染蜱率、染螨率分别为2.90%（2/69）、1.45%（1/69）、20.29%（14/69）、4.35%（3/69）。3.鼠形动物病原微生物检出情况:汉坦病毒阳性2份,阳性率为2.90%（2/69）,基因分型均为汉城病毒;致病性钩端螺旋体阳性3份,阳性率为4.35%（3/69）。遗传进化分析显示存在问号钩端螺旋体Leptospira interrogans及博氏钩端螺旋体L.borgpetersenii两种基因型;巴尔通体核酸阳性鼠样8份,阳性率为11.59%（8/69）,遗传进化分析显示存在部族（野鼠）巴尔通氏体Bartonella tribocorum及B.sp.两种基因型。检出一只鼠形动物复合感染汉坦病毒、巴尔通体、钩端螺旋体,阳性率为1.45%（1/69）。土拉弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、恙虫病东方体、伯氏疏螺旋体核酸检测为阴性。4.DNA条形码鉴定结果:利用DNA条形码技术成功扩增了69只鼠形动物的69条COI基因序列,并成功鉴定出鼠形动物种类。构建NJ进化树,3个鼠种能单独分为一个分支,从而将不同属种的物种区分开来。DNA条形码技术成功扩增鼠体表寄生虫的COI片段,获得相应的DNA条形码序列。结论:1.神湾港口岸地区鼠密度较高,全年鼠密度波动较大,应加强灭鼠工作;2.鼠形动物检出在蜱、螨、蚤、虱类寄生虫,其中鼠体染蜱现象普遍,应当加强防控相关传染病的传播;3.神湾港口岸鼠形动物中存在汉坦病毒、致病性钩端螺旋体、巴尔通体感染,其基因型对人类具有致病性,存在人群感染的风险,疾病的人群流行情况需做深入的调查研究;4.对鼠形动物COI基因进行序列比对、遗传距离分析及序列聚类分析能准确快速进行分类和鉴定,DNA条形码技术能够纠正现场形态鉴定的偏差。该方法亦能应用到鼠形动物携带体表寄生虫的鉴定当中。
李子微[8]（2019）在《LAMP和RealAmp技术检测四种细菌性生物战剂的研究》文中指出目的:土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis,FT）、类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,BP）、布鲁氏菌（Brucella,Bru）和鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis,YP）均具有高度致病性和传染性,是重要的生物战剂,对人类的健康、甚至生存,构成极大的威胁。本研究旨在建立一种快速、准确可靠及易于推广的检测技术,以防范和应对以上细菌可能造成的生物恐怖威胁。方法:本研究基于环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和实时荧光环介导等温扩增技术（real-time fluorescence loop-mediated isothermal amp Jlification,Real Amp）,分别建立并优化本研究中所涉及细菌的检测体系。针对Fop A基因设计LAMP引物,检测土拉弗朗西斯氏菌;针对Fli C基因设计LAMP引物,检测类鼻疽伯克霍尔德菌;针对Omp25基因设计LAMP引物,检测布鲁氏菌;针对F1基因设计LAMP引物,检测鼠疫耶尔森氏菌。以同源性较高的菌株基因组DNA作为模板,评价检测体系的特异性;采用目标菌的基因组DNA和质粒作为模板,评价检测体系的灵敏度。以质粒菌污染环境土壤制备模拟样本,评价检测体系在实际环境中的检出限和应用价值,并与行内认可的实时荧光定量PCR试剂进行平行比对检测实验,评价检测体系的准确度和检测率。结果:（1）筛选出土拉弗朗西斯氏菌FopA基因、类鼻疽伯克霍尔德菌Fli C基因、布鲁氏菌Omp25基因和鼠疫耶尔森氏菌F1基因分别建立了环介导等温扩增技术和实时荧光环介导等温扩增技术,并优化反应条件和体系;（2）以其他非目标菌菌株基因组DNA和蜱虫基因组总DNA为模板,未出现非特异性扩增;（3）以土拉弗朗西斯氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达4.9×102 cfu/m L和4.9×101 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达8 copies/μL和5 copies/μL;以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×103 cfu/m L和1×102 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×102 copies/μL和1×101 copies/μL;以布鲁氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×102 cfu/m L和1×101 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×101 copies/μL和8 copies/μL;以鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×104 cfu/m L和1×103 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×101 copies/μL和8 copies/μL;（4）分别采用土拉弗朗西斯氏质粒菌、类鼻疽伯克霍尔德菌质粒菌、布鲁氏质粒菌和鼠疫耶尔森氏质粒菌污染环境土壤建立模拟样本,除了LAMP检测鼠疫耶尔森氏质粒菌的检出限为44 cfu/g外,LAMP和Real Amp对其他质粒菌的检出限均可达4.4 cfu/g;且与实时荧光定量PCR试剂平行对比检测含高、中、低浓度（4.4×101 cfu/g4.4×108 cfu/g）共24份土壤模拟样本,结果与预期一致。结论:本研究建立的土拉弗朗西斯氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、布鲁氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的环介导等温扩增技术,特异性强、灵敏度高,仪器简便、成本低廉,反应时间较短,1 h即可完成,易于基层的推广使用;而实时荧光环介导等温扩增技术灵敏度更,2040min即可查看扩增结果,简便快速;两种检测技术与实时荧光定量PCR试剂平行对比检测模拟样本,准确率和检出率均能保持持平,有望为临床诊断、环境污染检测、应对生物恐怖威胁和维护公众安全等方面提供有效、可靠的快速检测手段。
张艳[9]（2018）在《云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义》文中指出目的了解云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的分布及其流行现状;完善三种致病耶尔森菌的PCR基因检测方法。方法1.样本采集:共选取云南省野鼠鼠疫疫源地和云南省家鼠鼠疫疫源地共11个地区,家鼠鼠疫疫源地包括:梁河县、宜良县、保山市、弥勒县、弥渡县、玉溪市、文山市;野鼠鼠疫疫源地包括:玉龙县、剑川县、洱源县、鹤庆县。捕鼠采用鼠铗法;同时采集部分家鼠鼠疫疫源地的犬类肛拭子。2.三种致病耶尔森氏菌筛查基因确定:通过对采集的部分样本进行实验,确定筛查三种致病耶尔森氏菌的目标基因。3.PCR初筛:将采取的鼠结盲肠部及其内容物和犬类肛拭子共4985份样本置于10mL改良磷酸盐缓冲液（PBS）中,4℃冷增菌15-21天后用其沉淀液提取DNA,并对foxA、inv、0392基因进行PCR筛查。4.细菌筛查:将初筛过程中PCR阳性样本接种在CIN琼脂平板上,于28℃条件下、24h培养,挑取可疑菌落对foxA、inv、0392基因进行细菌PCR筛查。5.保菌处理:对细菌筛查阳性样本,提取其DNA进行PCR检测并保存其纯菌样本,置于-80℃冰箱保存。6.对实验结果进行统计和分析:数据分析采用R×C列联表的χ2检验,使用SPSS17.0进行统计分析,检验水准P<0.05为有统计学差异。结果1.三种致病耶尔森氏菌筛查基因确定情况:2016年1-5月采集宜良、丽江、弥勒、弥渡四个地区1344份样本和其他菌株进行foxA、inv、F1、0392基因筛查。其中foxA、inv基因分别对筛查小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌筛查具有特异性,F1基因对筛查鼠疫耶尔森氏菌会出现非特异性条带,0392基因对鼠疫耶尔森菌筛查不会出现非特异性条带具有特异性,采用0392基因作为对鼠疫耶尔森菌筛查的目标基因。2.云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的分离情况:2016年1月至2017年10月,共采集云南省11个地区样本4985份样本,其中foxA阳性样本菌株共248株,分离为4.97%;初筛0392阳性样本6份,阳性率0.12%、初筛inv阳性样本0份。3.云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的统计学分析:云南省11个地区的三种致病耶尔森氏菌阳性率不完全相同（χ2=197.944,P<0.05）;其中0392基因统计分析P>0.05,无统计学意义。foxA阳性菌株（χ2=333.74,P<0.05）具有统计学差异。Inv均为阴性无差异。4.云南省部分鼠疫疫源地鼠类和犬类统计学分析:鼠类样本共4284份,犬类样本共701份。其中鼠类foxA阳性菌株有225株,分离率为4.97%。犬类肛拭子foxA阳性菌株有23株,分离率为3.28%,统计分析（χ2=4.95,P=0.024<0.05）具有统计学差异,即鼠类foxA阳性菌株分离率高于犬类肛拭子foxA阳性菌株分离率。5.云南省野鼠鼠疫疫源地和家鼠鼠疫疫源地统计学分析:云南省野鼠疫源地和家鼠疫源地foxA阳性菌株分离率不完全相同（χ2=164.51,P<0.05）,野鼠鼠疫疫源地的foxA阳性菌株分离率比家鼠鼠疫疫源地的分离率高。其中在野鼠鼠疫疫源地中玉龙县的foxA阳性菌株分离率比其他三个县的分离率高,在家鼠鼠疫疫源地以梁河县和弥勒县的foxA阳性菌株分离率较高。6.云南省部分鼠疫疫源地foxA阳性菌株在鼠类型分布情况:不同鼠类型的foxA阳性菌株分离率有差异（χ2=86.20,P<0.05）。其中家鼠鼠疫疫源地鼠类型主要是褐家鼠和黄胸鼠,野鼠鼠疫疫源地鼠类型主要是齐氏姬鼠、大绒鼠和中华姬鼠。对五种鼠类型进行两两比较:大绒鼠和齐氏姬鼠的foxA阳性菌株分离率要高于其他三种鼠的分离率,且foxA阳性菌株分离率主要分布在野鼠鼠疫疫源地,以齐氏姬鼠、大绒鼠为主。7.玉龙县和剑川县foxA阳性菌株分布情况:玉龙县鼠类样本共有853份,以南溪村委会旦后村foxA阳性菌株分离率最高。玉龙县的鼠类样本以大绒鼠foxA阳性菌株分离率要高于其他类型鼠类。剑川县样本包括鼠样本794份样本,foxA阳性菌株分离率较高地区主要集中在石龙村和长乐村。剑川县采集鼠类样本foxA阳性菌株分离率无统计学差异。结论1.云南省野鼠鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森菌鼠类标本总体分离率高于家鼠鼠疫疫源地。2.在初筛疫源地现场标本或者处理鼠疫疫情时,使用鼠疫菌染色体上的特异基因如YPO0392上基因比在质粒上的F1基因进行PCR中更具说服力。3.在对疫源地的三种致病耶尔森菌监测中,可采用0392、foxA、inv三种目标基因进行组合筛查三种致病耶尔森菌。
冯娜[10]（2017）在《免疫磁珠捕获技术结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森氏菌的研究》文中进行了进一步梳理鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）引起的一种烈性传染病,其具有传染性强、病死率高、传播速度快、自然疫源性等诸多特点。人类历史上,曾经发生过三次鼠疫大流行,引起数以亿计人死亡,给人类带来过沉重灾难。在我国,鼠疫被列为甲类传染病。随着现代医学技术的不断发展,鼠疫疫情虽已得到有效控制,但近年来,动物间鼠疫的流行区域不断扩大,人间鼠疫病例呈上升态势。与此同时,鼠疫菌作为一种典型的生物战剂及生物恐怖制剂,时刻威胁着人类的安全。由此可见,鼠疫的监控对人类健康安全、经济发展和社会稳定具有重要意义。众所周知,对鼠疫菌快速、有效的检测是控制其传染的重要手段。目前,对鼠疫菌的常规检测主要包括细菌学检测、免疫学检测、分子生物学检测等。细菌学检测一般分四步进行——显微镜镜检、细菌培养、鼠疫噬菌体裂解实验、动物实验。该方法耗时长、需要大量人力物力,不适用于鼠疫菌大量筛查及现场检测。分子生物学检测,即通过体外扩增特异性的核酸片段实现对鼠疫菌的检测,该方法虽然具有快速、灵敏、特异等优点,但其往往需要特定仪器才能进行,且价格昂贵,操作不便。因此,不适用于偏远地区实验室及野外检测。免疫学方法是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法,主要以胶体金、酶联免疫吸附实验等方法为代表。这些方法具有操作简便、安全性高、特异性好且灵敏度高等优点,但在检测前一般都需要进行增菌培养,耗费大量时间,并且该方法抗干扰能力较差。因此,建立一种可快速、高效、适用于偏远地区,且抗干扰能力强的检测方法十分重要。环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP）是由Notomi等人于2000年报道的一种分子生物学检测新技术。此技术针对靶基因的4—6个特异性区域,分别设计特异性引物,在一种具备链置换活性的dna聚合酶（bstdnapolymerase）的作用下,在恒温条件即可实现对目的基因快速、高效、特异性检测。lamp扩增反应过程中会形成大量的、白色焦磷酸镁（mg2p2o7）沉淀,因此,可通过肉眼或运用实时浊度仪检测沉淀生成量的多少来判断扩增反应进行的程度。若在反应前向反应体系中加入钙黄绿素这种复合荧光素,则可通过肉眼直接观察反应体系颜色是否由黄色变为绿色来判断反应是否发生。实际检测中,待检样本通常是复杂的混合物,多种杂质往往会对检测结果产生干扰,难于直接进行检测。免疫磁珠技术（immunomagneticbeadstechniquces）能将靶标物与杂质分离,从而实现靶标物的富集。免疫磁珠技术是20世纪70年代兴起的一种基于免疫学原理的分离技术。此技术是一种利用具有超顺磁性的磁性微球作为载体对目标物进行捕获、富集的生物学技术。这种具有超顺磁性的微球在经过一系列活化后,并与生物基团或者生物配体有效地结合在一起才可形成免疫磁珠,实现对待检物的特异性分离。本研究将免疫磁珠分离技术（immunomagneticseparation,ims）与环介导恒温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplificationofdna,lamp）相结合,以lamp特异性检测为基础,以磁珠捕获dna或免疫磁珠捕获菌体为条件,分别建立了磁珠捕获dna法结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫菌以及免疫磁珠捕获菌体法结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫菌。分别对两种检测方法的lamp检测体系、磁珠捕获体系、免疫磁珠制备体系进行优化,以及分别对每种方法的灵敏度、特异性、抗干扰能力、实际样本应用等多个方面均进行了全面的评价。本研究基于鼠疫菌3a保守序列,设计lamp引物,并以扩增效率、特异性为标准从设计出的多组引物中筛选出最佳引物。并以筛选出的最佳引物为基础,对lamp反应体系中,bstdna聚合酶加入量、dntps加入量、镁离子浓度等反应条件进行了优化,最终建立了25μl体积的lamp反应体系,具体为:10×thermopolbuffer2.5μl,mgso4（100mm）1.5μl,dntpmix（2.5mm）14μl,fip（100mm）0.4μl,bip（100mm）0.4μl,f3（10mm）0.5μl,b3（10mm）0.5μl,lf（10mm）0.2μl,bstdnapolymerase,largefragment（8,000u/ml）1μl,水3μl,模板1μl。65℃反应60min。并对建立的lamp反应体系在鼠疫菌检测方面的灵敏度、特异性及抗干扰能力等性能进行评价。实验结果显示,建立的lamp反应体系在鼠疫菌检测方面有良好的特异性、抗干扰能力,灵敏度可达100copy/ml。在磁珠捕获dna法结合lamp技术快速检测鼠疫菌研究中,将lamp技术与磁珠捕获dna技术相结合,依据磁珠加入量、dna富集程度对磁珠捕获dna体系进行优化,得到最佳体系。并对该检测方法的灵敏度、特异性及抗干扰能力进行了评价,将该方法与常规pcr检测技术进行对比。实验结果显示,该方法特异性良好,对鼠疫菌检测灵敏度可达10copy/ml,较常规pcr技术灵敏度高100倍。在脾脏、肺脏干扰情况下其灵敏性依然可以达到10copy/ml,比常规pcr技术高出1000倍。在肝脏悬液干扰情况下该检测方法的灵敏度稍有降低至103copy/ml,仍然比常规pcr技术高出10倍。在免疫磁珠捕获菌体法结合lamp技术快速检测鼠疫菌研究中,首先,基于实验室已有的鼠疫菌f1单克隆抗体,采用edc/nhss化学偶联法将鼠疫菌抗体与磁珠相偶联制备免疫磁珠。按实际捕获效率、抗体偶联率、抗体添加量、检测中免疫磁珠用量等进行了优化,并对该检测方法的灵敏度、特异性、抗干扰能力等方面进行了全面评价,并将该方法与常规pcr检测技术进行对比。实验结果显示,该方法可特异地捕获待检混合物中的鼠疫菌,灵敏度为1copy/ml,较常规pcr技术灵敏度高100倍。在脾脏、肺脏干扰情况下其灵敏性为10copy/ml,其灵敏度比常规pcr技术高出1000倍。在肝脏干扰情况下灵敏性为100copy/ml,较常规pcr技术高100倍。随后,采用灭活鼠疫菌为免疫原免疫小鼠,经小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、细胞株克隆、腹水制备、抗体纯化等步骤制备出不同于f1抗体的鼠疫菌单克隆抗体,并将制备出的单抗应用于免疫磁珠捕获菌体法结合环介导恒温扩增技术检测鼠疫菌。实验结果显示,制备出的抗体效价较高,且在检测方法上有较好的灵敏度,可应用于鼠疫菌的快速检测。本研究建立了两种较为成熟的鼠疫菌检测方法,这两种检测方法操作简便、无需大型仪器、成本低廉,且具有较高的灵敏性、极强的特异性、很强的抗干扰能力,所以,这两种检测技术适合用于现场筛查、野外作业及偏远地区检测工作的应用。在现有免疫学检测方法中,表达于鼠疫菌表面的F1抗原已成为唯一的靶标物,而鼠疫菌只有以37℃人工培养或哺乳动物体内为条件才可在表面形成F1抗原,而鼠疫菌最适生长温度为26℃,且自然环境中温度远远低于37℃,因此,自然环境下,鼠疫菌表面并不表达F1抗原。这一现象的存在,对现有鼠疫菌免疫学方法的检测带来诸多不便。本研究制备出的单克隆抗体对表面不表达F1抗原的鼠疫菌有良好的特异性,弥补了现阶段免疫学检测的漏洞,为鼠疫菌的检测提供了更广阔的前景。
二、鼠疫耶尔森菌检测技术研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼠疫耶尔森菌检测技术研究进展（论文提纲范文）
（1）鼠疫核酸诊断技术的应用概述（论文提纲范文）
| 1 聚合酶链反应(PCR) |
| 1.1 普通PCR |
| 1.2 多重PCR |
| 1.3 实时荧光定量PCR |
| 1.4 数字PCR |
| 2 恒温核酸扩增技术 |
| 2.1 环介导等温扩增(LAMP) |
| 2.2 重组酶聚合酶等温扩增(RPA) |
| 2.3 聚合酶螺旋反应(PSR) |
| 3 液相芯片(Luminex xMAP) |
| 4 原位荧光杂交(FISH) |
| 5 DNA条形码 |
| 6 结 语 |
（2）应用鼠疫耶尔森菌环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测1例自然携带噬菌体的旱獭脏器（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物材料 |
| 1.2.2 细菌培养 |
| 1.2.3 鼠疫耶尔森菌反向间接血凝试验(reverse indirect hemagglutination test, RIHA) |
| 1.2.4 鼠疫胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatography, RGICA) |
| 1.2.5 模板的制备 |
| 1.2.6 鼠疫耶尔森菌环介导等温扩增(LAMP)技术 |
| 2 结 果 |
| 2.1 被试旱獭肠组织鼠疫耶尔森菌常规检测法的检测结果 |
| 2.2 鼠疫耶尔森菌LAMP技术检测结果 |
| 3 讨 论 |
（3）环介导等温扩增技术检测鼠疫耶尔森菌的敏感性和特异性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂及仪器 |
| 1.1.2 实验菌株 |
| 1.2 鼠疫耶尔森菌常规检测方法 |
| 1.2.1 反向间接血凝试验（reverse indirect haemagglutination,RIHA） |
| 1.2.2 鼠疫胶体金免疫层析法（colloidal gold immunochromatography assay,RGICA） |
| 1.2.3 PCR |
| 1.3 LAMP技术优化及菌株检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 常规检测法结果 |
| 2.2 LAMP技术优化 |
| 2.3 LAMP技术的敏感性 |
| 2.4 LAMP技术的特异性 |
| 3 讨论 |
（4）PCR技术在鼠疫检测中的应用现状（论文提纲范文）
| 1 PCR技术概述 |
| 2 PCR技术在鼠疫检测中的应用 |
| 2.1 传统PCR技术 |
| 2.1.1 常规PCR |
| 2.1.2 多重PCR |
| 2.1.3 巢式PCR |
| 2.1.4 竞争性PCR |
| 2.2 荧光定量PCR技术 |
| 3 相关核酸扩增检测技术的研究 |
| 4 小 结 |
（5）食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 小肠结肠炎耶尔森菌概述 |
| 1.1.1 病原学研究 |
| 1.1.2 流行病学与药物敏感性 |
| 1.1.3 两种小肠结肠炎耶尔森菌外膜蛋白的概述 |
| 1.2 小肠结肠炎耶尔森菌检测技术进展 |
| 1.2.1 培养检测 |
| 1.2.2 分子生物学检测 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.3 免疫磁珠分离技术 |
| 1.3.1 免疫磁珠的原理与结构特点 |
| 1.3.2 免疫磁珠分离技术的优势 |
| 1.3.3 免疫磁珠分离技术的实际应用 |
| 1.4 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.4.1 实时荧光定量PCR技术原理与特点 |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR技术的应用 |
| 1.5 Red重组技术 |
| 1.5.1 Red重组技术原理以及优势 |
| 1.5.2 Red重组技术应用实例 |
| 1.6 研究目的与内容 |
| 第2章 小肠结肠炎耶尔森菌外膜蛋白的表达纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验用菌株与载体 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 细菌的培养以及基因组提取 |
| 2.2.4 ail,ompF基因生物信息学分析及序列扩增 |
| 2.2.5 原核表达载体的构建与验证 |
| 2.2.6 重组外膜蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 ail,ompF基因生物信息学分析结果 |
| 2.3.2 外膜蛋白基因的扩增与16SrDNA验证 |
| 2.3.3 原核表达载体的构建 |
| 2.3.4 三种外膜蛋白的表达纯化结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 扩增基因的选择标准 |
| 2.4.2 表达载体选择与包涵体蛋白纯化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 小肠结肠炎耶尔森菌免疫磁珠的制备与参数优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验菌株与动物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 重组外膜蛋白抗血清的制备 |
| 3.2.4 多克隆抗体的纯化以及效价的测定 |
| 3.2.5 多克隆抗体的免疫印迹分析(Western-blot) |
| 3.2.6 免疫磁珠的制备 |
| 3.2.7 免疫磁珠制备参数优化 |
| 3.2.8 免疫磁珠捕获小肠结肠炎耶尔森菌的特异性评价 |
| 3.2.9 扫描电镜(SEM)观察免疫磁珠-小肠结肠炎耶尔森菌复合物 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组外膜蛋白多克隆抗体的纯化以及效价的测定 |
| 3.3.2 多克隆抗体的免疫印迹分析(Western-blot)结果 |
| 3.3.3 免疫磁珠制备参数的优化 |
| 3.3.4 免疫磁珠捕获小肠结肠炎耶尔森菌特异性评价 |
| 3.3.5 扫描电镜(SEM)观察免疫磁珠-小肠结肠炎耶尔森菌复合物 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 免疫磁珠制备参数的优化 |
| 3.4.2 免疫磁珠捕获能力与特异性分析 |
| 3.4.3 两种抗体制备磁珠捕获效率差异分析 |
| 3.4.4 多抗交叉性原因分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验菌株以及载体 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 pKD46质粒抗性改造与验证 |
| 4.2.4 感受态细胞的制备与电转化 |
| 4.2.5 重叠PCR扩增抗性片段 |
| 4.2.6 抗性片段的电转化 |
| 4.2.7 PCR鉴定ompF基因敲除突变株 |
| 4.2.8 基因敲除菌株吸附纯化兔抗血清 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 pKD46质粒抗性改造与验证 |
| 4.3.2 重叠PCR扩增抗性片段结果 |
| 4.3.3 PCR鉴定小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 供体同源臂的长度对同源重组效率的影响 |
| 4.4.2 提高同源同组效率需注意的其他因素 |
| 4.4.3 构建ompF基因敲除突变株的意义 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 IMBs-qPCR检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌方法建立 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 基于在线软件设计foxA荧光定量PCR引物 |
| 5.2.3 建立荧光定量PCR标准曲线 |
| 5.2.4 荧光定量PCR检测foxA基因的重复性检测 |
| 5.2.5 荧光定量PCR检测foxA基因的特异性评价 |
| 5.2.6 IMBs-qPCR检测食品(肉、奶)中小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.2.7 IMBs-qPCR检测野生型与基因缺失菌株捕获效率差异 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 基于在线软件设计foxA荧光定量PCR引物 |
| 5.3.2 建立荧光定量PCR标准曲线 |
| 5.3.3 荧光定量PCR的重复性检测 |
| 5.3.4 荧光定量PCR检测foxA基因的特异性评价 |
| 5.3.5 IMBs-qPCR检测食品(肉、奶)中小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.3.6 免疫磁珠对野生型与OmpF基因缺失型菌株捕获效率对比 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 荧光定量PCR检测基因的选择 |
| 5.4.2 IMBs-qPCR检测食品中的小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.4.3 IMBs-qPCR检测体系的优化 |
| 5.4.4 IMBs-qPCR检测方法展望 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）乳制品和肉类中重要致病菌实时荧光重组酶聚合酶扩增（real-time RPA）快速检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 RPA技术概述 |
| 1.1.1 RPA技术及其原理 |
| 1.1.2 RPA和其它等温核酸扩增技术以及PCR的对比 |
| 1.1.3 RPA技术的应用及研究现状 |
| 1.1.3.1 植物病毒 |
| 1.1.3.2 动物和人病毒 |
| 1.1.3.3 转基因作物 |
| 1.1.3.4 寄生虫 |
| 1.1.3.5 动物源性成分 |
| 1.1.3.6 癌细胞 |
| 1.1.3.7 细菌 |
| 1.1.4 Real-time RPA技术要点和难点 |
| 1.2 致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌概述 |
| 1.2.1 特性及感染现状 |
| 1.2.2 检测现状 |
| 1.3 食品中的大肠埃希菌O157:H7概述 |
| 1.3.1 特性及感染现状 |
| 1.3.2 检测现状 |
| 1.4 本课题的研究意义及主要内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 主要内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光RPA方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 材料与试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA提取 |
| 2.2.1.1 奶粉溶液中DNA提取方法比较 |
| 2.2.1.2 菌种DNA的准备 |
| 2.2.2 引物探针设计 |
| 2.2.3 反应体系和条件 |
| 2.2.4 特异性 |
| 2.2.5 灵敏度 |
| 2.2.6 稳定性 |
| 2.2.7 人工污染实验 |
| 2.2.8 实际样品测试 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA提取方法的比对结果 |
| 2.3.2 引物探针筛选结果 |
| 2.3.3 反应程序的设置 |
| 2.3.4 特异性实验结果 |
| 2.3.5 灵敏度实验结果 |
| 2.3.6 稳定性实验结果 |
| 2.3.7 人工污染实验结果 |
| 2.3.8 实际样品测试 |
| 2.3.9 数据处理 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 检测大肠埃希菌O157:H7实时荧光RPA方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 材料与试剂 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 DNA提取 |
| 3.2.2 引物探针设计与筛选 |
| 3.2.3 反应体系和条件 |
| 3.2.4 特异性 |
| 3.2.5 灵敏度 |
| 3.2.6 稳定性 |
| 3.2.7 人工污染实验 |
| 3.2.8 实际样品测试 |
| 3.2.9 数据处理 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 引物探针筛选结果 |
| 3.3.2 特异性实验结果 |
| 3.3.3 灵敏度实验结果 |
| 3.3.4 稳定性实验结果 |
| 3.3.5 人工污染实验结果 |
| 3.3.6 实际样品测试 |
| 3.3.7 数据处理 |
| 3.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）中山市神湾港区鼠形动物及其携带病原体的调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鼠形动物及鼠传疾病 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.3 研究背景与意义 |
| 第二章 中山市神湾港区鼠形动物监测分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 监测时间 |
| 2.2.2 监测地点 |
| 2.2.3 材料 |
| 2.2.4 监测方法 |
| 2.2.5 鼠形动物及体表寄生虫标本制作与形态鉴定 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 神湾港鼠形动物的种群构成 |
| 2.3.2 神湾港鼠形动物的分布 |
| 2.3.3 鼠密度及季节消长 |
| 2.3.4 鼠形动物体表携带寄生虫 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 中山市神湾港鼠形动物携带病原微生物的调查研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 仪器与试剂 |
| 3.2.3 核酸的提取 |
| 3.2.4 病原微生物检测 |
| 3.2.5 阳性结果的进一步确认 |
| 3.2.6 系统进化树的构建 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 鼠形动物病原微生物感染情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 利用DNA条形码技术鉴定鼠形动物及其体表寄生虫 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验样品与分组 |
| 4.2.2 仪器与试剂 |
| 4.2.3 鼠形动物的DNA条形码鉴定 |
| 4.2.4 体表寄生虫的DNA条形码鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鼠形动物DNA条形码鉴定结果 |
| 4.3.2 体表寄生虫DNA条形码鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文及专利 |
（8）LAMP和RealAmp技术检测四种细菌性生物战剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要中英文缩写索引 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 土拉弗朗西斯氏菌研究现状 |
| 1.1.1 土拉弗朗西斯氏菌病原学 |
| 1.1.2 土拉热流行概况及其危害 |
| 1.1.3 土拉弗朗西斯氏菌鉴定技术进展 |
| 1.2 类鼻疽伯克霍尔德菌研究现状 |
| 1.2.1 类鼻疽伯克霍尔德菌病原学 |
| 1.2.2 类鼻疽病流行概况及其危害 |
| 1.2.3 类鼻疽伯克霍尔德菌鉴定技术进展 |
| 1.3 布鲁氏菌研究现状 |
| 1.3.1 布鲁氏菌病原学 |
| 1.3.2 布鲁氏菌流行概况及其危害 |
| 1.3.3 布鲁氏菌鉴定技术进展 |
| 1.4 鼠疫耶尔森氏菌研究现状 |
| 1.4.1 鼠疫耶尔森氏菌病原学 |
| 1.4.2 鼠疫耶尔森氏菌流行概况及其危害 |
| 1.4.3 鼠疫耶尔森氏菌鉴定技术进展 |
| 1.5 环介导等温扩增技术 |
| 1.6 实时荧光环介导等温扩增技术 |
| 1.7 本课题的主要研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 LAMP引物设计 |
| 2.2.2 LAMP和 RealAmp反应条件和体系 |
| 2.2.3 质粒的制备 |
| 2.2.4 特异性实验 |
| 2.2.5 灵敏度实验 |
| 2.2.6 土壤模拟样本检测 |
| 2.2.7 PCR、LAMP、Real Amp 和荧光定量 PCR 的对比分析 |
| 第3章 结果 |
| 第一部分 LAMP 检测四种细菌性生物战剂的应用研究 |
| 3.1 环介导等温扩增产物的电泳结果 |
| 3.2 优化环介导等温扩增反应体系 |
| 3.2.1 体系温度的单因素优化 |
| 3.2.2 体系引物对比例的单因素优化 |
| 3.2.3 体系dNTPs的单因素优化 |
| 3.2.4 体系Mg~(2+)浓度的单因素优化 |
| 3.2.5 体系Betaine浓度的单因素优化 |
| 3.3 LAMP特异性实验 |
| 3.3.1 土拉弗朗西斯氏菌特异性实验结果 |
| 3.3.2 类鼻疽菌特异性实验结果 |
| 3.3.3 布鲁氏菌特异性实验结果 |
| 3.3.4 鼠疫菌特异性实验结果 |
| 3.3.5 LAMP特异性验证 |
| 3.4 LAMP灵敏度实验 |
| 3.4.1 以重组质粒为模板的灵敏度实验 |
| 3.4.2 以基因组DNA为模板的灵敏度实验 |
| 3.5 土壤模拟样本检出限的LAMP检测 |
| 第二部分 Real Amp 检测四种细菌性生物战剂的应用研究 |
| 3.6 RealAmp扩增产物的结果 |
| 3.7 RealAmp特异性实验 |
| 3.7.1 土拉弗朗西斯氏菌特异性实验结果 |
| 3.7.2 类鼻疽菌特异性实验结果 |
| 3.7.3 布鲁氏菌特异性实验结果 |
| 3.7.4 鼠疫菌特异性实验结果 |
| 3.7.5 特异性验证 |
| 3.8 RealAmp灵敏度 |
| 3.8.1 以重组质粒为模板的灵敏度实验 |
| 3.8.2 以基因组DNA为模板的灵敏度实验 |
| 3.9 土壤模拟样本检出限的RealAmp检测 |
| 3.10 PCR、LAMP、RealAmp和 qPCR的对比分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（9）云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 鼠疫流行现状 |
| 1.2 小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌流行现状 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 三种致病耶尔森菌PCR检测结果 |
| 3.2 三种致病耶尔森菌筛查基因确定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1：测序结果 |
| 附录2：研究生期间发表论文 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）免疫磁珠捕获技术结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森氏菌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 1 鼠疫菌的研究进展 |
| 1.1 鼠疫的流行及危害 |
| 1.2 鼠疫菌的生物学特性及致病机制 |
| 1.3 鼠疫菌常规检测技术现状 |
| 1.3.1 细菌学检测 |
| 1.3.2 免疫学检测 |
| 1.3.3 分子生物学检测 |
| 2 环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP） |
| 2.1 环介导恒温扩增技术的原理 |
| 2.2 环介导恒温扩增技术的应用 |
| 3 免疫磁珠技术（ immunomagnetic beads techniquces） |
| 3.1 免疫磁珠技术的原理 |
| 3.2 免疫磁珠技术的应用 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 5 本研究的内容 |
| 第一章 鼠疫菌LAMP最佳引物的筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器和试剂 |
| 2.1.2 实验菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 LAMP引物设计与合成 |
| 2.2.2 DNA模板的制备 |
| 2.2.3 LAMP反应体系及扩增条件 |
| 2.2.4 LAMP扩增反应检测 |
| 2.2.5 特异性试验 |
| 2.2.6 灵敏度实验 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 最佳引物筛选 |
| 3.2 最佳环引物筛选 |
| 3.3 特异性实验 |
| 3.4 LAMP检测鼠疫菌的灵敏度 |
| 4 结论 |
| 第二章 环介导恒温扩增体系的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器和试剂 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DNA模板的制备 |
| 2.2.2 LAMP反应体系及扩增条件 |
| 2.2.3 常规PCR反应体系及扩增条件 |
| 2.2.4 LAMP自建体系中Mg2+加入量优化 |
| 2.2.5 LAMP自建体系中dNTPs加入量优化 |
| 2.2.6 LAMP自建体系中Bst DNA聚合酶加入量优化 |
| 2.2.7 LAMP扩增鼠疫菌灵敏度检测 |
| 2.2.8 LAMP扩增鼠疫菌特异性检测 |
| 2.2.9 LAMP扩增11株耶尔森氏菌混合菌液检测 |
| 2.2.10 小鼠脏器干扰实验 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 LAMP自建体系中Mg2+加入量优化 |
| 3.2 LAMP自建体系中dNTPs加入量优化 |
| 3.3 LAMP自建体系中Bst DNA聚合酶加入量优化 |
| 3.4 LAMP扩增鼠疫菌灵敏度检测 |
| 3.5 LAMP扩增鼠疫菌特异性检测 |
| 3.6 LAMP扩增11株耶尔森氏菌混合菌液检测 |
| 3.7 小鼠脏器干扰实验 |
| 4 结论 |
| 第三章 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术的建立并用于检测鼠疫耶尔森氏菌 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂和仪器 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DNA模板的制备 |
| 2.2.2 LAMP反应体系及扩增条件 |
| 2.2.3 常规PCR反应体系及扩增条件 |
| 2.2.4 磁珠捕获DNA |
| 2.2.5 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术检测混合菌液中DNA |
| 2.2.6 磁珠捕获DNA体系优化 |
| 2.2.7 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术用于小鼠脏器干扰实验 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术检测混合菌液中DNA |
| 3.2 磁珠捕获DNA体系优化 |
| 3.3 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术用于小鼠脏器干扰实验 |
| 4 结论 |
| 第四章 免疫磁珠捕获菌体法结合环介导恒温扩增技术的建立并用于检测鼠疫耶尔森氏菌 |
| 第一部分 基于鼠疫菌F1抗体制备免疫磁珠结合环介导恒温扩增技术的建立及应用 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂与仪器 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 合成 |
| 2.2.2 免疫磁珠制备及菌体的捕获 |
| 2.2.3 LAMP反应体系及扩增条件 |
| 2.2.4 应体系及扩增条件 |
| 2.2.5 免疫磁珠捕获鼠疫菌灵敏度检测 |
| 2.2.6 免疫磁珠捕获鼠疫菌特异性检测 |
| 2.2.7 免疫磁珠偶联抗体量优化 |
| 2.2.8 捕获菌体所用免疫磁珠量优化 |
| 2.2.9 脏器掺菌实验 |
| 2.2.10 实际样本检测 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 免疫磁珠捕获鼠疫菌灵敏度检测 |
| 3.2 免疫磁珠捕获鼠疫菌特异性检测 |
| 3.3 免疫磁珠偶联抗体量优化 |
| 3.4 捕获菌体所用免疫磁珠量优化 |
| 3.5 脏器掺菌实验 |
| 3.6 实际样本检测 |
| 4 结论 |
| 第二部分 鼠疫菌（26℃培养）单克隆抗体的制备及应用 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器与试剂 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫原的制备 |
| 2.2.2 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 抗体浓度及效价的测定 |
| 2.2.4 抗体鉴定 |
| 2.2.5 免疫磁珠结合LAMP技术检测鼠疫菌（26℃培养）体系的建立及评价 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 单克隆抗体浓度和效价 |
| 3.2 单克隆抗体分型鉴定 |
| 3.3 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.4 免疫磁珠捕获鼠疫菌灵敏度检测 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 主要仪器 |
| 常用试剂及配制方法 |
| 个人简历 |
| 主要学习经历 |
| 攻读硕士研究生期间获得的奖励 |
| 在学期间的研究成果目录 |
| 承担课题 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
四、鼠疫耶尔森菌检测技术研究进展（论文参考文献）
- [1]鼠疫核酸诊断技术的应用概述[J]. 史艳文,王梅. 中国地方病防治, 2021(06)
- [2]应用鼠疫耶尔森菌环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测1例自然携带噬菌体的旱獭脏器[J]. 谢辉,祁芝珍,李翔,杨建国,赵海红,刘中凯. 医学动物防制, 2021(12)
- [3]环介导等温扩增技术检测鼠疫耶尔森菌的敏感性和特异性研究[J]. 谢辉,祁芝珍,杨晓艳,袁静,李翔,赵海红. 微生物与感染, 2021
- [4]PCR技术在鼠疫检测中的应用现状[J]. 邴琪,李立东,赵斌,王铁峰. 中国地方病防治, 2021(02)
- [5]食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究[D]. 迟恒. 天津大学, 2020(01)
- [6]乳制品和肉类中重要致病菌实时荧光重组酶聚合酶扩增（real-time RPA）快速检测技术研究[D]. 刘婧文. 华南理工大学, 2019(02)
- [7]中山市神湾港区鼠形动物及其携带病原体的调查研究[D]. 陈利伟. 广东药科大学, 2019(02)
- [8]LAMP和RealAmp技术检测四种细菌性生物战剂的研究[D]. 李子微. 南华大学, 2019
- [9]云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义[D]. 张艳. 大理大学, 2018(12)
- [10]免疫磁珠捕获技术结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森氏菌的研究[D]. 冯娜. 安徽医科大学, 2017(02)