一、p27~(kip1)蛋白在宫颈癌组织中的表达及其意义（论文文献综述）
张艳丽[1]（2021）在《CSN6在黑色素瘤增殖、转移中的作用及机制研究》文中提出恶性黑色素瘤（malignant melanoma,MM）因其发展迅速、易转移和临床预后差而成为最致命的皮肤肿瘤。虽然早期黑色素瘤通常可以通过手术切除治愈,但晚期转移性黑色素瘤对放疗和化疗的反应较差。近10年来,靶向治疗和免疫治疗的发展极大地改善了转移性黑色素瘤患者的预后,但继发性耐药影响了其长期疗效。因此,迫切需要进一步探索黑色素瘤的发病机制,寻找新的可能的生物标志物和靶点,为改善黑色素瘤患者的预后提供依据。组成型光形态发生因子9（constitutive photomorphogenic 9,COP9）信号复合体（COP9 signalosome,CSN）是进化保守的多功能蛋白复合体,普遍存在于所有真核生物中。CSN由9个亚基组成,包括CSN1-CSN8和CSN酸性蛋白（CSN acidic protein,CSNAP）。CSN复合物是Cullin-RING-泛素连接酶（Cullin-RING Ligase,CRL）的重要调节因子,并修饰CRL介导的蛋白降解。近年来,已发现COP9信号复合体亚基6（COP9signalosome subunit 6,CSN6）在肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、甲状腺乳头状瘤、宫颈癌和胰腺癌中高表达,并且与这些肿瘤的进展密切相关,表明CSN6可能是一个潜在的预后标志物和治疗靶标。研究表明CSN6可以通过调控E3泛素连接酶的自泛素化和降解,进而调控蛋白质的表达。然而,CSN6在黑色素瘤中的表达情况和生物学功能尚不清楚。本研究的目的是验证CSN6在黑色素瘤中的作用,并进一步探索CSN6促进黑色素瘤细胞增殖和迁移侵袭的分子机制。主要研究结果如下:（1）CSN6在黑色素瘤中高表达,并且CSN6高表达与黑色素瘤患者的不良预后相关为了确定CSN6在黑色素瘤中的表达水平,我们进行了免疫组织化学实验（Immunohistochemical staining,IHC）检测,证实与良性痣相比,CSN6在黑色素瘤中高表达。接下来,我们检测了CSN6在A375、MV3和Skmel28黑色素瘤细胞系以及永生化黑素细胞系PIG1中的表达水平。我们发现,与PIG1细胞系相比,CSN6在黑色素瘤细胞系中过表达。为明确CSN6的表达与黑色素瘤患者预后的关系,我们对来自R2数据库的黑色素瘤临床数据进行生存分析,发现CSN6的高水平表达和黑色素瘤患者总体生存差相关。此外,CSN6水平随着肿瘤病理分期的进展而显着升高。综上所述,CSN6在黑色素瘤细胞系和黑色素瘤组织中表达上调,且其表达上调与黑色素瘤患者的预后差有关。（2）CSN6对黑色素瘤细胞增殖、克隆形成能力以及成瘤性的影响首先我们通过慢病毒介导的sh RNA技术,用sh CSN6质粒转染A375和MV3黑色素瘤细胞系以达到敲低CSN6的目的。为了探究CSN6下调对细胞活力的影响,我们通过四甲基偶氮唑蓝（Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT）分析发现CSN6下调降低了黑色素瘤细胞的增殖能力。通过5-溴脱氧尿苷（5-Bromo-2’-deoxyuridine,Brd U）实验,发现下调CSN6显着抑制了黑色素瘤细胞的DNA复制能力。接下来,进行了流式细胞分析,结果表明下调CSN6表达可诱导细胞周期在G1期的阻滞。最后,我们还通过蛋白免疫印迹（Western Blot）实验检测了一些周期调控蛋白的表达,显示下调CSN6后,细胞中Cyclin D1、CDK1和CDK4的水平显着降低,而p21和p27的表达显着增加。为明确CSN6的确参与了黑色素瘤细胞的增殖,我们通过将CSN6全长序列转染到sh CSN6#1的黑色素瘤细胞中,部分恢复了CSN6的表达。MTT和Brd U分析显示CSN6下调后再恢复CSN6表达部分挽救了黑色素瘤细胞的增殖。接下来Western Blot结果也显示CSN6的恢复导致Cyclin D1、CDK1及CDK4的表达增加,而p21和p27的表达降低。我们通过Soft Agar分析检测CSN6对黑色素瘤细胞体外克隆形成能力的影响,结果显示CSN6下调抑制了黑色素瘤细胞克隆形成能力。为了评估CSN6在黑色素瘤发生中的作用,我们进行了裸鼠皮下成瘤实验,结果显示CSN6下调显着抑制了黑色素瘤细胞的成瘤性。综上所述,这些发现表明CSN6促进了黑色素瘤细胞的增殖、克隆形成及成瘤性。（3）CSN6对黑色素瘤细胞迁移及侵袭能力的影响我们通过Transwell实验来探究CSN6对黑色素瘤细胞迁移及侵袭能力的影响,结果显示在A375和MV3黑色素瘤细胞中下调CSN6后细胞的迁移、侵袭能力明显降低。我们进一步检测了一些转移调控蛋白的表达水平,结果显示在下调CSN6后,间充质标记物N-cadherin和Vimentin的表达降低,而E-cadherin（上皮标记物）的表达上调。这些结果表明,黑色素瘤细胞的迁移及侵袭能力在下调CSN6表达后被显着抑制。接下来,我们发现在CSN6下调后再恢复CSN6表达部分挽救了黑色素瘤细胞的迁移及侵袭能力。此外,Western Blot结果显示恢复CSN6的表达导致N-cadherin和Vimentin的水平增加,而E-cadherin的水平降低。综上说明CSN6促进了黑色素瘤细胞的迁移、侵袭能力。（4）CSN6与CDK9相互作用并调节CDK9的稳定性为了明确CSN6在黑色素瘤细胞中可能的相互作用蛋白,我们进行了免疫共沉淀-质谱分析实验,并检测到细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）9可能是一个潜在的CSN6相互作用蛋白。免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation,co-IP）实验进一步验证了在A375和MV3黑色素瘤细胞中,CSN6与CDK9相互作用。为了探究CSN6是否影响CDK9的表达,我们通过Western Blot分析发现CSN6下调导致CDK9的蛋白水平显着降低,在恢复CSN6表达后,CDK9的蛋白水平也得到恢复,但是实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time fluorescent quantitative Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）显示CDK9的m RNA水平不受CSN6影响,说明CDK9的表达可能在转录后水平被CSN6调控。通过加入放线菌酮（Cycloheximide,CHX）探讨CDK9的稳定性是否受CSN6的影响,结果发现过表达CSN6导致CDK9的周转率降低。此外,我们发现蛋白酶体抑制剂MG132明显挽救了CSN6下调导致的CDK9表达降低,表明CSN6可能通过调控CDK9的泛素化稳定其表达。因此我们检测了黑色素瘤细胞和293FT细胞中CDK9的泛素化水平,发现在过表达CSN6后,CDK9的泛素化水平降低了,说明CSN6抑制CDK9的泛素化。综上所述,研究发现CSN6与CDK9相互作用并通过调控CDK9泛素化降解来稳定CDK9表达。（5）CSN6通过调控UBR5的泛素化降解来调节CDK9的稳定性已有研究报道CSN6可调节部分E3泛素连接酶的稳定性,如β-Trcp、E6AP、Fbxw7。已有研究报道泛素蛋白连接酶E3成分N-识别蛋白5（Ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 5,UBR5）可泛素化CDK9,因此我们假设CSN6通过调节E3泛素连接酶UBR5来稳定CDK9的表达。co-IP实验显示在A375和MV3黑色素瘤细胞中CSN6与UBR5相互作用。Western Blot分析表明,在293FT细胞中,CSN6以剂量依赖的方式增加了CDK9的表达,降低了UBR5的表达。并且在A375和MV3黑色素瘤细胞中,CSN6也负向调节UBR5的表达。然而,q RT-PCR显示UBR5的m RNA水平不受CSN6的影响,说明CSN6可能在转录后水平调控UBR5表达。为验证这一假设,我们通过加入CHX发现下调CSN6后UBR5蛋白的周转率下降。通过加入MG132发现MG132可以挽救CSN6介导的UBR5下调,说明CSN6可能调控UBR5的泛素化。为了进一步探究CSN6是否通过控制E3连接酶UBR5的泛素化和降解以稳定CDK9,进行了体内泛素化实验,发现在黑色素瘤细胞和293FT细胞中,CSN6促进了UBR5的泛素化。综上表明CSN6通过促进泛素介导的UBR5的降解以稳定CDK9的表达。（6）再次下调UBR5表达可以部分逆转CSN6下调对黑色素瘤细胞的抑制作用上述研究表明CSN6通过促进泛素介导的UBR5的降解来稳定CDK9的表达,因此我们推测UBR5可能是CSN6的下游效应因子。为证明这个推测,我们进行了双干涉实验,Western Blot结果显示在CSN6下调的黑色素瘤细胞中再下调UBR5表达后恢复了CDK9的表达。接下来进行了MTT、Soft Agar、皮下成瘤实验和Transwell实验,结果显示再次下调UBR5挽救了CSN6下调对黑色素瘤细胞的增殖、克隆形成、成瘤性及迁移、侵袭能力的抑制作用,表明UBR5是CSN6的一个关键的下游因子。综上所述,我们的研究证明了CSN6在黑色素瘤细胞系和组织中高表达,且其高表达与黑色素瘤患者的预后差相关。E3泛素连接酶UBR5能调控CDK9的泛素化降解,并且UBE5是CSN6的重要下游效应因子。CSN6通过促进泛素介导的UBR5的降解来稳定CDK9的表达,并通过CDK9介导的信号通路促进黑色素瘤细胞的增殖、克隆形成、成瘤性及迁移、侵袭。总之,本研究阐明了CSN6-UBR5-CDK9轴促进黑色素瘤发生发展的机制,并证明CSN6有望成为黑色素瘤的潜在生物标志物和抗癌靶点。
陈晓文[2]（2021）在《Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究》文中研究表明研究背景:慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是临床常见的血液系统恶性肿瘤,主要特征为骨髓造血生成大量未成熟的白细胞,其发病率高达新发成人白血病的20%。BCR-ABL融合基因目前被认为是CML发病的重要原因和基本特征,该融合基因表达可生成具备组成性酪氨酸激酶活性的BCR-ABL嵌合蛋白。在CML的临床治疗中,特异性BCR-ABL抑制剂,如酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）可将患者生存率显着提高,已被临床广泛应用。伊马替尼是（IM）一种通过阻断BCR-ABL蛋白的非活性构象的TKI,首次应用于CML的治疗,疗效显着,毒性较低。但仍有大量CML患者对伊马替尼不敏感或通过多种细胞机制产生耐药性。因此,在CML进展过程中筛选出有效的治疗靶点是非常迫切的,这将有助于提高CML在TKI药物治疗中的效果。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）是由人Skp2基因编码的E3泛素连接酶。Skp2是一种C-Myc直接靶基因,在细胞周期进程的调控中起重要作用,多种恶性肿瘤中常发现有其表达上调。在血清缺乏的细胞中,Skp2过表达从而诱导细胞周期素A积累和p27磷酸化依赖性的降解从而促进细胞进入S期。Skp2还参与其他细胞周期调节蛋白的泛素化,包括细胞周期蛋白E和转录因子E2F1。目前国内外多项研究证实Skp2与许多实体肿瘤的化疗耐药性有关。如Skp2通过p27-CDKs-E2F1途径正向调节有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitotic arrest deficient 2,MAD2）的表达,通过抑制Skp2可以增强肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。但Skp2在CML中的发生和抗肿瘤耐药中的作用尚待明确。研究目的:比较CML患者与正常对照组外周血白细胞中Skp2的蛋白水平与m RNA水平。探究Skp2的异常表达在K562细胞中的作用机制:在K562细胞中稳定敲减和过表达Skp2基因,检测细胞数量变化和细胞的增殖能力变化。在K562细胞中分别敲减和过表达c AMP应答元件结合蛋白（CREB）基因,检测Skp2的m RNA水平。检测抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴后K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。研究方法:1.收集24例新诊断的CML患者（研究组）和7例健康体检者（对照组）外周血,对外周血样本进行白细胞分离。分别通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）分析两组样本中Skp2的m RNA水平和蛋白水平。2.人CML细胞系K562在37℃,5%的CO2条件下用的RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）培养。构建基于PLK0.1的sh RNA-Skp2质粒,在K562细胞中稳定敲减Skp2,用Western Blot法检测稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞中Skp2蛋白水平,验证敲减Skp2基因的效果。通过细胞计数分析,比较K562细胞在Skp2稳定敲减和未敲减情况下的细胞增殖率,对稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞用Ed U染色及Hoechst 33342染色法观察细胞核,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞的比值。在K562细胞中转染Flag-Skp2质粒,对过表达Skp2的K562细胞行Western Blot分析,采用细胞计数分析法测定过表达Skp2的K562细胞的细胞数变化,并用Ed U染色及Hoechst33342染色观察细胞形态,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞之比。3.利用Jas PAR软件对编码Skp2基因的上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在保守的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析证实CREB基因和Skp2启动子中CREB结合区（BR）的基因片段之间存在特异性结合。构建一系列含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒。将K562细胞与含有野生型或突变型Skp2启动子区的PGL3荧光素酶报告质粒以及Flag或Flag-CREB质粒共转染K562细胞,转染后取细胞溶解物,使用荧光素酶测定其转录活性,用Western Blot法验证CREB的过表达效果,同时通过q RT-PCR测定Skp2的m RNA水平。K562细胞与含有sh RNA-CREB基因或sh RNA-ctrl基因共转染,转染后行Western Blot法证实基因敲减效果,荧光素酶分析转录活性。用q RT-PCR测定CREB基因敲减前后K562细胞中Skp2 m RNA水平变化。4.用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与sh RNA-ctrl组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用二甲基亚砜或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂Ly294002（10μmol/L）预处理K562细胞4 h,伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与对照组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,Western Blot分析caspase-3/7活性和PARP的裂解。K562细胞分别加用和不加Ly294002预处理再加用伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,试剂盒检测caspase-3/7活性并用Western Blot分析PARP的裂解。研究结果:1.和健康对照组相比,Skp2在CML患者中异常表达。收集24例CML患者和7例健康体检者外周血白细胞,CML样本显示Skp2的m RNA水平及蛋白水平均较健康对照组显着上调。数据表明CML患者Skp2表达上调,Skp2蛋白水平与m RNA水平呈一致性改变。2.Skp2是K562细胞增殖的关键。在K562细胞中稳定敲减Skp2基因,与对照组细胞相比,敲减了Skp2的K562细胞的细胞数量显着减少。Ed U分析显示敲减Skp2的K562细胞增殖能力显着低于对照组细胞。3.Skp2过表达影响K562细胞的增殖。与敲减基因结果相反,通过过表达Skp2基因,K562细胞数量增加。与此相关,Skp2过表达导致K562细胞中Ed U阳性细胞百分比显着增加。4.Skp2通过CREB转录调控。利用Jas PAR软件对Skp2编码基因上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析显示,CREB能和Skp2基因中CREB结合区（BR）的基因片段特异性。构建一系列包含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒,将含有WT或MUT的Skp2启动子区以及Flag或Flag-CREB的质粒共转染K562细胞,野生型CREB-BR（WT）转录活性在过表达CREB后明显升高,但突变型质粒（MUT）和p GL3空载体转录活性未见明显升高。相反,野生型CREB-BR（WT）转录活性在稳定敲减CREB基因的K562细胞中降低,同样突变型构建体（MUT）和PGL3空载体均未显示转录活性的改变。5.CREB的稳定敲减导致K562细胞中Skp2 m RNA水平显着降低。鉴于CREB的转录活性是由其第133位丝氨酸磷酸化后被活化的,我们试图评估野生型的Flag-CREB和第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对Skp2表达的影响。野生型的Flag-CREB能够上调Skp2的m RNA水平,但第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对于Skp2的m RNA水平无明显的调控作用。以上结果提示,在K562细胞中Skp2的表达在转录水平受到CREB的调控。6.抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴增加K562细胞对伊马替尼的敏感性。用伊马替尼处理（1μmol/L）CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞并观察其存活率,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后表现出细胞活力的急剧下降。7.CREB或Skp2的敲减导致伊马替尼处理的K562细胞中caspase-3/7活性的显着增加。caspase-3/7的活化是对伊马替尼治疗敏感性的响应,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后与对照组细胞药物处理后相比,caspase-3/7的活化及PARP的裂解更明显。8.PI3K/Akt信号通路在关联CREB的激活及Skp2的表达中起到特定的作用。在K562细胞中稳定敲减Akt或使用LY294002来抑制PI3K/Akt通路,结果导致伊马替尼处理的K562细胞活力显着下降,Skp2蛋白水平降低,caspase-3/7活化及PARP裂解明显增强,说明K562细胞对伊马替尼更加敏感。结论:与健康对照者相比,初治CML患者外周血白细胞中Skp2高表达,并且Skp2高表达对CML细胞增殖至关重要。从机制上讲,在K562细胞中Skp2受PI3K/Akt-CREB信号通路的转录调控。此外,稳定敲减Skp2的表达或阻断PI3K/Akt-CREB通路可显着提高K562细胞对伊马替尼的敏感性。
白米雪[3]（2020）在《去泛素化酶OTUD5与CacyBP的相互作用及OTUD5在宫颈癌中的生物信息学分析》文中指出目的研究发现,OTUD5（OTU deubiquitinase 5）作为OTU亚家族中的重要成员之一,在DNA损伤修复和免疫学领域扮演着重要角色。目前来说OTUD5的研究相对较少,并且其是否能够被调控仍未知。钙周期素结合蛋白（Calcyclin binding protein,CacyBP）在小鼠艾氏腹水细胞瘤中以S100A6蛋白的靶分子形式发现。研究发现CacyBP影响多种肿瘤的发生发展,此外已有报道表明在人胶质瘤细胞中过表达CacyBP下调p53的蛋白水平。目前,OTUD5在肿瘤中的功能尚不清楚,通过生物信息学分析OTUD5在宫颈癌中的表达给相关研究提供借鉴。去泛素化酶OTUD5是否与CacyBP相互作用和对宫颈癌的调控尚不清楚。方法利用Western blot实验检测OTUD5或CacyBP过表达后外源底物蛋白的变化。采用RNA干扰技术敲低OTUD5或CacyBP后检测内源底物蛋白的变化。采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测OTUD5或CacyBP过表达对底物mRNA水平的影响。利用半衰期实验检测CacyBP过表达后底物蛋白OTUD5的降解速率,探讨CacyBP对OTUD5稳定性的调节。运用体内泛素化实验检测OTUD5或CacyBP过表达或敲低对底物蛋白的泛素化水平的影响。通过核质分离试剂盒以及Western blot,检测OTUD5过表达是否影响CacyBP的核质定位。利用Oncomine、GEPIA、UALCAN数据库分析CESC组织中的OTUD5 mRNA水平的变化。利用LinkedOmics分析OTUD5基因的共表达基因和miRNA。利用cBioPortal数据库分析OTUD5在CESC组织中DNA拷贝数的变化。利用GeneMANIA数据库分析OTUD5的相互作用蛋白。用t检验验证CESC与癌旁组织中OTUD5 mRNA表达差异。用Spearman相关系数分析基因表达的相关性。采用Kaplan-Meier生存分析计算生存率,采用广义log-rank检验估计生存率的差异。结果（1）CacyBP和OTUD5具有相互作用,CacyBP过表达降低OTUD5蛋白水平,缩短OTUD5蛋白半衰期,但对其mRNA水平没有影响。CacyBP增加OTUD5蛋白的泛素化水平。且CacyBP通过OTUD5降低p53的蛋白水平。（2）OTUD5不影响CacyBP mRNA和蛋白水平的变化,但OTUD5的过表达促进CacyBP的核定位。（3）OTUD5在宫颈癌中的低表达与不良预后有关。它的表达与宫颈癌的肿瘤分期,转移性淋巴结相关。此外,OTUD5的低表达与宫颈癌的不同亚型有关,例如与磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-AKT信号传导,上皮-间质转化（EMT）和激素有关的亚型。通过分析OTUD5的共表达基因,相关的mi RNA,转录因子,激酶,E3和相互作用蛋白。我们证明了OTUD5影响WDR45,USP11,GRIPAP1和RBM10的表达水平。此外,hsa-mir–137、hsa-mir–1913、hsa-mir–937、hsa-mir–607、hsa-mir-3149和hsa-mir-144可能会抑制OTUD5的表达。综上,我们对22个共表达基因,33个相关miRNA和30个相互作用蛋白进行了富集分析。除了泛素化和免疫学相关过程外,它们还参与Hippo信号传导,胰岛素信号传导,EMT,组蛋白甲基化和磷酸化激酶结合。结论CacyBP通过与OTUD 5相互作用,CacyBP使OTUD5蛋白发生泛素化降解且稳定性降低;OTUD5促进CacyBP的核定位,降低其泛素化水平。研究首次分析了OTUD5在宫颈癌中的表达及其与临床病理的关系,并为进一步研其在肿瘤中的调控机制提供了新的见识。
张冬冬[4]（2020）在《转录因子NUB1调控胃癌恶性生物学行为的分子机制研究》文中研究说明肿瘤的发生发展是一种多因素,多步骤的疾病,这其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活等多种机制的失调。胃癌是消化系统中一种常见的恶性肿瘤,2018年在全球造成超过100W的新发病例和约78W的死亡病例的出现,这使得它成为全球范围内第五大最常被诊断出的癌症以及癌症死亡的第三大主要原因。尽管我们在外科手术治疗及辅助放化疗方面取得了长足的发展,预后不良仍旧是胃癌的顽疾之一。活跃的增殖性、强烈的侵袭及转移性以及胃癌本身的高异质性都是造成胃癌难以治愈的重要因素。因此研究探索介导胃癌发生发展的分子机制以及细胞调节机制显得尤为重要。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种关键方式,它在真核细胞生物体内的诸多生物学过程中起着至关重要的调节作用,它可以参与调节细胞周期、基因转录、细胞增殖以及信号转导等多种生理过程。此外,泛素化的调控机制在肿瘤的发生发展中也起着至关重要的作用,多种癌基因亦或是抑癌基因的表达受到这种机制的监管。蛋白质泛素化降解的基本方式:泛素亦或是泛素样蛋白通过结合泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和决定底物特异性的泛素连接酶E3形成复合物,然后附着于特异性的底物,从而实现对底物的泛素化标记,然后再通过泛素蛋白酶体系统对底物完成最终的降解。NUB1（negative regulator of ubiquitin-like protein-1）是泛素化调控系统的负性调节因子,它的主要调节目标是一种高度保守的泛素样蛋白NEDD8,NUB1可以通过负性调节NEDD8与其靶蛋白的缀合系统来控制多种底物的泛素化降解。目前,已有许多研究证实,NUB1在诸多类型的癌症中均有异常的表达,例如肾癌、直肠癌和宫颈癌。但是它在胃癌中的表达情况以及调控机制,我们却知之甚少。转移是造成癌症相关死亡的主要原因,上皮-间质转化（EMT）程序的部分激活被认为是增加肿瘤启动和转移潜能的关键驱动器。包括胃癌在内,几乎所有肿瘤的恶性进展均与EMT密切相关。上皮细胞形态过渡到间充质细胞形态时,多种EMT相关标记物会随之发生改变,如上皮细胞形态标记物E-钙黏蛋白表达会下降,同时间充质细胞形态的相关标记物,特别是N-钙黏蛋白,波形蛋白以及基质金属蛋白酶的表达会升高。这些改变会进一步促进肿瘤的恶性进展。此外,多个信号通路的激活也会诱导EMT,包括经典WNT,TGF-β,NF-κB通路等等。泛素化机制可以参与调控这些通路中部分关键蛋白的表达。然而NUB1作为负性调控泛素化过程的关键转录因子,它对于胃癌的侵袭和EMT的调控作用,我们仍然是未知的。本研究中,基于116例术后胃癌患者的组织切片以及对应的癌旁组织切片的免疫组织化学染色结果,我们对比了NUB1蛋白在癌组织与癌旁组织中的表达情况,同时分析了NUB1蛋白表达与临床病理特征之间的关系。此外,结合网络在线数据库,包括蛋白质表达和mRNA表达两个层面在内,我们还分析了NUB1表达与患者预后的关系。另一方面,我们还通过体外的细胞实验,验证了过表达NUB1对于胃癌的恶性生物学行为的影响作用,包括增殖、迁移和侵袭。通过流式细胞术分析了它对细胞周期的调控作用,尤其是控制细胞周期G1/S期的过渡。利用实时定量PCR（RT-PCR）和蛋白质印迹实验分析了NUB1对于EMT部分关键指标和抑癌基因p27Kip1表达的调控作用。本次研究,我们重点讨论了NUB1的过表达如何调控胃癌的发生和进展以及对于胃癌上皮间质转化（EMT）的影响,这些新的发现可为NUB1在抗癌过程中充当新型药物的载体或是诊断标记物提供帮助。当然,根据组化实验的结果,NUB1蛋白的表达对于胃癌的临床意义也是重要新发现的一部分。鉴于NUB1在胃癌的发生发展上积极的抑癌作用,我们希望通过此项研究帮助科研工作者更好的认识胃癌的发病机制,也为临床上制定更加精准的抗肿瘤方案提供潜在的策略。第一部分NUB1蛋白在胃癌及癌旁样本中的表达情况的研究目的:探索胃癌及癌旁病理组织样本中NUB1蛋白表达的意义。材料和方法:利用免疫组化染色的方法,对116例胃癌及配对的癌旁样本的石蜡切片进行检测,分析了NUB1在癌与癌旁样本中的表达差异。基于患者病理样本的组化评分结果,通过卡方检验和斯皮尔曼相关性系数分析了NUB1表达与临床病理特征之间的关系。同时,结合在线数据库mRNA表达数据,采用Kaplan-Meier估计和Log-Rank检验的方法,我们在蛋白质水平和mRNA水平两个层面上分析了NUB1表达与患者预后的关系,同时,通过构建COX比例风险模型,基于单因素和多因素的分析模式,评价了NUB1表达对于胃癌患者预后的价值。最后,结合患者淋巴结检查的临床信息,分析了NUB1表达与患者淋巴结阳性率之间的关系。结果:免疫组化实验结果显示,相对于癌旁样本,NUB1在胃癌组织中表达下调。NUB1蛋白表达水平与患者肿瘤大小、Borrmann分型、淋巴结转移、淋巴管浸润、TNM分期以及患者生存状态密切相关。生存分析结果显示,无论在蛋白质表达水平,还是在mRNA表达水平,低表达NUB1的患者预后更差。同时结合COX多因素分析的结果,包括Borrmann分型和TNM分期在内,证实NUB1的表达与胃癌患者的预后显着相关,结果有统计学意义。此外,淋巴结阳性率的比较证实,低表达NUB1的患者相对于高表达NUB1的患者拥有更高的淋巴结阳性率。结论:NUB1在胃癌组织中的低表达以及它与临床病理特征之间的紧密联系提示NUB1对于胃癌的发生发展意义重大。生存分析结果提示NUB1表达与患者预后之间存在密切关联,同时预后的多因素分析结果证实NUB1的表达有成为胃癌患者独立预后因素的可能。最后,淋巴结阳性率的比较提示低表达NUB1的患者拥有更高的淋巴结转移的风险。第二部分细胞实验研究NUB1调控胃癌恶性表型的作用机制目的:探索体外NUB1对于胃癌恶性生物学行为的调控作用。材料和方法:NUB1过表达细胞模型通过慢病毒转染的方式进行构建,实时定量PCR（RT-PCR）和蛋白质印迹实验确定慢病毒的转染效率。利用CCK-8试剂盒检测NUB1对于胃癌细胞系增殖活性的影响。利用荧光激活细胞分选术（FACS）分析其对细胞周期的影响作用。体外细胞划痕实验和基质胶Transwell实验验证NUB1对癌细胞迁移和侵袭的影响,最后通过蛋白质印迹实验检测NUB1对于EMT相关指标蛋白和调控细胞周期的关键抑癌基因p27Kip1的调节作用。结果:体外细胞实验证实,过表达NUB1可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性表型。流式细胞术证实了过表达NUB1阻滞了细胞周期G1/S期的转变过渡。NUB1过表达增加了抑癌基因p27Kip1的蛋白表达水平。然而,实时定量RCR实验结果却显示,NUB1过表达并没上调p27Kip1的mRNA表达水平,对照组与试验组之间的差异无统计学意义。此外,蛋白质印迹实验表明,NUB1过表达上调了E-钙黏蛋白的表达,同时下调了N-钙黏蛋白、波形蛋白和基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达。结论:过表达NUB1抑制了胃癌细胞在体外的增殖活性,并造成了细胞周期G1/S期的阻滞。同时,过表达NUB1上调了抑癌基因p27Kip1蛋白的表达,但是其mRNA表达没有显着变化。此外,过表达NUB1能够通过调控EMT相关蛋白的表达抑制胃癌细胞的迁移及侵袭的能力。
郭正晨[5]（2019）在《DNA甲基化水平在预测宫颈上皮内瘤变转归中的价值》文中进行了进一步梳理目的:应用焦磷酸测序技术定量检测DNA甲基化水平,在发现其对宫颈癌及癌前病变的诊断价值的基础上,通过随访,进一步探究宫颈上皮内瘤变1级（CIN1）组DNA的甲基化水平与CIN1自然转归的关系,以及CIN2/3组DNA甲基化水平与CIN2/3治疗后转归的关系,评价其是否对于CIN的转归有预测效能。方法:1.收取由HPV检测证实的hr-HPV感染的宫颈脱落细胞,所有样本均经组织病理学诊断。采用焦磷酸测序技术检测所获取的宫颈脱落细胞中SLIT2、SOX1、JAM3、TERT和C13ORF18基因的甲基化水平,发现其与不同病变程度的宫颈上皮内病变的关系。2.对142例组织学病理确诊为CIN患者进行24个月的随访,根据随访结果将患者进行分组,比较各组的JAM3、SLIT2、TERT、SOX1和C13ORF18基因的甲基化水平。ROC曲线分析利用各基因的甲基化水平预测CIN转归的效能。结果:1.SLIT2、SOX1、JAM3、TERT和C13ORF18的甲基化水平随宫颈病变的严重程度的加重而增加。2.50例CIN1患者中,病变消退者占58%（29/50）,持续者占34%（17/50）,进展者占8%（4/50,其中3例CIN2,1例CIN3）。92例术后CIN2/3患者中,2例失访,3例妊娠。疾病复发者占8%（7/87）,疾病治愈者占92%（80/87）。3.比较CIN1消退组、持续组和进展组三组患者JAM3、SOX1、SLIT2、TERT及C13ORF18基因的甲基化水平,除TERT基因组间甲基化水平无明显统计学差异（P=0.967）外,其余4种基因甲基化水平各组比较有统计学意义,且随病变的消退、持续和进展,基因甲基化水平逐渐升高,消退组明显低于持续组或进展组;比较CIN2/3术后治愈组和复发组患者5种基因的甲基化水平,差异均有统计学意义（P<0.001）。4.JAM3、SOX1、SLIT2、C13ORF18基因在预测CIN1持续或进展的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.984、0.919、0.913、0.744,JAM3基因取最佳临界值为3.94%时,敏感度为95.2%,特异度为93.1%;SOX1基因取最佳临界值为5.58%时,敏感度为90.5%,特异度为75.9%;SLIT2基因取最佳临界值为6.49%时,敏感度为95.2%,特异度为86.2%;C13ORF18基因取最佳临界值为1.31%时,敏感度为66.7%,特异度为72.4%。5.JAM3、SOX1、SLIT2、TERT、C13ORF18基因在预测CIN2/3术后复发的AUC分别为0.971、0.966、0.946、0.927、0.955。JAM3基因取最佳临界值为15.94%时,敏感度为94.8%,特异度为93.7%;SOX1基因取最佳临界值为17.99%时,敏感度为88.3%,特异度为93.7%;SLIT2基因取最佳临界值为14.92%时,敏感度为78.6%,特异度为91.0%;TERT基因取最佳临界值为8.97%时,敏感度为91.4%,特异度为87.5%;C13ORF18基因取最佳临界值为14.92%时,敏感度83.4%,特异度为92.5%。结论:1.基因SLIT2、JAM3、SOX1及C13ORF18的过度甲基化与CIN1的自然转归相关,其甲基化水平随着疾病的消退、持续和进展而升高;2.基因SLIT2、SOX1、C13ORF18、TERT及JAM3的高甲基化与治疗后CN2/3的转归相关,并且甲基化水平复发组明显高于消退组;3.DNA甲基化水平对于预测CIN1及治疗后CIN2/3的转归具有较高的敏感度和特异度,尤其是JAM3;4.DNA的高甲基化可以成为CIN的预后标志物。
陈静[6]（2019）在《抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究》文中研究指明胃癌（Gastric cancer,GC）是全球第4大肿瘤死因,多数患者就诊时已是晚期。化疗虽然能够适当的使肿瘤患者的生存期延长,但是其副作用较为明显。随着对胃癌的各种信号通路的逐渐认识,在分子水平抑制肿瘤生长的治疗受到人们越来越多的关注。胃癌是一种异质性疾病,分子靶点较少。近年来研究发现BAP31是一种新的肿瘤相关抗原,在多种癌症中高表达,并且可以促进一些癌症的发生发展。本文通过Oncomine和GCBI数据库分析发现BAP31在胃癌组织中高表达,胃癌细胞中也验证了此结果。通过抗体芯片分析BAP31与肿瘤相关因子的关系,发现BAP31与p27kip1呈负相关,与EpCAM呈正相关。进一步研究发现BAP31与p27kip1相互作用并且调节其蛋白酶体降解。p27kip1在细胞的生长发育中扮演重要角色,除了调节细胞周期进程,在细胞凋亡与分化中也具有重要作用。抑制p27kip1的降解可能会杀伤胃癌细胞。细胞内抗体是指将小分子抗体基因添加定位信号序列,使其在细胞内特定部位表达,可以中和或调节位于特定亚细胞部位的活性分子或触发免疫反应。细胞内抗体技术作为一种新的基因治疗手段,在神经系统疾病、肿瘤及HIV/AIDS等治疗方面展示了广泛的应用前景。本文利用噬菌体展示技术从人源单域抗体库中筛选得到BAP31的特异性单域抗体基因,添加内质网信号序列,成功构建了内质网滞留型的胞内抗体。其中VH-D1可以特异地阻碍BAP31与p27kip1的相互作用,抑制p27kip1的蛋白酶体降解。本文对VH-D1是否通过抑制p27kipl降解而杀伤胃癌细胞进行了研究。通过体内外实验,结果显示VH-D1通过抑制胃癌细胞增殖、诱导细胞凋亡,抑制了胃癌细胞异种移植在裸鼠体内的生长。胃癌干细胞,是胃癌复发和转移的主要原因。CD44是最早发现的胃癌干细胞标志物。近年来研究发现,CD47也可以作为胃癌干细胞的一个标记物。利用流式细胞分离技术分离出CD44+CD47high细胞。通过Real-Time PCR、Western blot及细胞克隆球形成实验,证明CD44+CD47high具有胃癌干细胞特性。考察VH-D1对胃癌干样细胞的杀伤作用,结果显示,VH-D1可以抑制胃癌干样细胞的干性相关因子的表达,并且抑制了其自我更新和增殖能力。此外,BAP31胞内抗体VH-F12可以特异性的降低EpCAM的表达,诱导MKN-45细胞周期阻滞在G1期,并且诱导细胞产生自噬,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。综上所述,本论文的研究结果证明,BAP31的胞内抗体VH-D1通过阻碍BAP31与p27kip1的相互作用,抑制了p27kip1的蛋白酶体降解,使胃癌细胞周期阻滞在G1期并且诱导了胃癌细胞的凋亡,抑制了胃癌细胞在鼠内的生长,VH-D1还可以抑制胃癌干样细胞的增殖和更新。此外,VH-F12可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞产生自噬。为胃癌的治疗策略提供了新的思路和理论基础。
张锦丰,李亮,邓国明,陈意标,朱文标[7]（2018）在《P27Kip1蛋白的表达与梅州地区客家人食管鳞癌的关系》文中指出目的探讨p27Kip1蛋白的表达与梅州地区客家人食管鳞癌的关系。方法收集我院病理科2003年1月—2008年12月的61例经手术切除的中国梅州地区客家人食管鳞癌组织及32例食管良性肿瘤组织为研究对象并包埋成蜡块。采用免疫组织化学技术检测组织中p27Kip1蛋白的表达,结合患者的临床病理资料和随访资料,进行回顾性分析,并作出评价。结果 P27Kip1蛋白在食管鳞癌细胞核和/或细胞浆都有表达。胞核表达阳性率为27.87%,低于食管良性肿瘤组织胞核表达（50.0%）（P<0.05）;而胞浆表达阳性率为49.18%,高于食管良性肿瘤组织胞浆表达（12.5%）（P<0.05）。无淋巴结转移的食管鳞癌p27Kip1蛋白胞核表达阳性率为42.41%,高于有淋巴结转移者的阳性率（10.7%）,差异有统计学意义（P<0.05）;而无淋巴结转移的食管鳞癌p27Kip1蛋白胞浆表达阳性率为42.4%,比有淋巴结转移者（57.12%）的阳性率有降低的趋势（P>0.05）。Ⅱ期（ⅡA+ⅡB）和Ⅲ期p27Kip1蛋白胞核表达阳性率分别为42.41%和10.71%,差异有统计学意义（P<0.05）;p27Kip1蛋白胞浆表达阳性率有随着TNM分期的增高而增高的趋势（P>0.05）。结论 p27Kip1蛋白作为肿瘤抑制因子,其在食管鳞癌的胞核和胞浆表达阳性呈相反趋势,随食管鳞癌TNM分期越高,胞核阳性率越低,胞浆阳性率越高,其可作为食管肿瘤恶性程度及进展的预测指标。
汪美容,舒宽勇[8]（2018）在《P21、P27蛋白在肿瘤中的表达研究进展》文中研究说明肿瘤的发生发展与细胞周期调控紊乱有关,肿瘤的研究已迈入分子生物学、基因学阶段。参与细胞周期调控的相关分子主要有细胞周期蛋白（cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）三大类。P21、P27蛋白作为近年来发现的细胞周期蛋白依赖性抑制剂CIP/KIP家族中重要的成员,其在肿瘤中的表达研究目前受到了很大关注。本文对P21和P27蛋白的结构、生物学功能及其与肿瘤的相关研究进行综述。
汪美容[9]（2018）在《P21、P27在宫颈病变中的表达及其临床意义》文中研究说明目的:检测P21、P27在不同级别宫颈病变组织中的表达情况,分析探讨它们在宫颈病变发生发展中的临床意义。方法:应用免疫组织化学染色（EliVision）法检测12例正常宫颈组织（Normal cervical endotheliment NCE）、16例低级别鳞状上皮内病变组织（Low grade squamous intraepithelial lesion LSIL）、15例高级别鳞状上皮内病变组织（High grade squamous intraepithelial lesion HSIL）和32例宫颈鳞状细胞癌组织（Squamous cell carcinoma of the cervix SCC）中P21、P27蛋白的表达情况,并对结果进行统计分析。结果:1.P21、P27免疫组化染色阳性主要定位于细胞核中,呈棕褐色表达。2.P21在NCE、LSIL、HSIL、SCC中的阳性表达率依次为16.7%、25.0%、53.3%、71.9%;强阳性表达率分别为0、0、20.0%、40.6%,P21的表达随宫颈病变程度升级而增强（r=0.499,P<0.05）。SCC中P21的表达率和强阳性率均明显高于NCE和LSIL组（P<0.05）,HSIL中P21表达率明显高于NCE组（P<0.05）,差异有统计学意义。3.P27在NCE、LSIL、HSIL、SCC中的阳性表达率依次为83.3%、75.0%、46.7%、31.3%;强阳性率分别为50.0%、43.8%、20.0%、12.5%,随宫颈病变程度升级表达下调减弱（r=-0.435,P<0.05）。P27在SCC组织中阳性表达率显着低于NCE和LSIL组（P<0.05）,HSIL组阳性率明显低于NCE组（P<0.05）。NCE、LSIL两组中P27的强阳性表达率明显高于SCC组（P<0.05）。4.P21在SCCⅠ期、Ⅱ期、Ⅲ期中的表达率分别为45.5%、81.8%、90.0%,随分期的升级而提高,Ⅲ期与Ⅰ期比较有显着差异（P<0.05）。有淋巴结转移组P21的表达率为92.3%,显着高于无淋巴转移组57.9%（P<0.05）。5.P27在SCCⅠ、Ⅱ期、Ⅲ期中的表达率分别为54.5%、36.4%、0,三组比较无显着差异（P>0.05）。在有盆腔淋巴转移组中P27阳性表达率为7.7%,明显低于无淋巴结转移组表达率为47.4%,差异显着（P<0.05）。结论:1.P27蛋白的表达与宫颈病变程度呈负相关,P27蛋白表达缺失或下调可能与宫颈病变的发生发展有重要关系。2.P21蛋白的表达与宫颈病变程度呈正相关,P21蛋白表达增强可能促进宫颈病变的发展升级。3.P21、P27在SCC中的表达与淋巴转移密切相关,P21表达增强、P27表达下调或缺失提示肿瘤有恶性侵袭或预后不良可能。4.联合检测P21、P27蛋白表达可能为识别宫颈高级别鳞状上皮内病变和早期宫颈鳞癌提供诊断帮助,并为宫颈鳞癌的恶性侵袭或预后评估提供重要的参考价值。
隋思蕾[10]（2017）在《LAPTM4B与p27Kip1在乳腺癌中的表达及临床意义》文中研究说明研究背景:乳腺癌是女性常见、多发的恶性肿瘤,成为女性健康的严重威胁。因此,找到可作为药物治疗靶点的关键变异基因和用于临床治疗的分子标记物,对于早期诊断和有效地治疗乳腺癌尤为重要。溶酶体四次跨膜蛋白质B（lysosome-associated protein transmembrane 4B,LAPTM4B）是2000年首次从肝细胞癌中分离出的一种新型基因,该基因在大多数肝癌细胞中高表达,而在正常肝细胞中低表达或不表达。LAPTM4B具有促进肝癌发生发展的作用,并与肝癌的不良预后相关,因此有望成为肝癌诊断治疗的重要靶点。在肺癌中LAPTM4B通过与PI-4,5-二磷酸（PIP2）结合来抑制EGFR的降解,而在一些恶性肿瘤中可能通过激活AKT发挥促瘤作用。但其在乳腺癌中的作用机制及其与乳腺癌临床特征的关系尚不明确。p27Kip1是一种细胞周期依赖性激酶抑制剂（Cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI）,作为抑癌基因它不仅促进肿瘤细胞的凋亡,还可以调节细胞周期的进程。p27Kip1抑制多种恶性肿瘤细胞的发生发展,其低表达还与患者不良预后相关,因此p27有可能作为新的预后指标及基因治疗的新靶点。在肝癌和胆囊癌中,过表达LAPTM4B可以抑制p27Kip1的表达,而沉默该基因则使p27Kip1表达增高。另外,体外实验证明LAPTM4B通过调节p27等细胞周期因子的表达,对肝癌细胞周期进程的调节起到十分重要的作用。但在乳腺癌中LAPTM4B与p27之间的相关性缺乏相关研究。因此,探讨LAPTM4B与p27Kip1在乳腺癌中的表达及其相关性,为研究LAPTM4B导致乳腺癌的发生发展的信号通路提供基础,并对乳腺癌的诊疗及预后的判断有一定的指导意义。研究目的:（1）明确LAPTM4B和p27Kip1在乳腺癌组织中的表达情况;（2）探讨LAPTM4B与p27Kip1在乳腺癌中的表达是否相关;（3）探究二者对乳腺癌的诊疗有何临床意义。研究方法:收集2013年12月——2016年12月间大连医科大学附属第二医院手术切除的乳腺病理存档蜡块145例,其中乳腺癌蜡块100例、良性纤维腺瘤20例及癌旁正常组织25例,并记录对应患者的临床信息。将乳腺病理蜡块制成切片,采用SP免疫组织化学法检测LAPTM4B和p27Kip1在乳腺癌、纤维腺瘤及正常组织中的表达情况,并用SPSS统计软件进一步分析LAPTM4B和p27Kip1之间的相关性,以及与乳腺癌临床特征的关系。研究结果:（1）LAPTM4B蛋白在乳腺癌组织中阳性表达率为74.0%（74/100）,在良性纤维腺瘤和癌旁正常组织的阳性率分别为40.0%（8/20）、28.0%（7/25）,p27Kip1在乳腺癌中的阳性表达率为31.0%（31/100）,在良性纤维腺瘤和癌旁正常组织的阳性率分别为65.0%（13/20）、76.0%（19/25）。（2）在乳腺癌中,LAPTM4B与淋巴结转移（P=0.019）、TNM分期（P=0.001）相关,而与患者年龄、肿瘤大小、脉管、ER、PR及HER2表达状态无关（P>0.05）;p27Kip1在乳腺癌中与肿瘤大小（P=0.025）、淋巴结状态（P=0.001）有关,而与其他因素无关（P>0.05）。（3）在乳腺癌中,LAPTM4B与p27Kip1的表达呈显着负相关（P=0.003,r=-0.293）。实验结论:（1）LAPTM4B蛋白在大多数乳腺癌组织中高表达,并明显高于乳腺良性腺瘤和癌旁正常组织。与之相反,p27Kip1在正常乳腺、良性腺瘤中表达较高,并明显高于乳腺癌组织。（2）LAPTM4B在乳腺癌中与淋巴结状态、TNM分期呈正相关。p27Kip1与肿瘤大小、淋巴结转移呈负相关。（3）在乳腺癌中,LAPTM4B与p27Kip1呈显着负相关,可能共同参与乳腺癌的发生发展过程,二者均可能是乳腺癌治疗靶点。
二、p27~(kip1)蛋白在宫颈癌组织中的表达及其意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、p27~(kip1)蛋白在宫颈癌组织中的表达及其意义（论文提纲范文）
（1）CSN6在黑色素瘤增殖、转移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 CSN6 在黑色素瘤中的表达分析及其对黑色素瘤预后的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CSN6 对黑色素瘤增殖、迁移侵袭的促进作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CSN6对CDK9 通路的调控作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 CSN6 在肿瘤发生发展中的作用及其机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 Skp-2 在恶性肿瘤发生机制中的作用 |
| 参考文献 |
（3）去泛素化酶OTUD5与CacyBP的相互作用及OTUD5在宫颈癌中的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 实时定量PCR引物序列 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细菌培养 |
| 2.3 蛋白的提取 |
| 2.4 体内泛素化实验 |
| 2.5 半衰期实验 |
| 2.6 免疫共沉淀 |
| 2.7 RNA抽提 |
| 2.8 反转录PCR |
| 2.9 GEPIA |
| 2.10 Oncomine分析 |
| 2.11 UALCAN分析 |
| 2.12 Linked Omics分析 |
| 2.13 Gene MANIA分析 |
| 2.14 cBio Portal分析 |
| 2.15 GO分析和KEGG分析 |
| 2.16 Kaplan-Meier绘图 |
| 结果 |
| 1.去泛素化酶OTUD5与CacyBP的相互作用 |
| 1.1 CacyBP调节OTUD5 的蛋白稳定性并促进其泛素化 |
| 1.2 CacyBP应答DNA损伤 |
| 1.3 OTUD5 调控CacyBP的泛素化水平并促进其入核 |
| 2.去泛素化酶 OTUD5 在宫颈癌组织中的表达及其生物信息学功能分析 |
| 2.1 OTUD5在CESC中异常低水平表达,预后不良 |
| 2.2 OTUD5表达与宫颈癌临床病理特征的关系 |
| 2.3 CESC中 OTUD5 共表达基因的富集分析 |
| 2.4 在CESC中 ,潜在的调节OTUD5 m RNA水平的mi RNA和转录因子 |
| 2.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)和与OTUD5 相互作用的蛋白质的富集分析 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）转录因子NUB1调控胃癌恶性生物学行为的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 NUB1蛋白在胃癌及癌旁样本中的表达情况的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂(盒)及耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配置方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 患者病理样本收集 |
| 2.2.2 石蜡组织切片制作 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.2.4 组化结果评分 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NUB1蛋白在胃癌及对应的癌旁组织中的表达情况 |
| 3.2 NUB1蛋白的表达与临床病理特征之间的关系 |
| 3.3 NUB1蛋白表达与胃癌患者淋巴结阳性率之间的关系 |
| 3.4 NUB1蛋白表达与患者预后生存的关系 |
| 3.5 NUB1蛋白表达的预后价值(包括单因素及多因素分析) |
| 3.6 NUB1的m RNA表达与患者预后的关系 |
| 4 结论 |
| 第二部分 细胞实验研究NUB1调控胃癌恶性表型的作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂(盒)及耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配置方法 |
| 2.1.4 主要胃癌细胞系及转染病毒的信息 |
| 2.1.5 主要引物序列 |
| 2.1.6 主要抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 正常胃粘膜细胞系及胃癌细胞系的培养 |
| 2.2.2 病毒转染 |
| 2.2.3 实时定量PCR(RT-PCR)实验 |
| 2.2.4 蛋白质印迹实验 |
| 2.2.5 细胞增殖实验(CCK-8实验) |
| 2.2.6 细胞迁移实验(体外划痕实验) |
| 2.2.7 细胞侵袭实验(预置基质胶Transwell实验) |
| 2.2.8 流式细胞实验(荧光细胞激活分选实验) |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NUB1基因在正常胃粘膜细胞系及胃癌细胞系中的表达情况 |
| 3.2 NUB1基因在胃癌细胞系中构建过表达细胞模型 |
| 3.3 NUB1基因对胃癌细胞系增殖活性的影响 |
| 3.4 NUB1基因对胃癌细胞周期的调控作用 |
| 3.5 NUB1 基因对抑癌基因p27Kip1 的影响 |
| 3.6 NUB1基因对胃癌细胞迁移性的影响 |
| 3.7 NUB1基因对胃癌细胞侵袭性的影响 |
| 3.8 NUB1基因对上皮-间质转化过程中相关蛋白表达的影响 |
| 4 结论 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）DNA甲基化水平在预测宫颈上皮内瘤变转归中的价值（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法与步骤 |
| 4 随访 |
| 5 统计方法 |
| 结果 |
| 1 焦磷酸测序技术定量检测DNA的甲基化结果 |
| 2 随访过程 |
| 3 DNA甲基化水平对CIN1 预后的预测价值 |
| 4 DNA甲基化水平对治疗后CIN2/3 预后的预测价值 |
| 讨论 |
| 1 CIN相关预后标志物 |
| 2 DNA甲基化与宫颈癌前病变或宫颈癌 |
| 3 5种基因与宫颈癌及癌前病变 |
| 4 关于CIN随访研究结果的讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 CIN自然转归预后生物标志物的相关研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.1.1 胃癌的现状 |
| 1.1.2 胃癌的发病机制 |
| 1.1.3 胃癌的治疗方法 |
| 1.2 BAP31 |
| 1.2.1 BAP31的结构 |
| 1.2.2 BAP31的功能 |
| 1.2.3 BAP31在癌症中的作用 |
| 1.3 细胞内抗体(Intracellular antibody,intrabody) |
| 1.3.1 抗体药物的发展及其分类 |
| 1.3.2 常用抗体库技术 |
| 1.3.3 细胞内抗体的分类应用 |
| 1.4 本文的主要研究内容和意义 |
| 第2章 BAP31在胃癌中的作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 BAP31在多种癌症中高表达 |
| 2.3.2 BAP31在胃癌组织及胃癌细胞系中高表达 |
| 2.3.3 BAP31与周期蛋白p27~(kipl)负相关 |
| 2.3.4 BAP31调节p27~(kipl)蛋白酶体降解并与其结合 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 本章讨论 |
| 2.4.2 本章小结 |
| 第3章 抗BAP31 VH抗体的筛选及胞内抗体的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BAP31 VH单域抗体基因的筛选 |
| 3.3.2 内质网滞留型细胞内抗体的构建 |
| 3.3.3 VH-D1通过与BAP31的C末端特异性结合,阻碍了其与p27~(kip1)的相互作用 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 本章讨论 |
| 3.4.2 本章小结 |
| 第4章 VH-D1在体内外抗肿瘤效果评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 VH-D1抑制GC细胞增殖 |
| 4.3.2 VH-D1阻滞GC细胞周期在G1期 |
| 4.3.3 VH-D1诱导GC细胞凋亡 |
| 4.3.4 VH-D1在体内对GC细胞的杀伤作用 |
| 4.3.5 VH-D1感染的细胞对小鼠的影响 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 本章讨论 |
| 4.4.2 本章小结 |
| 第5章 VH-D1诱导GC干细胞分化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 GC干样细胞的富集与鉴定 |
| 5.3.2 胞内抗体VH-D1对CD44~+CD47~(high)细胞的影响 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 本章讨论 |
| 5.4.2 本章小结 |
| 第6章 VH-F12通过诱导MKN-45细胞自噬引起死亡 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 EpCAM在胃癌组织中高表达 |
| 6.3.2 VH-F12抑制EpCAM的表达 |
| 6.3.3 VH-F12诱导MKN-45细胞周期阻滞在G1期 |
| 6.3.4 VH-F12诱导MKN-45细胞死亡 |
| 6.3.5 VH-F12引起MKN-45细胞自噬 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 本章讨论 |
| 6.4.2 本章小结 |
| 第7章 总结与创新点 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 作者从事科学研究和学习经历的简历 |
（7）P27Kip1蛋白的表达与梅州地区客家人食管鳞癌的关系（论文提纲范文）
| 1. 资料与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 对照设计 |
| 1.5 观察指标 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 P27Kip1在良恶性食管肿瘤组织中的表达分析 |
| 2.2 P27Kip1蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系分析 |
| 3 讨论 |
（8）P21、P27蛋白在肿瘤中的表达研究进展（论文提纲范文）
| 1 P21蛋白与肿瘤 |
| 1.1 P21蛋白的结构、生物学功能 |
| 1.2 P21蛋白在肿瘤中的表达 |
| 2 P27蛋白与肿瘤 |
| 2.1 P27蛋白的结构、生物学功能 |
| 2.2 P27蛋白在肿瘤中的表达 |
| 3 P21、P27蛋白在肿瘤中的联合检测 |
| 4 展望 |
（9）P21、P27在宫颈病变中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料 |
| 2.1 标本来源 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 自配试剂(由江西省妇幼保健院病理科配制) |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 第3章 方法 |
| 3.1 石蜡切片制作 |
| 3.2 免疫组织化学ELIVISION染色法操作步骤 |
| 3.3 显微镜观察及摄片 |
| 3.4 结果判断 |
| 3.5 统计学处理 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 P21蛋白在不同宫颈组织中的表达情况 |
| 4.2 P21在宫颈癌中的表达与临床病理因素之间的关系 |
| 4.3 P27蛋白蛋白在不同宫颈组织中的表达情况 |
| 4.4 P27在宫颈癌中的表达与临床病理因素之间的关系 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 宫颈的解剖组织学与宫颈癌 |
| 5.2 宫颈癌的筛查诊断方法 |
| 5.3 分子生物标志物CDKI与宫颈病变 |
| 5.3.1 P21蛋白与宫颈病变 |
| 5.3.2 P27蛋白与宫颈病变 |
| 5.3.3 P21蛋白和P27蛋白表达的联合检查 |
| 5.4 本研究的不足之处 |
| 第6章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 P21、P27 在肿瘤中表达的研究概况 |
| 参考文献 |
（10）LAPTM4B与p27Kip1在乳腺癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 组织标本来源及相关资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2.方法和步骤 |
| 2.1 SP染色及观察切片 |
| 2.2 观察病理切片及LAPTM4B和p27 表达结果判定 |
| 3. 统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、p27~(kip1)蛋白在宫颈癌组织中的表达及其意义（论文参考文献）
- [1]CSN6在黑色素瘤增殖、转移中的作用及机制研究[D]. 张艳丽. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究[D]. 陈晓文. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]去泛素化酶OTUD5与CacyBP的相互作用及OTUD5在宫颈癌中的生物信息学分析[D]. 白米雪. 青岛大学, 2020(01)
- [4]转录因子NUB1调控胃癌恶性生物学行为的分子机制研究[D]. 张冬冬. 中国医科大学, 2020
- [5]DNA甲基化水平在预测宫颈上皮内瘤变转归中的价值[D]. 郭正晨. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究[D]. 陈静. 东北大学, 2019(01)
- [7]P27Kip1蛋白的表达与梅州地区客家人食管鳞癌的关系[J]. 张锦丰,李亮,邓国明,陈意标,朱文标. 广州医药, 2018(06)
- [8]P21、P27蛋白在肿瘤中的表达研究进展[J]. 汪美容,舒宽勇. 实用临床医学, 2018(06)
- [9]P21、P27在宫颈病变中的表达及其临床意义[D]. 汪美容. 南昌大学, 2018(07)
- [10]LAPTM4B与p27Kip1在乳腺癌中的表达及临床意义[D]. 隋思蕾. 大连医科大学, 2017(08)