一、牛布氏菌RB51抗原的免疫效力（论文文献综述）
刘燕[1]（2019）在《布鲁氏菌病S2凝胶活疫苗的研制及不同黏膜免疫效果评价》文中认为布鲁氏菌病（blucellosis）是由布鲁氏菌引起的一种严重的人兽共患病。患病家畜是本病的主要传染源,对易感家畜用布鲁氏菌病活疫苗进行免疫是布鲁氏菌病防控的主要措施。但传统的注射免疫存在对孕畜不安全、抗体持续时间较长影响鉴别诊断等缺点。布鲁氏菌口服活疫苗（S2株）出现后,克服了注射免疫造成的对孕畜不安全、抗体持续时间较长影响鉴别诊断的缺点。但口服免疫又出现了免疫时疫苗容易流失的问题,对操作人员自身安全造成一定威胁,还会因流失而导致免疫剂量不足。本研究采用温度敏感型凝胶作为布鲁氏菌活疫苗（S2株）的赋型剂,在黏膜免疫部位完成液态到凝胶态的相转变,使得疫苗菌能被凝胶固定于免疫部位,从而降低疫苗流出免疫部位的风险。本实验利用星点设计方法合成13个凝胶配方,再由相变温度的三维效应面和等高线图挑选出4个备选配方,最后通过微流变仪对配方理化性质进行测定,选出空白温敏凝胶的最优配方。将布鲁氏菌病活疫苗S2与空白温敏凝胶按1:9配比混合,制备布鲁氏菌病温敏凝胶活疫苗（S2株）并使用环境扫描电镜对该温敏凝胶活疫苗进行表征分析,再利用以下方法对该温敏凝胶活疫苗不同黏膜免疫效果进行评价。首先测定S2凝胶活疫苗免疫小鼠的最小免疫剂量,使用4种黏膜免疫途径（阴道灌注、点眼、口服、直肠灌注）免疫小鼠,比较S2温敏凝胶活疫苗与S2常规疫苗的体表排菌量以及黏膜免疫与注射免疫的抗体水平变化;然后采用OIE推荐方法,通过攻毒保护试验测定S2凝胶活疫苗4种黏膜免疫途径及S2常规疫苗注射免疫途径对小鼠的免疫效果;最后利用小鼠模型试验中免疫效果较好的黏膜途径免疫羊,测定S2凝胶活疫苗对羊的最小免疫剂量;并比较不同黏膜途径（口服、阴道）的免疫安全性、细胞免疫水平、体液免疫水平。通过上述方法筛选出S2凝胶活疫苗的空白温敏凝胶最佳处方,质量分数为泊洛沙姆407（P407）:22.04%、泊洛沙姆188（P188）:2.81%;与布鲁氏菌活疫苗按一定配比混合制备出布病温敏凝胶活疫苗S2;电镜扫描图显示研制的布鲁氏菌病温敏凝胶活疫苗（S2株）能够充分承载疫苗菌,并便于疫苗菌的释放。S2凝胶活疫苗对小鼠的最小免疫剂量为100×108CFU对小鼠的免疫部位排菌量测定发现S2凝胶活疫苗排菌量只有常规疫苗的0～30%;从小鼠黏膜免疫方式比较发现,阴道灌注排菌量最小（低于100 CFU）,排菌时间最短（1 d以内）,眼部滴注与直肠灌注次之,而口服排菌量最多（1210 CFU/只）,结果表明与常规疫苗相比,凝胶活疫苗可显着减少排菌,且阴道免疫的排菌量最小。对不同黏膜途径抗体水平比较发现黏膜免疫抗体比注射免疫低25～80%,并且在免疫后45 d左右微量试管凝集试验结果（MSAT）即降至1:50以下或接近1:50,下降速度显着快于注射免疫,而且在免疫后90 d,直肠、点眼、口服3种免疫途径抗体水平低于阳性判定标准,结果表明黏膜免疫比注射免疫的抗体持续时间短,黏膜免疫一定程度上利于鉴别诊断。通过攻毒试验测定免疫组的单位保护指数（对照出菌指数-免疫出菌指数）,在对照组小鼠的出菌指数为6.47时,免疫组的单位保护指数如下:S2常规疫苗注射免疫是4.08,S2凝胶活疫苗阴道免疫是3.89、点眼免疫是3.41、口服免疫是3.32、直肠免疫是3.25,结果表明4种黏膜免疫途径都显示了良好的保护作用。其中,阴道灌注的免疫保护效果更接近传统的注射免疫,点眼免疫次之。根据小鼠模型对布病温敏凝胶疫苗评价结果,选择阴道灌注和点眼免疫两种方式免疫羊,测得布病温敏凝胶活疫苗S2株对羊最小免疫剂量为500×108CFU/只;比较羊免疫部位排菌量发现整体上凝胶疫苗组点眼和阴道灌注的免疫排菌量（15CFU/只、11CFU/只）低于常规剂型疫苗组排菌量（982CFU/只）,结果表明相比常规疫苗,凝胶活疫苗在黏膜免疫后可显着减少排菌量。外周血淋巴细胞因子测定发现免疫和攻毒后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α有明显变化趋势,而IL-12、IL-4、IL-8变化不明显,结果表明IFN-γ、TNF-α、IL-2等因子在抵抗布鲁氏菌感染过程中起重要作用。测定布病温敏凝胶活疫苗S2对羊攻毒保护试验,发现点眼免疫组和阴道免疫组的保护率均能达到80%以上,且单位保护指数分别为2.19和2.42,结果表明两种免疫方式的保护效果相比,阴道免疫的保护力更高一些。组织病理学检查发现攻毒对照组出现明显的病理组织学变化,而免疫组未引起明显的病理组织学变化。结果显示布病温敏凝胶活疫苗S2具有良好的保护作用,引起的病理组织学变化较小。本研究成功制备布病温敏凝胶活疫苗S2,通过小鼠和羊的实验动物模型对布病温敏凝胶活疫苗S2不同途径免疫效果评价发现黏膜免疫具有良好的免疫保护力而且阴道免疫效果最好,同时证实黏膜免疫抗体持续时间短有利于鉴别诊断的优点。
梁佳茗[2]（2019）在《布鲁菌S19重组疫苗株的构建及其免疫效果评价》文中研究指明布鲁菌病（简称布病）是由布鲁菌（Brucella）感染引起的一种动物源性人兽共患病,该病不但对畜牧养殖业危害巨大,对公共卫生安全也构成了威胁。家畜疫苗接种是布病防控的主要手段,特别是在发展中国家。然而,现有疫苗,包括国际上普遍使用的S19和我国自行研制的S2和M5,所提供的免疫保护效力并不理想。因此,改进和提高疫苗免疫原性和保护效力已成为研制新型布病疫苗的主要方向。美国学者在菌株RB51中过表达布鲁菌的保护性抗原SOD增强其疫苗功效。本研究以布鲁菌疫苗株S19为研究对象,借助广宿主穿梭载体将布鲁菌Omp31、BCSP31和UGPase基因转化至S19株中,实现自身免疫原性蛋白过表达,通过动物实验评价所构建的重组菌的免疫原性和免疫保护效果,探索重组菌该作为疫苗候选株的应用潜力,为防控家畜布病提供新策略。主要研究内容如下:首先,构建了含有双强启动子pR/pL-终止序列rrnbT1T2的重组广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-PT,分别插入布鲁菌Omp31、BCSP31和UGPase基因,构建重组表达质粒pBBR1MCS-PT-Omp31、pBBR1MCS-PT-BCSP31和pBBR1MCS-PT-UGPase;将重组质粒电转至布鲁菌S19感受态细胞,经抗性筛选与PCR鉴定,获得重组菌株S19-Omp31、S19-BCSP31和S19-UGPase。SDS-PAGE与Western-blot检测结果均显示重组布鲁菌可表达Omp31、BCSP31和UGPase蛋白。重组菌株连续传代至第15代未出现基因丢失,具有良好的遗传稳定性;生长动力学曲线结果显示重组菌株与亲本株生长规律基本一致,表明基因过表达并未改变布鲁菌生长特性。接着,本研究对重组菌株的安全性和免疫原性进行了研究。动物安全性实验结果显示,以相同剂量免疫Balb/c小鼠时,S19-Omp31组、S19-BCSP31组与亲本株S19组小鼠体重、脾重和脾菌数均无显着差异（P>0.05）;然而,S19-UGPase组在免疫高剂量条件下（1×108 CFU/mL和1×109 CFU/mL）,其脾菌数显着高于S19组（P<0.05）,这表明重组S19-Omp31和S19-BCSP31株具有良好的安全性。体液免疫检测结果表明,3组重组菌株均能有效产生针对S19株的特异性抗体,其中S19-BCSP31组和S19-UGPase组在第4周时抗体水平达到峰值,S19-Omp31组在第5周时达到峰值,其抗体效价均显着高于S19组（P<0.05）。同时,针对目的蛋白特异性抗体结果显示,S19-Omp31组和S19-BCSP31组的目的蛋白特异性抗体水平显着高于S19组（P<0.01）。细胞免疫检测显示,S19-Omp31组和S19-BCSP31组均能上调IFN-γ、INF-α、IL-2、IL-4和IL-12细胞因子的分泌,诱导机体产生Th1型（CD3+CD4+IFN-γ+）细胞免疫应答;而S19-UGPase组IL-2和IL-12分泌显着高于S19组（P<0.05）、IFN-γ水平略低于S19组（P<0.05）、INF-α、IL-4和IL-10分泌水平与S19组无显着差异。最后,采用布鲁菌强毒株16M攻毒试验评价重组菌株的免疫保护效力。结果显示,S19-Omp31组和S19-BCSP31组的免疫保护单位分别为2.25和2.08,显着高于S19组（1.68）;而S19-UGPase组的免疫保护单位为1.74,与S19组差异不显着。这表明重组菌株S19-Omp31和S19-BCSP31可提供良好的免疫保护效力。综上所述,本研究构建的3株重组布鲁菌株（S19-Omp31、S19-BCSP31和S19-UGPase）具有良好的遗传稳定性,其中S19-Omp31株和S19-BCSP31株具有良好的免疫原性,对强毒攻击能提供理想的免疫保护效力。本研究的结果将为新型布鲁菌疫苗的研制提供新策略。
苏敏利[3]（2019）在《布鲁氏菌病患者血液系统改变与免疫应答特征研究》文中研究指明目的本研究旨在对呼和浩特地区布鲁氏菌病患者外周血象、肝脾淋巴结、体液免疫和细胞免疫特征进行分析,把握布鲁氏菌病患者的临床特点,探讨布鲁菌感染机体后的免疫应答对疾病的影响,为今后该病的诊断及治疗提供实验依据,减少漏诊率和误诊率。方法1.选取2012年2月至2018年12月在内蒙古医科大学附属医院住院确诊的布鲁氏菌病患者95例,回顾性分析布鲁氏菌病患者住院期间外周血象及肝脾、淋巴结变化特点。2.选取2018年9月至2018年12月在内蒙古医科大学附属医院以及内蒙古疾控中心确诊的布鲁氏菌病患者共计90例组成布病组作为研究对象,其中急性期患者（急性组）70例,慢性期患者（慢性组）20例。同时选取体检的健康人群30例作为对照组,留取其清晨空腹外周血,采用流式细胞技术检测布鲁氏菌病患者与正常人外周血CD4+T、CD8+T细胞、CD4/CD8各指标的值,采用免疫比浊法检测布鲁氏菌病患者与正常人IgG、IgM、IgA、C3、C4、C1q各指标的值,比较上述指标的变化。结果1.95例布鲁氏菌病患者中,其中白细胞减少者22例（23.1%）,白细胞增高者4例（4.2%）,血红蛋白减少者47例（49%）,血小板减少者25例（25.8%）,三系均减少者共计13例（13.7%）。95例布鲁氏菌病患者中,87例患者行肝脾影像学相关检查,其中肝肿大者9例（10.3%）,脾肿大者28例（32.1%）,肝脾均肿大者6例（6.9%）。95例布鲁氏菌病患者中,64例患者行淋巴结影像学相关检查,其中淋巴结肿大者7例（9.9%）。2.布病组与正常组相比较,布病组外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞绝对计数水平较正常组升高,统计学上有显着性差异（P<0.01）。IgG、IgM、IgA、C3、C4、C1q、CD4/CD8各指标在两组间比较无统计学差异（P>0.05）。布病急性组与慢性组相比较,IgG、IgM、IgA、C3、C4、C1q、CD4+T、CD8+T、CD4/CD8各指标在两组间均无统计学差异（P>0.05）。结论1.布鲁氏菌病患者易出现外周血象异常及肝脾淋巴结肿大,需与血液系统疾病及其它细菌或病毒感染性疾病鉴别,减少误诊率和漏诊率,尽早明确诊治,预防慢性病变。2.CD4+T细胞、CD8+T细胞在布鲁菌感染期间升高,细胞免疫指标变化明显。但急性期与慢性期无显着差异。细胞免疫可能为布病预防、清除布鲁氏菌的主要免疫方式。
殷俊伟[4]（2019）在《宜兴市职业人群布鲁氏菌病监测数据分析》文中研究说明目的:通过对宜兴市职业人群布鲁氏菌病（简称布病）防治知识的知晓率、职业人群的布病血清抗体阳性率以及影响因素分析,发现宜兴市布病防控工作的不足和薄弱环节,为宜兴市和其他地区的布病防控措施提供依据,同时结合宜兴市的具体情况,因地制宜提出相应对策,防止布病疫情的进一步发展。方法:1、通过问卷调查了解职业人群布病防治知识知晓率。分析2013-2017年连续5年的5个横断面知晓率及相应问卷的信度。分析2017年知晓率在从业时间、工种等因素的分布是否有统计学差异。应用logistic回归分析2017年职业人群布病知识知晓率的影响因素。2、采用虎红平板实验（RBPT）及试管凝集试验（SAT）方法检测职业人群的布病血清抗体。分析2013-2017年5年间的血清抗体阳性率变化,比较2017年血清抗体阳性率在从业时间,工种等因素的分布是否有统计学差异。结果:1、2013年-2017年,问卷中与知晓率有关的10个题目的Cronbach’sα系数均>0.7,每年的调查问卷各题之间一致性较好,信度较高。2、2013年-2016年,宜兴市职业人群的布病知识知晓率基本稳定,2017年略有上升,5年的知晓率分别为32.49%,35.81%,31.97%,26.43%,54.62%。2017年知晓率在不同性别、年龄、从业时间、工种、文化程度之间无统计学差异。应用二分类logistic回归分析不同性别、年龄、从业时间、工种、文化程度与布病知识知晓率之间关系,提示文化程度越高者知晓率越高。3、2013年-2017年,宜兴市职业人群的血清布病抗体阳性率分别为19.41%,11.35%,13.52%,7.50%,14.86%。2017年职业人群抗体阳性率在不同性别、年龄、从业时间、工种、文化程度以及布病知识知晓之间未发现专业上可解释且有统计学意义的因素。结论:宜兴市近5年职业人群布病知识知晓率未有稳定提升,血清布病抗体阳性率没有下降,布病知识知晓率等因素与血清布病抗体阳性率未发现有统计学上的关联。建议宜兴市农林、卫生等布氏病防控领导小组成员单位进一步落实国家和江苏省布鲁氏菌病防治计划相关政策,继续加强健康教育,着力促进职业人群增加防护措施,避免通过呼吸道、消化道以及接触感染布病。
唐义国[5]（2017）在《规模化牧场牛布氏杆菌病血清学调查及A19疫苗免疫效果调查》文中认为布鲁氏菌病（Brucellosis,也称为布氏杆菌病）是由布氏杆菌属细菌引起的人兽共患的常见传染病。我国将其列为二类动物疫病。布氏杆菌是一种细胞内寄生的病原菌,主要侵害动物的淋巴系统和生殖系统。病畜主要通过流产物、精液和乳汁排菌,其中流产物是最主要的传染源。羊、牛、猪的易感性最强,母畜比公畜,成年畜比幼畜发病多,在母畜中,第一次妊娠母畜发病较多,主要症状即为流产,危害巨大。近年来,我国奶牛养殖业高速发展,饲养规模化、集约化程度不断提高,牛布氏杆菌病的防控形势也越来越严峻,严重危害到我国奶牛养殖业的健康发展。然而由于布病的特殊性,目前防控的主要方法还是依赖检疫隔离和疫苗接种两种措施。本实验对我国多个规模化牧场进行了牛血清布氏杆菌病抗体检测调查和流行病学调查,为牧场布病的防控提供数据支持;同时选择某一规模化牧场,采用虎红平板凝集试验、c-ELISA、i-ELISA三种方法对免疫A19疫苗的后备牛群进行长期的抗体水平检测,及生产数据跟踪,为牧场A19疫苗免疫效果提供临床验证。Ⅰ多个规模化牧场奶牛布氏杆菌病抗体血清学情况调查 从全国各地区13个规模化荷斯坦奶牛牧场采集血样,采用c-ELISA检测方法对收集到的血样进行布氏杆菌病抗体血清学检测,并对牧场的基本生产数据和流行病学情况进行调查。本次试验共检测血样6219份,检测结果表明除4个上海地区牧场检测结果为阴性外,其他8个牧场均存在阳性检测结果,阳性率最高达77.46%。Ⅱ布氏杆菌病感染牧场后备牛免疫A19疫苗后的抗体跟踪调查为研究布氏杆菌感染牧场犊牛免疫A19疫苗后布病抗体的变化情况及疫苗的免疫效果,选择3-4月龄母犊牛60只,采用虎红平板凝集试验、c-ELISA、i-ELISA三种方法对其免疫前、免疫后1、2、3、4、5、6月抗体水平的变化进行检测,并在后期跟踪这些牛只的繁殖情况。结果表明,三种检测方法在疫苗免疫6月后均可以抗体转阴,疫苗免疫牛只的繁殖情况正常,未发生规模型流产,表明疫苗对奶牛起到了一定的保护作用。
冯宇[6]（2017）在《牛布鲁氏菌病诊断技术研究》文中研究表明布鲁氏菌病（Brucellosis,又称布氏杆菌病、地中海弛张热、马耳他热、波浪热或波状热,简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种变态反应性人畜共患传染病。其最早于1887年由David Bruce在患病死者脾脏中发现并分离鉴定。我国则在1905年首次报道该病流行。目前,除少数发达国家以外,布病在全球160多个国家流行。布病作为重要的人畜共患病之一,其主要感染牛、羊、猪和犬等动物,其中以牛和羊的感染情况最为严重。布病可通过消化道、皮肤黏膜以及垂直传播等多种方式引起动物感染,其中最为危险的传染源为患病的妊娠动物,布鲁氏菌可伴随流产或分娩时的胎儿、胎衣和羊水排出,另外乳汁也是重要的传染源之一。布病最为显着的临床症状为生殖障碍,引起怀孕母畜流产,常见于妊娠中后期,且长期不孕;对于公畜来说,则引起睾丸炎和附睾炎,严重影响生殖性能。布病常伴随着波状热、关节炎等其他临床症状的发生。另外,布鲁氏菌作为胞内寄生菌,一旦感染个体后难以通过抗生素治疗,即使动物自愈,仍然有持续排菌的危险,所以免疫加检疫是控制和预防布病的基本方式。目前布病是《中华人民共和国传染病防治法》规定的35种传染病中的乙类传染病,同时并被列为二类传染病。目前,对于布病的检测方法大都建立在体液免疫基础上,传统的检测方法有虎红平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）等,但传统方法耗时较长,方法繁琐且判断较为困难,结果判定十分依赖于相关人员的经验。上世纪70年代,随着相关技术的发展,酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光偏振实验（FPA）也被应用于布病的检测之中。然而由于技术限制,我国使用的动物布病ELISA检测试剂盒一直被国外厂商垄断,使得产生了高昂的检测成本;而且,我国现有的预防动物布病的疫苗如猪种S2株、牛种A19株和羊种M5株均为光滑型菌株,其免疫后产生的抗体与自然感染之间存在干扰,使得现有手段无法区分动物的具体状态。国外有些国家（如美国、加拿大等）通过使用粗糙型疫苗的方式解决了该问题,但由于我国还未有有效的粗糙型疫苗使用,使得我国对于动物布鲁氏菌的有效检疫和及时淘汰变得更加困难。为了解决上述问题,本研究针分别建立了针对动物布鲁氏菌病的竞争ELISA抗体检测试剂盒和牛布鲁氏菌病间接ELISA抗体检测方法,同时建立了针对牛布鲁氏菌IgM亚型抗体的检测方法,构建了不同感染/免疫状态下的动物模型,并借鉴了之前的研究,确定了不同状态下牛体液免疫情况,建立了基于牛不同布鲁氏菌抗体亚型的鉴别诊断方法。同时,本研究针对现有检测手段均仅限于检测体液免疫状态的局限,通过对刺激源的选择,并借鉴牛结核分枝杆菌病的相关手段,建立了针对牛布鲁氏菌的ifn-γ释放试验的检测方法。本研究通过单克隆细胞制备技术筛选到针对布鲁氏菌的特异性单抗细胞株（4c3株）,并通过棋盘交叉法确定了包被浓度、酶标抗体稀释度、样品稀释度、样品稀释液等条件,建立了动物布鲁氏菌抗体竞争elisa检测方法。在此条件下该方法的敏感性为97.9%,特异性为96.3%。本研究同时以提纯的布鲁氏菌脂多糖（lps）抗原,按照上述方法分别建立了针对布鲁氏菌特异性igg和igm亚型抗体的检测方法,其敏感性分别达到97.7%和95.7%,特异性分别为95.5%和92%。而且,上述建立的间接elisa方法对与布鲁氏菌具有相同抗原为点的小肠结肠炎耶尔森氏菌o:9和大肠杆菌o:157抗血清无交叉反应性,证明了本研究建立方法的良好特异性。本研究在建立的分别针对布鲁氏菌igg和igm抗体亚型检测方法的基础上,通过构建易感动物（奶牛）模型,获得我国常用疫苗（猪种布鲁氏菌s2弱毒苗和牛种布鲁氏菌a19弱毒苗）以及标准强毒株（牛种布鲁氏菌2308株）的抗体规律。通过检测发现,s2疫苗口服后在整个检测期内（0150天）其igg的含量均低于临界值,而igm则在免疫15天后达到最高,之后逐步下降,并在免疫后60天后低于临界值;皮下注射a19免疫组其igg和igm则在15天后即达到高峰,之后均迅速下降,igg在感染后90天,igm则在60天后低于临界值;与s2组和a19组不同,攻毒对照组其igg在2130天时出现后则一直保持稳定水平,而igm亚型抗体出现时间也比免疫组延迟,迅速达到高峰后持续下降。这表明不同疫苗之间以及与野毒株之间其抗体亚型有明显的差别,通过这些区别,可以通过检测抗体亚型的方法来对牛群不同状态进行鉴别。为了验证本方法的可行性,本研究对背景清晰的50份样本进行检测,通过上述建立的鉴别诊断方法,判断了其真实状态,除个别因处于交叉范围外,其他样本（46/50）均可进行实施鉴别诊断,准确度为92%。本研究通过借鉴牛结核病的ifn-γ相关检测方法,确定了1.0×107cfu/ml的灭活牛种2308抗原作为牛布鲁氏菌病ifn-γ释放试验的最佳抗原,并对感染牛群进行检测,结果发现ifn-γ释放试验可将检测时间点提前到感染后5天,相较于传统抗体检测方法,提前了23周。说明该方法可以增强对于布鲁氏菌病的检测效果,对于尽早发现和处理阳性个体具有重要意义。最后,本研究建立的动物布鲁氏菌竞争ELISA检测方法、牛布鲁氏菌间接ELISA检测方法能够有效检测牛布鲁氏菌病的感染,相较于传统检测方法更加方便快速,并具有良好的符合率;而牛布病IgM亚型抗体间接ELISA检测方法对于准确分析感染时期具有重要意义;而基于抗体亚型的鉴别诊断方法解决了疫苗免疫与自然感染无法鉴别的问题;而IFN-γ释放试验对于布病早期诊断的早期诊断具有重要意义。
朱良全[7]（2016）在《布鲁氏菌病活疫苗S2株小鼠评价模型构建及其鉴别抗原筛选》文中研究表明布鲁氏菌病（布病）是严重危害公共卫生的人兽共患病。我国预防动物布病主要采用的是猪源分离致弱的布病活疫苗株S2,但国际上对其在牛、羊等异源动物的保护力存在争议。为此,本论文采用BALB/c小鼠为模型,系统研究了S2株残余毒力、体液和细胞免疫应答,并评价其免疫保护力。将55只小鼠皮下接种1×105CFU S2活菌,每周剖杀5只,测定脾重、脾脏含菌量、血清中IgG和细胞因子的消长情况。结果显示,小鼠脾脏含菌量随时间延长而逐步下降,4周后全部清除；小鼠免疫后2-3周IgG浓度达到最高,5周后逐步下降；IFN-y和TNF-a含量免疫后1周最高,然后迅速下降,至第3周几乎检不出。将免疫后8周小鼠,分别皮下接种3种不同种属布病强毒（猪布鲁氏菌S1330株、牛布鲁氏菌2308株和羊布鲁氏菌M28株）1×105 CFU（5只/组）,30日后进行脾脏称重、脾脏分菌及病理学检测,免疫小鼠能够抵抗3种不同强毒株的攻击,证实了其良好免疫保护力。此部分工作为国际组织推荐使用S2提供模型动物实验证据。当前布病防控中的最大难题是无法区分疫苗免疫与自然感染抗体,本论文采用免疫蛋白组学方法从S2株膜蛋白中筛选鉴别诊断抗原。各用30份布病阴性健康羊、30份S2免疫羊,以及30份临床布病感染羊阳性混合血清,分别与S2株膜蛋白二维电泳胶（2D）进行Western-blot,寻找S2膜蛋白与不同布病状态（感染/免疫／阴性）绵羊血清反应差异,共寻找到113个差异蛋白点。选择免疫反应差异较大的30个蛋白点进行MALDI-TOF质谱及生物信息学分析,共鉴定出14个蛋白,这些蛋白承担13类分子功能、参与组成6类细胞组分和13类生物学过程。将3种混合血清（感染／免疫／阴性）分别与S2膜蛋白进行免疫共沉淀（IP）,并对IP结合物进行Q-Extractive质谱鉴定,获得182个候选蛋白点,这些蛋白行使129类分子功能、参与组成91类细胞组分和137类生物学过程。通过2D-MALDI-TOF鉴定出的14个蛋白中有12个蛋白在IP Q-Extractive中同时被筛选出。对2种方法鉴定出的所有蛋白进行功能分析,共挑选出10个体外鉴别诊断的候选靶点（编号1#-10#）。构建10个候选靶蛋白原核表达质粒,除1#（transporter）与5# （cell division protein FtsH）外,8个蛋白成功表达。将表达蛋白分别与3种混合血清进行Western-blot和ELISA检测,显示2#（universal stress protein）、3# （glycoside hydrolase family 43）及10# （hypothetical protein）鉴别诊断效果明显。分别将3种蛋白用GST柱纯化后,作为包被抗原,通过方阵试验及单因子法优化并确定了ELISA检测参数。然后对30份感染血清及656份免疫羊场样品进行检测,2#,3#及10#蛋白建立的ELISA对感染样本检出率约60-80%。此部分工作对破解布病鉴别诊断难题,实现布病净化和根除意义重大。
易德武[8]（2015）在《羊种布鲁氏菌015株gmd、per和manb缺失株的构建及诊断抗原反应原性评价研究》文中认为布鲁氏菌病是一种人畜共患疾病,对畜牧业和人类健康构成了巨大威胁,被列为B类传染病。目前还没有人用布病疫苗,主要是通过布鲁氏菌弱毒活疫苗接种动物来防控布病。目前大多数动物布病疫苗为光滑型的减毒活疫苗,毒副作用较大、无法区分自然感染和人工免疫等不足。布鲁氏菌的致病机制还不完全清楚。脂多糖（LPS）是布氏杆菌非常重要的毒力因子,具有较强的抗原性。根据现有的研究表明,LPS的完整性与其胞内存活、增殖和毒力等密切相关。gmd、per和manb都与光滑型布鲁氏菌的LPS的生物合成过程有关。这些基因的缺失可以导致光滑型布鲁氏菌变为粗糙型布鲁氏菌。目的:本研究通过同源重组缺失了羊种布鲁氏菌生物3型流行株015的gmd,per和manb基因,构建相应的粗糙型缺失株;并在小鼠巨噬细胞RAW264.7和昆明系小鼠体内初步评价其毒力致弱情况,检测了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平;同时分别表达了gmd,per和manb蛋白,Western blot验证其反应原性;旨在为研发能区分疫苗免疫和自然感染的羊种布鲁氏菌标记性疫苗提供基础材料。方法:本研究以羊种布鲁氏菌015为模板,分别克隆gmd,per和manb基因的上、下游同源臂,以枯草芽孢杆菌为模板克隆SacB基因,将克隆得到的序列连接到pMDS19-T载体上,采用双酶切法将上游同源臂、下游同源臂、SacB序列分别连到自杀载体pGEM-7Zf上,分别构建了同源重组自杀载体pGEM-7Zf-Δgmd-SacB（pgs）,pGEM-7Zf-Δper SacB（pps）和pGEM-7Zf-Δmanb-SacB（pms）,然后分别电转至羊种布鲁氏菌015感受态细胞中,通过多次筛选分别获得015Δgmd,015Δper和015Δmanb基因缺失株;对获得的缺失株进行PCR鉴定和遗传稳定性等检测。用稳定遗传的粗糙型缺失株分别侵染鼠源巨噬细胞RAW264.7和昆明系小鼠,通过载菌量（CFU）检测缺失株毒力致弱情况;通过间接ELISA方法检测了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。此外,用PCR方法分别扩增gmd,per和manb基因,将测序正确的基因序列分别克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上,然后转化至大肠杆菌DE3（BL21）中诱导表达。建立稳定的表达gmd,per和manb蛋白的体系,用布鲁氏菌自然感染绵羊血清进行western blot检测,最终筛选出有鉴别诊断意义的抗原蛋白。结果:成功构建了遗传稳定的粗糙型羊种布鲁氏菌015Δgmd,015Δper,015Δmanb缺失株,在20代内没有发生回复突变;015Δgmd,015Δper和015Δmanb缺失株在细胞水平和小鼠体体内证实毒力都显着降低且具有较好的免疫原性;以布鲁氏菌自然感染羊血清证实gmd、manb和per蛋白反应原性良好,具有自然感染与候选疫苗免疫抗体区分的潜在价值。结论:构建的羊种布鲁氏菌015Δgmd、015Δper和015Δper缺失株与对应表达蛋白联合应用,有望研发具有自主知识产权的缺失候选疫苗及配套诊断方法。
张敏[9]（2013）在《流产布氏杆菌脂多糖突变株ΔrfbE和ΔrfbD的构建及其生物学特性研究》文中研究说明布氏杆菌是兼性胞内生长的革兰氏阴性菌,可感染多种动物和人,引起布氏杆菌病。布氏杆菌的致病机制与其胞内存活、增殖有关。脂多糖（LPS）是布氏杆菌一种重要的毒力因子,完整的LPS对其胞内生存和毒力十分必要。rfbE （BAB10542）编码ABC型转运系统ATP酶,rfbD （BAB10543）编码ABC型转运系统运载体,这两个蛋白参与LPS的O-抗原从细胞膜内侧转运到周质侧。rfbE, rfbD基因突变,将导致O-抗原在胞内合成,但不能转运到周质侧,无法合成完整的LPS。本研究通过同源重组的方法构建ΔrfbE和ΔrfbD突变株,通过比较突变株和野毒株的细菌表型、生长曲线、在小鼠巨噬细胞RAW264.7胞内生存能力、在BALB/c小鼠动物模型上的毒力情况,来探讨不完整LPS结构对布氏杆菌S2308生物学功能和毒力特性的影响；并通过监测ΔrfbE免疫后小鼠血清针对S2308产生的抗体效价、细胞因子表达,小鼠脾脏内MHC分子和共刺激分子在转录水平的表达,以及ΔrfbE免疫后小鼠对S2308攻毒产生的保护力,来评价ΔrfbE免疫保护性,探究其做为新型减毒活疫苗候选株的可能性。结果显示,ΔrfbE和ΔrfbD突变株构建成功,rfbE基因（BAB10542）编码框内缺失446bp, rfbD基因（BAB10543）编码框内缺失668bp。同时用实时定量PCR方法在转录水平上验证ΔrfbE突变成功,对上下游基因功能没有影响。应用结晶紫染色和热凝集实验方法确定ΔrfbE和ΔrfbD均为粗糙型表型；生长曲线结果表明ArfbE突变株生长速度于36h后明显低于野毒株S2308（P<0.01）,ΔrfbD突变株比野毒株S2308早8h到达平台期；ΔrfbE对大多数抗生素敏感,仅对红霉素不敏感,对表面活性剂Tween-20、Triton-X100不敏感,与野毒株S2308相比差异不显着；ΔrfbE和ΔrfbD突变株与野毒株S2308相比,在胞内的生存、增殖能力下降,在小鼠体内毒力减弱,而C2308ΔrfbE与野毒株S2308毒力一致。此外,ArfbE免疫2周后针对S2308产生抗体效价明显低于S2308接种小鼠产生的效价（P<0.05）,可以区分人为免疫和自然感染；ΔrfbE免疫小鼠1周后脾脏内MHCI的表达量明显上调（P<0.05）,而野毒株S2308免疫小鼠1周后脾脏内MHCI的表达量上调不明显,突变株ΔrfbE相对于野毒株S2308在免疫早期引起更高水平的细胞免疫水平；ΔrfbE. S2308免疫后脾脏中共刺激分子CD40ΟCD80ΟCD86调节趋势一致,血清中细胞因子IL-2、 IL-4、IL-6、IL-10变化不明显,即ArfbE、S2308产生免疫分子的趋势一致；ΔrfbE免疫小鼠后对强毒的攻毒保护率为100%,与疫苗株RB51相似。因此,ΔrfbE可作为新型减毒活疫苗的候选株。
蔺国珍[10]（2012）在《布鲁氏菌病LAMP检测方法的建立及双基因共表达分子疫苗研究》文中研究说明布鲁氏菌病，简称布病（Brucellosis），是由布鲁氏菌（Brucella spp.）引起的一种的人畜共患传染病。目前，该病已在世界范围内广泛流行，并呈一定上升态势，严重危害畜牧业发展和人类健康。建立方便快捷的布鲁氏菌检测技术，研发安全有效的新一代布病疫苗已成为控制和消灭动物布病的必然趋势。本研究主要内容如下：1.选择布鲁氏菌OMP25诊断基因和P39、18KD、L7/L12和BCSP31优势抗原基因，扩增后分别与pMD18-T载体连接，制备了克隆质粒。分析比对GenBank中OMP25基因序列，设计2套特异性引物，通过反应物浓度和反应条件的优化，建立了布鲁氏菌快速检测LAMP方法。该方法能从奶样和血样中检出6个种的布鲁氏菌病原，所能检测出的最低限度为9fg/μl，较PCR方法高出10倍，具有很高的特异性、敏感性和稳定性。对田间样品进行检测发现，LAMP方法与巢式PCR方法符合率达98.95%，可为临床布鲁氏菌的快速检测提供新的技术手段。2.借助pQCXIX和pcDNA3.1真核载体，成功构建了P39和18KD双基因共表达核酸质粒pcDNA-P39/18KD。体外转染293AD细胞，经RT-PCR鉴定、间接免疫荧光和Western blot检测，证实P39和18KD目的蛋白可在293AD细胞中有效共表达，反应原性良好。3.经测序鉴定成功构建了L7/L12和BCSP31双基因穿梭载体pSh-LL/BP。然后与复制缺陷型Ad5腺病毒于BJ5183工程菌内同源重组，成功筛选到腺病毒重组子质粒pAd-LL/BP。将其转染293AD细胞，成功包装并纯化出共表达重组腺病毒Ad-LL/BP，滴度达109.68TCID50/mL。连续传代后经PCR检测、电镜观察、IFA、Western blot等实验证实该重组病毒没有发生外源基因缺失，两个目的蛋白获得了稳定共表达，且反应性良好。4.以上述构建的共表达DNA疫苗和腺病毒载体疫苗单独和联合免疫BALB/c小鼠，共免疫三次。ELISA检测血清特异性抗体发现，各免疫组均能产生IgG特异性抗体，联合免疫组显着高于单独免疫组，抗体水平最高的为pcDNA-P39/18KD（prime）和Ad-LL/BP（boost）组，最低的为pcDNA-P39/18KD组；除IgA外，IgG、IgG1、IgG2a水平随免疫次数和免疫时间增加逐渐升高，IgG2a较IgG1升高更快（p<0.05）。MTT法检测脾淋巴细胞增殖指数（SI）显示，抗原和ConA刺激均能使各组SI升高，但以ConA略高（p>0.05），组间对比Cp>V3>V4>V1>V2>Cn。FCM脾脏T淋巴细胞亚群分析显示，除CD8+及CD4+/CD8+外，各疫苗免疫组CD3+、CD4+脾脏T淋巴细胞数均显着升高（P<0.05），联合免疫组显着高于其单独免疫组。ELISA检测脾淋巴细胞诱导上清IL-12和IL-10显示，联合免疫组IL-12水平，DNA/Ad和Ad/DNA分别为70.7±8.1pg/mL和64.2±7.5pg/mL，明显高于单独DNA免疫组36.4±4.4pg/mL或重组腺病毒免疫组38.7±5.15pg/mL，但都低于A19弱毒苗免疫组85.3±8.2pg/mL（p<0.05）；而各组IL-10水平与阴性对照组相比，均无显着差异（p>0.05）。由此可见，本研究所构建的双基因表达DNA疫苗和腺病毒活载体疫苗均能产生高水平的IgG抗体，能有效诱导以细胞免疫为主的免疫应答反应。首次证实布鲁氏菌DNA和重组腺病毒疫苗联合免疫效果优于单独免疫，以pcDNA-P39/18KD（prime）和Ad-LL/BP（boost）免疫效果最好。
二、牛布氏菌RB51抗原的免疫效力（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛布氏菌RB51抗原的免疫效力（论文提纲范文）
（1）布鲁氏菌病S2凝胶活疫苗的研制及不同黏膜免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 布鲁氏菌的病原学 |
| 1.2 布病的危害及流行情况 |
| 1.3 布鲁氏菌病疫苗研究进展 |
| 1.3.1 弱毒活疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 1.3.3 新型疫苗 |
| 1.4 温敏凝胶系统 |
| 1.4.1 温敏凝胶的分类 |
| 1.4.2 温敏凝胶的发展应用 |
| 1.4.3 温敏凝胶不同途径上的应用进展 |
| 1.5 本研究内容及意义 |
| 第二章 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)的制备与理化性质的测定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 菌株及来源 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂和耗材 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 免疫部位温度的测量 |
| 2.2.2 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)的制备及优化 |
| 2.2.3 布病温敏凝胶活疫苗的表征分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫部位温度测定结果 |
| 2.3.2 星点设计-效应面法结果 |
| 2.3.3 观察布病温敏凝胶活疫苗表征结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 布鲁氏菌病温敏凝胶活疫苗(S2株)对小鼠不同黏膜途径的免疫效果 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 菌种及来源 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)的制备 |
| 3.2.2 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)黏膜免疫最小免疫剂量测定 |
| 3.2.3 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)免疫安全性和免疫反应评价 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)黏膜免疫最小免疫剂量结果 |
| 3.3.2 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)免疫安全性和免疫效力评价结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)对羊不同黏膜途径的免疫效果 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 菌种及来源 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)羊最小黏膜免疫剂量测定 |
| 4.2.2 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)免疫安全性与免疫效力评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)羊最小黏膜免疫剂量结果 |
| 4.3.2 布病温敏凝胶活疫苗(S2株)免疫安全性和免疫反应评价结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（2）布鲁菌S19重组疫苗株的构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 布鲁菌病及诊断技术研究进展 |
| 1.1 布鲁菌病病原学 |
| 1.2 布鲁菌病流行病学 |
| 1.3 布鲁菌病诊断方法 |
| 第二章 布鲁菌疫苗研究进展 |
| 2.1 传统疫苗 |
| 2.2 重组蛋白疫苗 |
| 2.3 标记疫苗 |
| 2.4 DNA疫苗 |
| 2.5 外膜囊泡疫苗 |
| 2.6 菌壳疫苗 |
| 2.7 病毒活载体疫苗 |
| 2.8 细菌活载体疫苗 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 重组布鲁菌的构建及鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 重组布鲁菌的免疫原性和免疫效力评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）布鲁氏菌病患者血液系统改变与免疫应答特征研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（4）宜兴市职业人群布鲁氏菌病监测数据分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究背景 |
| 研究目的和应用价值 |
| 研究主要内容 |
| 第一章 职业人群知晓率分析 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 调查对象 |
| 1.2 调查方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 1.4 统计分析方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 调查对象基本情况 |
| 2.2 问卷信度分析 |
| 2.3 职业人群5年知晓率横断面调查 |
| 2.4 2017年职业人群知晓率分布调查 |
| 2.5 2017年知晓率多因素分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 知晓率的人群分布特征 |
| 3.2 知晓率提高情况 |
| 第二章 职业人群血清抗体阳性率分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 检测试剂 |
| 1.3 血样处理方法 |
| 1.4 血清抗体检测步骤 |
| 1.5 阳性判定标准 |
| 1.6 统计分析方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 调查对象基本情况 |
| 2.2 职业人群连续5年抗体阳性率 |
| 2.3 抗体阳性率与知晓率关联分析 |
| 2.4 2017 年血清抗体人群分布调查 |
| 3 讨论 |
| 3.1 布病抗体的人群分布特征 |
| 3.2 抗体阳性率控制情况 |
| 3.3 布病控制情况 |
| 3.4 布病防制工作建议 |
| 4 本次研究局限性 |
| 4.1 RBPT的漏检情况 |
| 4.2 缺乏职业人群暴露史调查 |
| 4.3 缺乏职业人群的高危行为调查 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 布鲁氏菌病基础研究、流行现状及防治进展[综述] |
| 1 国内外布病的基础研究概况 |
| 1.1 布病的病原学研究 |
| 1.2 布病致病机制的研究 |
| 2 国内外布病流行现状 |
| 2.1 国外布病流行现状 |
| 2.2 我国布病流行现状 |
| 3 国内外布病防治研究进展 |
| 3.1 国内外布病防治策略 |
| 3.2 布病疫苗应用 |
| 3.3 治疗 |
| 3.4 检测 |
| 4 我国布病防治中存在的问题 |
| 4.1 亟需解决的问题 |
| 4.2 关键技术的研究 |
| 5 我国布病防控的发展方向 |
| 参考文献 |
| 附录A 2013 年-2017 年调查问卷 |
| 附录B 2013 年流调表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）规模化牧场牛布氏杆菌病血清学调查及A19疫苗免疫效果调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 布氏杆菌病的流行病学特征 |
| 1、布氏杆菌的移行现象 |
| 2、布氏杆菌的传播 |
| 3、凝集反应 |
| 4、前苏联高尔基地区布氏杆菌病的防控策略 |
| 第二章 奶牛布氏杆菌疫苗应用现状 |
| 1 国内布氏菌病活疫苗 |
| 1.1 布氏菌病活疫苗S2株 |
| 1.2 布氏菌病活疫苗M5株 |
| 1.3 布氏菌病活疫苗A19株 |
| 2 国内布氏杆菌疫苗使用现状 |
| 3 国外布氏菌病活疫苗 |
| 3.1 流产布氏杆菌RB51株 |
| 3.2 羊种布氏杆菌Rev.1 |
| 4 关于布氏杆菌疫苗抗体与感染的鉴别问题 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第三章 南方地区规模化牧场布氏杆菌病血清学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验牧场与试验动物 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牧场生产情况调查数据 |
| 2.2 布氏杆菌抗体检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第四章 布氏杆菌病感染牧场后备牛免疫A19疫苗后的抗体跟踪调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物与疫苗 |
| 1.2 日粮营养成分及饲养管理 |
| 1.3 牧场布氏杆菌感染及免疫情况 |
| 1.4 试验器材及试剂 |
| 1.5 检测方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 后备牛血清布氏杆菌抗体检测结果 |
| 2.2 试验牛群繁殖情况调查 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 不同抗体检测方法的分析 |
| 3.2 免疫保护效果的评估 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）牛布鲁氏菌病诊断技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 布鲁氏菌及布鲁氏菌病概况 |
| 1.1.1 布鲁氏菌基本介绍 |
| 1.1.2 布鲁氏菌病临床表现 |
| 1.1.3 布鲁氏菌主要抗原位点及血清学特性 |
| 1.2 布鲁氏菌免疫应答机制 |
| 1.2.1 先天性细胞免疫应答 |
| 1.2.2 获得性细胞免疫应答 |
| 1.2.3 获得性体液免疫反应 |
| 1.2.4 IFN-γ 在抗布鲁氏菌病感染中的作用 |
| 1.3 动物布鲁氏菌病的预防 |
| 1.3.1 布病主要诊断方法 |
| 1.3.2 布病主要疫苗 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要实验耗材与仪器 |
| 2.1.1 实验所需相关试剂与仪器 |
| 2.1.2 主要实验用菌株及细胞 |
| 2.1.3 实验所需相关检测试剂 |
| 2.1.4 实验所需相关动物及血清 |
| 2.2 动物布鲁氏菌竞争ELISA抗体检测方法的建立 |
| 2.2.1 免疫抗原及单抗筛选抗原的制备 |
| 2.2.2 布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体的筛选及腹水制备 |
| 2.2.3 单克隆抗体反应性鉴定 |
| 2.2.4 布病竞争ELISA抗体检测方法最佳条件的确定 |
| 2.3 牛布鲁氏菌间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.3.1 包被抗原的制备 |
| 2.3.2 抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 2.3.3 最适条件的确定 |
| 2.3.4 临界值的确定 |
| 2.3.5 特异性实验 |
| 2.3.6 符合率实验 |
| 2.4 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.4.1 包被抗原的制备 |
| 2.4.2 抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 2.4.3 最适条件的确定 |
| 2.4.4 临界值的确定 |
| 2.4.5 符合率实验 |
| 2.4.6 抗体消长规律监测 |
| 2.5 疫苗免疫与自然感染鉴别诊断方法的建立 |
| 2.5.1 实验用动物免疫/攻毒及样本采集 |
| 2.5.2 免疫群体及攻毒组抗体规律的监测 |
| 2.5.3 临床样品的检测 |
| 2.6 γ-干扰素释放试验（IGRA）在布鲁氏菌病诊断上的建立及应用 |
| 2.6.1 刺激用菌体抗原的制备 |
| 2.6.2 布鲁氏菌水解素的制备 |
| 2.6.3 最佳刺激抗原的选择 |
| 2.6.4 IFN-γ 释放试验与血清学方法的比较 |
| 2.6.5 IFN-γ 释放试验在临床检测中的应用 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 动物布鲁氏菌间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1.1 LPS的提取与鉴定 |
| 3.1.2 LPS特异性单克隆抗体细胞的筛选 |
| 3.1.3 单克隆抗体反应性鉴定 |
| 3.1.4 最适工作浓度的确定 |
| 3.1.5 动物布鲁氏菌病竞争ELISA方法最适条件的确定 |
| 3.1.6 临界值的确定 |
| 3.1.7 符合率比较结果 |
| 3.2 牛布鲁氏菌间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.1 LPS的纯度及效价 |
| 3.2.2 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 3.2.3 最适条件的确定 |
| 3.2.4 临界值的确定 |
| 3.2.5 特异性实验 |
| 3.2.6 符合率实验 |
| 3.3 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.1 LPS的纯度及效价 |
| 3.3.2 抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 3.3.3 最适条件的确定 |
| 3.3.4 临界值的确定 |
| 3.3.5 符合率实验 |
| 3.3.6 抗体消长规律的监测 |
| 3.4 疫苗免疫与自然感染鉴别诊断方法的建立 |
| 3.4.1 A19疫苗免疫后抗体变化情况 |
| 3.4.2 S2疫苗免疫后抗体变化情况 |
| 3.4.3 人工感染布鲁氏菌强毒株后抗体变化 |
| 3.4.4 抗体趋势规律图的构建 |
| 3.4.5 临床样品检测 |
| 3.5 γ-干扰素释放试验（IGRA）在布鲁氏菌病诊断上的建立及应用 |
| 3.5.1 刺激抗原的比较和最佳刺激抗原的确定 |
| 3.5.2 IFN-γ 释放试验与血清学方法的比较 |
| 3.5.3 IFN-γ 释放试验在临床检测中的应用 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 7. 致谢 |
| 8.攻读学位期间论文与专利 |
（7）布鲁氏菌病活疫苗S2株小鼠评价模型构建及其鉴别抗原筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献概述 |
| 1.1 研究进展 |
| 1.1.1 布病疫情动态 |
| 1.1.2 防制与诊断技术进展 |
| 1.1.3 世界布鲁氏菌疫苗概况 |
| 1.1.4 蛋白组学及其研究技术 |
| 1.1.5 免疫蛋白组学及其在布鲁氏菌研究中的应用 |
| 1.1.6 布鲁氏菌外膜相关蛋白诊断抗原研究进展 |
| 1.2 研究内容及意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第二章 中国猪种布鲁氏菌病活疫苗(S2株)在BALB/c小鼠中的评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验所需的菌株、培养基与试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 试验分组 |
| 2.3.2 S2株在小鼠脾脏定殖试验 |
| 2.3.3 免疫后脾细胞细胞免疫应答水平 |
| 2.3.4 免疫后外周血抗体消涨规律检测 |
| 2.3.5 小鼠免疫攻毒试验 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 S2株在小鼠脾脏定殖情况 |
| 2.4.2 S2免疫后细胞免疫应答指标监测 |
| 2.4.3 S2免疫后抗体消涨规律变化 |
| 2.4.4 免疫攻毒试验 |
| 2.4.5 组织病理学结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 基于凝胶电泳的免疫蛋白质组学技术筛选S2鉴别诊断候选抗原蛋白靶点 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 菌株及来源 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 主要试剂及耗材 |
| 3.2.5 常用布鲁氏菌培养基及稀释溶液 |
| 3.2.6 2DE、western-blot及MALDI-TOF质谱试验用溶液 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 布鲁氏菌膜蛋白提取 |
| 3.3.2 膜蛋白浓度定量及电泳 |
| 3.3.3 双向电泳 |
| 3.3.4 湿转印 |
| 3.3.5 染色 |
| 3.3.6 图像扫描与分析 |
| 3.3.7 切胶、脱色、酶解消化、质谱 |
| 3.3.8 蛋白鉴定和分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 布鲁氏菌灭活结果 |
| 3.4.2 S2膜蛋白SDS-PAGE及浓度测定结果 |
| 3.4.3 布鲁氏菌S2株膜蛋白双相电泳和Western-blot结果 |
| 3.4.4 分析鉴定及功能分析 |
| 3.4.5 可能诊断靶点信息列表 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 基于免疫共沉淀的蛋白质组学技术筛选S2鉴别诊断抗原蛋白靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 菌株及来源 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 IP试验用溶液 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 布鲁氏菌膜蛋白提取及定量 |
| 4.3.2 免疫共沉淀 |
| 4.3.3 切胶、脱色、酶解消化、质谱和蛋白鉴定 |
| 4.3.4 蛋白鉴定和分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 S2膜蛋白提取SDS-PAGE及浓度测定结果 |
| 4.4.2 不同血清与S2膜蛋白免疫共沉淀结果 |
| 4.4.3 免疫共沉淀获得质谱点信息列表 |
| 4.4.4 所鉴定的鉴别诊断抗原的功能分析 |
| 4.4.5 可能的鉴别诊断抗原蛋白 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 候选鉴别诊断抗原蛋白的体外表达及间接ELISA方法的初步建立 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 菌株和载体 |
| 5.2.2 主要试剂耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 种子及细菌悬液的制备 |
| 5.3.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 5.3.3 引物设计与合成 |
| 5.3.4 10种基因的PCR扩增 |
| 5.3.5 目的基因的回收 |
| 5.3.6 重组表达质粒的构建 |
| 5.3.7 重组质粒转化 |
| 5.3.8 诱导、表达及验证 |
| 5.3.9 具有鉴别诊断价值的表达蛋白筛选 |
| 5.3.10 重组蛋白的纯化 |
| 5.3.11 ELISA方法验证及条件优化 |
| 5.3.12 鉴别诊断抗原ELISA检测方法cut-off值的确立 |
| 5.3.13 ELISA对临床样本的检测 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 2DE&Western-blot&MALDI-TOF与IP&QE共同鉴定的蛋白点 |
| 5.4.2 猪布鲁氏菌S2株抗原的克隆 |
| 5.4.3 重组蛋白的表达 |
| 5.4.4 重组蛋白与三种血清的Western-blot |
| 5.4.5 重组蛋白与三种血清的ELISA反应 |
| 5.4.6 重组蛋白的纯化 |
| 5.4.7 重组蛋白ELISA方法的建立 |
| 5.4.8 鉴别诊断抗原间接ELISA检测免疫血清的临界值(Cut-off) |
| 5.4.9 运用建立的间接ELISA方法对临床样本检测 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）羊种布鲁氏菌015株gmd、per和manb缺失株的构建及诊断抗原反应原性评价研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文及字符缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 布鲁氏菌概述 |
| 1 布鲁氏菌的病原学特征 |
| 1.1 布鲁氏菌分类 |
| 1.2 形态及染色特性 |
| 1.3 培养及抵抗力 |
| 1.4 致病性 |
| 2 布病疫情情况 |
| 2.1 世界布病流行情况 |
| 2.2 我国布病流行情况 |
| 2.3 新疆布病流行情况 |
| 2.4 布鲁氏菌病的防制 |
| 2.5 鲁氏菌病根除计划 |
| 3 布鲁氏菌病的诊断方法 |
| 3.1 细菌培养法 |
| 3.2 血清学技术 |
| 3.2.1 凝集反应 |
| 3.2.2 补体结合试验(CFT) |
| 3.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.3 聚合酶链反应(PCR)在布病检测中的应用 |
| 3.3.1 PCR应用于布鲁氏菌抗原鉴定的研究 |
| 3.3.2 PCR应用于布鲁氏菌种型的鉴定研究 |
| 4 布鲁氏菌主要的毒力因子 |
| 4.1 脂多糖及合成相关的毒力基因（manb、per和gmd） |
| 4.2 BvrR/BvrS双组分系统 |
| 4.3 四型分泌系统(Type 4 secretion system,T4SS） |
| 4.4 密度感应系统(Quorum Sensing ,QS) |
| 4.5 其他毒力因子 |
| 4.5.1 外膜蛋白(Major outer membrane proteins,OMPs ) |
| 4.5.2 环β-1,2 葡聚糖(Cyclicβ-1,2-glucans,CβGs) |
| 4.5.3 应激反应蛋白 |
| 5 布鲁氏菌病疫苗研究进展 |
| 5.1 布鲁氏菌病主要的弱毒苗及灭活苗 |
| 5.2 布鲁氏菌亚单位疫苗 |
| 5.3 载体疫苗 |
| 5.4 DNA疫苗 |
| 5.5 布氏菌外膜囊泡疫苗 |
| 第二章 试验研究 |
| 实验一 羊种布鲁氏菌015株gmd、per、manb基因缺失株的构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源、载体 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 目的基因的PCR扩增 |
| 1.2.2 目的基因回收 |
| 1.2.3 目的基因与pMD19-T载体的连接 |
| 1.2.4 连接产物的转化 |
| 1.2.5 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 1.2.6 阳性单克隆的扩繁 |
| 1.2.7 重组质粒的提取 |
| 1.2.8 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.9 自杀载体的构建 |
| 1.2.10 重组自杀载体的酶切鉴定 |
| 1.2.11 测序 |
| 1.2.12 重组自杀质粒pgs、pps、pms的电转 |
| 1.2.13 同源重组子的筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 布鲁氏菌 015 Δgmd、Δper、Δmanb缺失株的构建 |
| 2.1.1 同源重组质粒pgs、pps、pms的构建 |
| 2.1.2 同源重组质粒pgs、pps、pms的酶切鉴定 |
| 2.1.3 Δgmd、Δper、Δmanb的一次筛选 |
| 2.1.4 Δgmd、Δper、Δmanb的二次筛选 |
| 2.2 缺失株Δgmd、Δper、Δmanb的遗传稳定性检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 同源重组子的构建 |
| 3.2 电转条件的优化 |
| 3.3 无痕敲除构建突变株 |
| 4 小结 |
| 实验二 羊种布鲁氏菌 015Δmanb、Δper和Δgmd缺失株的毒力评价 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 实验细胞及动物 |
| 1.1.3 主要试剂和仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养液和PBS缓冲液的配制 |
| 1.2.2 RAW264.7 细胞的培养 |
| 1.2.3 细胞计数 |
| 1.2.4 菌株的培养及计数 |
| 1.2.5 Δmanb、Δper和Δgmd缺失株的毒力初步评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因缺失对布鲁氏菌毒力的影响 |
| 2.1.1 缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7 内的增殖 |
| 2.1.2 缺失株在小鼠体内的存活情况 |
| 2.3 菌株诱导机体抗体水平差异(IgG) |
| 2.4 菌株诱导机体产生INF-γ的差异 |
| 3 讨论 |
| 3.1 缺失株毒力评价 |
| 3.2 per、gmd和manb基因对免疫原性的影响 |
| 4 小结 |
| 实验三 布鲁氏菌gmd、per和manb基因的原核表达 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与载体 |
| 1.1.2 酶、主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 gmd、per、manb基因的扩增 |
| 1.2.2 gmd、per和manb基因的连接与转化 |
| 1.2.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.4 pET-28a-gmd、pET-28a-per和pET-28a-manb表达载体的构建 |
| 1.2.5 gmd、per和manb蛋白的表达 |
| 1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） |
| 1.2.7 Western blot分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因的扩增 |
| 2.2 重组表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.3 gmd、per和manb蛋白的表达 |
| 2.4 Western blot验证蛋白的反应原性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在学期间主要参与的研究项目 |
| 在学期间发表的文章 |
| 附件 |
（9）流产布氏杆菌脂多糖突变株ΔrfbE和ΔrfbD的构建及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 布氏杆菌病危害 |
| 2 布氏杆菌病流行现状 |
| 3 布氏杆菌病病原 |
| 4 布氏杆菌胞内生存机制 |
| 5 布氏杆菌主要毒力因子 |
| 6 布氏杆菌疫苗 |
| 7 布氏杆菌LPS相关基因突变株 |
| 8 布氏杆菌的免疫机制 |
| 9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 流产布氏杆菌LPS突变株ΔrfbE的构建及其生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 流产布氏杆菌LPS突变株ΔrfbD的构建及其生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）布鲁氏菌病LAMP检测方法的建立及双基因共表达分子疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 布鲁氏菌病概况 |
| 1.1.1 病原学特征 |
| 1.1.2 流行状况与危害 |
| 1.1.3 诊断方法 |
| 1.1.4 布鲁氏菌致病性 |
| 1.1.5 布鲁氏菌宿主免疫防御 |
| 1.2 布病疫苗研究进展 |
| 1.2.1 减毒活疫苗 |
| 1.2.2 灭活疫苗 |
| 1.2.3 突变株疫苗 |
| 1.2.4 重组蛋白疫苗 |
| 1.2.5 基因缺失疫苗 |
| 1.2.6 活载体疫苗 |
| 1.2.7 展望 |
| 1.3 DNA 疫苗研究进展 |
| 1.3.1 DNA 疫苗概述 |
| 1.3.2 作用机制 |
| 1.3.3 DNA 疫苗的优化策略 |
| 1.3.4 布鲁氏菌 DNA 疫苗 |
| 1.4 腺病毒载体研究进展 |
| 1.4.1 腺病毒概述 |
| 1.4.2 腺病毒载体的构建 |
| 1.4.3 腺病毒载体的优缺点 |
| 1.4.4 腺病毒载体在疫苗研究中的应用 |
| 1.5 本研究的目的意义及内容 |
| 1.5.1 研究的目的意义 |
| 1.5.2 研究内容和方法 |
| 第二章 布鲁氏菌目的基因的克隆及 LAMP 快速检测方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 OMP25、L7/L12、BCSP31、P39 和 18KD 基因的克隆 |
| 2.1.1.1 引物 |
| 2.1.1.2 布鲁氏菌全基因组 DNA 提取 |
| 2.1.1.3 目的基因的克隆与转化 |
| 2.1.2 布鲁氏菌 LAMP 快速检测方法的建立 |
| 2.1.2.1 试验菌株 |
| 2.1.2.2 主要的酶和试剂 |
| 2.1.2.3 LAMP 引物 |
| 2.1.2.4 DNA 模板的制备 |
| 2.1.2.5 LAMP 扩增体系的优化及检测方法的建立 |
| 2.1.2.6 LAMP 方法特异性鉴定 |
| 2.1.2.7 LAMP 方法敏感性鉴定 |
| 2.1.2.8 田间样品的检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的基因扩增与克隆载体鉴定 |
| 2.2.2 LAMP 检测方法的建立 |
| 2.2.3 LAMP 检测方法的特异性 |
| 2.2.4 LAMP 检测方法的敏感性 |
| 2.2.5 田间样品的检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 布鲁氏菌共表达 DNA 疫苗的构建与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、菌株及质粒 |
| 3.1.2 主要试剂和工具酶 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂和溶液配置 |
| 3.1.5 P39 和 18KD 基因的克隆 |
| 3.1.6 P39 与 18KD 基因 PQC-P39/18KD 载体的构建与鉴定 |
| 3.1.7 PCDNA-P39/18KD 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.1.8 阳性重组质粒的筛选和鉴定 |
| 3.1.9 去内毒素质粒 DNA 的制备与定量 |
| 3.1.10 人胚肾细胞 293AD 培养与保存 |
| 3.1.11 重组真核表达质粒转染 293AD 细胞 |
| 3.1.12 间接免疫荧光检测 |
| 3.1.13 RT-PCR 鉴定 |
| 3.1.14 Western blot 检测重组蛋白在 293AD 细胞中的表达 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 P39 和 18KD 基因的克隆 |
| 3.2.2 重组真核质粒的构建与鉴定 |
| 3.2.3 免疫荧光检测外源基因的瞬时表达 |
| 3.2.4 RT-PCR 鉴定 |
| 3.2.5 Western blot 检测重组质粒在 293AD 细胞中的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 布鲁氏菌共表达重组腺病毒疫苗的构建与鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞、菌株及质粒 |
| 4.1.2 主要试剂和工具酶 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂配置 |
| 4.1.5 L7/L12 与 BCSP31 基因的克隆 |
| 4.1.6 PQC-LL/BP 载体的构建与鉴定 |
| 4.1.7 重组腺病毒穿梭载体 pSh-LL/BP 的构建与鉴定 |
| 4.1.8 同源重组用线性化重组腺病毒穿梭载体的获得 |
| 4.1.9 携带腺病毒骨架载体工程菌 BJ5183-AD-1 的制备 |
| 4.1.9.1 BJ5183 感受态细胞的制备 |
| 4.1.9.2 腺病毒骨架载体 pAdEasy-1 质粒的转化 |
| 4.1.10 电转 BJ5183-AD-1 感受态细胞的制备 |
| 4.1.11 电转化 BJ5183-AD-1 细菌感受态细胞 |
| 4.1.12 复制缺陷型重组腺病毒质粒的鉴定 |
| 4.1.13 阳性重组子在宿主菌 DH10B 中的大量扩增回收 |
| 4.1.14 293AD 细胞的复苏与传代 |
| 4.1.15 复制缺陷型重组腺病毒的包装 |
| 4.1.16 重组腺病毒的扩毒 |
| 4.1.17 重组腺病毒的鉴定 |
| 4.1.17.1 PCR 鉴定 |
| 4.1.17.2 电镜观察 |
| 4.1.17.3 IFA 检测重组腺病毒的表达 |
| 4.1.17.4 Western Blot 鉴定 |
| 4.1.17.5 重组腺病毒稳定性检测 |
| 4.1.18 重组腺病毒的 CsCl 密度梯度纯化 |
| 4.1.19 重组病毒 TCID50 测定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 pSh-LL/BP 穿梭载体的构建与鉴定 |
| 4.2.2 重组腺病毒 pAd-LL/BP 载体的构建 |
| 4.2.3 重组腺病毒 Ad-LL/BP 的包装 |
| 4.2.4 Ad-LL/BP 重组腺病毒 PCR 鉴定 |
| 4.2.5 重组腺病毒电镜观察 |
| 4.2.6 免疫荧光检测 Ad-LL/BP 上外源基因的表达 |
| 4.2.7 Western blot 检测 Ad-LL/BP 外源基因的表达 |
| 4.2.8 重组腺病毒遗传稳定性检测 |
| 4.2.9 重组腺病毒 TCID50 测定 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 共表达重组腺病毒与 DNA 疫苗联合免疫效果的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 疫苗及佐剂 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器耗材 |
| 5.1.5 溶液配制 |
| 5.1.6 免疫方案 |
| 5.1.7 小鼠血清采集 |
| 5.1.8 血清中特异性抗体检测 |
| 5.1.9 小鼠脾淋巴细胞的制备 |
| 5.1.10 MTT 淋巴细胞转化试验 |
| 5.1.11 脾脏 T 淋巴细胞亚群分析 |
| 5.1.12 脾淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 5.1.13 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 小鼠血清特异性抗体检测 |
| 5.2.2 MTT 淋巴细胞转化试验 |
| 5.2.3 脾脏 T 淋巴细胞亚群分析 |
| 5.2.4 脾淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、牛布氏菌RB51抗原的免疫效力（论文参考文献）
- [1]布鲁氏菌病S2凝胶活疫苗的研制及不同黏膜免疫效果评价[D]. 刘燕. 沈阳农业大学, 2019(03)
- [2]布鲁菌S19重组疫苗株的构建及其免疫效果评价[D]. 梁佳茗. 吉林农业大学, 2019(03)
- [3]布鲁氏菌病患者血液系统改变与免疫应答特征研究[D]. 苏敏利. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [4]宜兴市职业人群布鲁氏菌病监测数据分析[D]. 殷俊伟. 东南大学, 2019(01)
- [5]规模化牧场牛布氏杆菌病血清学调查及A19疫苗免疫效果调查[D]. 唐义国. 南京农业大学, 2017(04)
- [6]牛布鲁氏菌病诊断技术研究[D]. 冯宇. 山东农业大学, 2017(01)
- [7]布鲁氏菌病活疫苗S2株小鼠评价模型构建及其鉴别抗原筛选[D]. 朱良全. 中国农业大学, 2016(08)
- [8]羊种布鲁氏菌015株gmd、per和manb缺失株的构建及诊断抗原反应原性评价研究[D]. 易德武. 石河子大学, 2015(05)
- [9]流产布氏杆菌脂多糖突变株ΔrfbE和ΔrfbD的构建及其生物学特性研究[D]. 张敏. 扬州大学, 2013(04)
- [10]布鲁氏菌病LAMP检测方法的建立及双基因共表达分子疫苗研究[D]. 蔺国珍. 中国农业科学院, 2012(10)