一、火鸡疱疹病毒繁殖非必须基因重组病毒用转移载体的构建（论文文献综述）
李文桂,陈雅棠[1]（2021）在《重组火鸡疱疹病毒疫苗研制现状》文中研究表明火鸡疱疹病毒（HVT）是一种预防马立克氏病的常规异源疫苗。该病毒可刺激感染的宿主产生细胞、体液和粘膜免疫应答,是一种有希望的疫苗载体,可表达病毒、细菌和寄生虫的多种蛋白。以HVT为载体的疫苗包括:禽流感病毒（rHVT-HA/NA）、新城疫病毒（rHVT-HA/NA/F）、传染性法氏囊病毒（rHVT-VP2）、传染性喉气管炎病毒（rHVT-gB/gD/gI）、马立克氏病病毒（rHVT-gB）、鸡传染性贫血病毒（rHVT-VP1/VP2）、鹦鹉热衣原体（rHVT-PmpD-N）和堆型艾美球虫（rHVT-EalA）等,本文将综述这些HVT病毒介导的疫苗的研制现状。
顾阳[2]（2020）在《PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析》文中研究表明猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）又称为奥耶斯基病（Aujeszky’s disease,AD）,是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种烈性传染病,育肥期猪呈现体温升高、呼吸道感染症状;哺乳期幼仔感染后通常具有较高致死率;怀孕母猪表现繁殖障碍、流产、死胎、木乃伊胎等。PRV宿主广泛,但猪是已知的唯一自然宿主,也是引起其他动物感染的重要排毒者和疫源,给整个养猪业带来巨大损失。近年来,我国很多地区经过经典疫苗株免疫接种的猪场再次出现猪伪狂犬病疫情,经初步研究发现其为PRV变异毒株感染导致,并且病料样本g E阳性率较高。我国之前大部分猪场使用的是敲除g E基因的Bartha-K61等疫苗,这表明传统的经典疫苗已不能对当前PRV感染提供有效保护,因而找出当前流行毒株的变异程度及野毒的感染情况是当务之急。由于常规的血清学检测方法无法区分疫苗免疫接种动物和野毒感染动物,已知g E基因是野毒感染的标志基因;g H基因是PRV内高度保守和病毒复制所必须的基因,因此根据Gen Bank中猪伪狂犬病毒（PRV）g H、g E基因序列,设计合成2对特异性引物,通过对退火温度等条件进行优化,建立了鉴别PRV强毒与疫苗弱毒的双重PCR方法。特异性分析表明,从强毒株基因组中扩增出2条大小为429bp和355bp的特异性片段,从弱毒株基因组中仅扩增出1条大小为355bp的特异性片段,而扩增猪圆环病毒2型和猪细小病毒基因组结果均为阴性。敏感性分析表明所建立的鉴别PRV强毒与疫苗弱毒的双重PCR方法的最低有效检测量为1×102 TCID50/0.1ml。对采自河南省郑州、许昌、濮阳、焦作、洛阳等地市以及山西省文水、河北邯郸的348份PRV疑似病料组织样品进行双重PCR检测,检测病原只需3 h～4 h。该方法具有较高的特异性、敏感性及可重复性,能够区分基因缺失疫苗接种与野毒感染,为PRV野毒的筛查以及PRV的快速检测提供技术支持。从河南、山西和河北收集的5份疑似PRV病料组织匀浆液,经无菌处理后接种于ST细胞,提取每一代收获的细胞病毒液DNA,PCR扩增、电泳,结果均为阳性。将培养至第7代的细胞病毒液接种于6周龄小鼠,攻毒48 h后小鼠开始出现死亡,62 h时全部死亡,而对照组小鼠168 h后仍无发病和死亡现象。表明所获得的5株分离株为PRV强毒株,将其命名为XC、SX-1、SX-2、HD1和HD2。以XC株为例,进行理化特性试验,结果表明其具有PRV理化特性。XC株在ST细胞上的一步生长曲线结果显示,感染ST细胞后第4-12 h时XC株病毒效价逐渐增长,第36 h达到最高峰(TCID50/m L为10 7.49),之后病毒效价开始降低。这与PRV在ST细胞上的生长动力规律相吻合。本试验成功分离5株PRV野毒株,为PRV的分离鉴定及控制猪伪狂犬病的流行提供了理论依据。参照Gen Bank中发表的g B和g D基因序列,使用引物设计软件设计2对引物,对实验室分离的5个PRV流行株（XC、SX-1、SX-2、HD1和HD2）的g B和g D基因进行PCR扩增、克隆、测序及其核苷酸与氨基酸序列分析。结果显示,分离出来的5株流行株虽然来自不同地区,但核苷酸和氨基酸的同源性均较高,对比国内早些年流行株Ea、Fa、SC等,本试验的5个分离毒株g B基因的氨基酸序列,共出现5处共同突变,此5处位点都与国内近年流行毒株的氨基酸保持一致;国内与国外毒株比对发现20多处突变。推导g D基因氨基酸序列发现,相对于国内早年流行株,在278位处国外毒株（除Becker和NIA3外）和国内近些年流行变异株出现了氨基酸位点缺失;相对于国外毒株（除Becker和NIA3外）,包括5个分离毒株在内的国内毒株共发生了8处位点共同突变。研究结果表明5个分离毒株与国外流行毒株由于地理隔离的存在差异较大,不同地区PRV毒株的感染和流行情况并不相同;5个分离毒株与2011年之前国内流行毒株亲缘关系较远,表明2011年以来我国PRV流行毒株发生了变异,可以推断出我国在2011年之后可能是由于出现了PRV变异毒株而导致不同地区PR疫情的发生;遗传进化树结果表明,这些分离的毒株与之前的经典毒株如Bartha-K61等亲缘关系较远,这也解释了为何我国近年各地已经免疫的猪场还是有PRV感染发生。
童武[3]（2020）在《猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制》文中研究表明猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染所引起的以妊娠母猪流产、仔猪表现神经症状及高死亡率为特征的一种传染性疾病。目前对猪伪狂犬病的防控与净化主要还是靠接种基因缺失疫苗并配合相应的血清学检测来完成。我国于上世纪70年代从匈牙利引进PRV弱毒活疫苗Bartha K61株,并在猪场中推广应用后,猪伪狂犬病疫情得到了有效的控制。但2011年以来,很多伪狂犬病疫苗免疫过的猪场,大面积爆发了伪狂犬病,原来已经净化的猪场也在短时间内变成伪狂犬病野毒阳性,给养猪业造成了巨大的经济损失。经研究发现,引发免疫猪场伪狂犬病疫情的是一种变异的PRV毒株,该变异株的毒力较经典强毒株有明显增强,且现有的疫苗不能为免疫猪群提供完全保护。因此,研制新一代针对变异株的疫苗对于控制新发伪狂犬病十分必要,且具有重要意义。1、猪伪狂犬病病毒g E/g I双基因缺失疫苗候选株的研制（1）猪伪狂犬病病毒变异株（JS-2012株）g E/g I双基因缺失株的构建:以实验室前期分离的PRV变异株（JS-2012株）为基础,将其经过两次同源重组,将主要毒力基因g E/g I进行缺失,成功构建g E和g I基因双缺失的重组伪狂犬病基因缺失株,命名为JS-2012-△g E/g I。（2）JS-2012-△g E/g I病毒的生物学特性分析:JS-2012-△g E/g I株在Vero细胞上连续传20代,未出现任何突变,表明其具有很好的稳定性。采用间接免疫荧光和Western blot进行g E蛋白表达检测,结果显示该疫苗候选株的g E蛋白成功失活。病毒生长曲线和蚀斑形态检查结果显示,JS-2012-△g E/g I与JS-2012在细胞上生长动力学相似,但JS-2012-△g E/g I形成的蚀斑要明显小于JS-2012。（3）JS-2012-△g E/g I病毒的安全性试验:结果表明,疫苗候选株对哺乳仔猪和妊娠母猪均具有很好的安全性;不能在猪群中水平传播,也不能通过母猪垂直传播;返祖试验证明该疫苗候选株不能在仔猪体内发生毒力返强。（4）JS-2012-△g E/g I病毒的免疫效力试验:免疫攻毒试验结果表明,该疫苗候选株免疫仔猪后针对PRV变异株和经典PRV强毒株攻击均能提供完全的免疫保护。被动免疫试验结果表明,该疫苗候选株免疫母猪后所产仔猪通过哺乳也能获得完全的免疫保护。2、含猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株的研制（1）表达猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株的构建:以本研究所构建的伪狂犬病基因缺失弱毒活疫苗（JS-2012-△g E/g I株）为骨架,经过两次同源重组,成功获得一株含猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株,命名为JS-2012-△g E/g I-E2。（2）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的生物学特性分析:JS-2012-△g E/g I-E2株在Vero细胞上连续传20代,E2基因均能在载体病毒JS-2012-△g E/g I中稳定存在,且未出现任何突变;采用间接免疫荧光和Western blot进行E2蛋白表达检测,结果证明该重组疫苗候选株中的E2蛋白在传代过程中均能稳定表达。病毒生长曲线和蚀斑形态结果显示,JS-2012-△g E/g I-E2与亲本病毒JS-2012-△g E/g I均具有高度的相似性。（3）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的安全性试验:结果表明,重组疫苗候选株对仔猪和妊娠母猪均具有很好的安全性;该重组疫苗不能在猪群中水平传播,也不能通过母猪垂直传播。（4）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的免疫效力试验:免疫攻毒试验结果表明,重组疫苗候选株JS-2012-△g E/g I-E2免疫阴性仔猪,能有效的抵抗PRV强毒株和猪瘟病毒强毒株的攻击,临床保护效率达100%。重组疫苗候选株免疫PRV母源抗体阳性仔猪,然后再攻猪瘟强毒,临床保护效率仍能达到80%,这表明该载体疫苗能够较好地抵抗母源抗体干扰。综上所述,本试验构建的两株伪狂犬病病毒基因工程疫苗候选株（JS-2012-△g E/g I株和JS-2012-△g E/g I-E2株）,对仔猪和妊娠母猪均安全、有效,且不具备水平和垂直传播能力。同时,这两种疫苗都具有标记疫苗的特征,在临床应用过程中可利用其相应的分子标记来区分野毒感染动物与疫苗免疫动物,从而有利于净化猪群中的PRV和猪瘟病毒。如此,这两种疫苗将具有广阔的临床应用前景。
黄文祥[4]（2020）在《表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备》文中指出伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）属于疱疹病毒科疱疹病毒属,该病毒的天然宿主是猪,可引起母猪发生流产、产出死胎,并伴有呼吸障碍。自2011年以来,Ⅱ型PRV在我国出现并流行,给我国养猪业造成巨大经济损失。猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是2015年新出现的一种猪病毒性传染病病原,能够产生猪生殖障碍、心脏和多系统炎症等临床症状,其衣壳（Capsid,Cap）蛋白是唯一的结构蛋白,能刺激动物机体产生针对PCV3的血清抗体,也是研制基因工程疫苗理想的抗原蛋白。迄今为止,PRV和PCV3共感染情况在兽医临床上屡见不鲜,所以研制预防PRV和PCV3双重感染的重组病毒疫苗工作显得尤为迫切。本研究以II型PRVHD/c株为亲本株,选择非结构蛋白基因gC和gG作为靶标位点,设计特异性引物扩增针对两个基因缺失的同源重组臂片段,同时构建了表达GFP的荧光表达盒和带有CMV启动子的PCV3 Cap表达盒。采用经典的分子生物学方法将各片段依次连接到pUC18载体上,构建了针对两个位点的同源重组转移载体并进行了测序验证,并且验证了两个载体质粒能够在细胞水平上稳定表达PCV3 Cap蛋白,为后续构建表达PCV3 Cap的PRV重组病毒提供重要分子工具。同时,本研究以Ⅱ型PRV HD/c基因组为模板,扩增出囊膜蛋白gC和gG基因截短序列,并通过构建到pET-28a（+）载体上进行原核表达gC和gG的主要抗原表位区域。以变性纯化的重组His-gC和His-gG蛋白为免疫原分别免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,从而获得了 WB和IFA反应性良好的多克隆抗体。同时取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,随后采用有限稀释法进行4次亚克隆筛选,分别获得了 3株稳定分泌gC和gG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过WB和IFA检测可知,所制备的两种单克隆抗体分别与外源转染样品和PRV感染样品均有良好反应,并进行了抗原表位的初步鉴定。通过使用针对gC的单克隆抗体可用于临床检测PRV疫苗毒株与流行毒株,并且PRV gC和gG单克隆抗体的制备也为研究其生物学功能以及基因缺失疫苗株的鉴定提供了基本工具。
谢青梅,封柯宇,沈勇[5]（2019）在《动物病毒重组活载体疫苗研究进展》文中研究说明病毒活载体疫苗作为一种新型疫苗,与传统疫苗相比,具有极大的优势与应用前景,是当今与未来疫苗研制与开发的重要方向之一。目前在人类医学和兽医领域,病毒活载体疫苗均取得了大量的研究成果。本文综述了主要的兽用病毒疫苗载体及重组活载体疫苗的最新研究进展,并分析了其发展趋势,为进一步研制新型重组病毒疫苗提供参考。
楚电峰[6]（2018）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验》文中进行了进一步梳理H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）对鸡的致病性低,仅引起轻微的呼吸道症状和短时间产蛋下降,但混合感染或继发感染其他病原可导致较高的发病率和死亡率。H9亚型禽流感对养鸡业危害较大,免疫接种是防控该病的主要策略之一。目前生产上常用的H9亚型禽流感疫苗为全病毒灭活疫苗,这类疫苗仅能诱导产生高水平的循环抗体,而不能有效地激发细胞免疫和黏膜免疫应答。近年来,以火鸡疱疹病毒（herpesvirus of turkey,HVT）为载体的重组病毒活疫苗已经成为研究热点。一方面,HVT具有较多的复制非必需区可供外源基因插入;另一方面HVT是常用的家禽疫苗,可供1日龄雏鸡免疫或18日龄胚内注射免疫,能够更早地诱导免疫应答。本研究旨在以HVT为载体,构建能稳定表达H9亚型AIV血凝素（HA）的重组病毒活疫苗候选毒株,与现有灭活疫苗组合使用,以提供更加有效的免疫保护。1.rHVT-YBF003株的构建及其遗传稳定性与安全性评价重组病毒构建:对近年分离的21株H9亚型AIV进行HA基因测序和遗传进化分析,发现这些毒株处于h9.4.2.5分支,为目前H9亚型AIV的优势流行毒株。因此,本研究选取其中的YBF003株,用于重组病毒的构建。采用RT-PCR扩增H9亚型AIV YBF003株的HA基因,将HA基因插入到含HVT FC-126疫苗株同源臂和CMV启动子的载体,构建转移载体pFR-H9。将pFR-H9与表达绿色荧光蛋白（EGFP）的重组HVT（rHVT-EGFP）基因组共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,以同源重组的方式将rHVT-EGFP的EGFP基因替换为HA基因表达盒,获得重组病毒rHVT-YBF003株。在CEF单层上反复纯化rHVT-YBF003株,直至所有重组病毒空斑均不带绿色荧光。经PCR鉴定,HA基因表达盒正确插入到HVT基因组;进一步进行Western-blot和IFA鉴定,rHVT-YBF003株能够表达HA蛋白。分别用rHVT-YBF003株和HVTFC-126株感染CEF,两者的生长特性并无显着差异。将rHVT-YBF003株在CEF上连续传20代,再接种于CEF单层,待形成典型空斑后,通过PCR从随机挑选的20个空斑中均能检测到HA基因表达盒;将第20代rHVT-YBF003株接种于CEF单层,通过间接免疫荧光试验（IFA）证明rHVT-YBF003株能够稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。重组病毒的遗传稳定性:1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103 PFU/只;21日龄时,从血液中分离淋巴细胞,再接种于另一批次1日龄SPF鸡（3.0×106个淋巴细胞/羽份）。如此反复传代6次,经PCR检测传代后的rHVT-YBF003株中均存在HA基因,IFA证明传代后的重组病毒仍能稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103PFU/羽份;每隔7天采血分离淋巴细胞,再接种于CEF单层,进行病毒分离和计数。结果显示,rHVT-YBF003株在鸡体内的病毒载量不断提高,至9周龄时,病毒载量达到峰值,此后呈下降趋势,直到第20周龄时仍能检测到少量重组病毒存在,说明该重组病毒可在鸡体内维持较长时间。重组病毒的安全性:以5.0X 104PFU/羽份的rHVT-YBF003株接种1日龄SPF鸡,对鸡群进行连续8周的临床观察、生长状况监测,结果显示接种重组病毒的试验鸡精神、采食、饮水均正常,剖检和组织切片检查均未发现病理变化。以5.0×104PFU/头份的rHVT-YBF003株接种4周龄ICR小鼠,接种后ICR小鼠的采食、精神均正常;接种后14天,对小鼠内脏器官检查并称重,显示接种重组病毒对小鼠无不良影响。因此,重组病毒对易感动物和非易感动物均具有良好的安全性。2.rHVT-YBF003株的免疫效力评价对SPF鸡的免疫保护效力试验:试验分为4组,分别为胚内免疫组、1日龄免疫组、灭活疫苗组和空白对照组;分别对18日龄SPF鸡胚胚内注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、1日龄SPF雏鸡皮下注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、14日龄SPF雏鸡肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗（YBF003株）、1日龄SPF雏鸡皮下注射0.5 mLPBS/只。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒（静脉注射1.0X 1 07 5 EID50/羽份）。28日龄时,胚内免疫组和1日龄免疫组的HI抗体效价分别为4.7±0.60和4.5±0.30,胚内免疫组比1日龄免疫组的HI抗体最大提高0.3±0.62个滴度,两组均能提供一定的早期保护;灭活疫苗组的HI抗体效价为6.5±0.75,攻毒保护率为50%;空白对照组的抗体为1.3±0.12,攻毒保护率为0%。对商品鸡的免疫保护效力试验:对商品鸡的分组及处理方式同SPF鸡。另外,增加重组病毒与灭活疫苗联合免疫组,该组于1日龄时颈部皮下注射5.0×103PFU/羽份的rHVT-YBF003株,14日龄时经肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗（YBF003株）。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒（静脉注射1.0×107.5EID50/羽份）。28日龄时,胚内免疫组、1日龄免疫组和灭活疫苗免疫组的HI抗体效价分别为4.3±0.49、4.1 ±0.89和6.2±0.34,攻毒保护率均为50%以上,差异不显着;而联合免疫组的抗体效价为7.8±0.45,攻毒保护率为70%;空白对照组的抗体为1.0±0.74,攻毒保护率为10%。3.重组病毒种子批建立与大规模培养工艺研究培养工艺研究:为提高重组病毒的效价,同时获得规模化生产条件下的重组病毒培养技术参数。我们对采用细胞工厂进行大规模培养的方法进行了研究。结合该病毒的培养特性,分别从宿主细胞的接种密度、种毒接种剂量和收毒时间等方面对培养工艺进行摸索,最终制定了最优的病毒培养技术工艺:即采用十层细胞工厂（总面积为6335 cm2,培养液为1200mL）,CEF密度为2.5×106个/mL时,接种3.0×106PFU的重组病毒,培养72 h,收获感染细胞,按照每个细胞工厂分装50支冻存管的标准进行收获,每支冻存管分装量为1.8mL,其收获的病毒效价可达5.0×106PFU/支以上,即成品疫苗可达5000 PFU/羽份以上,远高于2000 PFU/羽份的国家标准。种子批建立:将所收获的重组病毒分为原始种子、基础种子和生产种子。原始种子包括重组病毒的F1～F6代,基础种子包括F7～F12代,生产种子包括F13～F17代。并在各级种子批中随机选取一个代次的种子进行无菌检验、支原体检验、鉴别检验、安全性检验、免疫原性检验和外源病毒检验。无菌检验和支原体检验中,三个代次种毒的检验结果均为阴性;鉴别检验中,对HVT鉴定部分采用间接免疫荧光试验,结果显示,三个代次种毒形成的病毒空斑均呈现绿色荧光,说明形成的病毒空斑为HVT,对HVT表达的HA蛋白鉴定采用Western-blot方法鉴定,结果显示,三个代次种毒均能表达HA蛋白;安全性检验中,三个代次的种毒接种1日龄SPF鸡,免疫剂量为3.0×104PFU/羽,免疫后观察90天,所有免疫鸡均未观察到临床症状;外源病毒检验中,分别于1日龄和21日龄时,采用滴鼻、点眼（剂量为3.0×104PFU/羽份）和肌肉注射（剂量为3.0×104PFU/羽份）三种途径同时接种重组病毒,42日龄时采集血清,均未检测到外源病毒的抗体。结果显示,三个代次的重组病毒均符合种毒质量标准。综上所述,本研究构建了一株表达H9亚型AIV HA蛋白的重组HVT（rHVT-YBF003株）。在体内和体外传代过程中,rHVT-YBF003株所插入的HA基因均能稳定表达。在安全性评价方面,该重组病毒对易感和非易感动物均不具有致病性。该重组病毒可用于1日龄雏鸡和18日龄鸡胚内的早期免疫,虽然HI抗体低于灭活疫苗,但对H9亚型AIV的保护率等同于灭活疫苗。重组病毒与灭活疫苗联合使用具有协同效应,对H9防控效果更好。本研究还建立了种子批,并制定了符合大规模生产的重组病毒培养工艺,为将来工厂化生产打下了基础。
邵昱昊[7]（2018）在《表达新城疫病毒F蛋白传染性喉气管炎病毒的构建及评价》文中指出新城疫（Newcastle disease,ND）是禽类高度传染性病毒性疾病,在全世界性范围内呈地方性流行。ND的病原体是新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）。NDV只有一个血清型,但具有众多基因型。目前广泛应用的NDV La sota疫苗为基因II型,而我国目前主要流行强毒株为基因Ⅷ型NDV。现有疫苗虽然能够对基因Ⅷ型NDV强毒株感染提供临床保护,但不能有效的阻止其在鸡体内的复制和排毒,导致免疫鸡群疫病的发生。因此,迫切需要研制针对基因Ⅷ型NDV强毒株的新型NDV疫苗。Fusion（F）蛋白是NDV的囊膜糖蛋白,也是NDV的主要保护性抗原,可插入病毒载体中作为活病毒载体疫苗进行应用。传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是鸡的急性上呼吸道传染病,病原是传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）。ILT的防制主要依靠严格的生物安全措施和疫苗免疫,商品化致弱活疫苗和表达ILTV抗原的病毒载体疫苗是目前控制ILT的主要疫苗,但存在毒力返强和保护效果不完全的缺陷。为了克服现有疫苗的不足,科研人员尝试研发ILTV基因缺失疫苗和ILTV活载体疫苗。此外,ILT活疫苗可以通过气雾或饮水的方式大规模应用,因此ILTV可作为表达其他病原免疫保护性抗原的载体。在本研究中,分离并鉴定了一株ILTV,命名为ck/CH/LHLJ/120305（LHLJ/120305）。该毒株感染SPF鸡只不引起任何呼吸道症状,气管致病指数（Intratracheal pathogenicity index,ITPI）值为0,在感染鸡的气管和喉头未观察到明显的病理变化。LHLJ/120305在喉头和气管内的复制和排毒检测结果显示LHLJ/120305株在喉头和气管中可以复制但它在组织中的病毒DNA载量明显低于ILTV强毒WG株。以上结果证明LHLJ/120305株是一株ILTV弱毒株。LHLJ/120305可以为SPF鸡提供针对ILTV WG株的完全保护,并且没有检测到排毒,这些结果说明LHLJ/120305可以作为ILT的疫苗候选毒株。为探索LHLJ/120305株是否可作为病毒载体,以LHLJ/120305作为亲本毒,采用同源重组技术,将病毒的US9基因编码区缺失后引入绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）表达盒,获得了表达GFP的重组传染性喉气管炎病毒ILTV-?US9-G株,并且GFP蛋白能够在ILTV-?US9-G感染的细胞中表达。ILTV-?US9-G的最大病毒滴度与亲本病毒LHLJ/120305株相近,但生长速率略有延迟。这一结果表明ILTV US9基因编码区缺失和GFP表达盒的引入并不影响病毒的体外增殖特性。为了进一步研究外源基因的引入对ILTV病毒的致病性及免疫原性的影响,以ILTV-?US9-G作为亲本病毒,将GFP基因替换为基因Ⅷ型NDV主要保护性抗原F基因,获得了表达NDV F蛋白的重组病毒ILTV-?US9-F株。ILTV-?US9-F和亲本病毒LHLJ/120305的体外复制能力基本一致。将ILTV-?US9-F在LMH上连续传代至15代,通过间接免疫荧光和蛋白质印迹法对每5代的病毒的F蛋白的表达进行了检测,结果显示,不同代次的ILTV-?US9-F均能稳定表达NDV F蛋白。ILTV-?US9-F接种SPF鸡后,鸡只没有出现任何临床症状且未检测到排毒,并与LHLJ/120305一样,用ILTV强毒WG株的攻击免疫鸡后ITPI评分为0且未在咽拭子检测到ILTV。为了评价ILTV-?US9-F对NDV强毒株的免疫保护效果,ILTV-?US9-F免疫后检测了免疫鸡的抗体水平并进行了不同基因型NDV强毒株的攻毒保护试验。与La Sota相比,104PFU剂量的ILTV-?US9-F免疫后诱导产生的NDV ELISA抗体和中和抗体的滴度非常低。当用IX型NDV强毒株F48E9株攻击时,La Sota与ILTV-?US9-F均能提供临床保护,且均未检测到排毒,NDV的主要靶器官也未再重新分离到病毒。但当用NDV基因Ⅷ型ck/CH/LHLJ/1/06株攻击时,虽然La Sota与ILTV-?US9-F一样能提供临床保护,但从La Sota组中40%（2/5）鸡体内重新分离到NDV,而ILTV-?US9-F组所有组织中均未分离到NDV。攻毒后4d的排毒情况也表明ILTV-?US9-F（10%）的排毒保护效果好于La Sota（30%）。此外,本研究对ILTV-?US9-F针对NDV的最小免疫剂量进了评价。结果显示,以103PFU剂量免疫ILTV-?US9-F后,可以提供针对NDV强毒株ck/CH/LHLJ/1/06株的完全的临床保护,而以102PFU剂量免疫后也可以获得95%的临床保护,ILTV-?US9-F的最小免疫剂量可以定为103PFU。综上所述,本次试验成功构建了表达基因Ⅷ型NDV F蛋白的重组传染性喉气管炎病毒,该毒株免疫动物可以抵抗新城疫强毒株和传染性喉气管炎强毒株的攻击。ILTV-?US9-F株可以作为NDV和ILTV二联活载体疫苗的候选毒株。
毛汐语[8]（2018）在《表达猪流行性腹泻—轮状病毒的重组伪狂犬病病毒株的构建及部分生物学特性研究》文中研究指明猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害养猪业的三种重要传染病,分别由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪轮状病毒（Rotavirus,PoRV）和猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）引起。PEDV和PoRV主要导致仔猪腹泻,PRV则引起母猪繁殖障碍及新生仔猪急性死亡,并伴有呕吐、腹泻、震颤和运动失调等症状。三种病毒常常混合感染导致更大的危害,为了有效预防和控制这三种疾病,研究一种可同时预防这三种疾病的安全、高效的疫苗显得迫切而必须。本项目拟用PoRV VP7和PEDV S基因的免疫优势抗原区域为目标基因,以PRV XJ株作为活载体,同源重组构建表达PEDV S、PoRV VP7的重组伪狂犬病病毒PRV（CM）株,并开展培养特性、遗传稳定性、安全性等生物学特性研究。1 PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S的构建根据已有文献对PEDV S基因和PoRV VP7基因优势抗原表位的研究,结合生物信息学软件分析,参照NCBI上PEDV和PoRV序列分别设计引物S-a/S-b和VP7-a/VP7-b,在引物上下游5’引入合适的酶切位点、保护碱基和柔性肽序列。RT-PCR扩增出部分VP7和S基因作为本研究的候选基因片段,分别克隆至pMD19-T（Simple）,构建pMD-VP7、pMD-S克隆质粒。对pMD-VP7、pMD-S克隆质粒进行Kpn I、BamH I双酶切反应,回收目的片段连接转化,构建了重组质粒pMD-VP7.S,对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,表明目的基因片段无碱基的突变和缺失,相应酶切位点和柔性肽序列准确引入。对pEGFP-gI28k真核表达载体和pMD-VP7.S重组质粒用Xho I、Sal I双酶切,回收目的片段,连接转化,构建含有VP7.S融合基因的PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S,对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。2表达PEDV S和PoRV VP7基因的重组伪狂犬病毒PRV（CM）株的构建将PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S和伪狂犬野毒株PRV XJ株共转染至293T细胞,通过同源重组构建了共表达VP7和S基因并且gI、gE毒力基因缺失的重组伪狂犬病毒PRV（CM）株,经过PCR、Western-Blotting等鉴定,结果表明VP7和S基因成功表达,重组病毒构建成功。3 PRV（CM）株部分生物学特性研究通过将PRV（CM）接种到BHK-21细胞上,增值特性观察发现VP7.S融合基因片段的插入不影响重组病毒株的增值,测定PRV（CM）的TCID50和亲本株相比较,重组病毒株的增值滴度略有降低;一步生长曲线显示重组病毒株和亲本株具有相似的生长动力学;将PRV（CM）在BHK-21细胞传至20代,各代次病毒增殖规律相似;PCR测定显示外源基因稳定存在,毒力基因稳定缺失;安全性试验结果表明,以不同病毒滴度的PRV（CM）接种哺乳仔猪和怀孕母猪,无临床异常是安全的。
蒋叶林[9]（2017）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验》文中认为H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）自1992年首次在我国鸡群中被发现并报道以来,迅速在各地流行,严重危害养禽业的发展。研究表明,H9N2亚型AIV不经适应即可感染人和哺乳动物,也可为感染人的流感病毒提供内部基因,具有重要的公共卫生意义。在我国,独特的地理环境、养殖模式及活禽市场的存在为H9N2亚型AIV的传播提供了有利条件,而免疫压力更是病毒发生重组和变异的重要因素。通过对我国2010年-2015年间H9N2亚型AIV分离毒株的血凝素（HA）基因序列分析显示,近年来的分离毒株主要集中于h9.4.2.5分支上,而常用的灭活疫苗的毒株并不属于此分支,且灭活疫苗不能有效地诱导细胞免疫应答和黏膜免疫应答。因此,灭活疫苗的免疫保护率有时不高。火鸡疱疹病毒（herpesvirus of turkey,HVT）疫苗是预防鸡马立克氏病的常用疫苗,具有较多的复制非必需区可供外源基因的插入,被广泛应用于重组病毒活疫苗的构建。本研究拟以HVTFC126疫苗株为载体,构建表达h9.4.2.5分支H9N2亚型AIVHA的重组病毒,研制新型H9亚型AIV活疫苗。本研究通过PCR扩增出h9.4.2.5分支H9亚型AIV（YZ1406毒株）的HA基因,与人巨细胞病毒早期启动子（CMV）和TKpolyA组成表达盒。将该表达盒插入到HVTFC126疫苗株的US2非必需区片段中,构建转移载体pHVT-H9HA。将pHVT-H9HA与表达EGFP基因的重组HVTFC126病毒（rHVT-EGFP）基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经同源重组,将位于rHVT-EGFP US2区内的EGFP标记基因替换为HA基因表达盒,获得重组病毒rHVT-H9HA。通过PCR、Southern-blot、Western-blot和间接免疫荧光试验对rHVT-H9HA进行鉴定,并对其在CEF上的生长特性进行检测。结果显示:rHVT-H9HA中,HA基因表达盒已正确插入到US2复制非必需区内,并能成功表达出大小85kD左右的目的蛋白;同时,rHVT-H9HA在CEF上表现出与HVTFC126疫苗毒株相同的复制水平。本研究对重组病毒rHVT-H9HA进行了免疫效力的初步评价。将80只1日龄SPF鸡随机分成四组:rHVT-H9HA免疫组、灭活苗免疫组、攻毒对照组和空白对照组。其中rHVT-H9HA免疫组于1日龄经颈部皮下接种5000空斑形成单位（PFU）的rHVT-H9HA,灭活苗免疫组于14日龄时经肌肉注射0.25 mL/鸡的禽流感病毒H9亚型灭活苗。在7、14、21、28日龄,分别通过血凝抑制试验（HI）检测各组试验鸡的血清中H9亚型AIV的抗体效价。除空白对照组外,其余各组于28日龄均采用点眼/滴鼻方式以108EID50/鸡的YZ1406毒株攻毒。攻毒后的第3d、5d,采集喉头、泄殖腔拭子,进行病毒分离,检测各组试验鸡的排毒情况。结果显示:rHVT-H9HA免疫组的试验鸡在疫苗接种后抗体水平呈持续上升趋势;在攻毒后的第5d,病毒分离率显着降低,而攻毒对照组病毒分离率较高,表明重组病毒rHVT-H9HA对H9亚型AIV的攻击具有较好的保护作用。
刘芳[10]（2016）在《表达H5N1亚型禽流感病毒HA重组火鸡疱疹病毒的构建与鉴定》文中进行了进一步梳理H5N1亚型禽流感（Avian influenza H5N1 subtype,AI H5N1）是当前威胁家禽养殖业安全的重大传染性疾病之一,引起全世界的广泛关注。灭活苗的使用一直是防控禽流感的主要手段,但灭活苗免疫效果差,制备过程中存在散毒风险。基因工程活载体疫苗的研制是新型兽用疫苗研究的热点,在预防疾病流行中具有独特优势。血凝素（HA）是禽流感病毒的主要保护性抗原,可以诱导机体产生中和抗体,是研制禽流感基因工程病毒活载体疫苗的首选抗原性基因。商品化火鸡疱疹病毒载体已成为研制禽用病毒活载体疫苗的良好载体,免疫效果显着优于传统疫苗。疱疹病毒的细菌人工染色体是研制和改进疱疹病毒载体活疫苗的有力工具。本研究应用火鸡疱疹病毒细菌人工染色体克隆,通过基因重组技术将HA表达盒插入到火鸡疱疹病毒基因组的非必需区,成功构建了表达禽流感HA基因重组火鸡疱疹病毒HVTBAC-H5,为禽流感基因工程病毒活载体疫苗的研制打下了良好基础。本研究首先根据公开发表的H5N1亚型禽流感病毒2.3.2.1谱系的HA基因序列,人工合成HA基因,构建了含有该基因和CMV启动子以及poly A终止子的HA基因表达盒。采用一对含插入位点上、下游同源臂的引物,通过PCR方法扩增HA基因表达盒;采用EN PASSANT方法,第一步重组将HA基因表达盒导入火鸡疱疹病毒细菌人工染色体（BACHVT-G）UL54和UL55之间的非编码区。通过PCR和序列测定对重组BAC（BACHVT-HAKAN+）进行鉴定,确认正确后再进行第二次基因重组敲除KAN抗性基因,得到HA重组HVT BAC（BACHVT-G-H5）。通过PCR以及RFLP方法验证所获得的BACHVT-G-H5,结果表明与与预测结果一致。提取BACHvT-G-H5的DNA,应用磷酸钙沉淀法转染鸡胚成纤维细胞（CEF）进行病毒拯救,在紫外光激发下观察病毒蚀斑,结果获得了发出绿色荧光的病毒蚀斑,表明成功拯救出含BAC质粒序列的HVT重组病毒HVTBAC-H5。提取重组病毒HVTBAC-H5基因组DNA,应用一对特异性引物扩增HA基因表达盒并测序鉴定,结果表明HA基因表达盒成功插入,且序列与设计完全一致。通过血凝试验和Western Blotting对重组毒HVTBAC-H5进行鉴定,结果表明插入的外源基因HA能够正确表达,且可与H5N1阳性血清特异性结合,具有抗原性。本研究成功构建了表达禽流感HA重组火鸡疱疹病毒,HA基因在火鸡疱疹病毒基因组内正确插入,且没有发生变异,该研究表明应用HVT BAC（BACHVT-G）,通过EN PASSANT 方法能够高效地构建HVT重组病毒,为研制新型禽流感病毒HA重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗奠定了基拙。
二、火鸡疱疹病毒繁殖非必须基因重组病毒用转移载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、火鸡疱疹病毒繁殖非必须基因重组病毒用转移载体的构建（论文提纲范文）
（1）重组火鸡疱疹病毒疫苗研制现状（论文提纲范文）
| 1 重组火鸡疱疹病毒在抗病毒方面的研究现状 |
| 1.1 禽流感病毒 |
| 1.2 新城疫病毒 |
| 1.3 传染性法氏囊病毒 |
| 1.4 传染性喉气管炎病毒 |
| 1.5 马立克氏病病毒 |
| 1.6 鸡传染性贫血病毒 |
| 2 重组火鸡疱疹病毒在抗鹦鹉热衣原体方面的研究现状 |
| 3 重组火鸡疱疹病毒在抗堆型艾美球虫方面的研究现状 |
| 4 结语 |
（2）PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 1 PRV的病原学 |
| 1.1 PRV的分类地位 |
| 1.2 PRV的病毒粒子结构 |
| 1.3 PRV的理化特性 |
| 1.4 PRV的血凝性和培养特性 |
| 1.5 PRV的病原性及致病机理 |
| 2 PRV的分子生物学特性 |
| 2.1 PRV的基因组特性 |
| 2.2 PRV的主要基因及其功能 |
| 3 猪伪狂犬病毒病的诊断方法 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 解剖学与组织病理学诊断 |
| 3.3 分子病原学诊断 |
| 3.3.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 3.3.2 环介导恒温扩增技术(LAMP) |
| 3.4 血清学诊断 |
| 3.4.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.4.2 间接免疫荧光法(IFA) |
| 3.4.3 血清中和试验(SNT) |
| 3.4.4 乳胶凝集试验(LAT) |
| 3.4.5 免疫胶体金技术 |
| 3.5 病毒分离 |
| 4 猪伪狂犬病疫苗的研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 传统弱毒疫苗 |
| 4.3 亚单位疫苗 |
| 4.4 核酸疫苗 |
| 4.5 伪狂犬重组活载体疫苗 |
| 4.6 伪狂犬基因缺失苗 |
| 4.6.1 第一代基因缺失苗 |
| 4.6.2 第二代双基因缺失苗 |
| 4.6.3 第二代三基因缺失苗 |
| 5 猪伪狂犬的流行状况 |
| 5.1 猪伪狂犬国外流行状况 |
| 5.2 猪伪狂犬病国内流行状况 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 试验一 鉴别猪伪狂犬病病毒强毒与疫苗弱毒PCR方法的的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒、菌株及临床样品 |
| 1.1.2 主要试剂及设备 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.3 病料的研磨与DNA的提取 |
| 1.4 单项PCR扩增 |
| 1.5 DNA纯化回收,连接及转化 |
| 1.5.1 DNA纯化回收 |
| 1.5.2 连接 |
| 1.5.3 转化 |
| 1.5.4 蓝白斑筛选及测序 |
| 1.6 双重PCR扩增 |
| 1.7 双重PCR的特异性试验 |
| 1.8 双重PCR的灵敏度试验 |
| 1.9 双重PCR的重复性试验 |
| 1.10 临床应用 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 强毒株PCR扩增结果 |
| 2.2 弱毒株PCR扩增结果 |
| 2.3 双重PCR反应条件优化结果 |
| 2.4 双重PCR检测 |
| 2.5 双重PCR的灵敏度试验 |
| 2.6 双重PCR的重复性试验 |
| 2.7 临床应用 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪伪狂犬病病毒强毒株的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、试验动物及临床样品 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 工具酶及试剂 |
| 1.2 病毒的PCR扩增 |
| 1.3 PRV的分离及其gE基因的检测 |
| 1.4 ST细胞中病毒滴度TCID50 的测定 |
| 1.5 接种小鼠试验 |
| 1.6 分离株的理化特性试验 |
| 1.7 一步生长曲线的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 组织病料PRV的 PCR检测结果 |
| 2.2 PRV的细胞培养与CPE的观察结果 |
| 2.3 PRVgE基因检测结果 |
| 2.4 PRV病毒含量测定结果 |
| 2.5 接种小鼠试验结果 |
| 2.6 分离株的理化特性试验结果 |
| 2.7 分离株的一步生长曲线测定结果 |
| 3 讨论 |
| 试验三 PRV分离株gB、gD基因的扩增及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、细胞和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 病毒增殖培养及其DNA的提取 |
| 1.4 PRV gB、gD全基因的PCR扩增、克隆与测序 |
| 1.5 基因的遗传进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PRV gB、gD全基因的扩增结果 |
| 2.2 PRV gB、gD全基因重组质粒的PCR和酶切鉴定 |
| 2.3 gB全基因的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.4 gB基因推导氨基酸的同源性分析 |
| 2.5 gB基因的遗传进化树分析 |
| 2.6 gD全基因的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.7 gD基因推导氨基酸的同源性分析 |
| 2.8 gD基因的遗传进化树分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
（3）猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制（论文提纲范文）
| 英文缩略词或符号表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 伪狂犬病概述 |
| 1.2 伪狂犬病病毒研究概况 |
| 1.2.1 伪狂犬病病毒的形态结构 |
| 1.2.2 伪狂犬病病毒的基因组结构 |
| 1.2.3 伪狂犬病病毒的基因功能 |
| 1.2.4 伪狂犬病病毒的理化特性 |
| 1.2.5 伪狂犬病病毒的复制与传播 |
| 1.3 伪狂犬病疫苗的研究现状及应用 |
| 1.3.1 猪伪狂犬病灭活疫苗 |
| 1.3.2 猪伪狂犬病常规活疫苗 |
| 1.3.3 猪伪狂犬病基因缺失活疫苗 |
| 1.3.4 猪伪狂犬病核酸疫苗 |
| 1.3.5 猪伪狂犬病病毒活载体疫苗 |
| 1.4 猪伪狂犬病的防控与净化 |
| 1.5 猪瘟病毒的流行现状及其疫苗的研究进展 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要设备及仪器 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 伪狂犬病病毒变异株(JS-2012 株)gE/gI双基因缺失毒株的构建 |
| 2.2.2 JS-2012-△gE/gI病毒的生物学特性分析 |
| 2.2.3 JS-2012-△gE/gI病毒的安全性试验 |
| 2.2.4 JS-2012-△gE/gI病毒的免疫效力试验 |
| 2.2.5 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 |
| 2.2.6 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的生物学特性分析 |
| 2.2.7 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的安全性试验 |
| 2.2.8 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的免疫效力试验 |
| 2.3 数据处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 同源重组转移载体的构建 |
| 3.1.1 p EGFP-C3 质粒改造后的鉴定 |
| 3.1.2 同源重组臂的获得 |
| 3.1.3 同源重组转移载体的鉴定 |
| 3.2 同源重组转移载体转染条件的优化 |
| 3.3 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的构建 |
| 3.3.1 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的筛选及纯化 |
| 3.3.2 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的PCR鉴定 |
| 3.4 JS-2012-△gE/gI病毒的构建 |
| 3.4.1 JS-2012-△gE/gI病毒的筛选及纯化 |
| 3.4.2 JS-2012-△gE/gI病毒的PCR鉴定 |
| 3.5 JS-2012-△gE/gI病毒的生物学特性分析 |
| 3.5.1 JS-2012-△gE/gI病毒滴度及生长动力学 |
| 3.5.2 JS-2012-△gE/gI病毒的蚀斑形态学 |
| 3.5.3 JS-2012-△gE/gI病毒gE蛋白的表达情况 |
| 3.5.4 JS-2012-△gE/gI病毒的遗传稳定性 |
| 3.6 JS-2012-△gE/gI病毒的安全性 |
| 3.6.1 JS-2012-△gE/gI病毒对哺乳仔猪的致病性 |
| 3.6.2 JS-2012-△gE/gI病毒对妊娠母猪的致病性 |
| 3.6.3 JS-2012-△gE/gI病毒的水平传播能力 |
| 3.6.4 JS-2012-△gE/gI病毒的垂直传播能力 |
| 3.6.5 JS-2012-△gE/gI病毒在仔猪体内毒力返强能力 |
| 3.7 JS-2012-△gE/gI病毒的免疫效力 |
| 3.7.1 JS-2012-△gE/gI病毒对仔猪的主动免疫效力 |
| 3.7.2 JS-2012-△gE/gI病毒对仔猪的被动免疫效力 |
| 3.8 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 |
| 3.8.1 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的获得 |
| 3.8.2 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的PCR鉴定 |
| 3.9 JS-2012-△gE/gI-E2 病毒的生物学特性 |
| 3.9.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒滴度及生长动力学 |
| 3.9.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的蚀斑形态学 |
| 3.9.3 JS-2012-△gE/gI-E2病毒E2 蛋白的表达情况 |
| 3.9.4 JS-2012-△gE/gI病毒的遗传稳定性 |
| 3.10 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的安全性 |
| 3.10.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对哺乳仔猪的致病性分析 |
| 3.10.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对妊娠母猪的致病性分析 |
| 3.10.3 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的水平传播能力 |
| 3.10.4 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的垂直传播能力 |
| 3.11 JS-2012-△gE/gI-E2 病毒的免疫效力 |
| 3.11.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对母源抗体阴性仔猪的免疫效力 |
| 3.11.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对PRV母源抗体阳性猪的免疫效力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 伪狂犬病病毒变异株的抗原差异性与Bartha K61 免疫不完全保护的关系 |
| 4.2 伪狂犬病基因缺失活疫苗的安全性与缺失基因的关系 |
| 4.3 伪狂犬病基因缺失活疫苗的安全性与免疫原性的关系 |
| 4.4 伪狂犬病基因缺失活疫苗的鉴别诊断 |
| 4.5 猪瘟病毒的防控与净化 |
| 4.6 外源基因的插入位置与重组病毒特性的关系 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
（4）表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒3型研究概述 |
| 1 猪圆环病毒3型的生物学研究进展 |
| 1.1 PCV的起源与发现 |
| 1.2 PCV3的生物学特性 |
| 1.3 PCV3编码蛋白 |
| 1.3.1 结构蛋白 |
| 1.3.2 复制酶相关蛋白 |
| 2 猪圆环病毒3型的病原学及感染情况 |
| 2.1 PCV3的基因型分类及致病性 |
| 2.2 PCV3的感染情况 |
| 第二章 伪狂犬病病毒研究概述 |
| 1 伪狂犬病毒的生物学研究进展 |
| 1.1 PRV的起源与发现 |
| 1.2 PRV的生物学特性 |
| 1.2.1 基因组 |
| 1.2.2 衣壳蛋白 |
| 1.2.3 被膜蛋白 |
| 1.2.4 囊膜蛋白 |
| 2 PRV的流行病学 |
| 3 伪狂犬病毒的检测方法 |
| 3.1 核酸检测方法 |
| 3.1.1 环介导等温扩增法 |
| 3.1.2 纳米PCR法 |
| 3.1.3 实时荧光定量PCR法 |
| 3.2.4 多重PCR法 |
| 3.2 免疫学相关检测方法 |
| 3.2.1 酶联免疫吸附实验 |
| 3.2.2 免疫层析技术 |
| 4 伪狂犬病毒疫苗研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 弱毒活疫苗 |
| 4.3 基因工程疫苗 |
| 4.3.1 单基因缺失疫苗 |
| 4.3.2 双基因缺失疫苗 |
| 4.3.3 三基因缺失疫苗 |
| 4.4 重组病毒疫苗 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 表达PCV3 Cap的重组PRV转移载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器和器材 |
| 1.2 分子生物学试剂 |
| 1.3 毒株、菌株、细胞株以及载体 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV HD/c基因组抽提 |
| 2.2 感受态细胞的制备 |
| 2.3 重组载体设计与引物合成 |
| 2.4 PRV gC转移载体的构建 |
| 2.4.1 gC同源臂的扩增 |
| 2.4.2 EGFP荧光表达盒的设计 |
| 2.4.3 含有PCV3 Cap表达盒的设计 |
| 2.4.4 gC重组载体的分子构建及验证 |
| 2.5 PRV gG转移载体的构建 |
| 2.5.1 gG同源臂的扩增 |
| 2.5.2 GFP荧光表达盒的设计 |
| 2.5.3 含有PCV3 Cap表达盒的设计 |
| 2.5.4 gG重组载体的分子构建及验证 |
| 2.6 PCV3 Cap蛋白表达验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gC转移载体的构建 |
| 3.1.1 gC同源臂扩增结果 |
| 3.1.2 EGFP表达盒扩增结果 |
| 3.1.3 PCV3 Cap表达序列扩增结果 |
| 3.2 PRV gG转移载体的构建 |
| 3.2.1 gG同源臂扩增结果 |
| 3.2.2 EGFP表达盒扩增结果 |
| 3.2.3 gG同源左臂和Cap融合序列获取 |
| 3.3 PRV重组表达载体鉴定 |
| 3.4 PCV3 Cap蛋白表达验证 |
| 4 讨论 |
| 第二章 猪伪狂犬病毒gC蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器和器材 |
| 1.2 分子生物学试剂 |
| 1.3 其他生物学相关试剂 |
| 1.4 毒株、菌株以及载体 |
| 1.5 实验动物和细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV gC基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 PRV gC基因分析 |
| 2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3 目的基因的获取 |
| 2.1.4 酶切、连接 |
| 2.1.5 菌液PCR鉴定 |
| 2.2 His-gC蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.1 重组PRV gC蛋白的诱导表达 |
| 2.2.2 His-gC蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.3 His-gC蛋白的纯化及验证 |
| 2.3 PRV gC多克隆抗体制备及鉴定 |
| 2.3.1 新西兰白兔的免疫 |
| 2.3.2 兔的多抗血清采取及反应性鉴定 |
| 2.4 PRV gC单克隆抗体的制备 |
| 2.4.1 BA LB/C小鼠免疫 |
| 2.4.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.4.3 杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 2.5 阳性细胞株的筛选 |
| 2.5.1 ELISA法检测 |
| 2.5.2 IFA检测 |
| 2.5.3 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.6 单抗腹水的制备 |
| 2.7 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.7.1 ELISA检测腹水效价和抗体亚型 |
| 2.7.2 WB检测单抗的反应性 |
| 2.7.3 IFA检测单抗的反应性 |
| 2.7.4 PRV gC单克隆抗体可变区基因分析 |
| 2.8 单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 |
| 2.8.1 PRV gC截短体构建 |
| 2.8.2 PRV gC单抗与截短载体转染样品的反应 |
| 2.9 PRV Ⅰ型和Ⅱ型病毒的通用性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gC基因原核表达载体的构建 |
| 3.1.1 PRV gC氨基酸序列分析 |
| 3.1.2 PRV gC基因的克隆 |
| 3.2 His-gC重组蛋白表达及鉴定 |
| 3.2.1 His-gC蛋白诱导表达及可溶性分析 |
| 3.2.2 His-gC蛋白纯化及阳性血清验证 |
| 3.3 His-gC小鼠多抗血清反应性鉴定 |
| 3.3.1 ELISA鉴定 |
| 3.3.2 WB鉴定 |
| 3.3.3 IFA鉴定 |
| 3.4 His-gC兔子多抗血清反应性鉴定 |
| 3.4.1 ELISA鉴定 |
| 3.4.2 WB鉴定 |
| 3.4.3 IFA鉴定 |
| 3.5 PRV gC单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 单克隆抗体杂交瘤细胞筛选 |
| 3.5.2 单克隆抗体腹水制备 |
| 3.6 PRV gC单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.6.1 间接ELISA鉴定 |
| 3.6.2 WB鉴定 |
| 3.6.3 IFA鉴定 |
| 3.7 PRV gC抗体基因可变区克隆与分析 |
| 3.7.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 3.7.2 抗体可变区比对分析, |
| 3.8 PRV gC单抗表位的初步鉴定分析 |
| 3.8.1 PRV gC蛋白抗原性分析 |
| 3.8.2 PRV gC基因截短体的构建 |
| 3.8.3 WB鉴定分析 |
| 3.8.4 IFA鉴定分析 |
| 3.9 PRV Ⅰ型和Ⅱ型病毒的通用性检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 猪伪狂犬病毒gG蛋白单克隆抗体的制备以及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV gG基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 PRV gG基因分析 |
| 2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3 PRV基因组DNA抽提 |
| 2.1.4 目的基因的获取 |
| 2.1.5 双酶切、连接和转化 |
| 2.1.6 菌液PCR鉴定 |
| 2.2 His gG蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 PRV gG多克隆抗体制备及鉴定 |
| 2.3.1 新西兰白兔的免疫 |
| 2.3.2 兔血清的采取及反应性鉴定 |
| 2.4 PRV gG单克隆抗体的制备 |
| 2.4.1 BA LB/C小鼠免疫 |
| 2.4.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.5 阳性细胞株的筛选 |
| 2.5.1. ELISA检测 |
| 2.5.2 IFA检测 |
| 2.5.3 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.6 单抗腹水的制备 |
| 2.7 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.7.1 ELISA检测腹水效价和抗体亚型 |
| 2.7.2 WB检测单抗的反应性 |
| 2.7.3 IFA检测单抗的反应性 |
| 2.7.4 PRV gG单克隆抗体可变区基因分析 |
| 2.8 单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 |
| 2.8.1 PRV gG截短体构建 |
| 2.8.2 PRV gG单抗与截短体转染样品的反应 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gG基因原核表达载体的构建 |
| 3.1.1 PRV gG基因蛋白序列分析 |
| 3.1.2 PRV gG基因的克隆 |
| 3.2 His-gG重组蛋白表达及鉴定 |
| 3.2.1 His-gG蛋白诱导表达及可溶性分析 |
| 3.2.2 His-gG蛋白纯化及阳性血清验证 |
| 3.3 His-gG小鼠多抗血清反应性鉴定 |
| 3.3.1 ELISA鉴定 |
| 3.3.2 WB鉴定 |
| 3.3.3 IFA鉴定 |
| 3.4 His-gG兔子多抗血清反应性鉴定 |
| 3.4.1 ELISA鉴定 |
| 3.4.2 WB鉴定 |
| 3.4.3 IFA鉴定 |
| 3.5 PRV gG单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 单克隆抗体杂交瘤细胞筛选 |
| 3.5.2 单克隆抗体腹水制备 |
| 3.6 PRV gG单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.6.1 间接ELISA鉴定 |
| 3.6.2 WB鉴定 |
| 3.6.3 IFA鉴定 |
| 3.7 PRV gG抗体基因可变区克隆与分析 |
| 3.7.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 3.7.2 抗体可变区分析 |
| 3.8 PRV gG单抗表位的初步鉴定分析 |
| 3.8.1 PRV gG蛋白抗原性分析 |
| 3.8.2 PRV gG基因截短体的构建 |
| 3.8.3 WB鉴定分析 |
| 3.8.4 IFA鉴定分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 常用缓冲液、试剂及培养基配方 |
（5）动物病毒重组活载体疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 痘病毒活载体疫苗 |
| 2 疱疹病毒活载体疫苗 |
| 3 腺病毒活载体疫苗 |
| 4 新城疫病毒活载体疫苗 |
| 5 其他动物病毒载体疫苗 |
| 6 展望 |
（6）表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 H9亚型禽流感病毒遗传进化与疫苗研究进展 |
| 1 禽流感病毒的基因组特征 |
| 2 H9亚型AIV的基因演化与变异 |
| 3 H9亚型AIV疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 文献综述 以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体的重组疫苗研究进展 |
| 1 HVT的特点 |
| 2 HVT的基因结构 |
| 3 HVT载体构建的方法 |
| 4 HVT作为载体的应用 |
| 5 重组HVT疫苗存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组火鸡疱疹病毒构建和安全性评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 重组病毒的免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组病毒rHVT-YBF003培养工艺研究与种子批建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（7）表达新城疫病毒F蛋白传染性喉气管炎病毒的构建及评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 传染性喉气管炎概述 |
| 1.1.1 传染性喉气管炎 |
| 1.1.2 传染性喉气管炎病毒 |
| 1.1.3 鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展 |
| 1.2 新城疫概述 |
| 1.2.1 新城疫 |
| 1.2.2 新城疫病毒 |
| 1.2.3 新城疫疫苗的研究进展 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 第二章 ILTV CK/CH/LHLJ/120305 株的分离鉴定及致病性研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 SPF鸡胚和鸡、细胞、载体、菌株和毒株 |
| 2.1.2 酶类和主要试剂 |
| 2.1.3 主要设备和仪器 |
| 2.1.4 引物和溶液 |
| 2.1.5 病毒的分离 |
| 2.1.6 病毒的鉴定 |
| 2.1.7 病毒遗传进化分析 |
| 2.1.8 病毒在LMH上的适应性培养及蚀斑纯化 |
| 2.1.9 病毒在LMH上的滴度测定 |
| 2.1.10 检测ILTV病DNA的qPCR的优化 |
| 2.1.11 动物试验 |
| 2.1.12 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.0 ILTV分离结果 |
| 2.2.1 LHLJ/120305 遗传进化分析 |
| 2.2.2 LHLJ/120305在LMH上适应性培养、纯化及病毒滴度 |
| 2.2.3 LHLJ/120305对SPF鸡的致病性研究 |
| 2.2.4 LHLJ/120305 株对强毒株WG株的免疫保护试验 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 表达新城疫病毒F蛋白传染性喉气管炎病毒的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞和毒株 |
| 3.1.2 载体和菌株 |
| 3.1.3 酶类和主要试剂 |
| 3.1.4 主要设备和仪器 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.1.6 转移载体pILTΔUS9-GFP构建 |
| 3.1.7 转移载体pILT?US9-F的构建 |
| 3.1.8 表达GFP的重组ILTV毒株的构建 |
| 3.1.9 表达NDV F蛋白基因的重组ILTV毒株的构建 |
| 3.1.10 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pILT?US9-GFP转移载体的鉴定 |
| 3.2.2 pILT?US9-F转移载体的构建 |
| 3.2.3 ILTV-?US9-G重组毒株的鉴定 |
| 3.2.4 ILTV-?US9-F重组毒株的构建及鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株免疫效力评价 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 细胞、毒株、鸡胚和雏鸡 |
| 4.1.2 主要设备和仪器 |
| 4.1.3 试剂与耗材 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.1.5 血清抗体检测 |
| 4.1.6 重组病毒ILTV-?US9-F株的对ILTV WG的免疫保护评价 |
| 4.1.7 重组病毒ILTV-ΔUS9-F株不同基因型NDV强毒的免疫保护效力评价 |
| 4.1.8 重组病毒ILTV-?US9-F株对致病NDV的最小免疫剂量的评价 |
| 4.1.9 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组病毒ILTV-?US9-F株对致病ILTV的免疫保护效力评价 |
| 4.2.2 重组病毒ILTV-?US9-F株 NDV的免疫保护效力评价 |
| 4.2.3 重组病毒ILTV-?US9-F株对NDV的最小免疫剂量的试验 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）表达猪流行性腹泻—轮状病毒的重组伪狂犬病病毒株的构建及部分生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒的危害和流行特点 |
| 1.2 PEDV的分子生物学 |
| 1.2.1 PEDV的分子结构 |
| 1.2.2 PEDV S基因及纤突蛋白功能 |
| 1.3 PEDV疫苗研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 2 轮状病毒 |
| 2.1 轮状病毒的危害和流行特点 |
| 2.2 RV的病原学特征 |
| 2.3 PoRV的分子生物学 |
| 2.3.1 PoRV的分子结构及部分蛋白功能 |
| 2.3.2 RV编码的主要抗原蛋白 |
| 2.4 PoRV疫苗研究进展 |
| 2.4.1 传统疫苗 |
| 2.4.2 基因工程疫苗 |
| 3 病毒活载体疫苗的研究进展 |
| 3.1 病毒活载体疫苗概述 |
| 3.2 伪狂犬病毒活载体疫苗 |
| 3.2.1 PRV基因组的结构 |
| 3.2.2 国内外伪狂犬病病毒活载体疫苗的研究进展 |
| 第二章 PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、质粒、毒株和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PEDV S基因和PoRVVP7基因的扩增 |
| 2.1.1 PEDV S基因和PoRVVP7基因片段引物设计和合成 |
| 2.1.2 Vero细胞和MA-104细胞的复苏 |
| 2.1.3 病毒的增值培养 |
| 2.1.4 PoRV和PEDV的总RNA提取 |
| 2.1.5 cDNA的获得 |
| 2.1.6 VP7基因和S基因的RT-PCR扩增 |
| 2.1.7 VP7基因和S基因的纯化回收 |
| 2.2 pMD-VP7、pMD-S克隆质粒的构建 |
| 2.2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2.2 目的片段和pMD19-T(simple)载体的连接 |
| 2.2.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 |
| 2.2.4 阳性重组工程菌的筛选和PCR鉴定 |
| 2.2.5 质粒的提取 |
| 2.2.6 目的基因的序列测定与抗原参数分析 |
| 2.3 pMD-VP7.S重组质粒的构建 |
| 2.3.1 pMD-VP7和pMD-S质粒DNA抽提 |
| 2.3.2 S基因和质粒pMD-VP7的酶切回收 |
| 2.3.3 S基因和pMD-VP7的连接转化 |
| 2.3.4 pMD-VP7.S阳性重组工程菌的筛选和PCR鉴定 |
| 2.3.5 pMD-VP7.S的酶切鉴定 |
| 2.4 pEGFP-VP7.S真核转移载体的构建 |
| 2.4.1 pMD-VP7.S和pEGFP-gI28k质粒DNA抽提 |
| 2.4.2 VP7.S融合基因和质粒pEGFP-gI28k的酶切回收 |
| 2.4.3 VP7.S融合基因和pEGFP-gI28k的连接 |
| 2.4.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 |
| 2.4.5 pEGFP-gI28k阳性工程菌的筛选和PCR鉴定 |
| 2.4.6 pEGFP-VP7.S真核转移质粒的酶切鉴定 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 PEDV S基因和PoRVVP7基因的扩增结果 |
| 3.2 pMD-VP7、pMD-S克隆质粒的构建结果 |
| 3.2.1 pMD-VP7、pMD-S重组工程菌的PCR鉴定 |
| 3.2.2 pMD-VP7、pMD-S克隆质粒的序列测定 |
| 3.2.3 目的基因片段抗原参数分析 |
| 3.3 pMD-VP7.S重组质粒的构建结果 |
| 3.3.1 pMD-VP7.S重组工程菌的PCR鉴定 |
| 3.3.2 pMD-VP7.S重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.3 pMD-VP7.S重组质粒的序列测定结果 |
| 3.4 pEGFP-VP7.S真核转移载体的构建结果 |
| 3.4.1 pEGFP-VP7.S重组工程菌的PCR鉴定 |
| 3.4.2 pEGFP-VP7.S真核转移质粒的酶切鉴定 |
| 3.4.3 pEGFP-VP7.S真核转移质粒的序列测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PEDV S基因片段和PoRVVP7基因片段的选择 |
| 4.2 Linker序列的设计 |
| 4.3 PRV转移载体的构建 |
| 5 小结 |
| 第三章 表达PEDV S和PoRVVP7基因的重组伪狂犬病病毒株的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、毒株和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 PRV转移质粒pEGFP-VP7.S的抽提 |
| 2.2 PRV和pEGFP-VP7.S质粒DNA的共转染 |
| 2.3 重组病毒的筛选 |
| 2.4 重组病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的PCR鉴定 |
| 2.5.1 重组病毒的基因组DNA的抽提 |
| 2.5.2 重组病毒PCR鉴定 |
| 2.6 重组病毒的Western-Blotting检测 |
| 2.6.1 蛋白样品制备 |
| 2.6.2 SDS-PAGE |
| 2.6.3 Western-Blotting分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV转移质粒pEGFP-VP7.S在293T细胞中表达结果 |
| 3.2 重组病毒的筛选结果 |
| 3.3 重组病毒PRV(CM)的PCR鉴定结果 |
| 3.4 重组病毒PRV(CM)的Western-Blotting结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 提高同源重组效率的方式 |
| 4.2 重组病毒PRV(CM)株的筛选 |
| 4.3 重组病毒PRV(CM)株的表达 |
| 5 小结 |
| 第四章 重组病毒PRV(CM)株部分生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株和细胞 |
| 1.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV(CM)在BHK-21细胞上的增值特性观察 |
| 2.2 PRV(CM)在不同细胞上的增值特性观察 |
| 2.3 重组病毒PRV(CM)株和PRVXJ株的TCID50测定 |
| 2.4 PRVgB基因荧光定量方法的建立 |
| 2.4.1 引物设计 |
| 2.4.2 pMD-gB阳性标准品的制备 |
| 2.4.3 反应条件优化 |
| 2.4.4 重复性和特异性评价 |
| 2.4.5 PRVgB荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.5 重组病毒PRV(CM)和PRVXJ株一步生长曲线测定 |
| 2.6 重组病毒PRV(CM)株遗传稳定性测定 |
| 2.7 不同代次重组病毒株体外培养各时间点的病毒含量测定比较 |
| 2.8 重组病毒PRV(CM)的空斑观察 |
| 2.9 安全性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV(CM)在BHK-21细胞上的增值特性观察结果 |
| 3.2 重组病毒PRV(CM)株在不同细胞上的增值特性观察结果 |
| 3.3 重组病毒和亲本株的TCID50测定结果 |
| 3.4 PRVgB基因荧光定量方法的建立 |
| 3.4.1 PRVgB片段的扩增 |
| 3.4.2 反应条件的优化 |
| 3.4.3 PRVgB荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.4.4 PRVgB基因荧光定量PCR方法的特异性、重复性评价 |
| 3.5 PRV(CM)和PRVXJ株一步生长曲线的绘制 |
| 3.6 重组病毒PRV(CM)遗传稳定性检测结果 |
| 3.7 不同代次PRV(CM)在各时间点的病毒含量测定结果比较 |
| 3.8 重组病毒PRV(CM)的空斑形成 |
| 3.9 重组病毒PRV(CM)安全性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PEDV、PoRV、PRV三价基因工程疫苗的意义 |
| 4.2 外源基因的插入对伪狂犬病毒增殖的影响 |
| 4.3 重组病毒部分生物学特性研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 符号说明 第一章 H9N2亚型禽流感病毒的变异与进化 |
| 1 H9亚型AIV的病原学特征 |
| 2 H9亚型AIV的变异特性 |
| 2.1 抗原漂移 |
| 2.2 抗原转变 |
| 3 H9N2亚型AIV的遗传进化 |
| 3.1 H9N2亚型AIV HA基因的进化 |
| 3.2 H9亚型AIV作为新型流感病毒的基因供体 |
| 4 H9亚型AIV的跨种传播 |
| 5 H9N2亚型AIV的疫苗 |
| 6 结论 第二章 表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和质粒 |
| 1.2 鸡胚及实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.3.1 主要化学试剂 |
| 1.3.2 分子生物学试剂 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 H9亚型AIV HA基因的克隆及鉴定 |
| 2.1.1 刊物设计 |
| 2.1.2 病毒的扩增 |
| 2.1.3 病毒RNA的提取 |
| 2.1.4 RT-PCR |
| 2.1.5 HA基因遗传进化分析 |
| 2.2 真核表达载体pHVT-H9HA的构建 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 HA基因表达盒的PCR扩增 |
| 2.2.3 表达盒PCR产物连接、转化与阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.4 转移载体pHVT-H9HA的构建 |
| 2.3 转移载体pHVT-H9HA的鉴定表达 |
| 2.3.1 酶切鉴定 |
| 2.3.2 Western-blot试验 |
| 2.3.3 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.4 重组病毒的构建及纯化 |
| 2.4.1 rHVT-EGFP基因组DNA的制备 |
| 2.4.2 转移载体pHVT-H9HA的线性化 |
| 2.4.3 线性化的转移载体与rHVT-EGFP DNA共转染CEF |
| 2.4.4 重组病毒rHVT-H9HA的纯化 |
| 2.5 重组病毒的鉴定 |
| 2.5.1 PCR鉴定 |
| 2.5.2 Western-Blot试验鉴定 |
| 2.5.3 间接免疫荧光试验(IFA)鉴定 |
| 2.5.4 Southern blot |
| 2.5.5 重组病毒在CEF生长特性的检测 |
| 2.6 重组病毒rHVT-H9HA的免疫效力试验 |
| 2.6.1. 重组病毒的增殖与滴度测定 |
| 2.6.2 重组病毒免疫保护试验 |
| 2.6.3 排毒检测 |
| 2.6.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 真核表达载体的构建 |
| 3.1.1 HA基因的克隆 |
| 3.1.2 HA基因的遗传进化分析 |
| 3.1.3 HA基因表达盒的扩增 |
| 3.2 真核表达载体的鉴定 |
| 3.2.1 酶切鉴定 |
| 2.3.2 Western blot鉴定 |
| 2.3.3 IFA鉴定 |
| 3.3 重组病毒rHVT-H9HA的构建 |
| 3.4 重组病毒的鉴定 |
| 3.4.1 PCR鉴定 |
| 3.4.2 Western blot鉴定 |
| 3.4.3 IFA鉴定 |
| 3.4.4 Southern blot鉴定 |
| 3.4.5 重组病毒在CEF上的生长曲线 |
| 3.5 重组病毒的免疫效力评价 |
| 3.5.1 HI抗体消长规律 |
| 3.5.2 攻毒后排毒率 |
| 4. 讨论 全文总结 参考文献 附录 致谢 |
（10）表达H5N1亚型禽流感病毒HA重组火鸡疱疹病毒的构建与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽流感概况 |
| 1.1 禽流感病毒的分子生物学特征 |
| 1.1.1 禽流感病毒的结构 |
| 1.1.2 禽流感病毒的基因组结构 |
| 1.1.3 禽流感病毒的蛋白结构与功能 |
| 1.2 禽流感病毒的分类 |
| 1.3 禽流感病毒的致病机理 |
| 1.4 禽流感疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活全病毒疫苗 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 |
| 1.4.3 核酸疫苗 |
| 1.4.4 病毒活载体疫苗 |
| 2 火鸡疱疹病毒概况 |
| 2.1 火鸡疱疹病毒的增殖 |
| 2.2 火鸡疱疹病毒的基因结构 |
| 2.3 火鸡疱疹病毒载体的研究进展 |
| 2.4 重组火鸡疱疹病毒构建的方法和原理 |
| 2.5 火鸡疱疹病毒细菌人工染色体 |
| 2.5.1 BAC载体系统的简介 |
| 2.5.2 BAC载体系统的研究背景 |
| 2.5.3 BAC载体系统的优点 |
| 2.5.4 BAC分子克隆化病毒 |
| 2.5.5 细菌人工染色体修饰技术 |
| 2.5.5.1 Red/ET介导的同源重组 |
| 2.5.5.2 RecA蛋白介导的同源重组 |
| 2.5.5.3 Cre/Loxp介导的同源重组 |
| 2.5.5.4 火鸡疱疹病毒BAC及其应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 表达H5N1亚型禽流感病毒HA重组火鸡疱疹病毒的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 HA表达盒的构建与验证 |
| 2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.1.3 重组质粒PT-HA转化DH5α |
| 2.1.4 PT-HA质粒的提取 |
| 2.1.5 质粒pT-PHAE的构建 |
| 2.1.6 HA基因与T-PE连接转化 |
| 2.1.7 质粒PT-PHAE酶切鉴定 |
| 2.1.8 转移载体质粒PT-PHAE-Kan~+的构建 |
| 2.2 重组BAC(pBAC~(HVT-HA) KAN~+)的构建与验证 |
| 2.2.1 感受态细胞HVT GS1783的制备 |
| 2.2.2 HA表达盒添加同源臂 |
| 2.2.3 电转重组获得重组BAC(BAC~(-HVT-HA) KAN~+) |
| 2.2.4 重组BAC质粒(pBAC~(-HVT-HA) KAN~+)的提取 |
| 2.2.5 重组BAC(BAC~(-HVT-HA) KAN~+) PCR验证 |
| 2.2.6 BAC~(HVT-G)-H5的PCR验证 |
| 2.3 重组病毒HVT~(BAC)-H5的获得 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 HA表达盒的验证 |
| 3.1.1 质粒PT-PHAE HA基因的酶切鉴定 |
| 3.1.2 质粒PT-PHAE-Kan~+基因的PCR扩增 |
| 3.2 表达HA火鸡疱疹病毒转移载体的验证 |
| 3.2.1 HA表达盒添加同源臂 |
| 3.2.2 重组BAC质粒BAC~(HVT-HA) Kan~+PCR验证 |
| 3.2.3 转移载体HA重组HVTBAC(BAC~(HVT-G)-H5)的PCR验证 |
| 3.2.4 RFLP验证BAC~(HVT-G)、BAC~(HVT-HA) KAN~+、BAC~(HVT-G)-H5 |
| 3.3 重组病毒的获得与纯化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达H5N1亚型禽流感病毒HA重组火鸡疱疹病毒的鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 重组病毒HVT~(BAC)-H5 PCR鉴定和序列测序 |
| 2.1.1 重组病毒HVT~(BAC)-H5基因组DNA的提取 |
| 2.1.1 重组病毒HVT~(BAC)-H5 PCR扩增表达盒 |
| 2.2 重组病毒HA基因表达产物western blot鉴定 |
| 2.3 重组病毒HVT~(BAC)-H5血凝试验鉴定 |
| 2.3.1 1%鸡红细胞悬液配制 |
| 2.3.2 血凝试验 |
| 2.4 重组病毒HVT~(BAC)-H5遗传稳定性鉴定 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 重组病毒HVT~(BAC)-H5 HA表达盒的PCR扩增 |
| 3.2 重组病毒HVT~(BAC)-H5 HA基因表达产物western blot鉴定结果 |
| 3.3 重组病毒HVT~(BAC)-H5血凝试验结果 |
| 3.4 重组病毒遗传稳定性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
四、火鸡疱疹病毒繁殖非必须基因重组病毒用转移载体的构建（论文参考文献）
- [1]重组火鸡疱疹病毒疫苗研制现状[J]. 李文桂,陈雅棠. 热带医学杂志, 2021(09)
- [2]PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析[D]. 顾阳. 河南农业大学, 2020(04)
- [3]猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制[D]. 童武. 东北农业大学, 2020(04)
- [4]表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备[D]. 黄文祥. 浙江大学, 2020(01)
- [5]动物病毒重组活载体疫苗研究进展[J]. 谢青梅,封柯宇,沈勇. 华南农业大学学报, 2019(05)
- [6]表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验[D]. 楚电峰. 扬州大学, 2018(05)
- [7]表达新城疫病毒F蛋白传染性喉气管炎病毒的构建及评价[D]. 邵昱昊. 中国农业科学院, 2018(08)
- [8]表达猪流行性腹泻—轮状病毒的重组伪狂犬病病毒株的构建及部分生物学特性研究[D]. 毛汐语. 四川农业大学, 2018(02)
- [9]表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验[D]. 蒋叶林. 扬州大学, 2017(01)
- [10]表达H5N1亚型禽流感病毒HA重组火鸡疱疹病毒的构建与鉴定[D]. 刘芳. 南京农业大学, 2016(04)