一、大肠杆菌中重组猪生长激素提取方法及变复性的比较研究（论文文献综述）
曾婷婷[1]（2021）在《白细胞介素-6对草鱼GH-IGFs轴相关基因表达调控的研究》文中认为在脊椎动物中,生长激素（GH）主要通过调节肝脏中的胰岛素样生长因子（IGF）的表达和分泌,影响机体的糖、脂、蛋白质的代谢,进而调控其生长代谢、生殖发育及免疫功能。以GH/IGFs为中心的一系列激素、受体及信号分子构成所谓的GH/IGFs轴,该轴受到营养状况、盐度、渗透压、温度等多种因素的影响。有趣的是,越来越多的证据显示病原体感染会影响鱼类GH/IGFs轴的生理功能,但其影响机制还不清楚。本论文以草鱼为模型,研究杀鱼爱德华氏菌感染对草鱼GH-IGFs轴相关基因表达的影响,探讨促炎因子白介素-6（IL-6）在其中可能扮演的角色,并初步探索IL-6影响IGF-I表达和分泌的分子机制。首先,我们用杀鱼爱德华氏菌腹腔注射草鱼,发现其血清GH水平无明显变化,但肝脏中的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱa/b mRNA表达水平下调,且血清IGF-Ⅰ水平也被抑制,揭示细菌感染确实可抑制草鱼IGF的表达和分泌。同时,该细菌感染还抑制了肝细胞中GH受体（GHR）mRNA表达,诱导了细胞因子信号转导抑制因子2/3（SOCS2/3）的表达,提示细菌感染可能通过影响这三个基因来调节IGFs的表达和分泌。该感染还显着增加肝脏中的促炎因子IL-6的表达。鉴于肝脏中IL-6受体的高表达及肝脏是IL-6重要的靶器官,我们推测IL-6可能参与细菌感染对IGFs的抑制作用。因此,我们制备了具有生物学活性的重组草鱼IL-6蛋白,并用此蛋白注射草鱼,发现血清中的IGF-I水平降低,而血清GH水平没有发生变化,且肝脏中的IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱa/b mRNA表达水平下调,证明IL-6在杀鱼爱德华氏菌抑制IGFs的表达和分泌中发挥了重要作用。肝脏IGFs表达主要受到GH的调控,为了进一步探究IL-6对GH调控IGFs表达的影响及机制,我们用原核表达及变复性方法获得草鱼重组GH蛋白。用此重组蛋白处理草鱼原代肝细胞能显着上调IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱa/b的mRNA表达,表明该蛋白具有生物学活性。利用重组草鱼GH和IL-6蛋白,我们发现IL-6能剂量和时间依赖地抑制肝细胞中GH诱导的IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱa/b mRNA的表达;且在24 h处理后,IL-6的抑制作用最强。不但如此,IL-6还能抑制GH刺激的肝细胞中IGF-Ⅰ的分泌。我们研究发现IL-6注射草鱼后,其肝脏中GHR mRNA表达下调和SOCS2/3 mRNA表达上调,进一步研究发现IL-6单独处理并不改变肝细胞中IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱa/b mRNA的本底表达,但是能快速诱导SOCS2/3的合成和抑制GHR mRNA表达,这提示IL-6有可能通过上调SOCS2/3表达和降低GHR水平来调节IGF-I和IGF-Ⅱa/b mRNA的表达,但这还需要进一步研究验证。本次研究首次发现杀鱼爱德华氏菌感染能影响草鱼GH/IGFs轴相关基因的表达,证明了IL-6参与细菌感染对这些基因表达的影响,该研究有利于了解在细菌感染条件下,炎症因子对IGFs这一生长和代谢调节因子的调控新机制,是对鱼类免疫防御和生长发育之间联系及机制的探索。
王晓璐[2]（2020）在《广谱降解饲料中主要霉菌毒素的酶作用机制及高效表达》文中研究指明霉菌毒素是霉菌的次级代谢产物,对人和动物的健康具有严重威胁。在众多脱毒方法中,酶法脱毒因绿色环保而备受关注。但目前报道的霉菌毒素降解酶无法满足对多种霉菌毒素的混合污染进行有效处理的要求。基于此,本研究首先对锰过氧化物酶（Manganese peroxidase,MnP）进行了生化表征,发现锰过氧化物酶可降解饲料中的多种霉菌毒素。而后,对漆酶的广谱霉菌毒素降解能力进行了实验研究并初步探讨了降解机制。最后,利用毕赤酵母（Pichia pastoris）和里氏木霉（Trichoderma reesei）外源蛋白表达系统分别对Moniliophthora roreri来源的锰过氧化物酶和Melanocarpus albomyces来源的漆酶进行了高效表达和上罐发酵。以期通过研究,对锰过氧化物酶及漆酶-介体体系广谱降解霉菌毒素的能力具备一定认识,为广谱霉菌毒素降解酶的实际应用奠定基础。具体如下:对重组表达的7种分别来源于Irpex lacteus CD2、Phanerochaete chrysosporium、Ceriporiopsis subvermispora和商业化Nematoloma frowardii来源的锰过氧化物酶降解霉菌毒素的能力进行了分析。结果表明,上述锰过氧化物酶均能降解饲料中的4种主要的霉菌毒素（黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素及伏马菌素B1）。其对黄曲霉毒素B1的降解率介于78.4%-100.0%,对玉米赤霉烯酮的降解率介于42.2%-94.3%,对呕吐毒素的降解率介于42.9%-96.3%,对伏马菌素B1的降解率介于22.2%-43.6%。研究了Bacillus subtilis来源的漆酶BsCotA对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解。在无介体体系中,BsCotA用量为0.03 U/mL时,黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率仅为18.2%和17.6%。选择9种结构确定的小分子物质作为漆酶介体参与霉菌毒素降解。结果表明,丁香酸甲酯是漆酶BsCotA降解霉菌毒素的最佳介体。BsCotA-丁香酸甲酯体系对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率分别为98.0%和100.0%。而且,多种植物提取物（淫羊藿、荆芥等）也可作为漆酶BsCotA的有效介体。同时,商业化Ganoderma sp.来源漆酶也能够利用上述介体降解霉菌毒素。利用不同的有机酸体系及自由基捕获剂对I.lacteus CD2来源的锰过氧化物酶IlMnP5和IlMnP6降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的反应机制进行初步研究。结果表明,自由基在锰过氧化物酶降解霉菌毒素过程中发挥着重要作用。同时,锰过氧化物酶还可通过直接与玉米赤霉烯酮反应使其降解。在此基础上建立了利用染料RB5对高霉菌毒素降解能力的锰过氧化物酶进行高通量筛选的方法。利用UHPLC-MS/MS鉴定出了锰过氧化物酶降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的可能产物。利用UHPLC-MS/MS对漆酶BsCotA-丁香酸甲酯体系降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的产物进行分析。结果表明,体系中的反应包括漆酶对霉菌毒素、丁香酸甲酯的氧化及苯氧自由基与其他分子发生耦联。最后,利用水螅、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BLYES及结肠癌细胞Caco-2为模型,对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮经锰过氧化物酶和漆酶-介体体系降解后产物的毒性进行检测。结果表明,经两类酶降解后的毒素毒性均显着降低。利用饲料酶制剂工业生产中常用的毕赤酵母表达系统和里氏木霉表达系统对M.roreri来源的锰过氧化物酶和M.albomyces来源的漆酶进行了异源表达研究,并进行了上罐发酵。结果表明,毕赤酵母X33菌株可成功表达M.roreri来源锰过氧化物酶,上罐发酵至108 h时,锰过氧化物酶最高酶活2074.1 U/L。利用里氏木霉成功表达了M.albomyces来源的漆酶,上罐发酵91 h,漆酶酶活达到最高,为11703.7 U/L。
张敏[3]（2018）在《采用新型Fh8-ΔI-CM标签自切除系统制备可溶TRAIL蛋白》文中研究指明外源蛋白在五.coli中表达时,通常会形成不溶形式的包涵体。因此,迫切需要建立经济、简便、有效的蛋白质可溶表达和纯化方法。目前,有许多方法提高目的蛋白的可溶表达,基于增溶的融合基因表达策略由于效果显着而被广泛的采用。本文首先对重组TRAIL蛋白在E.coli中的可溶表达进行了研究。采用融合标签Fh8与TRAIL蛋白序列进行融合,融合蛋白Fh8-TRAIL成功可溶表达,可溶比例占融合蛋白Fh8-TRAIL总表达量的67.3%。研究比较了该融合蛋白的两种纯化过程:1)Fh8-TRAIL经HIC纯化,TEV蛋白酶切除标签后IMAC纯化,2)Fh8-TRAIL经IMAC纯化后,TEV蛋白酶标签切除后HIC纯化。最终采用纯化方法1)获得69.4 mg纯度为97.8%的可溶TRAIL蛋白。而后,我们进一步研究并构建了新型Fh8-ΔI-CM标签自切除系统,融合蛋白Fh8-ΔI-CM-TRAIL成功可溶表达,可溶比例为融合蛋白总表达量的91.2%。经过对自切除效率的优化研究后,采用HIC柱上一步标签切除和纯化获得纯度为86.3%TRAIL蛋白,再经IMAC纯化,最终从1 L发酵培养液中获得82.1 mg纯度为98.4%的TRAIL蛋白。Western blot检测表明上述可溶表达策略表达并纯化后的TRAIL蛋白都具有与抗TRAIL抗体特异性结合活性;MTT实验表明上述重组TRAIL蛋白对人非小细胞肺癌NCI-H460细胞株具有强烈的抑制作用,而对正常胎牛心脏内皮细胞FBHE细胞株几乎没有作用。最后,我们对发酵生产Fh8-ΔI-CM-TRAIL条件进行了优化。三因素三水平正交试验分析,确定了最佳发酵条件（诱导温度18℃、诱导时间12h、IPTG浓度0.3mM）。最终,通过发酵条件的优化,可将重组TRAIL蛋白的产量从82.1 mg/L提高到90.2 mg/L。
郁建锋,何赛,金泽楷,周欢庆,董小敏,龚道清,顾志良[4]（2016）在《鸡生长激素在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定》文中认为生长激素（growth hormone,GH）与受体结合调节靶细胞的功能在机体的生长发育及代谢过程中起着极其重要的作用。为获得高纯度具有生物学活性的鸡生长激素（chicken growth hormone,cGH）,试验将C端融合了6个组氨酸的cGH成熟片段基因序列克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使用电转法将重组质粒导入毕赤酵母GS115,以1%的甲醇诱导重组菌（GS115-pPIC9K-cGH）96h,表达大小约为25ku的目的蛋白cGH,经Ni离子亲和层析和聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶层析获得95%以上的cGH重组蛋白。实时荧光定量检测结果表明,纯化的cGH重组蛋白可刺激鸡肝癌细胞LMH内的胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ）基因的mRNA表达上调,表明所发酵纯化的重组蛋白cGH具有生物学活性,这为其结构和功能的研究及生产应用奠定了基础。
宋浩[5]（2016）在《重组大肠杆菌表达外源蛋白的共性发酵调控策略研究》文中研究说明大肠杆菌是常用的蛋白表达宿主,因其背景研究透彻、成本低、易操作等特点,在药物蛋白、酶制剂的制备以及蛋白相关研究工作中依然是应用最广泛的外源蛋白表达系统。随着对大肠杆菌发酵过程研究的深入,影响蛋白表达的因素如培养基成分、代谢抑制物积累、补料调控策略、发酵条件等不断被揭示。由于发酵宿主的一致性,通过研究总结可以形成一种适用于大肠杆菌表达系统的高密度发酵技术。这样就简化了因所表达外源蛋白的多样性和特殊性,而针对每一个蛋白的表达做大量的重复性的发酵参数优化的工作。从而快速优化目标产物的发酵制备过程,缩短研发周期,降低研发和生产成本。本论文在总结以往技术经验的基础上,通过对重组人生长激素（rhGH）和不耐热肠毒素（LT）等蛋白的发酵过程研究,总结蛋白发酵工艺参数变化的共性规律,旨在形成一种简化的、通用性的重组蛋白发酵技术。论文首先研究了pH-stat流加、变速流加结合pH-stat流加、变速流加结合恒速流加三种补料方式对rhGH表达量及发酵过程的影响,以确定大肠杆菌表达体系发酵过程中各参数变化的共性规律。通过对菌体浓度、呼吸活力、蛋白表达水平、CO2排放量和铵根离子浓度等参数的考察,采用变速流加结合pH-stat流加方式,蛋白表达后减低补料速率维持pH恒定,并维持发酵液残糖浓度在0.1g/L以下,这样使菌体呼吸活力、蛋白表达和菌体生长达到最优平衡,成功将rhGH的表达量提高到678 mg/L。然后,以上述发酵方法为指导,成功表达了不耐热肠毒素（LT）、豹蛙酶（ONC）等多种外源蛋白,验证和补充了大肠杆菌表达体系表达外源蛋白的共性发酵技术。鉴于包涵体造成蛋白纯化下游工艺的复杂性,蛋白的可溶性表达有广泛的研究价值和应用前景。本文在上述发酵工艺基础上,以LT为研究对象,针对发酵过程中可能影响LT可溶性表达的如诱导剂添加时刻、诱导浓度、培养基组成、卡那霉素浓度等因素开展了相关的研究,并最终确立了最利于蛋白可溶性表达的发酵条件：培养基葡萄糖浓度3 g/L；发酵5.5 h后,加入0.15mM IPTG诱导；诱导后,添加蔗糖浓度1 g/L,并添加卡那霉素至终浓度150μg/mL。经过5 L发酵罐补料分批发酵验证,蛋白可溶性水平从2%以下提高到6.5%。同时,初步确立了亲和层析与凝胶层析相结合的包涵体纯化工艺,目的蛋白经过两步层析纯化,最终纯度为92.1%,总收率为9.0%。
叶伟[6]（2013）在《地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶的功能特性研究》文中研究表明谷氨酸特异性内肽酶（GSE）是一种对谷氨酸羧基形成的肽键具有很强专一性的丝氨酸蛋白酶，在蛋白质序列及结构分析、多肽合成及活性多肽回收方面有着广泛的应用。由于大多数谷氨酸特异性内肽酶的晶体结构目前无法获得，因此我们对于其底物特异性的机制还不够了解。地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶（GSE-BL）与应用较广泛的来自金黄色葡萄球菌V8菌株的谷氨酸特异性内肽酶（V8-GSE）相比，对谷氨酸有着更强的底物专一性和更高的催化效率。因此，对GSE-BL进行表达纯化，并对其结构及功能进行深入分析对于了解其作用机制及拓展谷氨酸特异性内肽酶的应用范围有着十分重要的意义。重组GSE-BL前体在大肠杆菌胞内以无活性的包涵体形式表达，经过透析复性及胰酶处理后，我们得到有活性的成熟GSE-BL，其产量为140.5mg/L。Western blot鉴定、酶活力测定及氨基酸序列测定结果表明其复性过程中自切割形成中间体，其成熟化过程是逐步进行的。GSE-BL前体第-1位的赖氨酸突变成为谷氨酸后，可以在不引入外源胰酶的情况下得到成熟GSE-BL，从而为制备有活性的成熟提供了一种新方法。但突变后的GSE-BL对于Z-Phe-Leu-Glu-pNA的活性降低了27.4%，表明第-1位置的Lys突变成为Glu对GSE-BL的正确折叠有一定程度的影响。不包含前肽片段的GSE-BL在大肠杆菌中主要以可溶形式表达，相应纯化产物对Z-Phe-Leu-Glu-pNA几乎没有酶活力；27kDGSE-BL中间体主要以包涵体形式表达，相应成熟化产物对Z-Phe-Leu-Glu-pNA几乎没有酶活力，从而证明前肽的存在对于GSE-BL正确折叠形成有活性的构象是十分必要的。对GSE-BL的酶学性质研究结果表明，GSE-BL的最适反应pH为8.5，最适反应温度为37℃，对Z-Phe-Leu-Glu-pNA的Km值为1.495±0.034mM，最大反应速率Vmax为50.237μmol/mg.min。2mM钙离子的存在能显着提高重组成熟GSE-BL在50℃的热稳定性，EDTA能部分抑制成熟GSE-BL的酶活力。GSE-BL对于Z-Phe-Leu-Glu-pNA的催化效率是对于Z-Asp-pNA的催化效率的925倍。我们以已知晶体结构的中间芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶（GSE-BI）为模板，对GSE-BL进行了同源建模，预测GSE-BL中存在由His47、Asp96和Ser167组成的通过质子传递形成的稳定的催化活性中心，并用点突变实验分别进行了验证。我们还通过点突变实验证明了Val2、Cys32、Arg89和His190对于GSE-BL催化活性中心的形成和其底物特异性的重要性。其中Val2参与底物结合口袋的形成，对于GSE-BL的正确折叠十分重要；Cys32与底物结合，且参与二硫键的形成；Arg89为底物结合口袋提供正电荷，方便底物进入口袋；而His190与Glu残基的γ-羧基结合，对谷氨酸的负电荷进行补偿。Cys181突变成为Ala会降低GSE-BL的热稳定性。Phe57突变成为Ala能使GSE-BL对于Z-Phe-Leu-Glu-pNA的催化效率提高50%。Asp51Arg、Glu101Ala和Glu104Arg的突变影响GSE-BL催化域的电荷分布，导致GSE-BL无法形成稳定的催化活性中心。本论文将GSE-BL应用于重组蛋白标签切除和活性肽的成熟化。透明颤菌血红蛋白（VHb）是一种能提高生物体对氧气利用率的血红蛋白。VHb在大肠杆菌内重组表达，GSE-BL酶切15min可去除91.6%VHb-His6的组氨酸标签，从而获得与天然VHb氨基酸序列一致的VHb。无标签VHb的产量为31.8mg/L。去除标签的VHb对CO的亲和力比VHb-His6更高。无标签VHb对过氧化氢的最大反应速率为1169μmol/g.min，而VHb-His6对过氧化氢的最大反应速率为781μmol/g.min。0.1mM无标签VHb添加到产碱杆菌ATCC31555发酵液中能使韦兰胶的产量提高16.2%，而添加0.1mM VHb-His6仅使韦兰胶产量提高4.9%。人胰高血糖素是一种能促进肝糖原分解从而提高人体内血糖含量的活性多肽。我们在毕赤酵母菌株中重组表达了人胰高血糖素，重组人胰高血糖分泌到胞外上清液中，纯化的重组人胰高血糖素用GSE-BL处理1h能去除91.6%重组胰高血糖素的组氨酸标签，得到与人胰高血糖素标准品分子量大小一致及HPLC保留时间一致的短肽。去标签的胰高血糖素的产量为50.5mg/L。人β防御素-2（HBD-2）是一种富含半胱氨酸的小分子阳离子抗菌肽。我们在大肠杆菌内对HBD-2前原肽进行了重组表达，在成熟HBD-2序列前引入Glu残基作为GSE-BL的识别位点。纯化后的HBD-2前原肽经GSE-BL处理1h得到成熟的HBD-2，其产量为23.2mg/L。成熟HBD-2对于铜绿假单胞菌的抑菌能力强于对金黄色葡萄球菌的抑菌能力。成熟HBD-2对人结肠癌细胞HCT-8的毒性要强于对小鼠骨髓来源的DC细胞的毒性。
王鑫[7]（2012）在《1型鸭圆环病毒间接ELISA方法的建立及流行病学调查》文中研究表明鸭圆环病毒（Duck circovirus, DuCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）的成员之一,是一类没有囊膜的单链环状DNA病毒。自2003年在德国由Hattermann首次报道以来,相继在匈牙利、美国、中国台湾及中国大陆等地发现或报道。本研究建立了1型鸭圆环病毒间接ELISA检测方法,并对2011年山东省潍坊和泰安两个主要养鸭地区健康肉鸭群中DuCV的流行和分布情况,进行了血清学调查。研究共分为三部分：1、检测基因1型DuCV抗体的间接ELISA方法的建立及血清学调查本研究建立了检测基因1型DuCV抗体的间接ELISA方法。采用PCR技术,扩增1型DuCV部分Cap基因,构建原核表达质粒pET-32a（+）-Cap; IPTG诱导表达后以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床检测。结果显示：基因1型DuCV Cap基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达；Western blot检测表明,表达的重组Cap蛋白能与鸭圆环阳性血清发生特异性反应；建立的间接ELISA方法的蛋白最佳包被量为800ng/孔,血清最佳稀释度为1：50,阳性的Cut-of值为0.324。以建立的间接ELISA方法进行山东省健康鸭群DuCV抗体检测结果表明,结果显示：肉鸭场的DuCV抗体个体阳性率在0.4%-78.125%,平均为33.80%（382/1130）,群体阳性率为100%（17/17）。2、2011年山东部分地区肉鸭群基因2型DuCV血清学调查为了解2型DuCV在山东地区的流行情况,本研究采用实验室已经建立的2型鸭圆环病毒间接ELISA方法,对2011年山东省潍坊和泰安两个地区的17个肉鸭场1130份血清进行间接ELISA检测。结果显示：肉鸭场的DuCV抗体个体阳性率在2%-78%,平均为29.91%（338/1130）,群体阳性率为100%（17/17）。潍坊地区的抗体阳性率（42.81%）明显高于泰安地区（17.73%）,显示DuCV在老养殖区鸭群中污染更加严重。3、基因1型与2型DuCV共感染分析分析用检测基因1型和基因2型DuCV抗体的间接ELISA方法分别对山东潍坊、泰安地区的肉鸭群进行血清学检测结果,发现1型DuCV与2型DuCV的抗体符合率为80.7%。泰安地区两型均为阳性的鸭只数为63,占总体检测数的10.84%,潍坊地区,两型均为阳性的个体为23.50%,略高于泰安地区。统计发现基因1型和2型DuCV共感染的阳性率为16.99%,说明在山东省鸭群中存在比较严重的两种基因型DuCV共感染现象。
吴兵兵[8]（2012）在《肌抑素对小鼠巨噬细胞的影响及肌抑素和生长抑素免疫中和效果研究》文中研究表明肌肉形成及其维持是一个极其复杂的过程,受严密的机制调控,主要受激素、营养、生长因子、肌肉调节因子（MRFs）及运动的调控,这些因素相互作用形成复杂的调控网络。本研究针对该网络中的两条最重要的轴：正向调控轴GH/IGF-1和负向调控轴肌抑素,通过免疫中和手段,初步研究了调控该两条路径后对小鼠肌形成过程及生长的影响,同时还初步探索了肌抑素在对免疫细胞的调控方面的新型功能。主要研究内容和结果如下：1.肌抑素对巨噬细胞细胞因子分泌的调控及其通路本实验表明在高脂日粮饲喂的小鼠肌肉、脂肪和脾脏中均可检测到高水平肌抑素基因的表达,在脂肪和脾脏中同时还可以检测到高水平的巨噬细胞标志基因F4/80和CD68的表达；进一步研究发现在脾脏淋巴细胞可检测到肌抑素的表达,并且LPS可增加脾脏淋巴细胞肌抑素的表达（可达259.37%,P=0.082）；而进一步研究其对免疫细胞（巨噬细胞和树突状细胞）的影响发现,肌抑素主要可促进巨噬细胞炎症因子的表达,而对树突状细胞无显着影响。肌抑素处理可显着诱导骨髓来源巨噬细胞TNFα（最高可达545.71%,P=0.0011）、IL1β（最高可达14.97倍,P=0.039）、IL6（225.48%,P=0.012）等炎症因子的表达；对巨噬细胞系RAW264.7研究表明,小干扰RNA靶标ActRIIB受体后,肌抑素诱导的TNFα的表达受到抑制（抑制了50.43%,P<0.01）,预示着在RAW264.7小鼠巨噬细胞系中,肌抑素对TNF a的诱导表达是通过其ActRIIB受体；同样,小干扰RNA靶标ActRIIB受体后,肌抑素诱导的IL1β的表达也受到抑制（抑制了79.18%,P=0.01）,因此肌抑素也是通过ActRIIB受体诱导IL1β的表达；进一步深入研究肌抑素诱导TNF α及IL1β表达所激活的信号通路途径表明,肌抑素可能主要通过Smad （通路抑制剂可下调TNF a达51.72%,P=0.016）和JNK通路（通路抑制剂可下调TNFα达69.24%,P=0.0023）诱导TNFα的表达,而对1L1β的诱导表达可能主要通过Smad、p38及Erk通路,各通路抑制剂可分别下调IL1β达58.21%（P<0.01）、55.64%（P=0.002）及37.8%（P<0.05）。2.免疫中和生长抑素本实验构建、表达及纯化GM-CSF/SS和CTB/SS重组融合蛋白,分别免疫雌性BALB/c小鼠,与pBS组相比,GM-CSF/SS可显着增加免疫小鼠的体重4.62%（P<0.05）,诱导高水平的抗生长抑素抗体的产生,同时该处理组血清生长激素水平显着增加了44.54%（P<0.05）,相应的肌肉IGF-1mRNA表达水平增加了94%；而CTB/SS处理小鼠后,体重并未如预期的那样显着增加,处理组血清中除均可检测到抗生长抑素抗体之外,还可检测到高水平抗CTB抗体水平,与对照组比较CTB/SS组抗CTB抗体水平增加了28.69%（P<0.05）。结果表明GM-CSF/SS可有效诱导生长抑素抗体的产生及增加免疫小鼠体重,有望进一步应用于大型动物研究；而尽管CTB/SS同样可以诱导生长抑素抗体的产生,但可能是高水平的CTB抗体抑制了动物的生长及体重的增加。3.肌抑素单链抗体经过密码子优化、全基因合成成功构建了全长为759bp的抗肌抑素单链抗体,并成功在大肠杆菌中表达,经纯化发现单链抗体可有效结合肌抑素（P<0.05）,而且该单链抗体可显着促进成肌细胞增殖,高浓度（8μg/ml）的单链抗体可提高成肌细胞增殖活性达31.11%（P<0.01）,而且还可以降低肌抑素诱导的成肌细胞增殖抑制达55.48%（P<0.01）,显着抑制肌抑素所诱导的成肌细胞细胞周期蛋白抑制剂p21表达（降低了22.48%,P<0.05）；而且单链抗体还可抑制过氧化氢所诱导的成肌细胞E3泛素连接酶atrogin-1（MAFbx）口muscle ring finger1（MuRF1）的表达,与高浓度过氧化氢组比较,单链抗体共处理组的MuRF1和MAFbx表达量分别下调了80.41%（P=0.00013）和57.94%（P=0.049）：而且该单链抗体还可降低过氧化氢诱导的成熟肌纤维MuRP1的表达,显着下调了33.35%（P=0.014）;最后荧光素酶报告基因结果表明,该单链抗体可显着抑制肌抑素在成肌细胞的Smad信号通路（P<0.05）。
于瑞嵩,沈世缘,董世娟,朱于敏,李震[9]（2009）在《包含体表达基因工程牛生长激素提取、变复性及纯化的研究》文中研究说明为了取得较好的复性效果,对重组牛生长激素的纯化及变复性条件进行了研究。结果表明:发酵菌体高压匀浆破碎、离心得到的包含体在7.5 mol/L尿素中变性24 h后,以100 mmol/L Tris.HCl pH10.0稀释至尿素浓度4.5 mol/L,4℃复性48 h,对20 mmol/LTris.HCl pH9.0透析除盐可以成功对重组牛生长激素复性;采用截留分子量100 kD、5 kD超滤膜对复性重组牛生长激素浓缩,FPLC纯化后可得到高纯度的目标蛋白。
姜秀英,朱江[10]（2006）在《重组猪生长激素抗体的制备与纯化》文中认为为了获得重组猪生长激素抗体,对重组猪生长激素融合基因的真核表达产物进行免疫印迹（Western blot）检测,将利用DNA重组技术构建的重组质粒pPGH020在大肠杆菌（E.coli）BL21中进行诱导表达.表达产物经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化的重组猪生长激素融合蛋白.然后以此为抗原免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体,抗体再经硫铵沉淀、透析和亲和层析纯化.Western印迹结果表明,该纯化抗体显示了良好的免疫反应,其灵敏度比兔抗rpGH抗血清提高50倍,为猪生长激素融合基因在真核细胞的表达及功能鉴定奠定了基础.
二、大肠杆菌中重组猪生长激素提取方法及变复性的比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌中重组猪生长激素提取方法及变复性的比较研究（论文提纲范文）
（1）白细胞介素-6对草鱼GH-IGFs轴相关基因表达调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 IGFs的功能研究概况 |
| 1.1.1 哺乳动物IGFs的功能 |
| 1.1.2 硬骨鱼IGFs的功能 |
| 1.2 GH-IGFs轴的研究进展 |
| 1.2.1 GH-IGFs轴的简介 |
| 1.2.2 GH-IGFs轴涉及的信号通路 |
| 1.3 炎症对GH-IGFs轴相关基因表达的影响 |
| 1.3.1 免疫刺激对肝脏IGFs表达和分泌的影响 |
| 1.3.2 促炎因子对GH-IGFs轴相关基因表达的调控 |
| 1.4 白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)的概述 |
| 1.4.1 IL-6与炎症的关系 |
| 1.4.2 IL-6在肝脏中的生理功能及其对IGF-Ⅰ表达和分泌的调节 |
| 1.5 本论文研究内容和意义 |
| 第二章 杀鱼爱德华氏菌感染对草鱼肝脏中GH-IGFS轴相关基因及促炎因子表达的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器及设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法与操作 |
| 2.2.1 E.piscicida的活化和培养 |
| 2.2.2 腹腔注射E.piscicida感染草鱼 |
| 2.2.3 总RNA的提取及cDNA模板制备 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 草鱼血清的制备 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中GH和IGF-Ⅰ蛋白水平 |
| 2.2.7 数据统计与分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 E.piscicida感染对草鱼GH和IGFs的表达和分泌的影响 |
| 2.3.1.1 E.piscicida感染下调IGFs基因表达和IGF-Ⅰ分泌水平 |
| 2.3.1.2 E.piscicida感染后草鱼GH的分泌水平无变化 |
| 2.3.2 E.piscicida感染上调草鱼肝脏中IL-6 基因的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 草鱼GH重组蛋白的制备及活性验证 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物、菌株、质粒 |
| 3.1.2 实验仪器及设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 草鱼组织RNA 的提取以及c DNA 的合成 |
| 3.2.2 草鱼GH重组蛋白的制备 |
| 3.2.2.1 克隆草鱼GH编码序列 |
| 3.2.2.2 构建草鱼GH-pET30a(+)的重组表达质粒 |
| 3.2.2.3 诱导表达BL21(GH-pET30a)菌株 |
| 3.2.3 变复性方法制备重组草鱼GH蛋白 |
| 3.2.3.1 包涵体的收集与洗涤 |
| 3.2.3.2 包涵体的变性溶解与纯化 |
| 3.2.3.3 变性蛋白的稀释复性 |
| 3.2.3.4 复性蛋白的脱盐 |
| 3.2.4 草鱼肝细胞的分离和培养 |
| 3.2.5 重组草鱼GH蛋白的生物学活性验证 |
| 3.2.5.1 重组草鱼GH处理草鱼肝细胞 |
| 3.2.5.2 细胞样品的总RNA提取及c DNA模板的制备 |
| 3.2.5.3 实时荧光定量PCR |
| 3.2.5.4 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 构建草鱼GH-pET30a(+)的原核表达载体 |
| 3.3.2 成功获得重组草鱼GH蛋白 |
| 3.3.2.1 草鱼GH-pET30a(+)表达菌株的诱导表达和条件优化 |
| 3.3.2.2 通过变复性方法获取重组草鱼GH蛋白 |
| 3.3.3 重组草鱼GH蛋白上调IGFs基因表达水平 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 IL-6对草鱼GH-IGFS轴相关基因的表达调控 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验仪器及设备 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 体内实验:重组草鱼IL-6蛋白腹腔注射草鱼 |
| 4.2.2 体外实验:重组草鱼IL-6蛋白与重组GH蛋白联合处理肝细胞 |
| 4.2.3 总RNA的提取及cDNA模板制备 |
| 4.2.4 实时荧光定量PCR |
| 4.2.5 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 4.2.6 数据统计与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 IL-6对草鱼血清中GH的蛋白水平无影响 |
| 4.3.2 IL-6下调草鱼血清中IGF-Ⅰ的蛋白水平 |
| 4.3.3 IL-6对草鱼肝脏GH-IGFs轴相关基因表达的影响 |
| 4.3.4 IL-6抑制GH诱导的肝细胞中IGFs基因的表达水平 |
| 4.3.5 IL-6抑制GH诱导的原代肝细胞中IGF-Ⅰ的分泌水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 IL-6调控GH-IGFS轴机制的初探 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验仪器及设备 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 体内实验:重组草鱼IL-6 蛋白腹腔注射草鱼 |
| 5.2.2 重组草鱼IL-6 处理肝细胞 |
| 5.2.3 细胞样品总RNA提取与c DNA的合成 |
| 5.2.4 实时荧光定量PCR |
| 5.2.5 数据统计与分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 IL-6对草鱼肝脏中GHR和 SOCS2/3 基因表达的影响 |
| 5.3.2 IL-6调控肝细胞不同时间点的IGF-Ⅰ/Ⅱ、GHR和SOCS2/3基因表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（2）广谱降解饲料中主要霉菌毒素的酶作用机制及高效表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 霉菌毒素概述 |
| 1.1.1 霉菌毒素的种类及危害 |
| 1.1.2 霉菌毒素检测方法 |
| 1.2 霉菌毒素脱毒方法研究进展 |
| 1.2.1 物理脱毒法 |
| 1.2.2 化学脱毒法 |
| 1.2.3 生物脱毒法 |
| 1.3 木质素降解酶 |
| 1.3.1 锰过氧化物酶 |
| 1.3.2 漆酶及漆酶-介体体系 |
| 1.3.3 木质素过氧化物酶 |
| 1.3.4 多功能过氧化物酶 |
| 1.3.5 染料脱色过氧化物酶 |
| 1.4 外源蛋白表达系统 |
| 1.4.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.4.2 酵母表达系统 |
| 1.4.3 丝状真菌表达系统 |
| 1.4.4 其它表达系统 |
| 1.5 研究的内容及意义 |
| 第二章 锰过氧化物酶降解饲料中主要霉菌毒素研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株和质粒 |
| 2.1.2 基因合成、引物合成及测序 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 培养基及试剂配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 锰过氧化物酶基因片段的扩增 |
| 2.2.3 重组表达载体及表达宿主构建 |
| 2.2.4 重组锰过氧化物酶IlMnP和PcMnP1的表达、复性和纯化 |
| 2.2.5 重组锰过氧化物酶CsMnP的表达和纯化 |
| 2.2.6 锰过氧化物酶酶活测定 |
| 2.2.7 锰过氧化物酶的紫外-可见光谱分析 |
| 2.2.8 HPLC、UHPLC-MS/MS法标定霉菌毒素浓度 |
| 2.2.9 锰过氧化物酶降解霉菌毒素 |
| 2.2.10 锰过氧化物酶系统发生树的构建 |
| 2.2.11 实验数据统计学分析 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 重组锰过氧化物酶的表达、复性及纯化 |
| 2.3.2 霉菌毒素浓度测定标准曲线 |
| 2.3.3 锰过氧化物酶降解霉菌毒素 |
| 2.3.4 不同来源锰过氧化物酶系统发生树分析 |
| 2.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 漆酶降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株和质粒 |
| 3.1.2 引物合成及测序 |
| 3.1.3 试剂及试剂盒 |
| 3.1.4 培养基及试剂的配制 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 BscotA基因片段的扩增 |
| 3.2.3 重组表达载体及表达宿主构建 |
| 3.2.4 BsCotA的表达和纯化 |
| 3.2.5 漆酶酶活测定 |
| 3.2.6 蛋白浓度测定 |
| 3.2.7 BsCotA酶学性质测定 |
| 3.2.8 BsCotA降解霉菌毒素 |
| 3.2.9 BsCotA-介体体系降解霉菌毒素 |
| 3.2.10 Ganodermasp.来源真菌漆酶-介体体系降解霉菌毒素 |
| 3.2.11 HPLC法检测霉菌毒素的降解 |
| 3.2.12 实验数据统计学分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 BsCotA的表达、纯化及性质测定 |
| 3.3.2 BsCotA降解霉菌毒素 |
| 3.3.3 BsCotA-介体体系降解霉菌毒素 |
| 3.3.4 Ganodermasp.来源真菌漆酶-介体体系降解霉菌毒素 |
| 3.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 锰过氧化物酶和漆酶降解霉菌毒素的分子机制研究 |
| 4.1 实验试剂和仪器 |
| 4.1.1 实验动物、细胞及菌株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 培养基及试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1锰过氧化物降解霉菌毒素及染料RB5 |
| 4.2.2 BsCotA-介体体系降解霉菌毒素 |
| 4.2.3 HPLC和UHPLC-MS/MS法检测霉菌毒素降解产物 |
| 4.2.4 IlMnP5、IlMnP6及BsCotA-介体体系的脱毒效果检测 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 锰过氧化物酶降解霉菌毒素的机制及产物分析 |
| 4.3.2 BsCotA-丁香酸甲酯体系降解霉菌毒素的机制及产物分析 |
| 4.3.3 锰过氧化物酶和BsCotA-介体体系对霉菌毒素的脱毒 |
| 4.3.4 高活性锰过氧化物酶筛选方法的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第五章 锰过氧化物酶和漆酶的异源高效表达研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验菌株和质粒 |
| 5.1.2 基因合成、引物合成及测序 |
| 5.1.3 试剂及试剂盒 |
| 5.1.4 培养基及试剂的配制 |
| 5.1.5 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 基因片段的扩增 |
| 5.2.3 重组表达载体构建 |
| 5.2.4 重组表达表达宿主构建 |
| 5.2.5 锰过氧化物酶和漆酶的上罐发酵 |
| 5.2.6 酶活及蛋白浓度测定 |
| 5.2.7 MrMnP降解霉菌毒素 |
| 5.2.8 MaLac降解霉菌毒素 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 毕赤酵母上罐发酵表达锰过氧化物酶MrMnP |
| 5.3.2 里氏木霉上罐发酵表达漆酶MaLac |
| 5.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）采用新型Fh8-ΔI-CM标签自切除系统制备可溶TRAIL蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 外源蛋白在E.coli中的可溶表达策略 |
| 1.2.1 选择合适的宿主 |
| 1.2.2 分泌型表达 |
| 1.2.3 融合型表达 |
| 1.2.4 与分子伴侣共表达 |
| 1.2.5 控制蛋白质表达水平 |
| 1.2.6 改造蛋白质 |
| 1.2.7 优化培养基 |
| 1.2.8 优化发酵条件 |
| 1.3 融合标签的研究进展 |
| 1.3.1 促溶标签 |
| 1.3.2 沉淀标签 |
| 1.4 标签切除方法研究进展 |
| 1.4.1 蛋白酶切 |
| 1.4.2 化学裂解 |
| 1.4.3 标签自裂解 |
| 1.5 重组蛋白纯化策略 |
| 1.5.1 亲和色谱 |
| 1.5.2 疏水相互作用色谱 |
| 1.5.3 分子排阻色谱 |
| 1.5.4 离子交换色谱 |
| 1.6 TRAIL的研究进展 |
| 1.6.1 TRAIL的简介 |
| 1.6.2 TRAIL的可溶表达 |
| 1.7 本课题的研究背景、意义及内容 |
| 1.7.1 本课题的研究背景、意义 |
| 1.7.2 本课题的研究内容 |
| 第2章 采用Fh8标签在E.coli中制备可溶TRAIL蛋白 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 质粒、基因和菌株 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要试剂 |
| 2.2.5 主要溶液的配制 |
| 2.2.6 主要软件 |
| 2.2.7 实验流程 |
| 2.2.8 实验方法 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 PCR扩增目的基因 |
| 2.3.2 融合PCR扩增 |
| 2.3.3 重组菌的验证 |
| 2.3.4 重组菌的诱导表达 |
| 2.3.5 融合蛋白的纯化 |
| 2.3.6 酶切及酶切后纯化 |
| 2.3.7 western blot鉴定 |
| 2.3.8 MTT活性检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 采用新型Fh8-ΔI-CM标签自切除系统在E.coli中制备可溶TRAIL蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 质粒、基因和菌株 |
| 3.2.2 细胞株 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 主要试剂 |
| 3.2.5 主要溶液的配制 |
| 3.2.6 主要软件 |
| 3.2.7 重组载体的构建 |
| 3.2.8 重组载体的转化及验证 |
| 3.2.9 重组蛋白的表达及验证 |
| 3.2.10 标签自切除效率的研究 |
| 3.2.11 柱上标签切除和纯化 |
| 3.2.12 进一步纯化 |
| 3.2.13 Western blot鉴定 |
| 3.2.14 MTT法检测 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 PCR扩增 |
| 3.3.2 融合PCR |
| 3.3.3 重组菌的验证 |
| 3.3.4 重组菌的诱导表达 |
| 3.3.5 标签自切除效率研究 |
| 3.3.6 柱上标签切除和纯化 |
| 3.3.7 进一步纯化 |
| 3.3.8 Western blot鉴定 |
| 3.3.9 MTT法检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 融合蛋白Fh8-ΔI-CM-TRAIL可溶表达的优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 质粒与菌株 |
| 4.2.2 实验器材 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 培养基的配制 |
| 4.2.5 主要软件 |
| 4.2.6 蛋白表达及鉴定 |
| 4.2.7 培养基成分的优化 |
| 4.2.8 菌株生长阶段的优化 |
| 4.2.9 蛋白表达阶段的优化 |
| 4.2.10 正交实验设计 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 单一有机氮源对Fh8-AI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.2 复合有机氮源对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.3 装液量对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.4 接种量对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.5 诱导时菌浓对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.6 Zn~(2+)浓度对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.7 IPTG浓度对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.8 诱导温度对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.9 诱导时间对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 |
| 4.3.10 正交实验分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.1.1 采用Fh8标签在E.coli中制备可溶TRAIL蛋白 |
| 5.1.2 采用Fh8-AI-CM标签自切除系统在E.coli中制备可溶TRAIL蛋白 |
| 5.1.3 融合蛋白Fh8-ΔI-CM-TRAIL可溶表达的优化 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）鸡生长激素在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 cGH的pPIC9K表达载体的构建 |
| 1.2.2 GS115-pPIC9K-cGH重组表达菌的构建 |
| 1.2.3 甲醇诱导表达cGH重组蛋白 |
| 1.2.4 cGH重组蛋白的纯化 |
| 1.2.5 cGH重组蛋白活性鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 cGH表达重组载体pPIC9K-cGH的构建 |
| 2.2 GS115-pPIC9K-cGH表达菌的构建 |
| 2.3 cGH重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 2.4 cGH重组蛋白的活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）重组大肠杆菌表达外源蛋白的共性发酵调控策略研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 重组蛋白药物的市场概况 |
| 1.2 重组大肠杆菌表达系统 |
| 1.2.1 表达载体与宿主菌 |
| 1.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达形式 |
| 1.3 重组大肠杆菌高密度发酵 |
| 1.4 重组蛋白的分离纯化方法 |
| 1.5 大肠杆菌重组蛋白的可溶性表达 |
| 1.5.1 发酵策略的控制 |
| 1.5.2 共表达分子伴侣 |
| 1.5.3 融合表达技术 |
| 1.6 本课题的目的、意义和主要研究内容 |
| 第2章 大肠杆菌重组蛋白发酵调控策略研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种与质粒 |
| 2.2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 表达rhGH大肠杆菌的培养 |
| 2.3.2 表达rhGH大肠杆菌的发酵调控策略 |
| 2.3.3 多种重组大肠杆菌的发酵 |
| 2.3.4 参数测定方法 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 培养基中磷酸盐浓度对菌体生长和rhGH表达量的影响 |
| 2.4.2 提高rhGH表达量的补料策略对比 |
| 2.4.3 三种补料策略的补料分批发酵结果分析 |
| 2.4.4 多种重组蛋白的发酵表达 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 大肠杆菌重组蛋白的可溶性表达研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌种与质粒 |
| 3.2.2 仪器和试剂 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 蛋白纯化相关溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 最佳诱导表达时间的选择 |
| 3.3.2 重组LT-A的可溶性表达 |
| 3.3.3 重组大肠杆菌不耐热肠毒素包涵体的纯化 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 诱导表达时间对重组LT-A表达量的影响 |
| 3.4.2 诱导剂添加时刻对重组LT-A可溶性表达的影响 |
| 3.4.3 IPTG浓度对重组LT-A可溶性表达的影响 |
| 3.4.4 培养基中葡萄糖浓度对重组LT-A可溶性表达的影响 |
| 3.4.5 卡那霉素添加量对重组LT-A可溶性表达的影响 |
| 3.4.6 蔗糖添加量对重组LT-A可溶性表达的影响 |
| 3.4.7 重组大肠杆菌分批发酵表达可溶性LT-A |
| 3.4.8 重组大肠杆菌补料-分批发酵表达可溶性LT-A |
| 3.4.9 包涵体LT-A的变性和复性 |
| 3.4.10 包涵体LT-A的层析纯化 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 重组大肠杆菌表达外源蛋白的共性发酵技术总结与展望 |
| 4.1 论文总结 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（6）地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶的功能特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照和缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 丝氨酸蛋白酶 |
| 1.2.1 丝氨酸蛋白酶的分类 |
| 1.2.2 丝氨酸蛋白酶的催化活性中心 |
| 1.2.3 丝氨酸蛋白酶的底物特异性 |
| 1.3 谷氨酸特异性内肽酶 |
| 1.3.1 谷氨酸特异性内肽酶的来源及分类 |
| 1.3.2 谷氨酸特异性内肽酶的空间结构 |
| 1.3.3 谷氨酸特异性内肽酶底物特异性分析 |
| 1.3.4 谷氨酸特异性内肽酶的成熟化 |
| 1.3.5 谷氨酸特异性内肽酶的应用 |
| 1.4 亲和标签简介 |
| 1.4.1 亲和标签的应用 |
| 1.4.2 亲和标签的去除 |
| 1.5 本论文的主要内容及研究意义 |
| 第二章 重组 GSE-BL 的表达、纯化与成熟化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 GSE-BL 前体基因的扩增 |
| 2.3.2 GSE-BL 重组质粒的构建 |
| 2.3.3 GSE-BL 前体的小量表达 |
| 2.3.4 GSE-BL 前体的表达与纯化 |
| 2.3.5 GSE-BL 的复性及成熟化 |
| 2.3.6 GSE-BL 的鉴定 |
| 2.3.7 Lys-1Glu 突变 GSE-BL 前体的纯化及成熟化 |
| 2.3.8 不含前肽 GSE-BL 和 27 kD GSE-BL 中间体的表达与纯化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 重组 GSE-BL 的酶学性质研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 GSE-BL 的酶学性质测定 |
| 3.3.2 GSE-BL 热稳定性检测 |
| 3.3.3 钙离子对 GSE-BL 热稳定性影响 |
| 3.3.4 金属离子对 GSE-BL 酶活力的影响 |
| 3.3.5 GSE-BL 对不同底物催化效率比较 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 GSE-BL 作用机理的初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 GSE-BL 同源建模分析 |
| 4.3.2 GSE-BL 与底物相互作用的模拟 |
| 4.3.3 Val2Ala 突变 GSE-BL 的制备及鉴定 |
| 4.3.4 催化活性中心突变 GSE-BL 的制备及鉴定 |
| 4.3.5 Arg89Ala 突变 GSE-BL 的制备及鉴定 |
| 4.3.6 His190Ala 突变 GSE-BL 的制备及鉴定 |
| 4.3.7 参与二硫键形成氨基酸突变 GSE-BL 的制备及鉴定 |
| 4.3.8 GSE-BL 底物结合口袋的改造 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 GSE-BL 提高重组透明颤菌血红蛋白功能的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组质粒 pET22b-vgb 构建 |
| 5.3.2 重组 VHb 的表达及纯化 |
| 5.3.3 重组 VHb 中二聚体的含量 |
| 5.3.4 VHb-His6酶处理条件确定及其分离 |
| 5.3.5 VHb 的 CO 结合能力检测 |
| 5.3.6 VHb 的过氧化氢酶活性检测 |
| 5.3.7 VHb 添加对韦兰胶产量的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 GSE-BL 应用于人胰高血糖素的制备 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 重组质粒 pPIC9K-glucagon 的构建 |
| 6.3.2 酵母重组子的鉴定 |
| 6.3.3 重组胰高血糖素的表达及纯化 |
| 6.3.4 重组胰高血糖素 GSE-BL 处理时间确定 |
| 6.3.5 重组胰高血糖素标签去除与纯化 |
| 6.3.6 重组胰高血糖素的 HPLC 鉴定 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 GSE-BL 应用于成熟人β防御素-2 的制备 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 HBD-2 前原肽重组质粒的构建 |
| 7.3.2 重组 HBD-2 前原肽的小量表达 |
| 7.3.3 重组 HBD-2 前原肽的纯化及成熟化 |
| 7.3.4 HBD-2 前原肽及成熟肽 Western-blot 鉴定 |
| 7.3.5 HBD-2 抑菌活性检测 |
| 7.3.6 成熟 HBD-2 细胞毒性检测 |
| 7.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 论文创新性 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）1型鸭圆环病毒间接ELISA方法的建立及流行病学调查（论文提纲范文）
| 符号说明 中文摘要 ABSTRACT 1 前言 |
| 1.1 猪圆环病毒(PORCINE CIRCOVIRUS,PCV) |
| 1.1.1 病原学特征 |
| 1.1.2 病毒的分子生物学特征 |
| 1.1.3 流行病学特征 |
| 1.1.4 PCV2的致病机理 |
| 1.1.5 诊断方法 |
| 1.1.6 PCV的预防控制 |
| 1.2 鸡传染性贫血病毒(CHICKEN INFECTION ANAEMIA VIRUS,CAV) |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 检测方法 |
| 1.2.4 预防控制 |
| 1.3 鸭圆环病毒(DUCK CIRCOVIRUS,DuCV) |
| 1.3.1 病原学特征 |
| 1.3.2 分子生物学特征 |
| 1.3.3 流行病学特征 |
| 1.3.4 诊断方法 |
| 1.4 本研究的目的与意义 2 材料和方法 |
| 2.1 检测基因1型DuCV抗体的间接ELISA方法的建立及血清学调查 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂 |
| 2.1.4 用于蛋白纯化的溶液的配制 |
| 2.1.5 ELISA所用溶液 |
| 2.1.6 引物设计与合成 |
| 2.1.7 LJ07株Cap基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.8 SDS-PAGE |
| 2.1.9 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达和Western Blot分析 |
| 2.1.10 重组蛋白的变、复性及其纯化 |
| 2.1.11 间接ELISA条件的优化 |
| 2.1.12 间接ELISA的操作程序和结果判定 |
| 2.1.13 进行Western blot符合率的验证 |
| 2.1.14 间接ELISA方法的初步应用 |
| 2.2 2011年山东部分地区肉鸭鸭群基因2型DuCV血清学调查 |
| 2.2.1 血清、菌种、质粒及主要试剂 |
| 2.2.2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达和Western Blot分析 |
| 2.2.3 重组蛋白的变性、复性及其纯化 |
| 2.2.4 iELISA检测 3 结果与分析 |
| 3.1 检测基因1型DUCV抗体的间接ELISA方法的建立及血清学调查 |
| 3.1.1 DuCV Cap基因的克隆与鉴定 |
| 3.1.2 表达产物的分析 |
| 3.1.3 间接ELISA最佳反应条件的建立 |
| 3.1.4 Western blot符合率的验证 |
| 3.1.5 间接ELISA方法的初步应用 |
| 3.2 2011年山东部分地区肉鸭鸭群基因2型DuCV血清学调查 |
| 3.2.1 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.2 表达产物的Western-blot分析 |
| 3.2.3 DuCV抗体的iELISA检测结果 |
| 3.3 基因1型、2型间接ELISA检测结果的对比分析 |
| 3.3.1 两种已建立的IELISA方法的比较 |
| 3.3.2 基因1型鸭圆环病毒与基因2型鸭圆环病毒的血清学调查结果比较 4 讨论 |
| 4.1 检测基因1型DUCV抗体的间接ELISA方法的建立及血清学调查 |
| 4.2 2011年山东部分地区肉鸭群基因2型DUCV血清学调查 |
| 4.3 基因1型、2型间接ELISA检测结果的对比分析 5 结论 6 参考文献 7 致谢 8 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）肌抑素对小鼠巨噬细胞的影响及肌抑素和生长抑素免疫中和效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常见英文缩写词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 肌形成过程及其调控 |
| 1. 骨骼肌起源 |
| 2. 出生后骨骼肌的生长发育 |
| 3. 成年动物体骨骼肌的维持 |
| 4. 肌肉萎缩 |
| 5. 骨骼肌形成过程的调控 |
| 5.1 肌细胞的分化 |
| 5.2 肌肉调控因子(MRFs)对肌形成过程的调控 |
| 5.3 生长因子对肌形成过程的调控 |
| 第二节 IGF-1对肌形成过程的影响及其调控 |
| 1. IGF-1在骨骼肌中的生物学功能 |
| 2. IGF-1对肌肉特异转录因子(MRFs)的调控 |
| 3. IGF-1对肌肉萎缩的抑制作用 |
| 4. IGF-1在骨骼肌细胞的信号通路 |
| 5. 对IGF-1活性的调控 |
| 5.1 IGF-1结合蛋白(IGFBP) |
| 5.2 GH/IGF-1轴 |
| 5.3 生长抑素对GH/IGF-1轴的调控 |
| 5.4 生长抑素受体及信号通路 |
| 5.5 生长抑素拮抗剂及其免疫中和研究进展 |
| 5.5.1 生长抑素拮抗剂-半胱胺 |
| 5.5.2 免疫中和生长抑素 |
| 第三节 肌抑素对肌形成过程的影响 |
| 1. 简介 |
| 2. 组织表达分布 |
| 3. 肌抑素的生物合成途径 |
| 4. 生物学功能 |
| 4.1 对成肌细胞细胞周期的调控 |
| 4.2 对成肌细胞分化的调控 |
| 4.3 对骨骼肌蛋白合成和分解代谢的调控 |
| 5. 对肌抑素活性的调控 |
| 5.1 前体肽对肌抑素活性的调控 |
| 5.2 卵泡抑制素对肌抑素活性的调控 |
| 5.3 其他调控蛋白 |
| 6. 肌抑素的信号转导通路 |
| 6.1 Smad通路 |
| 6.2 非Smad通路 |
| 7. 肌抑素拮抗研究进展 |
| 第四节 免疫中和技术及其载体 |
| 1. 免疫中和技术 |
| 2. 免疫佐剂及抗原投递载体 |
| 2.1 CTB-霍乱毒素B亚基 |
| 2.2 CTA1-DD |
| 2.3 沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin |
| 2.4 细胞因子免疫调节剂-干扰素γ和GM-CSF |
| 3. 被动免疫与工程化抗体 |
| 第二章 肌抑素在小鼠淋巴细胞中的表达及其对巨噬细胞和树突状细胞的影响 |
| 摘要 |
| 第一节 小鼠肌抑素的组织器官表达分布 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 高脂日粮饲喂C57BL/6小鼠 |
| 2.2 脾脏淋巴细胞的分离、培养 |
| 2.3 LPS处理 |
| 2.4 RNA提取 |
| 2.5 反转录 |
| 2.6 荧光定量PCR |
| 2.7 统计分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 高脂日粮饲喂对小鼠体重及各组织器官重量的影响 |
| 3.2 高脂日粮饲喂对小鼠肌抑素、F4/80及CD68在不同组织器官中表达的影响 |
| 3.3 LPS处理对小鼠脾脏淋巴细胞肌抑素及卵泡抑制素表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 肌抑素对小鼠骨髓来源巨噬细胞的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物、主要器材及溶液配制 |
| 1.2 试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 小鼠骨髓单核细胞的制备及诱导巨噬细胞的分化培养 |
| 2.2 实验处理 |
| 2.3 RNA提取、反转录及荧光定量PCR |
| 2.4 ELISA检测 |
| 2.5 统计分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 肌抑素对巨噬细胞细胞因子基因表达的影响 |
| 3.1.1 肌抑素对巨噬细胞TNF-α表达的影响 |
| 3.1.2 肌抑素对巨噬细胞IL-1 β基因表达的影响 |
| 3.1.3 肌抑素对巨噬细胞IL-6基因表达的影响 |
| 3.1.4 肌抑素对巨噬细胞IL-10基因表达的影响 |
| 3.1.5 肌抑素对巨噬细胞IFN γ基因表达的影响 |
| 3.2 肌抑素对巨噬细胞分类标志基因(iNOS)表达的影响 |
| 3.3 巨噬细胞肌抑素受体基因(ActRⅡA、ActRⅡB)表达规律 |
| 3.3.1 LPS处理对巨噬细胞肌抑素受体基因ActRⅡB表达的影响 |
| 3.3.2 肌抑素处理对巨噬细胞肌抑素受体ActRⅡB表达的影响 |
| 3.3.3 LPS处理对巨噬细胞肌抑素受体基因ActRⅡA表达的影响 |
| 3.3.4 肌抑素处理对巨噬细胞肌抑素受体ActRⅡA表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 第三节 肌抑素对小鼠巨噬细胞系RAW264.7的影响及信号通路研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 小鼠巨噬细胞系RAW263.7细胞的培养 |
| 2.2 实验处理 |
| 2.3 RNA提取、反转录及荧光定量PCR |
| 2.4 统计分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 肌抑素对RAW264.7(TNF-α、IL-1 β、IFNγ、iNOS、COX2)基因表达的影响 |
| 3.1.1 肌抑素对RAW264.7 TNF-α表达的影响 |
| 3.1.2 肌抑素对RAW264.7 IL-1β表达的影响 |
| 3.1.3 肌抑素对RAW264.7 IFNγ表达的影响 |
| 3.1.4 肌抑素对RAW264.7 iNOS表达的影响 |
| 3.1.5 肌抑素对RAW264.7 COX2表达的影响 |
| 3.2 肌抑素受体对RAW264.7细胞因子表达的影响 |
| 3.3 肌抑素对RAW264.7细胞信号通路的影响 |
| 4. 讨论 |
| 第四节 肌抑素对小鼠骨髓来源树突状细胞及其因子表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物、主要器材及溶液配制 |
| 1.2 试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 小鼠骨髓单核细胞的制备及树突状细胞的诱导分化培养 |
| 2.2 实验处理 |
| 2.3 提取RNA、反转录 |
| 2.4 荧光定量PCR |
| 2.5 统计分析 |
| 3. 肌抑素对树突状细胞TNF-α、IL6及IL10基因表达的影响结果及讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 免疫中和生长抑素 |
| 摘要 |
| 第一节 小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子/生长抑素融合蛋白的构建、表达及其对小鼠生长的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞培养相关试剂 |
| 1.3 宿主菌和载体 |
| 1.4 酶、其他试剂和试剂盒 |
| 1.5 主要化学试剂的配制 |
| 1.6 本节所用引物 |
| 1.7 合成多肽 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆 |
| 2.1.1 小鼠脾脏细胞的分离、培养 |
| 2.1.2 脾脏细胞的PHA刺激 |
| 2.1.3 提取总RNA |
| 2.1.4 反转录 |
| 2.1.5 PCR扩增小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因 |
| 2.1.6 基因的纯化、TA克隆 |
| 2.1.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.1.8 热激转化、涂板、鉴定阳性克隆、测序 |
| 2.2 小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子/生长抑素融合基因及其表达载体的构建 |
| 2.2.1 SOE PCR融合基因的构建 |
| 2.2.2 表达载体构建 |
| 2.3 表达与纯化 |
| 2.3.1 诱导表达 |
| 2.3.2 亲和纯化 |
| 2.3.3 蛋白的透析复性 |
| 2.3.4 SDS-PAGE和Western Blot |
| 2.4 免疫小鼠 |
| 2.5 ELISA检测小鼠血清生长抑素抗体水平 |
| 2.6 ELISA检测小鼠血清生长激素水平 |
| 2.7 荧光定量PCR检测小鼠肝脏和肌肉IGF-1、myostatin表达水平 |
| 2.8 小鼠血清生化指标测定 |
| 2.9 统计分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 GM-CSF基因的克隆及融合基因表达载体构建 |
| 3.2 融合蛋白的表达及纯化 |
| 3.3 对小鼠体重的影响 |
| 3.4 对小鼠血清特异抗生长抑素抗体的影响 |
| 3.5 对小鼠血清生长激素的影响 |
| 3.6 对小鼠血清生化指标的影响 |
| 3.7 对小鼠肝脏、肌肉IGF-1和myostatin基因表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 霍乱毒素B亚基/生长抑素融合基因的构建、表达及对小鼠生长的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 融合基因及重组表达载体的构建 |
| 2.2 融合蛋白的表达、纯化 |
| 2.3 纯化后蛋白的五聚体化 |
| 2.4 SDS-PAGE和Western Blot检测 |
| 2.5 融合蛋白的生物活性检测 |
| 2.6 免疫小鼠 |
| 2.7 血清抗体水平检测 |
| 2.8 血清生长激素水平、生化指标检测 |
| 2.9 统计分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 CTB/SS融合基因及重组表达载体的构建 |
| 3.2 重组蛋白的表达、纯化及五聚体化 |
| 3.3 重组CTB/SS生物活性检测 |
| 3.4 重组蛋白对小鼠体重的影响 |
| 3.5 血清抗体水平 |
| 3.6 血清生长激素水平、生化指标检测 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 抗肌抑素单链抗体的合成、表达及其对成肌细胞和肌纤维的影响 |
| 摘要 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 引物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 质粒 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 抗肌抑素单链抗体的拼接与密码子优化 |
| 2.2 单链抗体的全基因合成 |
| 2.3 表达载体的构建及蛋白表达 |
| 2.4 亲和层析 |
| 2.5 SDS-PAGE和Western Blot检测 |
| 2.6 ELISA检测纯化后蛋白与抗原的结合能力 |
| 2.7 单链抗体对成肌细胞增殖的影响 |
| 2.7.1 单链抗体对成肌细胞增殖的影响-MTT法检测 |
| 2.7.2 Q-PCR检测p21基因表达 |
| 2.8 单链抗体对H_2O_2诱导的肌细胞肌肉萎缩标志基因表达的影响 |
| 2.9 单链抗体对肌抑素信号通路的影响 |
| 2.10 统计分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 单链抗体基因序列的优化 |
| 3.2 序列的合成、表达载体的构建 |
| 3.3 蛋白的表达纯化 |
| 3.4 单链抗体与抗原的亲和力检测 |
| 3.5 对细胞增殖的影响 |
| 3.6 肌肉萎缩标志E3泛素连接酶MAFbx和MuRF1基因表达的影响 |
| 3.7 单链抗体对肌抑素Smad信号通路的影响 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 论文创新点及后续研究展望 |
| 1.创新点 |
| 2.后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表与录用的论文 |
| 致谢 |
（9）包含体表达基因工程牛生长激素提取、变复性及纯化的研究（论文提纲范文）
| 1 材 料 与 方 法 |
| 1.1 溶液的配方 |
| 1.2 包含体提取流程 |
| 1.3 变复性程序 |
| 2 结 果 与 分 析 |
| 2.1 包含体的提取 |
| 2.2 不同复性方法的比较 |
| 2.3 溶解变性时间的确定 |
| 2.4 蛋白浓度对复性率的影响 |
| 2.5 尿素浓度、pH对复性率的影响 |
| 2.6 复性rBGH选择性沉淀 |
| 2.7 超滤浓缩 |
| 2.8 复性蛋白的FPLC纯化 |
| 2.9 分离纯化及变复性过程小结 |
| 3 结 论 与 讨 论 |
（10）重组猪生长激素抗体的制备与纯化（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基因工程菌 (pPGH020/BL21) 的诱导培养 |
| 1.2.2 菌体收集、洗涤与裂解 |
| 1.2.3 rpGH包涵体变性与复性 |
| 1.2.4 金属螯合亲和色谱纯化 |
| 1.2.5 兔抗rpGH多克隆抗体的制备及效价测定 |
| 1.2.6 兔抗rpGH多克隆抗体的纯化 |
| 1.2.7 免疫印迹分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大肠杆菌表达产物rpGH的纯化 |
| 2.2 兔抗rpGH抗血清IgG的的含量测定、纯化及免疫印迹分析 |
| 3 讨论 |
四、大肠杆菌中重组猪生长激素提取方法及变复性的比较研究（论文参考文献）
- [1]白细胞介素-6对草鱼GH-IGFs轴相关基因表达调控的研究[D]. 曾婷婷. 电子科技大学, 2021(01)
- [2]广谱降解饲料中主要霉菌毒素的酶作用机制及高效表达[D]. 王晓璐. 中国农业科学院, 2020
- [3]采用新型Fh8-ΔI-CM标签自切除系统制备可溶TRAIL蛋白[D]. 张敏. 华东理工大学, 2018(11)
- [4]鸡生长激素在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定[J]. 郁建锋,何赛,金泽楷,周欢庆,董小敏,龚道清,顾志良. 中国畜牧兽医, 2016(11)
- [5]重组大肠杆菌表达外源蛋白的共性发酵调控策略研究[D]. 宋浩. 华东理工大学, 2016(05)
- [6]地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶的功能特性研究[D]. 叶伟. 华南理工大学, 2013(11)
- [7]1型鸭圆环病毒间接ELISA方法的建立及流行病学调查[D]. 王鑫. 山东农业大学, 2012(08)
- [8]肌抑素对小鼠巨噬细胞的影响及肌抑素和生长抑素免疫中和效果研究[D]. 吴兵兵. 浙江大学, 2012(08)
- [9]包含体表达基因工程牛生长激素提取、变复性及纯化的研究[J]. 于瑞嵩,沈世缘,董世娟,朱于敏,李震. 上海农业学报, 2009(01)
- [10]重组猪生长激素抗体的制备与纯化[J]. 姜秀英,朱江. 淮阴师范学院学报(自然科学版), 2006(04)