一、树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞凋亡并抑制其增殖（论文文献综述）
杜华珊[1]（2021）在《STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究》文中认为研究背景:宫颈癌是最常见的妇科癌症之一。每年全球大约有57万新发病例,31万死亡病例。大约95%的宫颈癌病例是由高危人类乳头瘤病毒（HPV）的持续感染引起的。尽管已有预防高危型HPV的疫苗,宫颈癌对妇女来说仍然是一场健康危机。因此,有必要为宫颈癌的预防和治疗提供新的视角。干扰素基因刺激因子（STING）是一种跨膜蛋白,是细胞质DNA传感通路的重要分子。越来越多的证据表明,STING通路除了能保护宿主免受多种致病性攻击外,在癌症中也起着至关重要的作用。在结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤中,与抗肿瘤T细胞启动和I型干扰素相关的STING信号被严重抑制以逃避免疫监视。STING在胃癌组织中低表达,与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴转移、临床病理分期和生存率有关。敲除STING可促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。此外,多项研究表明,STING激动剂可以作为单药或联合手术治疗、放化疗、免疫治疗发挥抗肿瘤作用,弥补传统疗法的不足。研究目的:目前,尚不清楚STING在宫颈癌发生发展过程中的具体作用。本研究检测了人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中STING的表达情况。通过构建沉默STING和过表达STING的稳定转染宫颈癌细胞系,进行细胞生物学行为实验探讨STING对于宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响和相关调控机制。此外,通过构建裸鼠皮下移植瘤模型进行体内实验对体外实验的结果进行验证,为宫颈癌预防和宫颈癌复发或转移的治疗提供新的思路。研究方法:第1部分:STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验1、通过qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验检测体外培养的人角质形成细胞Ha Ca T、宫颈上皮永生化细胞H8、四种宫颈癌细胞系（He La、Si Ha、C33A、Ca Ski）的STING m RNA和蛋白表达情况;2、构建沉默STING的sh RNA慢病毒载体。选择He La、Si Ha细胞系作为沉默STING的转染细胞系。设计构建STING基因的过表达慢病毒载体,转染C33A细胞系。鉴定稳定转染细胞系中STING的表达情况;3、通过CCK8实验、平板克隆实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验探究STING对于宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。第2部分:STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索1、下调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;2、上调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;3、应用免疫共沉淀实验检测STING是否与β-catenin结合;4、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;5、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,通过CCK8实验、平板克隆实验和Transwell小室实验探究下调STING表达对宫颈癌生物学行为的影响能否被β-catenin通路抑制剂所逆转。第3部分:沉默STING对宫颈癌细胞增殖能力影响的体内实验1、使用vector He La、sh STING-He La细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,探究移植瘤沉默STING对裸鼠体重影响;2、通过测量裸鼠移植瘤体积和绘制肿瘤生长曲线验证下调STING表达对于宫颈癌细胞体内增殖能力的影响;3、肿瘤组织进行HE染色,探究下调STING表达是否影响肿瘤组织病理形态;4、肿瘤组织进行免疫组化染色,验证沉默STING的He La细胞在体内成瘤后是否仍保持沉默STING的特征;5、通过免疫组化染色Ki67探究沉默STING对于移植瘤增殖能力的影响。研究结果:第1部分:1、qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验显示在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞、4种宫颈癌细胞系中STING表达水平有差异。与正常细胞相比,HPV阴性宫颈癌细胞系C33A中的STING表达降低,其余三种HPV阳性宫颈癌细胞系（He La、Si Ha、Ca Ski）STING表达升高;2、成功合成了靶向STING的sh RNA并筛选出干扰效率最高的sh RNA片段。成功构建并验证沉默STING基因的He La和Si Ha稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异。STING过表达慢病毒载体构建成功,成功构建并验证过表达STING基因的C33A稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异;3、STING表达下调后,He La及Si Ha细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力增强。过表达STING基因后,C33A细胞体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭的能力明显下降。第2部分:1、沉默STING后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显增加,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平也随之升高;2、STING过表达后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显减少,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平也随之明显降低;3、免疫共沉淀实验显示内源性STING可与β-catenin结合;4、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂,显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平与单纯沉默STING组比较明显降低;5、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂显示细胞体外增殖速度、克隆形成能力、迁移和侵袭的能力明显低于单纯沉默STING组。第3部分:1、裸鼠接种移植瘤后,sh STING-He La组裸鼠体重呈低于vector-He La组趋势,但趋势无统计学意义;2、sh STING-He La组肿瘤体积和生长速度明显大于对照组;3、HE染色显示vector-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紧密、胞核深染、细胞形态呈卵圆形;sh STING-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紊乱、血管组织较丰富;4、免疫组化染色显示体外构建的sh STING-He La细胞系成瘤后,STING低水平表达特征保留;5、免疫组化染色显示sh STING-He La组Ki67表达水平高于vector He La组Ki67表达水平。研究结论:1、不同类型的宫颈癌细胞STING表达水平不同,但STING的细胞生物学作用相同。STING可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭,在宫颈癌的发生发展中起抑癌基因作用;2、STING下调宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路中总β-catenin蛋白、活化β-catenin蛋白、核β-catenin蛋白以及Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）蛋白表达水平;3、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白质的表达上调。4、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的上调。5、STING通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制宫颈癌的发生发展。6、沉默STING对宫颈癌细胞体内增殖能力有促进作用。
贾文玉[2]（2021）在《基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用》文中研究表明目的:在临床样本中探讨膀胱癌肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞与肿瘤分期及恶性程度的关系,通过动物实验及细胞实验探究均一猪苓多糖（HPP）调节肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞从而发挥抗膀胱癌作用,在巨噬细胞亚型分析的基础上进一步明确猪苓均一多糖活化巨噬细胞抗肿瘤的免疫分子机制。方法:第一节:膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润与膀胱癌恶性程度的关系研究收集29例确诊为尿路上皮癌患者的基本临床资料（年龄、性别、临床诊断、病理分级）和膀胱病理组织切片,进行免疫组化染色,检测膀胱组织中M2亚型巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67的表达,分析M2亚型巨噬细胞的浸润程度与膀胱癌的分级、肿瘤细胞恶性程度的关系。第二节:均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响收集课题组前期采用BBN膀胱癌模型大鼠进行HPP药效研究的膀胱癌组织石蜡块,取空白组、模型组、HPP处理组及卡介苗处理组,将石蜡组织切片后进行免疫组化染色,检测膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206、CD16、CD86及细胞增殖指标Ki-67的表达情况,探讨HPP干预的膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞亚型的变化情况。第三节:均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究将人急性单核细胞白血病细胞THP-1用不同浓度（0,10,20,50,100,200 ng/mL）的佛波酯诱导为巨噬细胞,通过细胞形态、细胞黏附能力的变化及细胞膜表面分子CD14、CD68的表达情况判断出最佳的诱导浓度作为后续实验中的巨噬细胞模型。提取的均一猪苓多糖（HPP）对THP-1来源的巨噬细胞进行干预,采用RT-PCR法研究HPP对巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及INOS mRNA表达情况的影响,流式细胞术检测巨噬细胞膜表面分子CD86、CD16、CD40和CD23的表达,ELISA法检测细胞因子IL-1β、TNF-α的表达。HPP干预THP-1来源的巨噬细胞72 H后,更换新鲜培养基,继续培养24H,收集活化的巨噬细胞上清,按照巨噬细胞上清:新鲜培养基1:1的比例处理人膀胱癌细胞系T24及EJ,采用MTT法检测肿瘤细胞24 H和48 H的细胞活力变化,EDU增殖实验检测膀胱癌细胞48 H的增殖情况变化,克隆形成实验检测癌细胞增殖能力和成球能力,流式细胞术检测48 H的细胞周期和细胞凋亡的变化情况。Transwell实验检测细胞迁移能力的改变,Western Blot检测凋亡蛋白、上皮间质转化（EMT）相关蛋白以及通路分子JAK2-STAT5/NF-κB蛋白的表达。JAK2抑制剂AZD1480给予膀胱癌细胞系T24及EJ处理后,检测P-JAK2的表达情况及膀胱癌细胞细胞活力、细胞凋亡的变化情况。第四节:基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨用THP-1来源的巨噬细胞作为研究对象,给予均一猪苓多糖10 μ g/mL、T24肿瘤细胞上清:新鲜培养基1:1进行处理,培养72 H后收集细胞检测细胞膜表面分子CD209、CD301、CD172 α、CD36、CD163、CD16、CD23 及 CD206 的表达情况。细胞因子的检测是在刺激剂活化巨噬细胞72 H后更换新鲜培养基继续培养24 H,收集细胞上清,采用液相悬浮芯片技术检测 TNF-α、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL24、CCL22、CXCL9、CCL17、IL-23p40的含量,采用ELISA法检测TGF-β的表达情况。整理数据,根据上述细胞因子及细胞膜分子的表达情况,分析HPP活化巨噬细胞的抗肿瘤作用及肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤进展的机制。结果:第一节:患者的基础资料（年龄、性别）与膀胱癌的浸润程度以及病理分级之间无明显相关性（P>0.05）;M2亚型巨噬细胞表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67在浸润性膀胱癌中的表达均高于非浸润性膀胱癌（P<0.05）,在高级别膀胱癌中的表达均高于低级别膀胱癌（P<0.05）。CD163、CD206在膀胱癌组织中的浸润程度均与Ki-67的表达呈正相关（rs>0）,与CD206相比较,CD163和Ki-67表现出了更强的相关性（P<0.001）。第二节:与空白组大鼠相比较,BBN膀胱癌模型大鼠肿瘤组织内CD163和CD206的表达明显升高（P<0.05）,CD16和CD86显示出升高的趋势,但无统计学意义。与模型组相比较,BCG组和HPP组的CD163和CD206的表达量均呈现下降趋势,但只在CD163表现出显着性（P<0.05）,CD86和CD16的表达量均表现出来升高的趋势,但未表现出来明显的统计学意义（P>0.05）。模型组BBN膀胱癌大鼠的肿瘤组织中Ki-67的表达量明显高于正常大鼠（P<0.05）,与模型组相比较,BCG和HPP干预后肿瘤组织中Ki-67明显减少（P<0.05）。第三节:HPP在0-100 μg/mL浓度范围内对人单核细胞系THP-1未表现出细胞毒性（P>0.05）;50 ng/mL PMA是THP-1诱导为巨噬细胞的最佳浓度;HPP能诱导THP-1来源的巨噬细胞IL-1 β、IL-6、INOS、TNF-α mRNA的表达升高（P<0.05）、上调细胞表面分子CD86、CD23、CD40、CD16（P<0.05）。HPP活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,并伴有时间依赖性（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的克隆形成能力,阻断细胞周期进程,使得细胞周期停滞在G0/G1期,减少肿瘤细胞向S期过度,从而抑制肿瘤增殖（P<0.05）;促进人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞凋亡,主要表现为促进晚期凋亡,细胞凋亡时伴有细胞体积的皱缩,并伴有凋亡抑制蛋白Bcl-2水平下降（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞迁移能力,抑制肿瘤细胞的上皮间质转化相关蛋白N-cadherin、Vimentin,上调E-cadherin的表达。HPP活化的巨噬细胞能够下调人膀胱癌细胞系EJ、T24细胞中通路分子 JAK2-STAT5/NF-κB 的表达（P<0.05）;JAK2 抑制剂 AZD1480 能够抑制 JAK2磷酸化蛋白P-JAK2的表达（P<0.05）、抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,促进细胞凋亡（P<0.05）。第四节:HPP上调细胞因子TNF-α、IL-1 β、IL-23 P40、IL-10及细胞膜受体CD16、CD86、CD23、CD40、CD36 的表达,下调了 CCL2、CCL24 及 CD209、CD301、SIRPα 的表达,对于 TGF-β、IL-6、CCL22、CCL17、CCL18、CXCL9、CD163、CD206 无明显影响;肿瘤细胞上清能够上调巨噬细胞中细胞因子TGF-β、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL22、CCL24 及细胞膜表面受体 SIRP α、CD36、CD16、CD86、CD209、CD163、CD23 的表达,下调 TNF-α 表达,对于 IL-23、CXCL9、CCL17、CD40、CD206、CD301的表达无明显影响。结论:1、膀胱癌患者肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的浸润程度与肿瘤的肌层浸润程度、病理分级及恶性程度有关。2、HPP能够下调膀胱癌大鼠肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的表达,上调M1亚型巨噬细胞的表达,促进肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞向M1亚型极化,并抑制肿瘤细胞的增殖。3、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24、EJ的细胞活力及增殖能力,阻断细胞周期,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移能力及上皮间质转化,HPP活化的巨噬细胞发挥抗肿瘤作用是通过JAK2-STAT5/NF-κB通路实现的。4、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞通过分泌炎症因子杀伤肿瘤细胞,并通过减轻肿瘤微环境中的免疫抑制来发挥抗膀胱癌作用;肿瘤细胞通过诱导TAMs分泌炎症抑制因子及免疫抑制分子诱导免疫系统的失活,从而促进肿瘤的进展。
李青[3]（2021）在《ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸》文中进行了进一步梳理肺癌是全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。据文献报道,过去的40年里,肺癌的5年生存率小于21%。肺腺癌（Lungadenocarcinoma,LUAD）作为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）最重要的亚型,发病率逐渐增多,成为备受关注的NSCLC亚型。伴随着靶向治疗的出现,晚期LUAD患者的5年总生存有所改善,但仍面临靶向药物耐药、获益人群受限、缓解率不高等问题。以PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫检查点阻断（Immunecheckpointblockade,ICB）及以抗原嵌合受体T细胞（CAR-T）治疗为代表的过继性T细胞转移（ACT）治疗的出现为晚期肺癌患者带来了新的希望。而目前PD-I/PD-L1抑制剂在实体瘤的临床有效率及瘤种反应率不尽相同。单纯抗PD-1/PD-L1免疫治疗在晚期NSCLC的客观有效率仅为20%,除了患者选择不足和肿瘤自身免疫原性低外,复杂的免疫抑制微环境,包括抑制性免疫细胞、细胞因子和代谢物,以及肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）数量和功能下降,是T细胞免疫和有效ICB治疗的主要障碍。因此,寻找新的免疫检查点分子作为替代或补充,以突破肿瘤免疫抑制性屏障,逆转肿瘤免疫抑制微环境是目前肿瘤免疫治疗亟需解决的问题。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是肿瘤免疫微环境的重要组成部分,而肿瘤浸润T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境中参与抗肿瘤免疫应答的最重要的免疫细胞,如何提高肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的浸润水平及功能是当下免疫治疗的研究热点。成熟T淋巴细胞膜表面可表达CD3分子,根据T细胞表面分化抗原的不同,T细胞可分为CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞二个亚群。CD4+T淋巴细胞,通过与外源性抗原肽-MHCII分子结合发挥辅助作用;CD8+T淋巴细胞,主要与内源性抗原肽-MHC-I分子结合、活化,借助于颗粒酶、穿孔素等发挥特异性杀伤功能,是机体免疫系统中最重要的效应细胞。目前研究表明肿瘤浸润淋巴细胞,特别是CD4+Th1和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）的存在与肿瘤患者较好的预后及肿瘤免疫治疗的疗效相关。FOXP3是Tregs的特异性转录因子。它不仅控制其表型,而且维持其免疫抑制功能,是应用最广泛的Treg标记。Treg通常通过接触依赖方式抑制Teffertor、NK或APC的激活,或通过分泌IL-10、TGF-β等抑制因子介导免疫抑制功能。目前大部分研究表明,在绝大多数肿瘤类型中,细胞毒性抗肿瘤免疫应答的主要细胞(如细胞毒CD8+T细胞、Th1导向的CD4+T细胞、三级淋巴结构（TLSs,tertiary lymphoid structures）的存在与良好的临床结果相关。相反,Tregs表达者预后较差。肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中Tregs和抑制性检查点分子等复杂的免疫抑制因子可以限制T细胞的浸润和杀伤能力,而这对于肿瘤的根除至关重要。因此,开展肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的研究对肿瘤的免疫治疗尤为重要。ILT4作为免疫球蛋白样转录子抑制性受体的一种,主要在髓系固有细胞（DC细胞、单核巨噬细胞及中性粒细胞）中表达,通过与经典或非经典组织相容复合体I类分子（MHC-I）结合,在维持母婴免疫耐受、器官移植耐受及炎症反应中发挥重大作用。研究表明,免疫细胞中ILT4的表达可有效抑制CD4+T细胞、CD8+细胞毒T细胞、NK细胞及树突状细胞的免疫活性,同时亦能诱导不同类型Treg细胞发挥免疫抑制作用。其虽在免疫学研究中取得十足的进展,但在肿瘤领域的研究相对较少。近年来,研究发现ILT4在NSCLC、白血病、乳腺癌、食管癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞中存在表达,且与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移等多种恶性生物学行为息息相关。此外,ILT4在髓系抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSC）中高表达,可促进肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAM）的M2极化,在创造肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用。但肿瘤源性ILT4对实体肿瘤免疫抑制性微环境中T淋巴细胞亚群的调控作用及相关机制尚无报道。研究目的1.通过免疫组化染色方法和大数据统计分析ILT4在肺腺癌中的表达及其与T细胞浸润与亚群分布的相关性,以及二者与患者预后的相关性,明确ILT4对免疫抑制微环境的调控作用。以此为基础构建肺腺癌患者预后Nomogram列线图模型,为患者预后的预测提供量化工具。2.体外利用CD3+、CD4+和CD8+T细胞及敲低/过表达ILT4的肺腺癌细胞株构建T细胞-肿瘤细胞共培养体系,应用CCK-8和流式细胞术检测T细胞的增殖和凋亡情况。旨在探讨肿瘤源性ILT4抑制T细胞浸润的可能机制。方法1.收集216例经烟台市烟台山医院病理科诊断明确的原发性肺腺癌患者的病理组织标本及临床病理资料,并通过电话随访的方式获得入组患者的生存资料。应用免疫组织化学染色法检测其ILT4及CD3、CD4、CD8、FOXP3在肿瘤癌巢及间质的表达情况;结合免疫组化结果和GEO公共数据库统计分析ILT4与肺腺癌预后的关系。其次,分别统计ILT4的表达与上述T淋巴细胞亚群在癌巢及间质的分布密度关系,探讨ILT4与T淋巴细胞两者共表达对肺腺癌患者生存预后的影响。2.利用KM-plotter在线工具（http://kmplot.com/）数据库分析肺腺癌患者ILT4的生存情况。对基因表达综合数据库（GEO）中的720例和461例LUAD患者分别进行无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分析。自动选择每个队列的最佳截止值,其他所有参数均为默认设置。从GEO数据库下载LUAD患者的基因表达谱（GSE50081;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50081）,GSE50081的基因注释基于微阵列平台GPL570,对127个L UAD样本进行了进一步的研究。对于癌症基因组图谱（TCGA）队列,泛癌的RNASeq数据从UCSC xena下载（https://xenabrowser.net/datapages/）,共纳入515个样本。用ssGSEA函数对R package GSVA中的Treg浸润评分进行量化。采用Spearman相关系数评价ILT4表达与Treg浸润的相关性。3.利用患者临床病理资料、ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据创建可评估患者预后生存的诺谟图。其中,利用Lasso回归,基于Lambda.1se筛选有意义的指标,将能够反应免疫微环境状态（即ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据）的这些自变量与其回归系数组成一个计算评分,即为lasso系数。将lasso回归筛选得到的指标联合临床病理参数制作诺谟图,以估算NSCLC患者2年和3年的生存率。其中模型的构建采用R语言3.0.1（R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria）和glmnet package进行LASSO Cox回归模型分析,并运用图形校准法检验模型的一致性/标定度（Calibration）及C-Index值评价模型的区分度。4.利用基因转染技术,分别敲低/过表达LUAD细胞系-H1975中ILT4的表达,应用Western blot、RT-PCR方法分别检测ILT4的转染效率。然后,运用Ficoll-Paque分离液分离健康志愿者全血中的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,采用相应T细胞亚群磁珠分选试剂盒分选并利用CD3单抗活化人CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群。将敲低/过表达ILT4的LUAD H1975细胞系（H1975-shILT4与H1975-ILT4）分别与活化的CD3+、CD4+及CD8+T细胞按2:1比例共培养48h。然后,分离共培养之后的T细胞。分别利用CCK-8法和流式细胞术检测共培养体系中T淋巴细胞亚群增殖和凋亡情况。结果1.ILT4在LUAD高表达,正常邻近组织低表达,其表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及较差的PFS、OS相关。此外,ILT4的表达与肿瘤浸润T淋巴细胞的减少有关。进一步行T细胞亚群分析显示,ILT4高表达肿瘤中癌巢和间质中浸润的CD8+T淋巴细胞的减少,Treg浸润增加,而与CD4+T淋巴细胞亚群的浸润密度无关。同时ILT4highCD8low/ILT4highTreghigh肺腺癌患者的OS更差。因此,ILT4与CD8/Treg联合相比任何单一标记具有更好的生存预测价值。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可以有效的预测患者2年及3年的生存率,为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者的2年、3年生存概率。3.应用RT-PCR及Western blot方法分别检测敲低/过表达肺腺癌细胞H1975中ILT4的转染效率满意。敲低H1975细胞中ILT4表达后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性增加,而凋亡比例明显减少。而过表达H1975细胞中ILT4后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性受到抑制,凋亡比例明显增加。但两组中均未观察到CD4+T淋巴细胞亚群的浸润变化。结论1.肿瘤源性ILT4的表达与肺腺癌免疫抑制T淋巴细胞亚群的浸润和不良的临床预后相关。提示ILT4可能成为LUAD患者潜在的免疫治疗靶点和预后生物标记物。同时,ILT4与CD8/Treg联合可作为评估LUAD患者预后的更佳指标。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者生存概率。3.肿瘤源性ILT4通过调控T细胞亚群增殖、凋亡诱导肺腺癌的免疫逃逸。
林垦[4]（2021）在《趋化因子CCL25介导活化成纤维细胞诱导舌鳞癌细胞免疫逃逸及相关机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]肿瘤微环境的免疫抑制状态有利于肿瘤细胞发生免疫逃逸。肿瘤微环境中处于活化状态的成纤维细胞被称为癌相关成纤维细胞（CAFs）,可促进肿瘤的发生与发展,并与肿瘤细胞的免疫状态密切相关,但其机制尚不明了。课题组前期研究发现血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）能诱导成纤维细胞活化,高分泌趋化因子CCL25,促进肿瘤发展。本研究以趋化因子CCL25为切入点,探索PDGF-BB诱导活化的成纤维细胞对舌鳞癌细胞免疫逃逸的调节作用及分子机制,以期为靶向CAFs调节肿瘤细胞免疫状态发挥肿瘤治疗作用提供实验依据。[方法]1.采用30 ng/ml PDGF-BB诱导成纤维细胞活化,免疫印迹法检测活化标志蛋白α-SMA表达,ELISA法检测CCL25分泌情况,常规培养活化成纤维细胞制备条件培养基（AFs-sup）。2.免疫印迹法检测不同体积浓度和不同时间条件下活化成纤维细胞上清（AFs-sup）或CCL25处理前后,舌鳞癌细胞PD-L1、CCL25受体（CCR9）、Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3及AP1表达情况。实时荧光定量PCR检测舌鳞癌细胞程序性死亡蛋白配体1（PD-L1）mRNA表达水平。免疫荧光染色检测舌鳞癌细胞CCR9和PD-L1表达情况。3.构建低表达CCR9慢病毒载体LV-CCR9-RNAi,转染舌鳞癌Cal-27细胞获得稳转 Cal-27-shRNA-hCCR9,以空载慢病毒载体 Cal-27-shRNA-Scramble 为对照组,q-PCR及免疫印迹法检测转染后舌鳞癌Cal-27细胞中CCR9的表达水平。4.构建裸鼠舌鳞癌移植瘤模型,观察成瘤情况和免疫组化染色分析舌鳞癌组织PD-L1、CCR9及p-Akt蛋白表达情况。5.磁珠分选正常人外周血CD8+T细胞;建立不同条件诱导的舌鳞癌Cal-27细胞与CD8+T细胞直接共培养模型,ELISA法检测IFN-γ的分泌情况,CFSE染色和流式细胞仪检测CD8+T细胞增殖率,PI/Annexin V染色流式细胞仪检测舌鳞癌Cal-27细胞凋亡率。6.所有实验数据以“平均值±标准差”表示,非配对t检验和单因素方差分析,采用Graphpad Prism 6.0对数据进行分析和作图,P<0.05有统计学意义,P<0.01有显着统计学差异。[结果]1.PDGF-BB诱导成纤维细胞后,免疫印迹检测显示α-SMA表达增加（P<0.05）,呈现活化状态,ELISA法检测成纤维细胞经PDGF-BB诱导后培养基中趋化因子CCL25浓度明显升高（P<0.05）。活化成纤维细胞上清（AFs-sup）诱导舌鳞癌Cal-27细胞,免疫印迹结果显示PD-L1蛋白表达水平上调,并具有浓度和时间依赖性（P<0.01）。2.活化成纤维细胞上清诱导舌鳞癌Cal-27细胞的同时,分别加入CCL25抗体阻断剂和其受体CCR9抑制剂后,免疫印迹检测发现PD-L1蛋白表达上调受抑制,行q-PCR进一步检测PD-L1 mRNA表达,其结果相似（P<0.05）。与对照组相比,免疫荧光染色观察活化成纤维细胞上清组和CCL25因子组舌鳞癌Cal-27细胞CCR9和PD-L1表达明显增加,进一步免疫印迹检测结果相似。3.趋化因子CCL25分别直接诱导Cal-27、HSC-4细胞后,与对照组相比,Cal-27、HSC-4细胞PD-L1蛋白表达水平上调,同时加入CCR9受体抑制剂后,Cal-27、HSC-4细胞PD-L1蛋白表达上调受抑制,行q-PCR进一步检测舌鳞癌Cal-27细胞PD-L1 mRNA表达,其结果相似（P<0.05）4.免疫印迹检测发现,CCL25处理前后,舌鳞癌Cal-27细胞Akt、STAT3、p-STAT3及AP1蛋白表达无明显变化（P>0.05）,而p-Akt蛋白表达随处理时间延长而升高（P<0.05）,且表达水平随CCL25浓度增高而增强（P<0.05）。加入Akt抑制剂后,PD-L1 mRNA表达上调受抑制,免疫印迹检测结果相似（P<0.05）。5.与Cal-27-shRNA-Scramble对照组相比,CCL25诱导舌鳞癌Cal-27-shRNA-hCCR9 细胞,PD-L1 和 p-Akt 蛋白表达上调受抑制（P<0.05）。6.活化成纤维细胞与舌鳞癌Cal-27细胞共移植裸鼠皮下,与单独舌鳞癌Cal-27细胞移植组和正常成纤维细胞共移植组相比,其移植瘤重量增加,且移植瘤组织中PD-L1、CCR9和p-Akt的表达水平显着升高（P<0.05）。进一步用稳转舌鳞癌Cal-27-shRNA-hCCR9细胞与活化成纤维细胞共移植,移植瘤重量增加受抑制,及PD-L1和p-Akt的表达上调均受抑制。7.CD8+T淋巴细胞与经活化成纤维细胞上清或CCL25诱导的舌鳞癌Cal-27细胞直接共培养后,与未诱导的舌鳞癌细胞对照组相比,流式细胞仪检测显示舌鳞癌Cal-27细胞凋亡率减低,CD8+T淋巴细胞的增殖率下降,ELISA法检测IFN-γ分泌浓度降低;加入CCL25中和抗体、Akt抑制剂和PD-L1抑制剂后,其舌鳞癌Cal-27细胞凋亡率升高,CD8+T淋巴细胞增殖率和上清中IFN-γ浓度较对照组相比明显升高（P<0.05）。[结论]1.PDGF-BB诱导活化的成纤维细胞是使舌鳞癌细胞处于免疫逃逸状态的一个重要因素,而舌鳞癌细胞免疫逃逸状态促进肿瘤发生发展。2.CCL25是活化成纤维细胞诱导舌鳞癌细胞免疫逃逸的一个关键介导因子。其可能通过与CCR9受体结合,激活Akt信号通路,上调癌细胞PD-L1高表达,促进舌鳞癌Cal-27细胞免疫逃逸。
何金蓉[5]（2021）在《诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略》文中研究指明[背景]肿瘤的低免疫原性、高度异质性和肿瘤发生发展过程中免疫抑制性微环境及物理屏障的形成是肿瘤逃避机体免疫监视的主要手段。细胞焦亡是一种新型的免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）形式,会释放大量炎性细胞因子和危险信号分子激活免疫系统,对机体抗感染免疫反应与抗肿瘤免疫应答具有重要的调节作用。GSDMD是具有成孔效应的蛋白,研究表明异位表达GSDMD的N末端活性结构域（GSDMD-NT）能造成裂解性、炎症性的细胞焦亡,此外,细胞焦亡效应分子GSDMB/GSDME能与毒性淋巴细胞相互作用,由颗粒酶切割活化诱导细胞焦亡,诱导少于15%的肿瘤细胞发生焦亡就足以激发强效的免疫应答消除整个肿瘤。不同肿瘤细胞ICD的诱导条件不同,不同肿瘤对不同诱导物的响应不同,且往往需要大剂量,同时潜在毒性副作用。基于细胞焦亡的独特发生机制,通过四环素诱导系统在肿瘤细胞中过表达GSDMD-NT可实现通用、高效的焦亡诱导,且GSDMD-NT只能从细胞内膜发挥打孔效应,不会损伤周围正常组织造成焦亡副作用;针对肿瘤高度异质性,细胞焦亡裂解可提供个性化,丰富的肿瘤相关抗原,同时释放大量的炎性细胞因子辅助打破肿瘤免疫抑制机制。因此,诱导肿瘤细胞免疫原性焦亡对于克服肿瘤免疫抑制与免疫逃逸机制,重塑免疫系统对肿瘤的监视与杀伤,获得显着临床治疗效果具有重要意义。[目的]本研究基于细胞焦亡明确的发生机制及在机体抗肿瘤免疫中的调控作用,旨在探讨安全、有效的肿瘤细胞焦亡诱导策略,揭示其免疫特点及效应机制,以及以其为基础的免疫干预策略优化,以期提高肿瘤细胞疫苗的临床治疗潜能。[方法]利用重组慢病毒载体介导的基因表达系统筛选诱导型稳定表达焦亡效应分子GSDMD-NT的肿瘤细胞系;体外CCK-8检测细胞增殖情况,显微镜观察细胞焦亡形态,流式细胞术双染AnnexinV和7-AAD分子检测细胞焦亡比列,免疫荧光检测GSDMD-NT的表达与定位;体外考察细胞焦亡免疫原性特点,Real time qPCR检测相应分子转录水平表达,Western blot检测相应分子蛋白水平表达,ELISA检测炎性细胞因子的释放;利用Transwell小室评估焦亡的肿瘤细胞对BMDCs迁移募集的影响,利用流式细胞术检测BMDCs的成熟情况;体内诱导表达GSDMD-NT引起肿瘤细胞焦亡对小鼠肿瘤进行免疫干预,流式细胞术检测小鼠脾脏与肿瘤的免疫效应细胞激活和免疫抑制性细胞浸润的情况。[结果]（1）成功构建四环素诱导表达GSDMD-NT的慢病毒质粒,质粒酶切鉴定和293FT瞬时转染蛋白表达检测验证质粒正常工作;（2）成功筛选得到三种诱导型稳定表达GSDMD-NT的小鼠肿瘤细胞系（TC-1,4T1,CT26）,四环素诱导后GSDMD-NT的转录水平和蛋白水平表达升高;（3）体外成功诱导肿瘤细胞焦亡,GSDMD-NT作用于细胞膜,显微镜观察到细胞肿胀变大膜破裂、细胞核固缩、DNA断裂的典型细胞焦亡形态,AnnexinV+7-AAD+双阳性细胞比率随诱导时间动态增加;（4）CCK-8细胞增殖检测验证GSDMD-NT基因修饰后未诱导表达不影响细胞增殖,当诱导表达后明显抑制细胞增殖;（5）肿瘤细胞焦亡发生过程中,ELISA检测IL-18,IL-1β,IL-33,IL-6炎性细胞因子释放增多,Western blot检测HMGB1表达水平升高,细胞焦亡上清中ATP、LDH、HMGB1释放增多,Real time qPCR检测Hsp70/90,CXCL9,H-2Kb的表达上调,PD-L1表达下调;（6）焦亡的肿瘤细胞能促进BMDCs的迁移与成熟,CD80,CD86,MHC Ⅰ,MHC Ⅱ类分子表达升高;（7）GSDMD-NT基因修饰的TC-1小鼠皮下移植瘤模型,体内诱导细胞焦亡可完全消除20～800mm3的肿瘤,并对再次接种的野生型TC-1肿瘤产生了长达至少30天的免疫保护作用;（8）不同剂量GSDMD-NT基因修饰的TC-1肿瘤细胞皮下注射后直接诱导焦亡,证明基因修饰的肿瘤生长可人为控制且不会成瘤,其免疫保护效果与细胞剂量成正相关;（9）（10）瘤内注射GSDMD-NT基因修饰的TC-1肿瘤细胞疫苗体内诱导焦亡可显着抑制已建立的TC-1肿瘤生长,流式检测脾脏和肿瘤中的抗肿瘤CTLs,NKs效应细胞数量增多,MDSCs抑制性细胞数量减少;（11）GSDMD-NT基因修饰的4T1乳腺癌原位肿瘤模型和CT26结直肠癌皮下移植瘤模型,在不同肿瘤大小时体内诱导细胞焦亡,在6～40mm3大小时能显着抑制肿瘤生长,在40～200mm3大小时其抑瘤效果并不显着,流式细胞术分析结果显示新型焦亡肿瘤细胞疫苗通过刺激活化系统性抗肿瘤CTLs效应细胞数量增多,减少MDSCs抑制性细胞数量显着抑制4T1乳腺原位肿瘤的生长。[结论]诱导型稳定表达焦亡核心效应分子GSDMD-NT是高效、通用的肿瘤细胞免疫原性死亡诱导方式,小鼠体内肿瘤细胞焦亡诱导提供了广谱、个体化的肿瘤抗原和充足的ICD性状表达,从而提供强的免疫刺激信号激发了强效的抗肿瘤免疫应答。其中,针对含有HPV-E6/E7抗原的高免疫原性TC-1肿瘤具有完全清除肿瘤的效应,而对于免疫抑制性强的4T1/CT26肿瘤其抑瘤效果就未达到同等效果。总之,本研究针对肿瘤的异质性挑战,提出了基于细胞免疫原性死亡诱导的肿瘤细胞疫苗新策略,为新型肿瘤免疫干预治疗及肿瘤疫苗的研究提供了有益的探讨及重要参考。
张颖慧[6]（2021）在《粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]粘蛋白Mucin1（MUC1）在结肠癌中表达高低与肿瘤的进展阶段和患者预后相关,表达上调表明疾病处于晚期阶段且提示预后较差。MUC1的过表达和异常糖基化可促进肿瘤细胞的增殖,同时MUC1相关的唾液酸（Mucin-associated sialyl-Tn）抗原与树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞上存在的多种受体结合,通过抑制免疫细胞的抗肿瘤效应有助于肿瘤细胞逃避免疫监视。我们通过比较MUC1阳性和阴性的结肠癌细胞在野生型和免疫缺陷型小鼠上的生长情况,发现只有在野生型小鼠中生长速度存在明显差异,数据表明MUC1可能通过影响肿瘤微环境中的免疫应答状态,促进肿瘤生长。本论文的研究目的是通过构建MUC1过表达荷瘤模型和收集MUC1高表达的结肠癌组织,分析肿瘤微环境中免疫细胞的功能,阐明MUC1在抗结肠癌免疫应答中的功能。[方法]（1）构建稳定表达人MUC1的人和小鼠肿瘤细胞系SW480/MUC1和CT26/MUC1,将其注射至BALB/c鼠和免疫系统缺陷鼠腹部皮下。每3天测量一次肿瘤的直径。荷瘤小鼠肿瘤最长径大于12mm时,被认为死亡,获得荷瘤小鼠的生存曲线。（2）收集CT26/MUC1荷瘤小鼠的肿瘤组织,通过酶联免疫吸附法测定肿瘤组织匀浆液中细胞因子的分泌;流式细胞仪检测浸润至肿瘤组织中的CD4+T细胞,调节性T细胞（Regulatory T cells）,CD8+T细胞,骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells）,肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophage）的比例。通过细胞胞内细胞因子检测测定T细胞的杀伤功能。（3）PDL1抗体治疗CT26/MUC1荷瘤小鼠,分析荷瘤小鼠的生存曲线,评价PDL1抗体治疗效果,同时收集抗体治疗小鼠的肿瘤组织,检测组织中T细胞,MDSC,TAM的浸润情况。测定T细胞的活性改变,分析肿瘤组织中程序性死亡分子PD1及其配体PDL1的表达情况。（4）利用CD8抗体,封闭荷瘤小鼠体内CD8+T细胞功能,通过动物体内T细胞耗竭实验,研究抗体发挥作用的细胞依赖机制。（5）收集结直肠癌患者术后的肿瘤组织样本,同过分析MUC1表达情况,分为MUC1高表达组和MUJC1低表达组。通过酶联免疫吸附法检测肿瘤组织中细胞因子的分泌,通过流式细胞仪分析肿瘤组织免疫细胞的比例,T细胞的活化状态,程序性死亡分子PD1及其配体PDL1的表达情况。（6）利用TCGA结肠癌数据库,分析粘蛋白MUC1在结肠癌患者肿瘤组织中的转录水平与肿瘤患者生存时间的关系。[结果]（1）在免疫系统完整的野生型小鼠中,MUC1阳性的肿瘤细胞生长速度快于MUC1阴性的肿瘤细胞生长（p<0.05）,但是在免疫系统缺陷的裸鼠中,MUC1阳性和阴性的肿瘤细胞的生长速度没有显着差异。（2）MUC1阳性肿瘤组织中炎性细胞因子增加。与MUC1阴性或低表达的肿瘤组织相比,MUC1阳性或者高表达的肿瘤组织中炎性细胞因子IL-17A和IFN-γ水平明显升高,而抑炎性因子如IL-10,TGF-β和TNF-α水平没有显着变化（p<0.05）。流式细胞仪分析荷瘤小鼠和患者的肿瘤组织中CD45+CD3+CD4+T细胞、CD45+CD3+CD8+T细胞胞内细胞因子分泌情况,发现MUC1阳性和MUC1高表达的肿瘤组织内,CD4+、CD8+T细胞诱导产生的IL-17A和IFN-γ的水平明显升高,但与MUC1阴性或者低表达的肿瘤组织相比,CD8+T细胞分泌granzyme B的水平并没有显着增加。（3）MUC1阳性肿瘤组织中免疫抑制性细胞增加。流式细胞仪分析发现MUC1 阳性和MUC1 高表达的肿瘤组织中 Tregs（CD4+Foxp3+）,MDSC（CD11b+Gr1+）,TAM（CD11b+F4/80+）的浸润明显增加（p<0.05）。MUC1 高表达的人结肠癌组织或MUC1阳性的小鼠肿瘤组织中MDSC、TAM和肿瘤细胞表面PDL1表达升高（p<0.05）。然而,在转染了表达MUC1质粒的CT26和SW480细胞中,MUC1并没有促进肿瘤细胞表面PDL1的表达。而IL-17A和IFN-γ刺激可促进CT26细胞和CT26/MUC1细胞上PDL1的表达。结果还显示,在MUC1阳性的小鼠肿瘤组织中以及高表达MUC1的人结肠癌组织中的CD8+T细胞上PD1的表达均显着增加（p<0.05）。（4）MUC1阳性的荷瘤小鼠模型中靶向PDL1治疗可诱导抗肿瘤免疫反应。与同型抗体治疗的荷瘤小鼠相比,PDL1抗体治疗的小鼠,肿瘤组织中浸润的CD8+T细胞比例显着升高,CD4+/CD8+T细胞比例明显下降,MDSC和TAM的比例也显着降低。CD8+T细胞分泌IFN-γ和granzyme B的能力,CD4+T细胞产生IFN-γ的能力增强（p<0.05）。表达PD1的CD8+T细胞的百分比也明显更高（p<0.05）。（5）靶向PDL1可抑制肿瘤生长。与对照组相比,PDL1抗体治疗组的肿瘤体积明显缩小,生存期显着延长。而CD8+T细胞缺失的小鼠则失去了 PDL1抗体诱导的抗肿瘤保护作用。注射PDL1抗体治疗后,MUC1阳性的荷瘤小鼠则显示出更强的抗肿瘤免疫应答效应。（6）在TCGA结肠癌数据库中,通过MUC1的拷贝数来确定其在肿瘤组织中表达。分析MUC1的表达与患者的生存之间的关系。数据显示,MUC1低表达患者组较MUC1高表达患者组生存时间显着延长（p<0.05）。[结论]在MUC1阳性或MUC1高表达的肿瘤组织中发现了更多的炎性细胞因子和抑制抗肿瘤免疫应答的免疫细胞。在炎性细胞因子作用下,抑制性免疫细胞MDSC,Treg,TAM和肿瘤细胞上调免疫检查点分子PDL1的表达,抑制了肿瘤微环境中T细胞的抗肿瘤免疫应答。在MUC1阳性肿瘤细胞荷瘤小鼠模型中,利用PDL1抗体,阻断PDL1-PD1抑制性信号通路,减少了肿瘤微环境中Treg细胞,MDSC和TAM的细胞百分比,增强了 T细胞的细胞毒性并抑制了肿瘤的生长,最终使MUC1阳性荷瘤小鼠的生存时间得以延长。因此,本研究阐明了 MUC1在肿瘤免疫逃逸中的作用,并为PDL1抗体在MUC1阳性结直肠癌患者的治疗中的应用提供了理论基础。
陈小徵[7]（2021）在《ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究》文中研究说明研究背景针对PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂（ICIS）是近年来抗肿瘤治疗的里程碑。这些药物已经在多发性实体瘤中取得了有希望的结果,并被确立为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）一线治疗的标准治疗方案。然而,ICIS的疗效仍然有限,在表皮生长因子受体（EGFR）野生型NSCLC患者中小于20%。更糟糕的是,到目前为止,在EGFR驱动的非小细胞肺癌中ICIS的临床试验基本上是无效。据报道,除了固有的低肿瘤突变负荷（TMB）和主要组织相容性复合体（MHC）的表达外,激活的EGFR信号可以利用多种策略来诱导免疫抑制性肿瘤微环境（TME）,包括抑制T细胞浸润和细胞杀伤功能,募集免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性T细胞（Tregs）,以及分泌抑制性细胞因子和代谢物,这是有效的抗肿瘤免疫和免疫治疗的主要障碍。因此,探索EGFR促进肿瘤免疫逃逸和发生发展新机制、逆转抑制性TME是提高EGFR激活的NSCLC患者ICIS疗效的潜在策略。免疫球蛋白样转录子（ILT）4是免疫球蛋白超家族的一种抑制性受体,主要表达于髓系细胞,包括树突状细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和血小板。这些细胞中的ILT4代表其免疫抑制表型,负性调节DC的抗原呈递、中性粒细胞的吞噬、巨噬细胞的成熟和血小板聚集。近年来,我们和其他人发现ILT4还富集于多种实体肿瘤细胞中,并直接诱导其增殖、侵袭和迁移。此外,ILT4与肺腺癌患者的免疫抑制T细胞亚群浸润有关,并预测患者不良预后。这些证据表明ILT4是一个潜在的肿瘤治疗靶点。然而,ILT4在NSCLC细胞中表达的调控机制,以及在免疫微环境和免疫治疗中的作用尚不清楚。TME是癌症不可分割的一部分,它从根本上协调了肿瘤的发生、疾病的进展和治疗的耐药性。在TME的复杂细胞成分中,包括TAMs和失能T细胞在内的免疫细胞在ICI抵抗中起着核心作用。TAMs是TME中最丰富的免疫细胞。大量证据表明,TAMs在肿瘤发生时具有促肿瘤表型,其功能是通过诱导T细胞功能障碍、血管生成以及肿瘤细胞的侵袭和迁移来促进肿瘤的进展。在免疫学角度讲,这些促肿瘤的TAMs既可以直接抑制细胞杀伤功能T淋巴细胞（CTL）反应,也可以通过重塑免疫微环境来间接调节免疫抑制,最终削弱了 ICIS的有效性。除TAMs外,包括CD4+T辅助细胞和CD8+CTL在内的T细胞在抗肿瘤反应中占据最关键和最直接的位置。当CD4+T细胞通过产生干扰素-γ和白细胞介素-2杀死肿瘤细胞并招募肿瘤特异性CTL时,CTL直接通过释放细胞毒颗粒（穿孔素和颗粒酶）或间接通过分泌细胞因子（IFN-γ和肿瘤坏死因子）介导抗肿瘤活性。然而,TME中的T细胞通常由于耗竭或衰老而对肿瘤反应低下,这阻碍了有效的抗肿瘤免疫治疗。虽然针对PD-1/PD-L1信号的ICIS部分逆转了 T细胞的耗竭,但T细胞功能障碍的机制比我们预期的要复杂得多。进一步探索肿瘤介导的免疫抑制机制,通过联合免疫治疗逆转抑制性TME,将为提高ICI疗效提供有效途径。然而,ILT4对TAMs和T细胞介导的EGFR活化NSCLC免疫微环境的作用尚不清楚。因此,全面了解阻断ILT4治疗EGFR活化NSCLC的机制将有利于探索更有效的免疫治疗策略。研究目的本研究将首先明确ILT4在EGFR活化NSCLC中的表达机制和功能作用,发现ILT4可被EGFR-AKT/-ERK1/2信号通路上调表达。其次构建体外肿瘤-TAM/T细胞共培养体系,证实肿瘤细胞中ILT4 一方面可诱导TAMs的募集和M2样极化,应一方面抑制了 T细胞的浸润和细胞杀伤功能。运用全基因的在C57BL/6J小鼠和免疫缺陷的NSG小鼠,证实ILT4不仅可直接促进肿瘤细胞增殖,还可以通过调控M2-TAM和失能T细胞浸润重塑肿瘤微环境,促进小鼠肿瘤生长;ILT4阻断联合PD-L1抑制剂在治疗肿瘤方面显示出协同作用。此外,为明确ILT4阻断是否可增强EGFR突变TKIs耐药和EGFR野生型NSCLC免疫治疗疗效,我们构建EGFR这两类亚型的人源化小鼠肿瘤免疫治疗模型。明确了ILT4阻断与PD-L1抑制剂在EGFR野生型中表现出协同抗肿瘤治疗作用,而在EGFR突变TKIs耐药NSCLC中ILT4阻断单独而非与PD-L1阻断联合显示出了肿瘤治疗疗效。我们的研究确定了在ILT4介导的肿瘤免疫逃逸的新机制,并为EGFR活化NSCLC患者提供了有前途的免疫治疗和联合治疗策略。研究方法1.采用免疫组化检测NSCLC患者组织标本中ILT4的表达和EGFR磷酸化表达水平,并统计分析二者表达的相关性及与患者临床病理参数的关系;2.用EGFR-TKIs/EGF分别刺激EGFR突变/野生型NSCLC细胞,来抑制/激活EGFR活化;或分别敲除/过表达EGFR突变/野生型NSCLC中EGFR,real-time PCR、western blot、免疫荧光和流式细胞术分析人NSCLC细胞系中EGFR活化对ILT4表达的调控作用;3.采用mRNA基因芯片和TCGA数据库分析筛选EGFR调控的信号通路,并通过相应信号通路抑制剂利用western blot确定EGFR诱导肿瘤细胞ILT4表达的特异性分子信号通路;4.敲除EGFR活化NSCLC细胞中ILT4,构建肿瘤细胞与TAM或T细胞的共培养体系,采用Transwell迁移实验、流式细胞术和real-time PCR检测肿瘤细胞ILT4对TAMs募集和极化的影响;通过CFSE增殖实验、凋亡实验、流式细胞术、ELISA和细胞杀伤实验分析肿瘤细胞ILT4对T细胞存活和细胞杀伤功能的影响。5.分别用单抗阻断EGFR活化NSCLC细胞中ILT4和PD-L1,构建肿瘤细胞与TAM或T细胞的共培养体系,如上所述检测TAMs募集和M2样极化及T细胞存活和杀伤水平,验证ILT4联合PD-L1阻断协同逆转了 TAMs/T细胞介导的免疫抑制;6.C57BL/6小鼠皮下注射敲除PIR-B（小鼠ILT4的同源物）的肺癌细胞株LLC,定期给与PD-L1抑制剂治疗,建立肿瘤免疫治疗模型。研究阻断PIR-B及PD-L1单抗治疗对肿瘤生长的影响,用流式细胞术检测小鼠脾脏和外周血中TAMs和T细胞的数量和表型,用免疫组化和免疫荧光检测肿瘤组织中肿瘤TAMs和T细胞的数量和表型。明确PIR-B对肿瘤生长及免疫逃逸的双重影响;7.在NSG小鼠中皮下注射PIR-B敲除的肺癌细胞株LLC构建肿瘤生长模型,观察免疫缺陷小鼠中PIR-B对肿瘤生长的影响;8.将人PBMC尾静脉注射至NSG小鼠,构建人源化免疫系统;分别接种敲除ILT4的吉非替尼耐药PC9（PC9-GR）和EGFR野生型H1299细胞,定期给与PD-L1抗体或对照抗体治疗,建立肿瘤免疫治疗模型。用流式细胞仪检测小鼠脾脏和外周血中TAMs和T细胞的数量和表型,用免疫组化法检测肿瘤组织中TAMs和T细胞的数量和表型。研究结果1.EGFR活化诱导NSCLC细胞ILT4表达在患者NSCLC组织中,我们发现肿瘤细胞ILT4的表达与EGFR磷酸化水平呈明显正相关。在NSCLC细胞系中,证明了 EGFR活化的两种方式,即酪氨酸激酶突变诱导的EGFR激活和配体（EGF）结合依赖的EGFR激活,均上调了 ILT4的表达。2.EGFR通过激活ERK和AKT信号通路介导ILT4表达通过mRNA基因芯片和TCGA大数据分析筛选出EGFR与MAPK,NF-κB,和AKT信号通路密切相关;运用相关通路的特异性抑制剂并WB验证,证实EGFR激活通过ERK和AKT信号通路诱导NSCLC细胞ILT4的表达。3.EGFR活化的NSCLC中ILT4促进TAM募集和M2样极化,抑制T细胞的增殖和细胞杀伤功能利用临床患者肿瘤组织标本及TCGA大数据初步发现肺癌组织ILT4表达与TME中TAMs募集极化及T细胞数量功能有相关性。体外机制研究证实,EGFR活化NSCLC中ILT4通过上调趋化因子CCL2和CCL5表达分泌促进的TAM募集。敲除EGFR活化NSCLC细胞株中ILT4表达,显着降低了其诱导的TAMs的迁移能力;并抑制TAMs中CD206、CD209、IL-10和Arg1等M2样标记物表达,增加了 IL-12、TNFα和IL-6等M1样标记物表达,且削弱了 TAMs诱导的肿瘤免疫抑制作用。敲除EGFR活化NSCLC细胞株中ILT4表达,显着增强了共培养T细胞的增殖、IFN-y的表达分泌水平及杀伤能力。4.ILT4阻断剂在EGFR活化的NSCLC细胞中可与PD-L1抑制剂发挥协同作用,逆转TAM和失能T细胞介导的肿瘤免疫抑制分别用ILT单抗或/和PD-L1单抗预处理EGFR突变、EGFR突变TKIs耐药和EGFR野生型NSCLC肿瘤细胞,然后与TAMs或T细胞共培养。结果发现,阻断上述三种EGFR活化状态的NSCLC细胞中ILT4或PD-L1均抑制了诱导的TAM的迁移能力,而两种抗体的联合应用对TAM的迁移表现出最显着的抑制作用;同时,阻断ILT4或PD-L1可降低TAMs中CD163和CD206的水平,联合抗体组CD163和CD206表达最低。与抗ILT4-或抗PD-L1-预处理肿瘤细胞共培养可提高T细胞的IFN-γ水平、肿瘤杀伤能力和增殖水平,而联合阻断这两种分子则表现出最显着的增加。5.PIR-B和PD-L1阻断剂联合治疗可协同抑制肿瘤生长和免疫逃逸将PIR-B敲除/对照的LLC皮下注射至全基因C57BL/6J小鼠后,腹腔注射PD-L1单抗/对照抗体治疗。结果显示显示PIR-B敲除或PD-L1阻断均可抑制小鼠体内肿瘤的生长,改善T细胞和TAMs介导的免疫抑制TME;二者显示协同治疗作用。NSG小鼠肿瘤生长模型中PIR-B的敲除同样抑制了小鼠体内肿瘤的生长,但变化趋势明显小于全基因的C57BL/6J小鼠,提示免疫系统参与了 PIR-B诱导的肿瘤发生发展。6.ILT4单独阻断而非与PD-L1抑制剂联合可抑制TKI耐药EGFR突变NSCLC的肿瘤进展和免疫逃逸运用TKI耐药EGFR突变型NSCLC细胞系PC9-GR建立了免疫重建NSG小鼠的免疫治疗模型。证实ILT4基因敲除显着抑制了肿瘤生长,增强了脾脏、外周血和肿瘤组织中的T细胞浸润和功能;然而,PD-L1单抗竟然是促进而非抑制了 PC9-GR的肿瘤生长,PD-L1单独阻断或联合ILT4抑制都不会未能改善T细胞上述器官中的浸润。提示单独阻断ILT4而非与ICIs联合,可能是EGFR-TKI耐药的EGFR突变患者一种有效的治疗策略。7.ILT4阻断增强PD-L1抑制剂对EGFR野生型NSCLC的体内治疗疗效敲除EGFR-H1299细胞中ILT4,建立人源化NSG小鼠肿瘤免疫治疗模型。证实ILT4或PD-L1阻断剂均可抑制体内肿瘤的生长,联合治疗对肿瘤生长的抑制作用最为显着;二者协同增强了脾脏、外周血和肿瘤组织中的T细胞的浸润及IFN-γ表达水平。结论1.NSCLC细胞中的ILT4是由EGFR-AKT/-ERK1/2信号通路激活诱导表达的;2.EGFR活化NSCLC中ILT4 一方面可诱导TAM募集和M2样极化,增强TAMs的肿瘤免疫抑制作用;另一方面还可直接抑制T细胞增殖、细胞杀伤作用以及干扰素-γ的表达和分泌。ILT4阻断和PD-L1阻断在体外协同逆转了肿瘤免疫抑制。3.体内研究证实PIR-B不仅促进肿瘤恶性生物学行为,而且诱导了 TAM/T细胞介导的免疫抑制微环境,进而促进肿瘤进展。PIR-B和PD-L1阻断在EGFR活化NSCLC治疗中显示出协同功效。4.人源化小鼠治疗模型中ILT4阻断可增强PD-L1抑制剂对EGFR野生型NSCLC的疗效,但对EGFR突变型NSCLC无影响。
尹良伟[8]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中研究表明自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
涂丽裙[9]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中进行了进一步梳理转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
李美蓉[10]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中研究说明急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
二、树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞凋亡并抑制其增殖（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞凋亡并抑制其增殖（论文提纲范文）
（1）STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 cGAS-STING信号在癌症免疫和免疫治疗中的作用 |
| 2.1 CGAS-STING信号通路抗肿瘤机制 |
| 2.1.1 细胞质DNA如何积聚? |
| 2.1.2 cGAS-STING通路消除癌细胞机制 |
| 2.2 CGAS-STING通路在治疗中的应用 |
| 2.2.1 单药治疗 |
| 2.2.2 STING激动剂联合疗法 |
| 2.3 STING免疫疗法:一把双刃剑 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验流程 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞来源和细胞培养条件 |
| 3.3.2 细胞复苏 |
| 3.3.3 细胞换液 |
| 3.3.4 细胞传代 |
| 3.3.5 细胞冻存 |
| 3.3.6 细胞计数 |
| 3.3.7 Trizol法提取HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的RNA |
| 3.3.8 RNA逆转录 |
| 3.3.9 定量实时聚合酶链式反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction, qRT-PCR) |
| 3.3.10 HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的蛋白样品制备 |
| 3.3.11 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3.3.12 短发夹RNA慢病毒载体的构建及转导 |
| 3.3.13 过表达慢病毒载体的构建及转染 |
| 3.3.14 Trizol法提取vector HeLa、shSTING-Hela、vectorSiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STING细胞的RNA |
| 3.3.15 RNA逆转录 |
| 3.3.16 定量实时聚合酶链式反应 |
| 3.3.17 vector HeLa、shSTING-Hela、vector SiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STNG细胞的蛋白样品制备 |
| 3.3.18 蛋白质免疫印迹实验 |
| 3.3.19 宫颈癌细胞增殖实验 |
| 3.3.20 宫颈癌细胞平板克隆实验 |
| 3.3.21 宫颈癌细胞划痕实验 |
| 3.3.22 宫颈癌细胞Transwell小室迁移实验 |
| 3.3.23 宫颈癌细胞侵袭实验 |
| 3.3.24 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 STING在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中的表达 |
| 3.4.2 稳定的沉默STING细胞系、STING过表达细胞系的鉴定 |
| 3.4.3 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞系细胞增殖和克隆形成的影响 |
| 3.4.4 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.4.5 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验流程 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养、冻存、传代、计数 |
| 4.3.2 总蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.3 核蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,co-IP)和免疫印迹实验 |
| 4.3.5 细胞培养、冻存、传代、计数 |
| 4.3.6 总蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.7 CCK8实验 |
| 4.3.8 平板克隆 |
| 4.3.9 Transwell小室迁移 |
| 4.3.10 Transwell小室侵袭 |
| 4.3.11 统计学方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的作用 |
| 4.4.2 过表达STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 4.4.3 STING调控宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路机制探讨 |
| 4.4.4 β-catenin通路抑制剂对沉默STING介导的宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用的影响(rescue实验) |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 沉默STING促进宫颈癌细胞增殖的体内实验 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验设备 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验流程 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞的复苏、传代及培养 |
| 5.3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 5.3.3 裸鼠体重测量 |
| 5.3.4 裸鼠移植瘤组织大小的测量 |
| 5.3.5 肿瘤组织脱水及包埋 |
| 5.3.6 苏木精和伊红染色技术(Hematoxylin and eosin dyeingtechniques,HE) |
| 5.3.7 免疫组织化学染色技术(Immunohistochemistry,IHC) |
| 5.3.8 统计学方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 沉默STING的宫颈癌细胞移植瘤对裸鼠体重的影响 |
| 5.4.2 沉默STING对裸鼠移植瘤体积的影响 |
| 5.4.3 裸鼠肿瘤组织HE染色结果 |
| 5.4.4 裸鼠肿瘤组织STING免疫组化染色结果 |
| 5.4.5 裸鼠肿瘤组织免疫组化Ki67染色结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 膀胱癌免疫治疗的研究进展 |
| 一、卡介苗的研究进展 |
| 二、免疫检查点抑制剂 |
| 三、小结 |
| 第二节 巨噬细胞作为膀胱癌治疗靶点的研究进展 |
| 一、巨噬细胞的研究进展 |
| 二、巨噬细胞在肿瘤免疫中的作用 |
| 三、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对膀胱癌的作用 |
| 四、巨噬细胞作为治疗靶点的抗膀胱癌研究 |
| 五、小结 |
| 第三节 中药多糖免疫调节作用的研究进展 |
| 一、中药多糖的开发与中医理论的渊源 |
| 二、中药多糖的免疫调节作用 |
| 三、中药多糖的免疫调节功能在疾病中的研究进展 |
| 四、小结 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润程度与膀胱癌恶性程度的关系 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二节 均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三节 均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究 |
| 一、THP-1来源巨噬细胞模型的建立及HPP对巨噬细胞的极化作用 |
| 二、HPP活化的巨噬细胞对于人膀胱癌细胞的直接作用及分子机制研究 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四节 基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分: 肺腺癌中ILT4过表达与免疫抑制性T细胞亚群浸润及患者的不良预后相关 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 肿瘤源性ILT4通过抑制T细胞增殖及诱导T细胞凋亡介导肿瘤免疫逃逸 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 肺癌与免疫抑制细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）趋化因子CCL25介导活化成纤维细胞诱导舌鳞癌细胞免疫逃逸及相关机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 趋化因子CCL25介导活化成纤维细胞上调舌鳞癌细胞PD-L1表达的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 趋化因子CCL25通过CCR9/p-Akt通路上调舌鳞癌细胞PD-L1表达的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 活化成纤维细胞通过CCL25/Akt/PD-L1途径促进舌鳞癌细胞免疫逃逸的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤相关成纤维细胞调节肿瘤免疫的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 肿瘤发生发展的多样性及其免疫逃逸机制 |
| 2. 肿瘤免疫治疗具有极好的临床应用前景 |
| 3. 疫原性细胞死亡的抗肿瘤作用机制及研究进展 |
| 4. 细胞焦亡 |
| 4.1 细胞焦亡的发生发展 |
| 4.2 细胞焦亡的发生机制及其与肿瘤的密切关系 |
| 4.3 细胞焦亡在抗肿瘤免疫治疗中的研究 |
| 5. 本研究思路,目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 质粒、菌株、细胞株 |
| 1.2 动物 |
| 2. 实验试剂及仪器设备 |
| 2.1 试剂盒 |
| 2.2 酶、抗体 |
| 2.3 引物及序列合成 |
| 2.4 相关试剂及耗材 |
| 2.5 主要仪器及设备 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 重组质粒plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro的构建 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒瞬转表达鉴定 |
| 3.4 纯化收集慢病毒 |
| 3.5 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1细胞系的筛选鉴定 |
| 3.6 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞的增殖情况 |
| 3.7 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡形态观察 |
| 3.8 免疫荧光检测TC-1肿瘤细胞焦亡时GSDMD-NT的表达与定位 |
| 3.9 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡流式检测 |
| 3.10 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡免疫原性介质表达与释放的检测 |
| 3.11 建立小鼠皮下移植瘤模型 |
| 3.12 建立小鼠脂肪垫原位乳腺癌肿瘤模型 |
| 3.13 获取骨髓来源的树突状细胞 |
| 3.14 新型焦亡肿瘤细胞疫苗对BMDC的趋化作用 |
| 3.15 新型焦亡肿瘤细胞疫苗促进BMDC的成熟 |
| 3.16 小鼠体内诱导已成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 3.17 新型焦亡肿瘤细胞疫苗对小鼠宫颈癌移植瘤的预防效果 |
| 3.18 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗对宫颈癌移植瘤的生长影响 |
| 3.19 小鼠体内诱导已成瘤的CT26及4T1肿瘤细胞焦亡 |
| 3.20 体外分离小鼠脾脏淋巴细胞 |
| 3.21 体外分离小鼠肿瘤淋巴细胞 |
| 3.22 流式细胞术检测CTL细胞水平 |
| 3.23 流式细胞检测MDSC水平 |
| 4. 流式抗体剂量表 |
| 5. Real time qPCR引物序列表 |
| 结果 |
| 1. 诱导型稳定表达GSDMD-NT/eGFP肿瘤细胞系的筛选与鉴定 |
| 1.1 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.2 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒瞬时表达的功能鉴定 |
| 1.3 筛选鉴定GSDMD-NT/eGFP诱导型稳定表达的肿瘤细胞系 |
| 2. 诱导型稳定表达GSDMD-NT/eGFP肿瘤细胞系的生物学特性 |
| 2.1 生长特性 |
| 2.2 诱导GSDMD-NT稳定表达导致肿瘤细胞焦亡 |
| 2.3 诱导肿瘤细胞焦亡LDH的释放 |
| 3. 诱导型稳定表达GSDMD-NT肿瘤细胞系的免疫学特性 |
| 3.1 免疫原性物质HMGB1、LC3bⅠ/Ⅱ的释放与表达 |
| 3.2 免疫原性物质ATP的释放 |
| 3.3 免疫原性物质Hsp70/90,PD-L1,CXCL9,H-2K~b的表达 |
| 3.4 炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-33的释放 |
| 4. 焦亡的肿瘤细胞促进BMDCs的迁移成熟 |
| 4.1 焦亡的肿瘤细胞上清促进BMDCs的迁移 |
| 4.2 焦亡的肿瘤细胞上清促进BMDCs的成熟 |
| 4.3 焦亡的肿瘤细胞促进BMDCs的成熟 |
| 5. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗具有良好的抗肿瘤潜力并具有免疫保护效果 |
| 5.1 小鼠体内诱导已成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 5.2 小鼠体内诱导未成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 6. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗激发强效的抗肿瘤免疫应答效应 |
| 6.1 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗显着抑制已建立的TC-1肿瘤生长 |
| 6.2 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗激发强效的抗肿瘤免疫应答效应 |
| 7. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗抗肿瘤的普适性研究 |
| 7.1 新型焦亡肿瘤细胞疫苗抑制CT26移植瘤及4T1原位肿瘤的生长 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 免疫原性死亡在肿瘤治疗中的作用与应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 MUC1在小鼠结肠癌模型中诱导的免疫抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 WUC1高表达的人结肠癌肿瘤组织中免疫细胞的功能变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 局限性与展望 |
| 附表 |
| 综述 癌症相关粘蛋白MUC在肿瘤免疫调节和转移中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章及科研项目情况 |
| 致谢 |
（7）ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分E GFR激活AKT/ERK1/2信号通路上调非小细胞肺癌中ILT4表达 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4促进TAM-和失能T细胞介导的EGFR活化NSCLC免疫逃逸 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 阻断EGFR活化NSCLC中ILT4增强了PD-L1免疫治疗疗效 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第四部分 ILT4阻断可增强EGFR野生型,而非EGFR突变TKIs耐药NSCLC中PD-L1抑制剂疗效 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（8）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（9）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞凋亡并抑制其增殖（论文参考文献）
- [1]STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究[D]. 杜华珊. 吉林大学, 2021(01)
- [2]基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用[D]. 贾文玉. 广州中医药大学, 2021(02)
- [3]ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸[D]. 李青. 山东大学, 2021(10)
- [4]趋化因子CCL25介导活化成纤维细胞诱导舌鳞癌细胞免疫逃逸及相关机制研究[D]. 林垦. 昆明医科大学, 2021(02)
- [5]诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略[D]. 何金蓉. 昆明医科大学, 2021(01)
- [6]粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究[D]. 张颖慧. 昆明医科大学, 2021
- [7]ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究[D]. 陈小徵. 山东大学, 2021(10)
- [8]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [9]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [10]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020