一、Gene expression profile favoring phenotypic reversion: a clue for mechanism of tumor suppression by NF-IL6 3'UTR（论文文献综述）
陈凯[1]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中研究表明一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
张飞[2]（2021）在《长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析》文中研究说明睾丸发育、精子生成过程涉及生殖细胞、间质细胞和支持细胞在内的多种细胞协同作用,该过程受到极其复杂和严格的分子时空调控,人们对其理解仍十分有限。环状RNA作为一类新的长链非编码RNA存在于人和牛等动物的睾丸及精清中,可能参与调控睾丸发育及精子发生过程。然而,公猪睾丸组织发育成熟过程中环状RNA的表达谱及其潜在生物学功能尚不清楚。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是存在于RNA内部最常见的一类修饰,参与调控细胞分化、个体发育等多种生理病理进程,但关于m6A与睾丸发育、精子发生之间的关系目前仍知之甚少。因此,本文选取性成熟前后两个不同发育阶段的长白公猪睾丸组织,利用高通量测序技术和生物信息学等手段,揭示不同阶段睾丸中的环状RNA和m6A表达特征并比较分析其表达差异,预测和解析差异表达的环状RNA、m6A修饰在睾丸发育和精子发生事件中的潜在生物学功能,为增进了解环状RNA、m6A修饰参与公猪精子发生、睾丸发育调控等提供新的线索。本论文得到研究结果如下:本研究对未成年（30日龄,D30）和性成熟（210日龄,D210）长白公猪睾丸进行组织形态学观察。H&E染色结果显示,30日龄长白公猪睾丸曲细精管尚未发育完整,睾丸内未见明显管腔,处于性成熟前阶段;210日龄长白公猪睾丸体积显着增大,曲细精管发育完全,内含大量不同类型的生殖细胞并产生大量圆形精子及长形精子,已达到性成熟后阶段。使用去除核糖体RNA及线性RNA的总RNA-Seq来检测D30和D210长白公猪睾丸组织中环状RNA的表达谱。高通量测序显示睾丸组织中含有丰富的环状RNA,性成熟前后睾丸中分别鉴定出34521与31803个环状RNA。生物信息学分析发现这些环状RNA广泛分布于常染色体和性染色体上,长度主要位于100～10000 nt之间（58.97%）,主要来源于源头基因的外显子区域,大部分环状RNA由1-7个外显子形成（86.54%）,并且部分源头基因可以产生多个环状RNA。在公猪睾丸成熟过程中共发现来源于1526个源头基因的2326个差异表达的环状RNA,其中1003个D210公猪睾丸组织中上调,1323个下调。此外,差异表达的环状RNA源头基因GO功能分析显示这些环状RNA主要与精子发生、激素生物合成过程的正调控、生殖细胞发育、雄性减数分裂等生物过程有关。KEGG通路富集分析发现他们分别参与了干细胞多能性调节、紧密连接、粘附连接、cAMP等信号通路。因此,以上结果表明性成熟前后公猪睾丸表达大量的环状RNA,这些环状RNA呈现发育阶段特异性的动态表达模式,且主要与睾丸发育、精子发生等生物学过程密切相关。这些结果将有望为鉴定种公猪睾丸发育状态及筛选优秀种公猪提供一种潜在的分子标记物。同时为了研究睾丸发育成熟过程中m6A甲基化修饰的动态变化,本研究绘制了长白猪性成熟前后睾丸转录组范围信使RNA m6A甲基化图谱。本研究描述了m6A甲基化修饰在睾丸发育过程中的广泛分布模式,并分析了基因表达与m6A甲基化修饰的关系,同时广泛地鉴定了性成熟前后m6A甲基化修饰差异基因,这些基因可能与睾丸的生物学功能的密切相关。这些结果为确定睾丸中mRNA m6A甲基化的存在及其图谱提供了依据,并扩展了对m6A在哺乳动物器官发育和生长中作用的认识。
马意[3]（2021）在《MiR-508-3p在肺动脉高压中的功能性表达和调节机制研究》文中进行了进一步梳理1研究背景肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）是一种严重的心肺相关慢病,由肺小动脉的细胞增殖和纤维化以及非肌型小动脉肌化引起,导致肺血管阻力（pulmonary vascular resistance,PVR）逐渐升高。对PAH明确诊断需在海平面条件下,右心漂浮导管检测平均肺动脉压≥25mmHg,肺动脉楔压≤15mmHg和PVR>3wood单位。此外还必须排除如肺部疾病和慢性血栓栓塞性疾等其他病因导致的PAH。在过去20多年中,PAH流行病学特征和治疗观念发生很大变化。在老年患者中越来越多诊断出PAH,其中大部分患有合并症,增加医疗护理挑战性。尽管PAH发病机理始于肺循环,然而右心衰竭是死亡首要原因。当前,临床上PAH主要治疗策略是针对靶向肺血管系统中功能异常的信号通路以及传导途径,疗效有限,不能满意提高PAH患者生活质量。因此,迫切需要更深入地探讨PAH的复杂调控网络,开辟新的特异性治疗靶点。PAH主要病理学特征表现在肺动脉血管收缩（vasoconstriction）、血管重塑（vascularremodeling）以及血栓形成（thrombosis）。PAH分子机制涉及内皮细胞功能障碍、肺动脉血管平滑肌细胞增殖、血管炎症和免疫失调、能量代谢和线粒体异常、过度的生长因子刺激和离子通道缺陷等。体内一氧化氮（nitric oxide）,内皮素-1（endothelin-1）,前列环素（prostacyclin）和 5-羟色胺（serotonin）等血管活性介质的失衡和肺泡低氧（缺氧）（alveolarhypoxia）共同促进肺血管收缩。血管损伤和内皮细胞功能紊乱（endothelialcells,EC）可通过改变细胞因子/生长因子水平、提高凝血能力以及增加分泌细胞外基质（extracellular matrix,ECM）（主要是弹力蛋白和胶原蛋白）来改变血管稳态,进而促进肺血管重塑。炎性反应贯穿在PAH病理生理过程,并被认为是肺血管重塑主要致病因素。肺血管细胞（平滑肌细胞和内皮细胞）和炎性细胞是局部趋化因子和细胞因子的重要来源,可促进肺血管重塑。实际上,细胞因子和趋化因子表达增强导致肺血管细胞过度收缩和增殖。IL-1可以诱导成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）-2表达,FGF-2和IL-6又能刺激PAH中平滑肌样细胞和肺血管的成纤维细胞增殖。多种细胞因子可直接控制肺血管细胞细胞增殖、迁移和分化。其中IL-6在促炎性细胞因子中占据主导地位,并且与PAH发病机理有关。在PAH动物实验中,与对照组小鼠相比,重组IL-6蛋白显着促进模型小鼠肺血管重构,并增强模型小鼠对缺氧的高反应性。此外,IL-6还通过调控转录因子KLF-5促进FGF-2表达,进而导致肺动脉平滑肌细胞增殖。PAH中肺动脉血管丛周围浸润着由巨噬细胞,T淋巴细胞和B淋巴细胞组成的血管周细胞。在野百合碱（monocrotaline,MCT）诱导的 PAH 模型中,基质衍生因子-1（stromal-derived factor,SDF-1）是炎症细胞募集的关键趋化因子之一,具备阻断CD68+细胞、CD3+细胞和肥大细胞的肺血管浸润的作用。巨噬细胞和单核细胞的聚集和活化通常导致细胞因子、血管活性分子（如内皮素等）和活性氧释放（reactive oxygen species,ROS）。活化的巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）和丝氨酸蛋白酶（serineproteases）,有利于基底膜和细胞外基质降解,促进白细胞迁移、外膜纤维化以及细胞分化。肺血管周围CD8+T细胞的浸润与内皮细胞凋亡-抗凋亡信号转导受损有关。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）激活巨噬细胞表达,而巨噬细胞本身反馈并参与BMP信号调节。在PAH中,BMPR2突变以及BMPR2相关联的信号通路功能障碍都会导致血管细胞中生长因子异常表达和促炎反应。微小RNA（microRNA,miRNA）,是长度约为22个核苷酸的非编码RNA。研究表明,miRNA参与并调节正常细胞和肿瘤细胞中的多种细胞过程,异常表达的miRNA通过充当疾病抑制因子或激活因子调控疾病病理机理过程。迄今,已证实多种 miRNA,如 miR-17-92、miR-143/145、miR-204、miR-214、miR-21和miR-130/301等在调节PAH相关信号通路和病理发展中发挥重要调控作用,使得miRs逐渐成为临床上预测和治疗PAH的新思路。前期分析发现,在PAH病理组织测序miRNA表达芯片,与对照组相比,PAH组中miR-508-3p呈显着低表达。这提示miR-508-3p可能参与调节抑制PAH相关的信号通路和疾病发展。通过研究PAH病理组织测序mRNA微阵列,我们发现在PAH组中,NR4A3（nuclear receptor subfamily 4 A3）表达量与对照组中相比显着增高,表示NR4A3过表达可能促进PAH疾病进展。先前研究发现,miR-508-3p抑制卵巢癌、肾透明细胞癌的癌细胞增殖和迁移能力,可作为抗癌的生物标志物,生物信息学研究提示miR-508-3p与NR4A3的31-UTR有直接结合配对的碱基序列,这提示miR-508-3p可能直接调节NR4A3发挥功能。然而,miR-508-3p在PAH中的研究十分有限,miR-508-3p能否通过影响肺动脉血管平滑肌细胞（pulmonary arterial smoothmuscle cell,PASMC）增殖、迁移以及作用于NR4A3,从而调节PASMC的功能和影响PAH发展仍需探讨。本课题提出如下假说:在PASMC中过表达miR-508-3p并下调NR4A3表达致使PASMC增殖和迁移能力降低,从而起到抑制PAH发生。本研究将通过构建MCT-PAH大鼠模型,验证NR4A3表达变化。同时,通过miR-508-3p mimics/inhibitor分别模拟miR-508-3p过表达和敲低在人源肺动脉血管平滑肌细胞（human-derive PASMC,h-PASMC）上探讨 miR-508-3p-NR4A3 通路的调控机理,为寻找治疗PAH新分子提供在体和体外实验证据支持。2研究目的（1）研究miR-508-3p在h-PASMC表达和调节h-PASMC的作用及机制;（2）研究miR-508-3p-NR4A3在MCT-PAH大鼠和h-PASMC的作用及机制。3研究方法3.1 PAH组织样本基因表达微阵列和miRNA表达矩阵分析Gene Expression Omnibus（GEO）平台获取两个PAH相关病理组织基因测序表达谱和两个miRNA表达矩阵,通过生物信息学途径得出差异基因和差异miRNA。构建miRNA-mRNA关系互作网络,筛出关键miRNA及靶基因。对两个基因表达谱进行基因富集分析,找出PAH疾病发展过程中的主要信号调节通路。3.2构建MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型SpragueDawley（SD）大鼠（平均体重为180±20g）分为两组,每组5只。实验组大鼠每只每天单次左下腹皮下注射MCT（60 mg/kg;C2401,Sigma-Aldrich）,连续注射3周。对照组的大鼠每天每只单次左下腹注射等量的生理盐水,连续注射3周。确认建模成功:3周后,大鼠麻醉后接呼吸机,分别测定平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure,mPAP）、右心室收缩压（right ventricular systolic pressure,RVSP）和右心室肥厚指数（Right ventricular hypertrophy index,RVHI）（计算方法:右心室厚度与左心室和室间隔厚度之和的比值,RV/（LV+S））。3.3细胞实验（1）miR-508-3p功能表达测定:血小板源生长因子-BB（PDGF-BB,GF149,Sigma-Aldrich,USA）刺激细胞后（对照组不加）,分别于0、6、12和24h抽提细胞总RNA,实时荧光聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定miR-508-3p表达量。（2）miR-508-3p转染:过表达组和抑制组分别转染miR-508-3pmimics和inhibitor。对照组不做处理,载体组加入等量转染试剂。（3）CCK-8实验:细胞分别转染miR-508-3p mimics和inhibitor,对照组不做任何处理,分别于1、2、4、8、12、24和48h测定细胞活性。（4）创伤愈合实验:细胞分别转染miR-508-3p mimics和inhibitor,对照组不做任何处理,分别于0和48h观察并测量痕道面积。（5）细胞免疫荧光实验:细胞分别转染miR-508-3p mimics和inhibitor,对照组不做任何处理。计算ki67/DAPI核比率（计算方法:ki67/（ki67+DAPI））。（6）双荧光素酶基因报告实验:证明NR4A3是miR-508-3p下游直接作用靶基因。3.4 Western blot在蛋白水平上检测NR4A3、GAPDH、Erk、p-Erk、Slug表达。3.5 qRT-PCR在 mRNA 水平上检测 miR-508-3p、miR-508-3p mimics、miR-508-3p inhibitor、NR4A3、GAPDH 表达。4实验结果4.1生物信息学方法筛出参与并调节PAH的关键miRNA及其靶基因从GEO中筛选得到了两个PAH相关基因表达芯片（GSE70456和GSE117261）和两个miRNA表达矩阵（GSE55427和GSE67597）。经过分析和筛选,我们得到185个差异表达基因（dysregulated expression genes,DEG）和172 个差异表达 miRNA（dysregulated expression miRNA,DEM）,通过蛋白互作关系（protein-protein interaction,PPI）和 miRNA-mRNA 调控网络,我们最终选定深入探究miR-508-3p和它下游的靶基因NR4A3在PAH疾病发展和信号调节中的角色。基因集富集分析的结果,主要围绕在MAPK/ERK（MEK）、mTOR 和 Toll-like receptor 信号通路（NES 分别为 1.81、1.62、1.59,P<0.05）,表明了这些通路在PAH发生发展过程中起重要调控作用。4.2成功建立MCT-PAH大鼠模型PAH组5只大鼠,连续3周注射MCT。对照组5只大鼠,连续3周注射生理盐水。根据判定指标测量结果,PAH组大鼠的mPAP、RVSP和RVHI数值明显高于对照组大鼠的值,并且具有统计学差异（p<0.01）。说明MCT诱导PAH大鼠模型建立成功。4.3细胞实验（1）PDGF-BB 刺激 h-PASMC 后,我们发现 miR-508-3p 表达量在 0、6、12和24h依次递减。（2）在转染miR-508-3p mimics条件下,与对照组相比,miR-508-3p表达量明显升高（p<0.05）。转染 miR-508-3p inhibitor 明显抑制 miR-508-3p 表达（p<0.05）。（3）CCK-8实验中,与对照组相比,转染miR-508-3p mimics抑制h-PASMC增殖,转染miR-508-3p inhibitor促进h-PASMC增殖（p<0.05）。划痕结果表明,与对照组相比,细胞在转染miR-508-3p inhibitor情况下,迁移能力变强（p<0.05）。（4）与对照组相比,h-PASMC转染miR-508-3p mimics后降低ki67的荧光强度和核比率,而细胞在miR-508-3p inhibitor处理后ki67荧光强度增强,ki67核比率上升（p<0.05）。（5）在PAH组大鼠肺动脉血管组织中,NR4A3在蛋白和mRNA水平上都表现出高表达。双荧光素酶基因报告实验表明,细胞在转染miR-508-3p mimics时,与野生型NR4A3结合时荧光强度明显弱于与突变型NR4A3结合时荧光强度。在Western blot和mRNA水平上,我们发现细胞转染miR-508-3p mimics抑制NR4A3表达,细胞转染miR-508-3pinhibitor促进NR4A3表达,这些都证明miR-508-3p 直接作用于NR4A3（p<0.05）。（6）PASMC 转染 miR-508-3p mimics 导致 p-Erk、slug 和 NR4A3 表达量降低,而 PASMC 转染 miR-508-3p inhibitor 升高 p-Erk、slug 和 NR4A3 表达量。补救实验（rescue experiment）证明,当NR4A3表达被选择性siRNA敲低,PASMC 转染 miR-508-3p mimics/inhibitor 得到相反结果。5结论（1）在PASMC中miR-508-3p低表达,而NR4A3表现出高表达,这与我们的生物信息学研究结果一致;（2）NR4A3是miR-508-3p下游直接作用靶点,miR-508-3p-NR4A3可能在人类PAH疾病发展和信号调节通路发挥作用;（3）miR-508-3p过表达抑制h-PASMC增殖和迁移以及直接调控NR4A3表达并激活MEK通路在PAH中发挥生物功能,可作为临床治疗PAH的新思路。
陈鹏[4]（2021）在《陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究》文中认为目的:通过非编码RNA基因多态性筛选出陕西汉族结直肠癌易感人群,筛选与结直肠癌发生密切相关microRNA,并对其在结直肠癌发生发展中的作用进行探讨,为临床预防及早期诊断结直肠癌提供理论依据。方法:1.设计一项包括514例CRC患者和510例健康对照的病例-对照关联研究,选取9个lnc RNAs基因[MIR137HG、MIR143HG（CARMN）、MIR3142HG、LINC-PINT、MIR124-1HG、MIR675HG（H19）、MIR17HG、MIR497HG和MIR133A1HG]、7个miRNAs基因（MIR577、MIR608、MIR675、MIR192、MIR618、MIR492和MIR423）及GREM1基因的49个SNPs,采用Agena Mass ARRAY基因分型技术,对所筛选的SNPs位点进行基因分型,通过卡方检验、logistic回归分析在遗传模型和分层分析下这些位点与中国陕西汉族人群CRC发病风险及临床病理参数之间的关系。并进行单倍型分析及MDR分析寻找预测CRC风险的最佳模型。2.分析MIR17HG及miR-17-92a簇在CRC病例及对照组的组织及血液中的表达。从TCGA和GDC数据库下载肿瘤RNA-seq数据,分析MIR17HG的mRNA表达。在TCGA数据库中下载生存数据用于生存分析,下载miRNA-seq表达量数据用于分析不同疾病分期的差异。从SRA和GEO数据库中下载数据用于健康人和患者血清及不同临床分期患者血清中游离miR-17-92a簇的丰度比较。3.纳入未经过任何治疗的陕西汉族病例50例,健康对照50例,用RT-qPCR对其血清中miR-17-92a簇的microRNAs表达进行检测,用ROC曲线判断这些microRNAs在诊断结直肠癌病例中的作用。4.用hsa-miR-18a-5p mimics和hsa-miR-18a-5p inhibitor对结直肠癌HCT116和SW480进行处理,研究hsa-miR-18a-5p对结直肠癌细胞的作用。利用shortest path算法分析蛋白互作网络中各基因与表达差异基因之间的网络关系,筛选结直肠癌的候选关键靶基因并进行初步验证。结果:1.rs73376930与增加中国陕西汉族CRC发病风险相关;而rs7549905、rs7318578、rs633727和rs58658771与降低中国陕西汉族CRC发病风险相关。单倍型GA较CA（rs3024270和rs2075744）、单倍型CT较TA（rs4779584和rs58658771）、单倍型AA较AG（rs2293581和rs73376930）均与降低CRC风险相关。含5个SNPs位点的模型（rs9440302,rs353300,rs1582417,rs157928,rs3024270）为预测CRC最佳模型,其交叉检验一致性为9/10,平衡精确性为:0.719,可预测患CRC的风险OR为6.65（95%CI:4.96-8.91）。2.MIR17HG在CRC组织中高表达,在Ⅳ期病例及黑种人中最高。miR-17-92a簇在CRC组织及血清中高表达,hsa-miR-20a-5p表达量最高。3.在陕西汉族结直肠癌病例血清中hsa-miR-18a-5p和has-miR-92a-1相对表达量高于正常人群。hsa-miR-18a-5p表达量与临床分期相关。血清hsa-miR-18a-5p+CEA+AFP诊断早期结直肠癌的AUC=0.899（95%CI:0.836-0.962,P<0.001）,灵敏度=0.88,特异性=0.738,优于单一指标。4.hsa-miR-18a-5p能降低CRC细胞的增殖、克隆形成能力,增加细胞凋亡的发生。用最短距离算法评估hsa-miR-18a-5p可能的11个靶基因,hsa-miR-18a-5p可能通过靶向LIF起到抑制CRC发展的作用。结论:1.非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关。含五个SNPs的模型可以预测CRC的发病风险。2.MIR17HG与结直肠癌发生密切相关。MIR17HG及其microRNAs在CRC组织中高表达,表达量与临床分期及种族相关。miR-17-92a簇在CRC血清中高表达。3.在陕西汉族CRC血清中hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-92a-3p表达量增加,hsa-miR-18a-5p+CEA+AFP在诊断早期结直肠癌中具有优越性。4.hsa-miR-18a-5p的高表达能降低结直肠癌细胞的增殖、克隆形成能力,促进细胞凋亡的发生。
龚雪[5]（2021）在《CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究》文中研究表明心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）在全球范围内具有较高的患病率和死亡率,已成为影响各国社会发展的重大公共卫生问题。最新统计资料表明,我国至少有3.3亿公民面临着CVD的威胁。CVD死亡约占居民总死亡原因的40%,远超肿瘤或其他疾病。而动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）导致的动脉粥样硬化性心血管病（ASCVD）,如冠心病、心肌梗死、脑卒中,是导致CVD最主要的病因。AS及其并发症已成为严重影响我国国民健康的主要因素,为国家经济社会发展带来了沉重的负担。AS引起的血管管腔狭窄主要累及全身大、中动脉,导致相应器官长期缺血进而引发系统性的功能障碍或器质性损伤。脂代谢紊乱是直接导致AS发病的独立危险因素。其中,氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）诱发血管内皮细胞损伤和炎症因子等生物活性分子的释放,刺激血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）过度增殖、迁移以及表型转换相关的血管重塑过程,最终促进动脉壁硬化和粥样斑块形成。目前,以降脂药物为基础的主流疗法虽然起到了延缓病情的效果,但并未完全阻止AS的病变进展,提示既往机制研究存在局限性。AS作为受“环境-遗传”交互作用高度影响的疾病,从表观遗传学入手探究AS相关的病理机制将会成为对经典遗传学的重要补充。非编码RNA（noncodingRNA,ncRNA）是一类重要的表观遗传调控分子,其中研究最多的微小RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码RNA（long noncodingRNA,lncRNA）已被证明与AS发病的关系密切。近年兴起的环状RNA（circularRNA,circRNA）研究发现该分子具有独特的分子特点和广泛的生物学功能,其与心血管系统发育和疾病的关系也逐渐成为研究热点。因此,我们力图寻找AS疾病相关的circRNA,并对病理机制进行深入探讨,旨在扩展当前对circRNA作用分子机制的有限认识,同时为实现有效抑制AS发生发展的目标提供新的线索。第一部分环状RNA circEsyt2调控血管重塑在动脉粥样硬化中的作用及机制研究方法:1.环状RNA circEsyt2的鉴定及在AS中的生物学作用研究1.1高脂饮食喂养Apo E敲除（Apo E-/-）小鼠建立AS动物模型,对主动脉斑块组织进行高通量测序及circRNA表达谱分析,筛选出10个显着高表达的候选circRNA。通过qRT-PCR实验进行组织表达验证,锁定AS斑块中上调幅度最大的circRNA为目标分子继续后续研究,并根据其宿主基因命名为circEsyt2。1.2评估circEsyt2的分子特性,检测核酸酶RNase R消化和放线菌素D转录抑制处理对circEsyt2以及线性RNA（GAPDH,Esyt2）表达量的影响,比较环状和线性RNA分子结构稳定性的差异。检测circEsyt2在小鼠全身主要脏器中的分布情况,以及通过核质分离和荧光原位杂交（FISH）实验观察circEsyt2在小鼠VSMC中的亚细胞定位。评估小鼠和人属circEsyt2的序列相似程度,进行物种间保守性分析。1.3 FISH实验结合免疫荧光染色（IF）分析circEsyt2在血管壁中的细胞定位,以及检测circEsyt2在AS动物（小鼠主动脉）和临床血管样本（人冠状动脉）中的表达,比较其在正常（或轻度CAD）与AS（或重度CAD）样本间的表达差异,明确circEsyt2在发挥AS相关的生物学作用中可能涉及到的血管组成细胞类型。1.4通过qRT-PCR实验检测circEsyt2在C57BL/6J小鼠颈动脉线损伤模型中的表达变化,并利用FISH实验在血管平滑肌谱系示踪小鼠损伤颈动脉中进行验证,评估circEsyt2与损伤后血管重塑的关系。1.5分别构建特异敲降和过表达circEsyt2的AAV2/8腺相关病毒,在C57BL/6J小鼠颈动脉线损伤模型中进行转染,在经qRT-PCR和FISH-IF实验证明干预手段的有效性和特异性的基础上,通过苏木素-伊红（HE）染色观察损伤处颈动脉内膜新生的情况,以及细胞增殖指标Ki-67染色检测细胞增殖改变,利用免疫印迹实验（Western blot）和IF实验定量血管平滑肌表型转换标志物的表达变化。1.6细胞层面上采用siRNA特异性沉默circEsyt2表达,观察人主动脉平滑肌细胞（HASMC）和小鼠VSMC增殖（CCK-8、Ed U掺入实验）、迁移（划痕和细胞小室实验）、凋亡（细胞流式实验）以及表型转换标志物（α-SMA、Calponin、Myh11）表达的改变（Western blot）,明确circEsyt2对VSMC生物学行为的调控作用。2.CircEsyt2直接结合PCBP1蛋白并调控其在胞质胞核内分布的关系研究2.1利用生物信息学工具cat RAPID基于circEsyt2核酸序列预测结合蛋白,选择综合评分最高的蛋白即多聚胞嘧啶结合蛋白1（PCBP1）进行后续研究。2.2为证明circEsyt2与PCBP1的直接结合,我们采用生物素标记的circEsyt2探针在细胞水平上捕获实际结合蛋白（RNA pulldown实验）,经Western blot实验和蛋白质谱分析发现结合蛋白中含有PCBP1。通过RNA-蛋白质免疫共沉淀（RIP）实验用PCBP1特异性抗体反向捕获结合RNA,经qRT-PCR检测捕获下的RNA中存在circEsyt2。沉默circEsyt2后再次检测与PCBP1结合的circEsyt2量的变化,以说明两者结合具有特异性。利用FISH-IF实验观察circEsyt2与PCBP1在VSMC中的共定位.2.3通过IF实验分别在细胞以及损伤后颈动脉上敲降circEsyt2后观察PCBP1在胞内分布的改变,Western Blot检测PCBP1在胞质/胞核内表达量的变化。3.CircEsyt2通过影响p53β的生成调控VSMC增殖的机制研究3.1通过对circEsyt2沉默后的VSMC进行转录组高通量测序和基因表达谱分析,以及细胞实验验证,鉴定出受circEsyt2调控的细胞增殖相关的差异表达靶基因-PUMA和NOXA,因均属于p53信号通路,故提示circEsyt2对p53通路的调控作用。3.2通过qRT-PCR、Western blot实验检测沉默circEsyt2对p53总蛋白、乙酰化（赖氨酸382位点）水平以及可变剪接的影响,发现circEsyt2不影响p53基因转录、翻译和乙酰化修饰,但可调控p53剪接异构体p53β的生成。3.3细胞水平上观察干预p53β表达后circEsyt2对VSMC增殖调控的影响,目前p53β发挥的关键作用。4.CircEsyt2-PCBP1相互作用在剪接体p53β生成过程中的机制研究4.1利用生物信息学工具cat RAPID评估PCBP1与p53前体RNA（pre-mRNA p53）的结合可能性,通过RIP、FISH-IF实验在细胞上验证。4.2在已知PCBP1可招募剪接小体辅助因子U2AF65到前体RNA上促进基因剪接的基础上,单独或同时干预circEsyt2、PCBP1表达,RIP实验检测与U2AF65结合的pre-mRNA p53量的变化,明确circEsyt2对p53基因的可变剪接有调控作用,该作用的发挥依赖于PCBP1。4.3 RIP实验检测沉默circEsyt2后与PCBP1结合的与pre-mRNA p53量的改变,进一步明确circEsyt2与PCBP1的相互作用对p53基因可变剪接的影响。4.4通过qRT-PCR、Western blot实验检测干预PCBP1表达后circEsyt2对p53β生成调控的影响,证明PCBP1是介导circEsyt2发挥调控作用的关键调控因素。结果:1.经circRNA表达谱分析以及组织验证,我们发现并鉴定了一个在小鼠主动脉斑块组织中表达显着升高的circRNA,并根据宿主基因将其命名为circEsyt2。2.与线性转录本（GAPDH,Esyt2）相比,circEsyt2可抵抗核酸外切酶RNase R的消化作用,放线菌素D抑制细胞内基因转录后能长时间维持表达不被降解,表现出环状结构的高度稳定性。CircEsyt2在小鼠全身主要脏器中均有表达,在心血管系统的主动脉中表达相对较高。亚细胞层面上,circEsyt2大部分布于VSMC胞质。序列比对后发现小鼠与人源circEsyt2具有高度相似性。3.CircEsyt2在血管主要组成细胞（平滑肌、内皮、外膜成纤维和巨噬细胞）中均有分布,但其表达在小鼠主动脉粥样斑块和严重CAD病人的冠状动脉组织中显着上调,并且在小鼠颈动脉线损伤后的血管重塑过程中明显增加,以上变化主要体现在VSMC内。4.敲降血管中的circEsyt2后小鼠颈动脉线损伤处的内膜新生受到抑制,代表细胞增殖的Ki-67阳性率明显降低,而血管平滑肌表型标志物（α-SMA、Myh11）的表达上调。相反,过表达circEsyt2可促进颈动脉损伤处的内膜新生,细胞Ki-67阳性率升高,而表型转换标志物表达下调。细胞水平上沉默circEsyt2后,VSMC增殖、迁移能力减弱,凋亡增加,表型转换标志物表达增多。5.结合生物信息学预测和RNA pulldown、蛋白质谱和RIP等实验,我们证明circEsyt2可与PCBP1蛋白直接相互结合。6.沉默细胞或颈动脉内circEsyt2的表达后,胞质内的PCBP1表达量减少,而胞核内的表达增加。说明circEsyt2在胞质中与PCBP1蛋白直接结合并阻碍其核转位,可作为“分子开关“调控PCBP1在胞质胞核中的分布。7.沉默circEsyt2可促进p53发生可变剪接生成p53β,从而激活p53通路中的细胞增殖相关调控基因而抑制VSMC增殖。8.PCBP1可与pre-mRNA p53直接结合,通过促进U2AF65结合到pre-mRNA p53上从而提升剪接活性而正向调控p53基因可变剪接生成p53β。9.干预PCBP1可影响circEsyt2对p53β生成的调控作用。细胞质内circEsyt2-PCBP1的相互作用影响了PCBP1的入核,并最终导致p53β的生成改变。结论:1.CircEsyt2是AS中一重要的致病分子。2.CircEsyt2通过影响VSMC的增殖、迁移、表型转换过程从而参与血管重塑的调控。3.CircEsyt2通过调控p53基因剪接异构体p53β的生成而影响VSMC的增殖。4.PCBP1与pre-mRNA p53直接结合并促进p53基因可变剪接生成p53β。5.CircEsyt2-PCBP1在胞质内的相互结合影响了PCBP1入核发挥促剪接作用。心肌梗死（myocardial infarction,MI）是主要由动脉粥样硬化引起的严重并发症之一,具有较高的院内和院外死亡率。而MI后心肌细胞的进行性丢失是导致心功能恶化和终末性心衰的基础病理表现。因此,如何减轻MI后心肌细胞损伤是防治MI后心衰的关键。心肌细胞上存在多种G蛋白偶联受体（GPCR）,例如β1肾上腺素能和脂联素受体。它们在生理状态下介导了正常心功能的维持和调节,但在MI后因过度磷酸化而失敏从而产生促心肌细胞凋亡的作用。GPCR的磷酸化水平在通常情况下受到G蛋白偶联受体激酶（GRK）的调控,但在MI后被其过度磷酸化。在7个GRK亚型中,GRK4与高血压的发病关系密切,其表达或活性升高均可通过GPCR损害肾脏正常的尿钠排泄功能。另外,人群研究结果提示,与野生型相比,带有活性增强突变体（A142V、A486V和R65L）的个体表现出显着升高的3年内全因死亡、MI和卒中风险。故我们将对GRK4可能参与的MI后心肌损伤作用进行深入阐释和研究,以及对GRK4与引起心肌梗死的重要危险因素—高血压日夜节律间的关系进行初步探讨。第二部分G蛋白偶联受体激酶4在心肌梗死中的作用和关联研究方法:1.在C57BL/6J小鼠上建立MI模型,通过qRT-PCR和Western blot实验检测GRK4在心肌内的表达水平变化。2.通过免疫荧光染色检测MI后上调的GRK4在小鼠心肌细胞内的定位。3.构建心肌特异性GRK4敲除小鼠并进行MI手术,4周后用Masson染色检测心脏梗死后面积,明确GRK4在MI中的作用。4.通过M型心脏超声检测MI后心肌特异性GRK4敲除小鼠的左室射血分数（LVEF）,确定GRK4对MI后心功能的影响。5.通过PCR结合外显子测序检测GRK4各活性增强突变体（A142V、A486V和R65L）在杓型和非杓型高血压患者中的分布。结果:1.GRK4在小鼠MI后的心脏组织内表达明显升高。2.MI后心肌细胞内上调的GRK4主要集中在细胞核内。3.心脏特异性敲除GRK4可缩小MI后心肌的梗死面积。4.心脏特异性敲除GRK4可改善MI后的心功能。5.在非杓型高血压患者中,GRK4活性增强突变体的携带率高达84%,各突变体与非杓型高血压间均具有正相关性。结论:1.GRK4在MI中具有致心肌损伤作用,抑制GRK4可减轻MI后的心肌损伤。2.GRK4可能通过影响核内的基因转录过程从而发挥病理学作用。3.GRK4活性突变增强体可能促进非杓型高血压的发病。大量动物实验及流行病学调查研究表明,在遗传和环境因素之外,处于胚胎发育关键期的不良子宫内环境可对子代的长期健康产生不利影响,包括增加子代成年后罹患高血压的概率。现有研究表明,暴露在孕期母代糖尿病环境下会导致胚胎编程改变,产生子代血管功能障碍并导致高血压的发生。因此,关注子宫内高血糖环境暴露对子代长期健康的影响及危害具有重要的意义。然而,由母代糖尿病/高血糖编程导致的子代高血压发病机制目前尚未完全清楚。既往大量的实验结果表明,内质网应激（endoplasmic reticulum stress）是导致高血压发病的一个重要的病理生理机制。内质网在蛋白质合成、折叠以及运输中发挥了基础而关键的作用,同时也被认为是细胞应激的初始感受器。内质网稳态和功能的损害将诱发内质网应激,导致"未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）"这一复制信号通路的激活以企图恢复内质网的稳态。然而,该通路的长期激活将干扰细胞的正常功能并导致慢性疾病如高血压的发病。另有证据表明,高血压中内质网应激也参与了血管内皮细胞功能障碍的发生,而抑制内质网应激可提升一氧化氮的生物利用度,进而改善血管内皮细胞依赖的血管舒张功能。因此,我们将对内质网应激引起的血管内皮功能障碍在母代糖尿病导致的子代高血压发病中的作用进行研究和阐释。第三部分内质网应激在孕期糖尿病所致的子代成年后高血压发病中的作用研究方法:1.腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）制备糖尿病孕期大鼠模型,检测母代大鼠血糖、胰岛素浓度以及评估平均动脉压、体重变化和同胎子代数与对照组的差异。2.检测糖尿病及对照母代鼠的成年子代大鼠的体重、血压、心率、空腹血糖浓度。3.在孕期糖尿病及对照母代鼠的成年子代大鼠中进行腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠盐（4-PBA）或牛磺熊去氧胆酸（Tudca）,监测子代成年大鼠血压的变化情况。结果:1.STZ处理后孕期大鼠血糖浓度明显升高,血胰岛素浓度降低,而孕期时间、平均动脉压、体重增加和同胎子代数与对照组相比无明显差异。2.与对照母代大鼠的子代成年大鼠相比,孕期糖尿病母代大鼠的子代成年鼠体重、收缩压更高,而心率、空腹血糖水平无显着差异。3.使用内质网应激抑制剂处理孕期糖尿病母代大鼠的子代成年大鼠可抑制其血压升高,而对对照组母代大鼠的子代成年大鼠血压无明显影响。结论:1.孕期糖尿病大鼠的子代成年鼠更容易患有高血压。2.抑制内质网应激有助于改善孕期糖尿病大鼠子代成年鼠的血压。
高海霞[6]（2021）在《弥漫大B细胞淋巴瘤信号通路相关microRNA和蛋白质的筛选及功能研究》文中提出目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是成人最常见的B细胞淋巴瘤,经R-CHOP标准化疗后仍有30-40%的患者治疗欠佳短期内复发耐药甚至死亡,因此寻找新的药物靶点是提高DLBCL患者生存的迫切需要。本研究拟在微小RNA（microRNA,miRNA）、mRNA、蛋白质水平筛选和验证与DLBCL发生发展相关的可能关键因子及信号通路,并对重要信号通路相关的关键因子在细胞水平进一步进行功能研究,初步阐明人类种属（Homo sapiens,hsa）-miR-193a-3p靶向TCL1调控PI3K/AKT信号通路影响DLBCL细胞增殖、凋亡和周期的作用机制,为深入理解DLBCL的发生发展和提供新的治疗靶点奠定理论基础。方法:1)本研究选择新鲜冰冻人DLBCL组织为实验组、人淋巴结反应性增生（lymph node reactive hyperplasia,LRH）为对照组,应用miRNA表达谱芯片筛选差异mi RNA;对差异miRNA进行生物信息学分析,阐明差异mi RNA的靶基因及其生物学功能和富集的信号通路;对重要信号通路相关差异miRNA应用q RT-PCR验证其表达;2)本研究同样选择新鲜冰冻人DLBCL组织为实验组、人LRH为对照组,应用蛋白质组学筛选差异蛋白质;对差异蛋白质进行生物信息学分析,阐明其生物学功能和富集的信号通路;对重要信号通路相关差异蛋白质应用平行反应监测（Parallel reaction monitoring,PRM）和免疫组化验证其蛋白表达,并分析其蛋白表达与DLBCL患者临床病理特征和预后的相关性;将mi RNA芯片和蛋白质组学研究结果进行交叉分析,确定在细胞水平进行hsa-miR-193a-3p靶向TCL1调控PI3K/AKT信号通路影响DLBCL细胞增殖、凋亡和周期的机制研究;3)应用双荧光素酶报告基因检测hsa-mi R-193a-3p与TCL1的互作关系;选择人DLBCL细胞为实验组、正常人外周血B淋巴细胞为对照组,应用qRT-PCR检测hsa-mi R-193a-3p和TCL1的基因表达,并筛选后续实验DLBCL细胞株;将hsa-miR-193a-3p类似物（mimic）和抑制剂（inhibitor）、si RNA-TCL1、siRNA-TCL1+hsa-miR-193a-3p inhibitor分别转染DLBCL细胞,设立相应的阴性和空白对照,应用CCK8和流式观察DLBCL细胞增殖、凋亡和周期;并应用q RT-PCR和Western-blot检测DLBCL细胞中TCL1、PI3K/AKT信号通路重要调控因子AKT和磷酸化的AKT,细胞凋亡因子BCL-2和BAX的基因和蛋白表达。结果:1)本研究筛选出204个差异miRNA,54个上调,150个下调;差异miRNA预测到7522个靶基因;差异miRNA的靶基因主要富集在Pathway in cancers、MAPK、Focal adhesion、PI3K/AKT等信号通路;qRT-PCR验证PI3K/AKT信号通路相关差异miRNA发现在DLBCL中hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-490-5p的表达降低,hsa-miR-630的表达升高;2)本研究筛选出335个差异蛋白质,131个上调,204个下调;差异蛋白质主要富集在Pathway in cancers、PI3K/AKT、Alcoholism、Necroptosis等信号通路;PRM和免疫组化验证PI3K/AKT信号通路相关差异蛋白质发现在DLBCL中TCL1、HSP90、AKT、IKKβ的蛋白表达水平升高;生存分析发现TCL1蛋白高阳性表达是DLBCL患者短的总生存期和无进展生存期的独立影响因素;3)细胞水平证实TCL1是hsa-miR-193a-3p的靶基因;在DLBCL细胞中hsa-mi R-193a-3p的表达降低,而TCL1 mRNA的表达升高;hsa-miR-193a-3p在DLBCL中是一个肿瘤抑制因子,hsa-miR-193a-3p mimic使DLBCL中hsa-miR-193a-3p表达升高,其高表达使DLBCL细胞增殖降低,凋亡增加,细胞周期被阻滞在S期,DNA合成受阻,细胞在S期与后续G2/M、G0/G1期之间的转换被调控;hsa-miR-193a-3p inhibitor使DLBCL中hsa-miR-193a-3p表达降低,其低表达使DLBCL细胞增殖升高,凋亡降低,并可逆转mimic对细胞周期的调控作用;TCL1在DLBCL中是一个癌基因,TCL1-siRNA在DLBCL中可沉默TCL1的表达,沉默TCL1表达可抑制DLBCL细胞增殖、促进凋亡、细胞周期被阻滞在S期、并可抑制PI3K/AKT信号通路激活,但加入hsa-miR-193a-3p inhibitor能逆转siRNA-TCL1对PI3K/AKT信号通路的抑制效应。结论:应用miRNA表达谱芯片筛选出204个差异miRNA,54个上调,150个下调;应用蛋白质组学筛选出335个差异蛋白质,131个上调,204个下调;对已筛选重要信号通路即PI3K/AKT信号通路相关因子验证发现在DLBCL中hsa-miR-193a-3p的表达降低,TCL1的蛋白表达升高并且生存分析发现TCL1蛋白高阳性表达是DLBCL患者短的总生存期和无进展生存期的独立影响因素;hsa-miR-193a-3p通过靶基因TCL1实现对DLBCL细胞增殖、凋亡、周期等生物学行为的调控,hsa-miR-193a-3p inhibitor能逆转siRNA-TCL1对PI3K/AKT信号通路的抑制效应,进而影响DLBCL发生和进展。
张颖一[7]（2020）在《胃癌中差异表达mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定分析及核心circRNA circFOXO3的功能与作用》文中研究表明目的:胃癌（gastric cancer）是一种常见的恶性肿瘤,因起病隐匿,预后较差,严重威胁人类健康。因此,早期诊断极为重要,但临床尚缺乏该病特异性的生物标记。现有的大量研究显示非编码RNA（ncRNA）在人类癌症的发生和发展中起着至关重要的作用,其中lncRNA和circRNA与m RNA通过形成复杂的竞争性内源性RNA（ce RNA）调控网络参与疾病进程。值得注意的是,目前在胃癌中仍然缺乏对lncRNA、m RNA和circRNA的系统鉴定,并且它们在胃癌中构成的复杂调控网络尚未揭示。因此,本课题旨在探索胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,揭露其转录物之间的复杂相互作用,试图为后续胃癌的临床诊断提供理论依据。circRNA由于序列及结构不同于其他ncRNA,从而表现出特有的生物学活性,在许多肿瘤的发生发展中起到关键作用。circ FOXO3是circRNA家族核心成员,已有文献报道显示circ FOXO3通过发挥原癌基因的作用参与了前列腺和脑胶质瘤的发生发展,而其在胃癌中的功能未见报道。本课题拟探究circ FOXO3对于胃癌细胞增殖、周期、转移、侵袭和成瘤的影响以及是否参与胃癌的免疫应答和代谢进程,分析下游靶基因与预后的关系,探索胃癌全新的生物靶标。方法:本课题选用微阵列分析筛选了胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,在11个配对胃癌样本中用q RT-PCR验证了随机选择的6个上调基因的表达,并用STRING系统构建了差异表达的m RNA介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络、lncRNA介导的顺式调节网络以及circRNA介导的ce RNA网络。另外,使用公共数据库Kaplan-Meier Plotter评估差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,判断其在胃癌中的预后价值。之后采用CCK-8、流式细胞仪、transwell等实验方法检测circFOXO3敲低之后胃癌细胞的增殖,转移和侵袭的变化,并观察其对动物体内成瘤的影响。最后,使用RNA-sequencing技术检测敲低circ FOXO3之后的胃癌细胞中m RNA的表达变化差异,在STRING系统分别构建敲低circ FOXO3后上下调的基因介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络,利用GEPIA数据库探究20个circ FOXO3下游核心基因在胃癌中的表达情况,并使用公共数据库Kaplan-Meier Plotter评估circ FOXO3核心下游基因在胃癌中的预后价值。结果:本课题发现922个m RNA、2112个lncRNA和2896个circRNA在胃癌组织中差异表达,并观察到lncRNA lnc-GLI3-4:1、LMF1、OLFM4、HKDCC1、hsa＿circ＿0058819、hsa＿circ＿0058830在胃癌中的表达相较癌旁组织显着升高。生信分析显示胃癌中差异表达的m RNAs参与调控丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;醛固酮调节钠的重吸收;氨基糖和核苷酸糖代谢;柠檬酸盐循环（TCA循环）;BMP绑定;醛脱氢酶（NAD）活性;胺结合;支链氨基酸分解代谢过程;静脉血管发育。本课题总共鉴定出230个lncRNA-m RNA调节对,KEGG信号通路预测结果显示这些lncRNA参与调控的信号通路包括:粘附连接、醛固酮调节钠的重吸收、轴突指导、B细胞受体信号通路、ARF蛋白信号转导、G蛋白偶联谷氨酸受体结合及L-α-氨基酸跨膜转运。所构建circRNA介导的ce RNA网络共包括34个上调的circRNA,33个下调的circRNA,170个上调的m RNA,153个下调的m RNA和42个mi RNA,生物信息学分析表明这些差异表达的基因与调节支链氨基酸分解代谢过程,糖酵解/糖异生和ARF蛋白信号转导显着相关。通过对已知数据库的分析,Kaplan-Meier生存曲线显示,胃癌患者m RNA中高表达的GPER、COL8A1、GLT25D1、EPOR、ENG、SLC5A5、OMP、NDE1和REM1与较短的总生存时间显着相关;lncRNA中则是高表达的NR＿073084、ENST00000565689、LOXL1-AS1、NR＿110232、ENST00000472494（HOTTIP）和ENST00000469148（PTPRG-AS1）与较短的总生存时间显着相关,其均具有评估预后的价值。本课题发现circ FOXO3在胃癌组织中表达水平显着高于癌旁组织,敲低其能够显着抑制AGS以及N87细胞的增殖、转移和侵袭能力,阻滞细胞周期的进程,并显着抑制动物体内瘤体的增长,故其可能在胃癌中发挥着原癌基因的效应。利用RNA-sequencing技术检测敲低circ FOXO3前后胃癌细胞中m RNA的表达变化,总共得到5104个差异基因。其中2378个基因的表达水平在敲低后显着上调,2726个基因的表达水平在敲低后显着下调。生物信息学预测显示circ FOXO3敲低后上调表达的基因主要富集在防御反应、固有免疫应答、免疫反应、病毒防御反应、免疫效应过程中。circ FOXO3敲低后下调表达基因广泛参与到代谢、翻译、有机物生物合成、生物合成、细胞周期等生物进程。本课题所构建的敲低circ FOXO3后上下调基因介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络揭露了三个上调表达/三个下调表达的核心PPI网络,其内20个circ FOXO3下游核心基因中,CDK1、MYC、BRCA1、MCM3、RFC4、MX1、ISG15、OAS1、STAT1、DDX58、IFI35、RSAD2、B2M、DDX60、IFI27在胃癌中显着高表达。有趣的是,高表达的BRCA1、IFI35、MCM3、DDX60与胃癌患者较长的总体生存时间呈现明显相关性,而高表达的MX1、ISG15、DDX58、IFI27、RPS28、RPS20则与较短总生存显着相关。结论:本课题对胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA进行了综合分析,首次构建了复杂的调控网络以揭示这些RNA之间的相互作用,发现某些核心m RNA和lncRNA的失调与胃癌患者的总生存时间有关,为深入理解胃癌进展的机制以及探索胃癌的潜在治疗和预后靶标提供了有用的信息。通过对调控网络中处于核心地位的环状RNA circ FOXO3的进一步研究,证明了其在胃癌组织中显着高表达,而敲低circ FOXO3则能够显着降低胃癌细胞的增殖、周期、转移、侵袭进程和体内成瘤能力,且得知其可能参与肿瘤的免疫应答和代谢进程相关的信号通路调控,并发现数个circ FOXO3核心下游基因在胃癌中显着高表达且与患者的生存时间显着关联。首次,我们阐明了circ FOXO3在胃癌中的原癌效应,为寻找胃癌全新的生物靶标提供了思路。
曹韪凡[8]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中认为近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
马丽[9]（2020）在《基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究》文中认为慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）是世界范围内的重要公共卫生问题,中医药对CHB的防治已显示其独特优势,进一步提高中医药防治能力,深入阐述CHB的证候生物学基础,似为其主要一环。四川地区CHB常见的中医证候为脾胃湿热证与肝郁脾虚证,课题组前期从mi RNA对上述两证候的生物学基础进行了初步研究。有文献表明DNA甲基化参与CHB的发生发展,且DNA甲基化与中医证候的形成在理论上似有契合之处,此或许能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证生物学基础的研究提供新的思路。目的:本研究基于前期相关mi RNA研究,多维度综合观察CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化水平的差异表达,探讨上述两证候的生物学基础是否是通过DNA甲基化与mi RNA相互调控,影响表观遗传,进而调节基因表达,形成不同的证候,以期初步证实DNA甲基化的差异表达是否为CHB证候差异的主要表观遗传机制之一,为上述两种CHB中医证候的客观化与规范化提供部分实证依据。方法:1.招募CHB脾胃湿热证（Spleen-stomach damp heat syndrome,SSDHS）患者7例SSDHS组),肝郁脾虚证（Liver depression and spleen deficiency syndrome,LDSDS）患者7例（LDSDS组）和健康志愿者6例（健康对照组（Healthy control,HC））。2.采集所有受试者清晨空腹、无菌环境下外周静脉血,检测各组间肝功能相关指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量。3.用ELISA法检测各组间DNA甲基化相关蛋白DNMT1、Me CP2的表达水平及HBV相关蛋白P53、E-cad、P16的表达水平。4.及时分离外周静脉血血清,提取DNA,用Illumina Bead Array TM Infinium850K甲基化芯片检测各组间DNA甲基化差异表达的情况,对差异甲基化位点相关基因进行GO功能富集和KEGG pathway富集分析。5.利用Target Scan7.2与miRDB数据库对不同中医证候中部分相同mi RNAs靶基因进行预测,采用Cytoscape3.6软件构建DNA甲基化基因与mi RNAs预测靶基因共表达网络图。结果:1.SSDHS、LDSDS组分别与HC组相比,在DNMT1、p16表达水平、性别、年龄、病程、生化指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量检测结果方面均无显着性差异（P>0.05）;E-cad表达水平均有显着性差异（P<0.05）,Me CP2、P53表达水平在SSDHS组中无显着性差异（P>0.05）,在LDSDS组中有显着性差异（P<0.05）。2.Illumina Bead Array TM Infinium 850K甲基化芯片检测结果显示CHB患者组与HC组有7868个显着差异甲基化位点,其中高甲基化位点2310个,低甲基化位点5558个;经过筛选高甲基化差异程度最高的位点为cg03278611位于基因NLGN4Y,低甲基化差异程度最高的位点为cg03670113位于基因TAZ;差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、脂肪颗粒、各种酶等;KEGG pathway主要富集在类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等。3.SSDHS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg21898358位于基因LILRA3,低甲基化差异程度最高的位点为cg09323788位于基因CHTF18,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在T细胞共刺激、Rho蛋白信号转导、Rho GTPases相关的功能等;KEGG pathway主要富集在ABC转运蛋白、AMPK信号通路及肿瘤相关通路;LDSDS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg09857096位于基因BMPR1B,低甲基化差异程度最高的位点为cg09972436位于基因LCE3C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在树突棘、丝氨酸/苏氨酸激酶、Rac GTPase等;KEGG pathway主要富集在苯丙氨酸代谢、氮代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢通路;SSDHS组与LDSDS组间最显着的高甲基化位点为cg10765459位于基因COL6A2,最显着的低甲基化位点为cg07445365位于基因STK32C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在肌动蛋白相关细胞及组织,KEGG pathway主要富集在Erb B信号通路及代谢通路等。4.SSDHS、LDSDS组差异甲基化位点相关基因分别与mi R-122-5p、mi R-1228-3p、mi R-191-3p预测靶基因进行对比分析:两证候差异甲基化位点相关基因与mi R-122-5p预测靶基因均有6个基因重合,其中SSDHS组独有基因为RIMS1,LDSDS组独有基因为SLC41A1;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有21个基因重合,该组独有基因为OTUB、AMPH、SEMA3C、ZC3H12B、PCGF3、JAKMIP3,LDSDS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有17个基因重合,该组独有基因为ARID1B、NUDT7;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-191-3p预测靶基因有2个基因重合,该组独有基因为MPP7、LDSDS组差异甲基化基因与mi R-191-3p预测靶基因有3个基因重合,该组独有基因为SPTB2、CCNY。结论:1.Me CP2、P53可能通过影响DNA甲基化修饰参与CHB肝郁脾虚证的形成;E-cad可能是CHB脾胃湿热证或肝郁脾虚证形成的物质基础之一。2.CHB患者存在DNA甲基化的差异表达,具体机制可能与NLGN4Y、TAZ等基因的甲基化及蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等有关。3.CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证均存在DNA甲基化的差异表达,同时分别具有各自特有的DNA甲基化谱。LILRA3、CHTF18等基因的甲基化及T细胞共刺激诱导肝脏炎症等,可能是CHB脾胃湿热证的分子生物学基础;BMPR1B、LCE3C等基因的甲基化及树突棘的改变和物质代谢异常等,可能是CHB肝郁脾虚证的分子生物学基础,提示DNA甲基化可能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证差异的表观遗传机制之一。4.不同证候出现部分相同mi RNA的原因可能与其影响不同靶基因甲基化水平的差异性有关,具体调控机制尚需进一步研究证实。
陈胤[10]（2020）在《TMUB1上调STAT1表达抑制肝癌细胞增殖的研究》文中研究说明背景肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤,HCC的治疗方法多种多样,如手术切除、肝移植、放化疗、射频消融、分子靶向治疗等。然而,HCC的5年生存率仍低于12%。全球每年报告的HCC新增病例约为748,300例,死亡病例约为695,900例,其中一半在中国。我国是肝病大国,近年来,HCC的发病率及死亡率呈上升趋势。HCC的高发病率和高死亡率使其防治研究在世界范围内得到广泛开展。HCC的发生、发展机制仍不明确,寻找有效的治疗方法仍十分困难。因此,对肝癌发生、发展的分子机制的研究仍然是目前HCC研究的重点。TMUB1（Transmembrane and ubiquitin-like domain-containing protein 1）最早于2005年报道,其在肝切除后剩余肝细胞中表达明显升高。TMUB1基因位于大鼠的4号染色体4q11位置（人类位于7号染色体）,全长1381bp。TMUB1蛋白全长245个氨基酸,它包括一个位于氨基端的出核信号区（nuclear export signal,NES）,和1个包含类似泛素结构的区域（UBL;121-175aa）。TMUB1是一种跨膜蛋白,N端有一个跨膜结构域,C端有2两个跨膜结构域。在膜上,TMUB1作为泛素类蛋白参与内质网相关蛋白降解（Endoplasmic reticulum-associated protein degradation,ERAD）途径而发挥作用。作为细胞核-细胞质穿梭蛋白,TMUB1从膜上释放出来,在细胞核-细胞质中穿梭而发挥起生物学功能。早期的研究显示TMUB1能显着抑制正常肝细胞增殖。IL-6以及miRNA-27a/b可以调节TMUB1表达以及转录后修饰,TMUB1可以通过抑制STAT3磷酸化以及干扰CAML与cyclophilin B结合,从而抑制肝细胞增殖。同时,TMUB1可以作为重要的调节因子,参与p14Arf-p53途径,促进损伤DNA修复,抑制肿瘤的发生,研究发现TMUB1能保持p14Arf稳定性以及促进p14Arf向细胞核内转运。但是TMUB1在HCC的中作用尚不清楚。STAT3和STAT1都是JAK/STAT通路的重要成员,并且二者在分子结构、作用机制上有很多相似之处,并且在很多生物学功能上互相拮抗,其可能的作用机制包括:1)互相之间的表达抑制;2)磷酸化竞争,影响下游基因的表达;3)互相干扰功能性二聚体形成。既往研究发现TMUB1对STAT3功能有调节作,因此我们推断TMUB1可能通过调节STAT1功能进而对HCC生物学特性产生作用。方法1.经过我院伦理委员会批准,我们收集了2013年1月～2014年12月于我科行肝部分切除手术的肝细胞肝癌患者的石蜡标本以及病历资料,并通过查阅门诊病历、住院病历、电话随访等方式对术后病人进行随访至2019年1月,记录术后复发、死亡等信息。免疫组化检测HCC标本中TMUB1表达,并分析其与患者预后以及肿瘤病理特性的关系。2.免疫组化染色检测了肝癌组织标本中STAT1表达,统计分析其与TMUB1表达的相关性,以及TMUB1-STAT1共表达与HCC组织病理特性以及病人预后的关系。3.体外培养了Hep G2、Huh7、MHCC97h、LM3、SMMC-7721等肝癌细胞系以及正常肝细胞系LO2,Western-blot及qPCR检测不同细胞系中TMUB1的表达,然后选取了表达较高的Huh7细胞转染干扰质粒、表达较低的MHCC97h细胞转染过表达质粒,CCK-8检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力。4.转染干扰、增强质粒改变TMUB1表达,western-blot及qPRC检测了STAT1以及CCND1的表达。Huh7细胞同时转染TMUB1干扰质粒及STAT1过表达质粒,MHCC97细胞同时转染TMUB1过表达质粒及STAT1干扰质粒,Western-blot检测TMUB1、STAT1、CCND1表达,EdU检测细胞增殖能力。5.采用生物信息学方法,通过各种在线分析软件、数据库筛选TMUB1、STAT1相关的miRNA网络,以miRNA为桥节点,筛选mRNA、lnc RNA,构建TMUB1、TMUB1+STAT1 ceRNA调控网络,预测TMUB1在HCC中的其他调控机制以及TMUB1对STAT1可能的具体调控机制。结果1.TMUB1表达与HCC恶性程度负相关（大小、分化、TNM分期、肿瘤多发比率）,预后正相关。TMUB1高表达组肿瘤大小（5.2±2.2）（cm）明显小于TMUB1低表达组（6.8±4.0）（cm）（P<0.001）;TMUB1高表达组肿瘤多发比率（9.1%,n=12）明显低于TMUB1低表达组（14.1%,n=19）（P=0.011）;TMUB1高表达组肿瘤细胞分化程度明显优于低表达组（P=0.021）;肿瘤TNM分期,TMUB1高表达组III期（1.5%,n=2）、IV期（0.8%,n=1）所占比率明显低于低表达组III期（6.8%,n=9）、IV期（2.3%,n=3）（P=0.004）;TMUB1高表达组与低表达组在血管侵犯、淋巴结转移、肝外转移上没有明显差异;TMUB1高表达组无瘤生存期（1009±183天）明显长于低表达组（705±102天）（P=0.014）。TMUB1高表达组总生存期（1180±150天）明显长于低表达组（828±102天）。2.STAT1表达和TMUB1表达正相关,P<0.0001,pearson r=0.47。TMUB1highSTAT1high组肿瘤大小（4.7±2.0（cm））明显小于其他三组,TMUB1lowSTAT1low组（7.8±4.4（cm））、TMUB1highSTAT1low组（6.7±3.0（cm））、TMUB1LowSTAT1high组（5.3±2.7（cm））。TMUB1lowSTAT1low组肿瘤多发的比率（8.3%,n=11）明显高于其他三组TMUB1highSTAT1high（5.3%,n=7）,TMUB1highSTAT1low（3.0%,n=4）、TMUB1lowSTAT1high组（6.1%,n=8）。并且TMUB1highSTAT1high组在细胞分化、TNM分期上也优于其他三组。TMUB1highSTAT1high组HCC病人的总生存期明显长于其他三组（P=0.004）,而无瘤生存期无明显差异。3.TMUB1能抑制HCC细胞增殖,但对HCC细胞迁移、侵袭无明显影响。Huh7细胞转染干扰质粒后细胞增殖能力明显增强,但侵袭转移潜力无明显变化。MHCC97h细胞转染过表达质粒后细胞增殖能力明显受抑制,但侵袭转移潜力无明显变化。4.TMUB1可以促进STAT1表达,抑制CCND1表达。Huh7细胞转染TMUB1干扰质粒,STAT1表达下调,而CCND1表达上调。MHCC97h细胞转染TMUB1过表达质粒,STAT1表达上调,而CCND1表达下调。5.干扰TMUB1表达对Huh7细胞增殖能力的促进作用被STAT1过表达质粒阻断。TMUB1过表达质粒对MHCC97h细胞增殖能力的抑制作用被STAT1干扰质粒阻断。6.通过生物信息学分析,TMUB1 mRNA在HCC组中表达较正常肝组织有所升高,但其蛋白表达较正常肝组织明显减少,说明TMUB1的抑癌功能在转录水平并未受影响,而是在转录后调控中被抑制,使其翻译沉默,蛋白表达减少。我们筛选出了miR-615-3p、miR-423-5p、miR-222-3p、miR-92a-3p、miR-25-3p等在HCC中表达上调的miRNA,并基于此构建了TMUB1 mRNA可能的ce RNA网络。结论1.TMUB1与HCC恶性程度（大小、分化、TNM分期、肿瘤多发比率）负相关,与患者预后正相关。2.TMUB1可以抑制HCC细胞增殖,但对转移无明显影响。3.TMUB1通过促进STAT1表达抑制HCC细胞增殖。4.TMUB1可能由于miRNA的转录后抑制,导致其抑制增殖的作用在HCC中被沉默。
二、Gene expression profile favoring phenotypic reversion: a clue for mechanism of tumor suppression by NF-IL6 3'UTR（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Gene expression profile favoring phenotypic reversion: a clue for mechanism of tumor suppression by NF-IL6 3'UTR（论文提纲范文）
（1）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析（论文提纲范文）
| 本项研究受下列基金资助 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写与符号清单 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪睾丸发育过程及其表观遗传调控 |
| 1.1.1 公猪的性成熟 |
| 1.1.2 猪睾丸发育过程 |
| 1.1.3 间质细胞在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.1.4 睾丸发育与精子发生的表观遗传调控 |
| 1.2 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.1 环状RNA的生物起源、特性及功能 |
| 1.2.2 环状RNA的数据发掘、分析及研究方法 |
| 1.2.3 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.4 结论和展望 |
| 1.3 m6A修饰在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.3.1 m6A修饰概述 |
| 1.3.2 m6A修饰的检测 |
| 1.3.3 m6A修饰的生物学功能 |
| 1.3.4 哺乳动物精子发生过程中m6A修饰的动态调节 |
| 1.3.5 结论与展望 |
| 第二章 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学观察与分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 睾丸大小 |
| 2.2.2 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学特征 |
| 2.2.3 睾丸组织显微观察结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 石蜡切片及H&E染色 |
| 2.3.2 性成熟前后长白种公猪睾丸发育情况 |
| 2.3.3 性成熟前后长白种公猪睾丸组织结构观察 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 性成熟前后公猪睾丸文库构建及环状RNA的鉴定与基本特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 睾丸组织样本RNA提取及质检结果 |
| 3.2.2 RNA文库构建及高通量测序数据质量分析 |
| 3.2.3 环状RNA的鉴定 |
| 3.2.4 性成熟前后长白种公猪睾丸组织中环状RNA的基本特征 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 性成熟前后长白种公猪睾丸环状RNA的差异表达及生物信息学分析 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 性成熟前后公猪睾丸组织中显着差异表达环状RNA的鉴定与分析 |
| 4.2.2 性成熟前后公猪睾丸组织环状RNA测序结果的试验验证 |
| 4.2.3 差异环状RNA的GO分析 |
| 4.2.4 差异环状RNA的 KEGG信号通路富集分析 |
| 4.2.5 环状RNA靶miRNA预测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 性成熟前后长白种公猪睾丸转录组信使RNA甲基化图谱的建立 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 数据质控与序列统计 |
| 5.2.2 参考基因组比对 |
| 5.2.3 全基因组m6A Peak扫描分析 |
| 5.2.4 差异Peak分析 |
| 5.2.5 m6A Motif分析 |
| 5.2.6 RNA-seq基因/转录本差异结果分析 |
| 5.2.7 RNA-seq中差异基因GO富集分析 |
| 5.2.8 RNA-seq中差异基因KEGG富集分析 |
| 5.2.9 MeRIP-seq中差异m6A Peak GO富集分析 |
| 5.2.10 MeRIP-seq中差异m6A Peak KEGG富集分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）MiR-508-3p在肺动脉高压中的功能性表达和调节机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 创新性 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 科研论文Ⅰ |
| 科研论文Ⅱ |
（4）陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结直肠癌(CRC)简述 |
| 1.2 microRNAs与CRC关系 |
| 1.3 LncRNAs与CRC关系 |
| 1.4 结直肠癌的早筛 |
| 1.4.1 目前用于平均风险人群的CRC筛查主要包括以下方法 |
| 1.4.2 microRNAs可作为肿瘤的早期筛查指标 |
| 1.5 MIR17HG及其在结直肠癌中的作用 |
| 1.6 本课题的研究目标和意义 |
| 第二章 LncRNAs,miRNAs及GREM1基因多态性与中国陕西汉族结直肠癌风险的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 统计分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 参与者的基本特征 |
| 2.3.2 HWE检验结果 |
| 2.3.3 等位基因分布及与CRC风险的关系 |
| 2.3.4 遗传模型下SNPs与CRC风险的关系 |
| 2.3.5 SNPs与CRC风险相关分层分析 |
| 2.3.6 SNPs与CRC临床特征相关性 |
| 2.3.7 单倍型与CRC风险的关系 |
| 2.3.8 多个SNPs交互作用的MDR分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 MIR137HG和MIR577多态性与CRC的关系 |
| 2.4.2 MIR143HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.3 MIR3142HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.4 LINC-PINT多态性与CRC的关系 |
| 2.4.5 MIR124-1HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.6 MIR608多态性与CRC的关系 |
| 2.4.7 H19和MIR675多态性与CRC的关系 |
| 2.4.8 MIR192、MIR618和MIR492多态性与CRC的关系 |
| 2.4.9 MIR17HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.10 GREM1 多态性与CRC的关系 |
| 2.4.11 MIR497HG、MIR423和MIR133A1HG多态性与CRC的关系 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 MIR17HG及其编码的micro RNAs在结直肠癌中的表达及临床信息关联的生物信息学分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 研究方法 |
| 3.2.3 统计方法 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 MIR17HG的泛癌分析 |
| 3.3.2 MIR17HG在结直肠癌中的表达与临床预后分析 |
| 3.3.3 miR-17-92a簇在结直肠癌与癌旁正常组织中的表达及临床预后分析 |
| 3.3.4 miR-17-92a簇在结直肠癌病例与健康对照,病例不同分期中血清中的表达及预后分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 miR-17-92a簇在大多数肿瘤及CRC中高表达 |
| 3.4.2 miR-17-92a簇的microRNAs在大多数肿瘤及结直肠癌组织中高表达 |
| 3.4.3 miR-17-92a簇的microRNAs在CRC病例血清中高表达 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 miR-17-92簇在结直肠癌病例与健康人群血清中的表达分析及诊断作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.4 统计学方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 研究对象基本特征 |
| 4.3.2 病例组与对照组血清学指标 |
| 4.3.3 血清中microRNA的相对表达量 |
| 4.3.4 CEA、AFP、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-92a-1诊断结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.3.5 CEA、AFP、hsa-miR-18a-5p联合诊断结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.3.6 各指标与结直肠癌分期的相关性分析 |
| 4.3.7 hsa-miR-18a-5p、CEA对早期结直肠的诊断的ROC曲线 |
| 4.3.8 各指标区分早晚结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 糖蛋白癌胚抗原和甲胎蛋白 |
| 4.4.2 miR-17-92a簇作为血清肿瘤诊断标志物的应用 |
| 4.4.3 hsa-miR-18a-5p作为血清肿瘤诊断标志物的应用 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 hsa-miR-18a-5p对结直肠癌细胞生物学功能的影响及候选靶基因分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要仪器及试剂 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.2.4 统计方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 hsa-miR-18a-5p在结直肠癌细胞系中表达上调 |
| 5.3.2 结直肠癌细胞中hsa-miR-18a-5p干预效果 |
| 5.3.3 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 5.3.4 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 5.3.5 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞凋亡的影响 |
| 5.3.6 结直肠癌表达差异基因及功能注释 |
| 5.3.7 hsa-miR-18a-5p靶基因及其预后分析 |
| 5.3.8 关键靶基因分析 |
| 5.3.9 靶基因LIF与hsa-miR-18a-5p结合位点预测 |
| 5.3.10 Western Blot检测LIF与hsa-miR-18a-5p表达关系 |
| 5.3.11 LIF功能预测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 hsa-miR-18a-5p促进肿瘤发生发展 |
| 5.4.2 hsa-miR-18a-5p抑制肿瘤发生发展 |
| 5.4.3 在不同发育阶段和不同组织学亚型的同一器官的癌症中已观察到hsa-miR-18a的相反作用 |
| 5.4.4 hsa-miR-18a-5p抑制结直肠癌的发生发展 |
| 5.5 结论 |
| 结语和展望 |
| 参考文献 |
| 附录1:基因与泛癌的相关性 |
| 附录2:HCT116细胞鉴定证明 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间的科研成果 |
| 个人简历 |
（5）CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 第一部分 环状RNA circEsyt2调控血管平滑肌细胞重塑在动脉粥样硬化中的作用及机制研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 CircEsyt2 的鉴定以及调控血管重塑作用的研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料与实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二章 CircEsyt2 结合并调控PCBP1 核转位 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 CircEsyt2 调控p53 可变剪接生成p53β在 VSMC增殖中的机制研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 CircEsyt2-PCBP1 相互作用调控剪接异构体p53β生成的机制研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与实验方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第一部分 全文总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 G蛋白偶联受体激酶4 在心肌梗死引起的心肌细胞损伤中的作用和机制研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与实验方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论及结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 内质网应激在孕期糖尿病所致的子代成年后高血压发病中的作用研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 6.1 研究背景 |
| 6.2 材料与实验方法 |
| 6.3 统计学分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.5 讨论及结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述环状RNA在动脉粥样硬化及相关疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章与科研成果 |
| 致谢 |
（6）弥漫大B细胞淋巴瘤信号通路相关microRNA和蛋白质的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分: 弥漫大B细胞淋巴瘤差异microRNA的筛选及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分: 弥漫大B细胞淋巴瘤差异蛋白质的筛选及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分: hsa-miR-193a-3p靶向TCL1 调控PI3K/AKT信号通路影响弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖、凋亡和周期的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 TCL1 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（7）胃癌中差异表达mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定分析及核心circRNA circFOXO3的功能与作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胃癌中差异表达的mRNA、lncRNA和circRNA调控网络的构建及分析 |
| 一、实验方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 circFOXO3在胃癌增殖和转移进程中的功能 |
| 一、材料和试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（8）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（9）基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 文献研究一 慢性乙型肝炎中医证候客观化规范化研究概述 |
| 1 中医对CHB病名的认识 |
| 1.1 肝着 |
| 1.2 肝毒 |
| 1.3 胁痞 |
| 1.4 异湿 |
| 2 中医对CHB病因病机的认识 |
| 2.1 湿热疫毒是本病的始动因素 |
| 2.2 毒损肝络是本病的病机关键 |
| 2.3 正气之盛虚决定本病的转归及预后 |
| 2.4 发则有证可辨,伏则无机可循为本病的发病特点 |
| 3 CHB中医证候分型指南与标准 |
| 4 影响CHB中医证候分布的相关因素 |
| 4.1 不同地域的CHB证候分布具有差异性 |
| 4.2 体质类型与CHB证候分布具有相关性 |
| 4.3 情志及生存质量的改变是部分CHB证候分布的易感性因素 |
| 5 中医证候的客观化规范化研究 |
| 5.1 肝功能指标 |
| 5.2 肝组织病理分级分期 |
| 5.3 肝脏硬度及肝纤维化值 |
| 5.4 细胞因子及免疫蛋白 |
| 5.5 HBV基因型 |
| 5.6 基因组学 |
| 5.7 转录组学 |
| 5.8 蛋白组学 |
| 5.9 代谢组学 |
| 6 小结 |
| 文献研究二 DNA甲基化在中医证候的应用研究 |
| 1 DNA甲基化概述 |
| 2 DNA甲基化在CHB发病机制中的作用 |
| 2.1 DNA甲基化与HBV |
| 2.2 Cp G岛与HBV基因型 |
| 2.3 DNMTs与 HBV |
| 2.4 甲基化相关蛋白与CHB |
| 3 DNA甲基化在中医证候的应用 |
| 4 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化及HBV相关蛋白的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规检测方法 |
| 2.2 ELISA检测方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般资料收集结果 |
| 3.2 乙肝两对半定性检测结果 |
| 3.3 生化指标检测结果 |
| 3.4 HBV定性定量检测结果 |
| 3.5 DNA甲基化及HBV相关蛋白检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 中医证候与DNMT1间关系的探讨 |
| 4.2 中医证候与MeCP2间关系的探讨 |
| 4.3 中医证候与P53间关系的探讨 |
| 4.4 中医证候与E-cad间关系的探讨 |
| 4.5 中医证候与P16间关系的探讨 |
| 5 小结 |
| 实验二 慢性乙型肝炎全基因组DNA甲基化的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 样本采集 |
| 2 方法 |
| 2.1 Infinium Human Methylation850K甲基化芯片简介 |
| 2.2 DNA抽提 |
| 2.3 DNA样本质检 |
| 2.4 DNA甲基化芯片实验流程 |
| 2.5 DNA甲基化芯片数据分析流程 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 DNA样本质检结果 |
| 3.2 实验质控结果 |
| 3.3 样本beta值密度曲线 |
| 3.4 数据归一化 |
| 3.5 差异甲基化位点筛选结果 |
| 3.6 GO功能富集结果 |
| 3.7 KEGG pathway富集结果 |
| 3.8 差异甲基化区域结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 差异甲基化位点结果分析 |
| 4.2 差异甲基化位点相关基因GO功能富集结果分析 |
| 4.3 差异甲基化位点相关基因KEGG pathway富集分析 |
| 5 小结 |
| 实验三 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同中医证候差异甲基化位点筛选结果 |
| 3.2 不同中医证候GO功能富集结果 |
| 3.3 不同中医证候KEGG pathway富集结果 |
| 3.4 不同证候差异甲基化区域分布结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 脾胃湿热证与肝郁脾虚证是四川地区CHB常见的中医证候 |
| 4.2 中医证候与DNA甲基化在理论上有共通之处 |
| 4.3 不同中医证候差异甲基化表达分析 |
| 5 小结 |
| 实验四 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化与mi RNA联合分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同中医证候中4条相同miRNA靶基因预测结果 |
| 3.2 不同中医证候差异甲基化位点相关基因筛选结果 |
| 3.3 miRNA预测靶基因与差异甲基化位点相关基因联合分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 mi RNA与 DNA甲基化间存在相互调控关系 |
| 4.2 miR-122-5p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 4.3 miR-1228-3p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 4.4 miR-191-3p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 中药干预DNA甲基化修饰的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（10）TMUB1上调STAT1表达抑制肝癌细胞增殖的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 TMUB1在肝细胞肝癌手术标本中的表达与临床病理特征以及病人预后的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 TMUB1与STAT1在HCC组织中表达相关性研究及TMUB1与STAT1共同表达与临床病理特征以及病人预后的相关性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 TMUB1 通过调节STAT1 表达抑制HCC细胞增殖 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料及方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 TMUB1在HCC中的ce RNA网络预测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 TMUB1研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 STAT1在恶性肿瘤中研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
四、Gene expression profile favoring phenotypic reversion: a clue for mechanism of tumor suppression by NF-IL6 3'UTR（论文参考文献）
- [1]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析[D]. 张飞. 安徽农业大学, 2021
- [3]MiR-508-3p在肺动脉高压中的功能性表达和调节机制研究[D]. 马意. 山东大学, 2021
- [4]陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究[D]. 陈鹏. 西北大学, 2021(12)
- [5]CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究[D]. 龚雪. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [6]弥漫大B细胞淋巴瘤信号通路相关microRNA和蛋白质的筛选及功能研究[D]. 高海霞. 新疆医科大学, 2021(08)
- [7]胃癌中差异表达mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定分析及核心circRNA circFOXO3的功能与作用[D]. 张颖一. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [8]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [9]基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究[D]. 马丽. 成都中医药大学, 2020(01)
- [10]TMUB1上调STAT1表达抑制肝癌细胞增殖的研究[D]. 陈胤. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)