一、犬脑内移植大鼠胰岛细胞的凋亡状况（论文文献综述）
谢俊豪[1]（2021）在《人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究》文中认为糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是一种全球性慢性代谢性疾病。据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation,IDF）报告显示,到2040年,糖尿病人口预计将从2015年的4.15亿增加到6.42亿。1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM）的病例以每年3%-5%速度稳步增加,全世界患有T1DM的青年人数（<20岁）超过100万人,按照目前的趋势发展,预计每年将增加10万人。胰岛素终生替代疗法是目前临床T1DM的主要治疗方法,但其不能遏制胰岛功能进行性衰竭,也无法有效阻止T1DM相关并发症的发生和进展。近年来,干细胞疗法有望通过胰岛β细胞替代或再生,保护甚至重建内源性胰岛素分泌系统,从而改善疾病进程与预后,是T1DM治疗领域备受关注的研究方向。而人乳牙牙髓干细胞（stem cells from pulps of human exfoliated deciduous teeth,SHED）的应用逐步显示其潜在优势。SHED较其他间充质干细胞来源丰富、获取简单、增殖能力强、低免疫原性、低致瘤风险,且不存在伦理问题,有更好的免疫调节作用,较好的生物学稳定性和良性特征,较低的凋亡性和衰老性。已证明SHED可诱导为胰岛β细胞,显示其运用于未来T1DM治疗的巨大潜力。目前,其应用于DM的研究正逐步开展,尚未见其治疗T1DM恢复β细胞功能相关基础及临床研究的报道,其发挥作用的机制也有待阐明。一、研究目的（一）通过尾静脉和胰背动脉两种途径移植SHED,探究不同移植途径对SHED治疗STZ诱导DM大鼠疗效的影响。（二）皮下注射胰岛素,维持DM大鼠血糖于不同水平,通过尾静脉多次移植SHED,探究不同血糖水平DM大鼠多次输注SHED疗效差异。（三）通过动物和细胞实验,探究SHED治疗DM的可能机制。二、研究方法180-200g雄性SD大鼠,适应性喂养后,予60mg/kg STZ腹腔注射构建糖尿病模型。（一）SHED经不同输注途径治疗DM大鼠随机选取48只STZ诱导DM大鼠,分为DM对照组（DM组,diabetes mellitus group,n=14）,尾静脉输注组（CV组,Caudal vein infusion SHED group,n=16）,胰背动脉输注组（DPA组,Dorsal pancreatic artery infusion SHED group,n=18）。对照大鼠12只为正常对照组（NC组,Normal control group,n=12）。成模后,CV组和DPA组皮下注射胰岛素降糖治疗,一周左右至目标血糖后开始干细胞治疗,胰岛素降糖治疗持续至治疗结束。每周监测大鼠食量、体重、空腹血糖,每天监测CV组和DPA组大鼠随机血糖,记录胰岛素注射剂量。治疗前及SHED治疗2周后,行口服葡萄糖耐量试验（Oral glucose tolerance test,OGTT）评价糖代谢情况,并留取血清标本检测C肽、糖化血清蛋白（glycated serum protein,GSP）等。干细胞治疗2周后,处死大鼠留取器官进行后续研究。（二）SHED治疗不同血糖水平DM大鼠36只STZ诱导DM大鼠分为DM对照组（diabetes mellitus group,DM组,n=6）,胰岛素治疗组（n=12）和干细胞治疗组（n=18）,其中胰岛素治疗组又分为中糖组（Middle glycemic group,MG组）和低糖组（Low glycemic group,LG组）;干细胞治疗组又分为高糖干细胞组（High glycemic SHED group,HGSHED组）、中糖干细胞组（Middle glycemic SHED group,MGSHED组）和低糖干细胞组（Low glycemic SHED group,LGSHED组）,每组各6只。未造模大鼠为正常对照组（normal control group,NC组,n=6只）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠均给予胰岛素治疗,2周内达到目标血糖后开始干细胞治疗,胰岛素降糖治疗持续至治疗结束。每周监测食量、体重、空腹血糖,每天监测MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠随机血糖,记录胰岛素注射量。治疗前和第3次输注干细胞2周后,分别对所有大鼠行OGTT试验,评价糖代谢情况,并留取血清检测C肽、GSP等。干细胞治疗5周后,处死大鼠留取器官进行后续研究。（三）SHED治疗DM大鼠机制研究苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining,HE染色）观察胰腺病理变化,透射电镜观察胰岛β细胞内部结构变化,免疫组织化学和免疫荧光双标染色探究β/α胰岛细胞比例、胰岛素和胰高血糖素分泌情况。冰冻切片活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）染色及氧化应激相关指标检测评价各组大鼠胰腺氧化应激情况,蛋白质印迹法（Western-Blot,WB）分析胰腺Keap1/Nrf2抗氧化信号通路、p-Erk激活情况和抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达情况。（四）SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究1、细胞模型的构建予不同浓度STZ（50mM、20 mM、10 mM、7.5 mM、5 mM、2.5 mM、1.25 mM、1 mM）刺激胰岛RIN-m5F细胞不同时间（2h、6h、12h、24h）,行Cell-Counting Kit-8检测,选择抑制率为50%的浓度和时间为后续细胞实验造模条件,在该浓度和时间检测ROS,确定DM氧化应激细胞模型构建成功。2、SHED培养上清液刺激实验按照不同处理分为正常对照组（normal control group,NC组）、SHED培养上清液处理组（culture medium treatment group,CM组）、STZ组、STZ+SHED培养上清液处理组（STZ+CM组）。各组进行ROS荧光染色及流式细胞检测,氧化应激相关指标检测,凋亡流式细胞检测,Ed U-594细胞增殖荧光染色及流式细胞检测,荧光定量PCR确定Keap1、Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）m RNA表达量变化。3、关键作用细胞因子确定及siRNA干扰查阅文献确定HGF为本研究细胞因子,SHED改善STZ诱导的DM胰岛β细胞功能可能与其分泌较高量的HGF密切相关,并对SHED的HGF基因进行siRNA干扰。4、SHED培养上清液与siRNA-HGF SHED培养上清液刺激对比实验按照不同处理分为STZ组、STZ+SHED培养上清液处理组（STZ+CM组）、STZ+siRNA干扰SHED培养上清液处理组（STZ+siRNACM组）及STZ+重组肝细胞生长因子处理组（STZ+HGF组）。各组进行相关检测,包括ROS荧光染色及流式细胞检测,氧化应激相关指标检测,凋亡流式细胞检测,Ed U-594细胞增殖荧光染色及流式细胞检测,荧光定量PCR检测Keap1、Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3、PCNA m RNA表达量变化。并进一步通过Western Blot探索HGF在细胞模型中对Keap1、Nrf2、p-Erk、p-Akt及凋亡相关蛋白的影响。三、研究结果（一）SHED经不同输注途径治疗DM大鼠干细胞治疗后,CV组和DPA组大鼠每周日均食量明显少于DM组（均P<0.01）,且CV组小于DPA组（P<0.01）。CV组和DPA组大鼠体重明显大于DM组（P<0.01）（P<0.05）,CV组大鼠体重也明显大于DPA组大鼠（P<0.01）。治疗后1周,两组空腹血糖均值相同（15.68mmol/L）,且治疗后2周,两组空腹血糖均明显低于DM组（均P<0.01）。CV组和DPA组日均胰岛素注射量较治疗前（第5周）均明显减少（P=0.001,P=0.001）。治疗后,CV组和DPA组血糖AUC0-120min均明显低于DM组（均P<0.01）。CV组和DPA组大鼠C肽AUC0-120min水平较治疗前明显升高（P=0.004）（P=0.001）,且CV组明显高于DM组和DPA组（均P<0.01）。DM组大鼠GSP水平明显高于NC组、CV组和DPA组（均P<0.01）,但三组之间无明显差异（P>0.05）。CV组大鼠GSP治疗前后无明显变化（P=0.309）,DPA组大鼠GSP较治疗前降低（P=0.001）。（二）SHED治疗不同血糖水平DM大鼠干细胞治疗后,MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠日均食量均明显小于DM组、HGSHED组和MG组（P<0.05）（P<0.01）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠体重均明显大于同期DM组和HGSHED组（均P<0.01）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠空腹血糖均明显低于同期DM组和HGSHED组,且MG组、MGSHED组和LGSHED组空腹血糖与NC组无明显差异（P>0.05）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠日均胰岛素使用量较干细胞治疗前均明显减少（P<0.05）（P<0.01）。治疗后,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组血糖AUC0-120min较治疗前逐渐降低（均P<0.01）,且均明显低于DM组和HGSHED组（均P<0.01）。DM组C肽AUC0-120min较治疗前明显降低（P<0.01）,而HGSHED组治疗前后无明显变化。DM组、HGSHED组和MG组大鼠C肽AUC0-120min水平均明显低于NC组（P<0.05）（P<0.01）;MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠C肽AUC0-120min水平明显高于DM组和HGSHED组（P<0.01）。治疗后,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组GSP水平均明显低于DM组和HGSHED组（均P<0.01）。（三）SHED治疗DM大鼠机制研究1、HE染色,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组胰岛体积较DM组和HGSHED组明显增大,胰岛细胞明显增多,细胞核染色清晰度明显增加,空泡细胞和玻璃样变减少,炎性细胞浸润明显减少。MGSHED组较MG组、LGSHED组较LG组体积增大,改善更明显。其中,MGSHED组胰岛体积最大,但小于NC组。2、胰腺电镜结果显示,各治疗组胰岛β细胞状态不同程度改善,MGSHED组改善最为明显。胰岛免疫组织化学和荧光双标染色均显示,各治疗组β/α细胞比例增大,胰岛素分泌增多,而胰高血糖素分泌不同程度减少。3、ROS染色,DM组平均荧光强度最大,各治疗组大鼠较DM组平均荧光强度一定程度降低。其中,MGSHED组平均荧光强度最小。4、各治疗组大鼠胰腺总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）不同程度升高,而丙二醛（MDA）、一氧化氮合成酶（NOS）分型尤其是i NOS一定程度降低。5、Western Blot蛋白分析,DM组大鼠胰腺Nrf2蛋白表达较NC组明显减少,各治疗组均有不同程度增加,其中MGSHED组Nrf2蛋白表达增加最多。而DM组大鼠胰腺Keap1蛋白表达较NC组明显增加,各治疗组一定程度减少,MGSHED组Keap1蛋白表达最少。DM组p-Erk、抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少,各治疗组一定程度增加,MGSHED组明显大于MG组,LGSHED组明显大于LG组。（四）SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究1、STZ浓度为5mM、时间为12h,作为后续细胞实验造模条件。ROS荧光强度明显增强表明氧化应激细胞模型构建成功。2、SHED培养上清液刺激实验STZ+CM组较STZ组ROS平均荧光强度减小,抗氧化相关指标T-AOC、SOD、GSH升高,脂质过氧化产物MDA减少,细胞凋亡率明显降低,增殖率明显升高（p<0.01）。STZ+CM组Nrf2m RNA表达量明显高于STZ组（p<0.01）,而STZ+CM组Keap1表达量明显低于STZ组（p<0.01）。STZ+CM组Bcl-2和PCNA m RNA表达量明显大于STZ组（p<0.01）,而Bax和Caspase-3明显小于STZ组（p<0.01）。3、关键作用细胞因子确定及siRNA干扰siRNA-HGF干扰SHED,HOMO-HGF-2能明显抑制SHED细胞中HGF基因m RNA（抑制率约71.78%）（p<0.01）和蛋白表达。Elisa法检测SHED培养上清液中HGF浓度,siRNA-HGF2组明显低于NC组和siRNA-NC组（p<0.05）（P<0.01）。4、SHED培养上清液与siRNA-HGF SHED培养上清液刺激对比实验STZ+CM组ROS平均荧光强度明显小于STZ+siRNACM组（p<0.01）,STZ+siRNACM组T-AOC明显小于STZ+CM组（p<0.01）,细胞增殖率（p<0.05）、Nrf2（p<0.01）,Bcl-2、PCNA m RNA表达量明显低于STZ+CM组（p<0.01）,而Caspase-3m RNA表达量明显高于STZ+CM组（p<0.01）。5、Western Blot检测确定HGF作用相关蛋白发现,重组HGF能激活Nrf2、p-Erk、p-Akt,下调Keap1,增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达,减少凋亡相关蛋白Caspase-3表达。四、研究结论1、不同输注途径及不同血糖水平SHED治疗对DM大鼠症状、糖代谢相关指标及胰岛分泌功能均有不同程度的改善作用。2、不同输注途径移植SHED,输注相同次数,在相同糖代谢水平,观察相同时间,对血糖改善作用类似。3、多次尾静脉移植SHED,对不同血糖水平DM大鼠疗效不同。MGSHED组DM大鼠症状、糖代谢及胰岛功能整体改善效果较好,表明维持血糖平稳控制于合适的水平,更利于SHED体内存活迁移及相关细胞因子分泌,达到更好的治疗效果。4、控制血糖水平后,多次静脉移植SHED,可明显改善糖尿病症状,降低空腹血糖水平、改善胰岛储备与分泌功能、减少胰岛素使用剂量,且三次移植效果优于一次。5、SHED移植治疗DM大鼠,可能启动胰腺内源性氧化应激系统,增强其抗氧化能力,调节氧化应激可能是其发挥作用重要机制之一。最重要的抗氧化信号通路Keap1/Nrf2与调控密切相关。且与p-Erk激活相关的细胞增殖及Bcl-2家族蛋白的活化减轻细胞凋亡相关。6、体外研究发现,SHED减少STZ诱导胰腺RIN-m5F细胞氧化应激、促进其存活与其分泌大量HGF密切相关。可能通过HGF激活p-Erk、p-Akt及Keap1/Nrf2抗氧化信号通路,启动内源性抗氧化途径,从而影响氧化应激相关指标,并减少凋亡蛋白,促进抗凋亡及增殖相关蛋白表达,保护β细胞,从而在抗糖尿病中发挥重要作用。
傅红兴[2]（2018）在《胰岛移植关键技术探索及动物体内移植研究》文中研究表明胰岛移植是指将有活性、有功能的胰岛细胞团（自体、同种异体）移植入糖尿病患者中,使患者恢复对血糖的实时应答及调控,是目前唯一微创并能根治糖尿病的治疗方法。但胰岛移植目前还存在供体数量有限、终身服用免疫抑制剂、血管内移植有急性血液介导的炎症反应（IBMIR）、移植后胰岛微血管重建慢导致细胞缺血缺氧调亡等问题,使胰岛移植技术很难实现大规模应用,甚至连供体到受体一对一的移植都较难实现胰岛素脱离的效果。微囊化和非微囊化胰岛移植是胰岛移植领域的两大重要方向。微囊化胰岛移植即将分离的胰岛包裹于微囊中,再移植至动物体内。常用的微囊为海藻酸钠-聚左赖氨酸-海藻酸钠微囊（APA微囊）,由于囊膜的阻隔作用,可阻止受体自身免疫系统对移植胰岛的免疫排斥反应,又不阻碍营养物质、胰岛素、胰高血糖素、C肽等通过微囊膜,有望实现异种胰岛移植和患者无需长期服用免疫抑制剂,从而解决胰岛移植供体不足和术后免疫抑制的问题。本论文中采用锐孔凝固浴工艺制备了包裹胰岛的APA-Ca和APA-Ba微囊,并对微囊膜厚度、强度、表面结构、囊膜稳定性、通透性和小鼠腹腔内移植的效果进行了研究,结果发现APA-Ba微囊的膜强度较高,移植后小鼠血糖控制稳定。为提高微囊的营养和氧气供应,我们还制备了复式微囊、改造人造血管,将微囊放至改造的人造血管移植装置中;并采用Cuff技术进行了家兔单侧颈动脉的端端吻合技术,将含复式微囊的人造血管装置移植至家兔颈动脉上,使微囊与血液充分接触,但移植五日后,人造血管内血栓严重,预示血管内微囊化胰岛移植难度大。微囊化胰岛移植对材料学、移植部位等有极高要求,且微囊化也阻碍了胰岛与宿主的血管对接和交流,这极大的限制了该技术在临床的应用。非微囊化胰岛移植已在临床研究和应用领域开展多年。小鼠的胰岛移植研究主要采用分离纯化小鼠胰岛,并经肾被膜下进行移植。临床胰岛移植目前主要采用分离纯化人的胰岛,再进行门静脉内胰岛输注,移植的胰岛定植于肝脏的小血管分支,根据血糖的变化实时分泌胰岛素和胰高血糖素,来实时调节血糖的变化。本论文研究中我们采用了改进的小鼠肾被膜下胰岛移植工具,将分离纯化后400 IEQ小鼠胰岛输注至糖尿病Balb/c小鼠的肾被膜下,术后小鼠血糖恢复正常,并模型稳定,维持正常血糖超过2个月,为后续的胰岛移植研究奠定了基础。在门静脉内胰岛输注后胰岛的定植部位和分布情况我们也进行了研究。采用C57BL/6小鼠和SD大鼠在体制备肝脏去细胞支架,将分离的高纯度小鼠、大鼠胰岛和中等纯度人胰岛,经DTZ染色后从门静脉在体输注至小鼠或大鼠的肝脏去细胞支架中。结果可见,红色的胰岛细胞团主要栓塞至小鼠或大鼠的肝脏周围的毛细血管分支中。小鼠肝脏体积小,300±50 IEQ的小鼠胰岛导致了约30%的肝脏血管栓塞;大鼠肝脏体积相对较大,800±250 IEQ的胰岛导致了约5%的肝脏血管栓塞;但50%纯度800±250 IEQ的人胰岛输注时,大量的外分泌腺组织阻塞在肝脏血管分支的胰岛周围,可能会加速移植的胰岛缺血、缺氧死亡。因此,移植高纯度的胰岛将更有利于提高胰岛移植的效果。促进移植的胰岛快速微血管重建是胰岛移植研究的一个重要方向。移植后的胰岛会经历缺血缺氧过程,导致胰岛内细胞的凋亡。动物实验研究已证实,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能刺激血管生长及趋化血管内膜各类细胞,有望成为一个促胰岛移植后微血管重建的重要细胞因子。但bFGF稳定性差,在体内半衰期仅3～10 min。本研究在体外将纯化的小鼠胰岛在含不同浓度bFGF的CMRL 1066培养液中培养,通过透射电镜（TEM）观察胰岛内微血管基底膜的修复、胰岛素颗粒分泌情况及FDA-PI荧光染色评价bFGF对胰岛活性的影响;在体内用含不同浓度bFGF的培养液配制透明质酸钠生物胶,并将胶与移植的胰岛进行混合后共移植至糖尿病小鼠肾被膜下,观察bFGF对移植后胰岛的促微血管重建作用。结果显示,在TEM下,1 μg/mL bFGF共培养的胰岛内分泌颗粒大量释放;20ng/mL、60 ng/mL、100 ng/mL bFGF共培养组不影响胰岛内部结构且可有效促进胰岛内皮细胞修复的作用;FDA-PI荧光染色结果也显示胰岛在上述三种bFGF浓度共培养组中胰岛活性均大于90%;体内实验显示,含60 ng/mL、100 ng/mL bFGF的透明质酸钠胶与200IEQ胰岛共移植组对比400 IEQ单纯胰岛移植组,血糖均维持在正常水平,与0 ng/mL bFGF透明质酸钠胶与200 IEQ胰岛移植组有显着性差异;免疫组化及Westem-Blot实验证明,含bFGF透明质酸钠胶与胰岛共移植,可促进胰岛移植后微血管重建和促进胰岛存活的作用。胰岛移植相比胰腺移植手术操作简单、安全性高,用于治疗糖尿病前景广阔。本论文从小鼠胰岛的微囊化移植研究出发,比较了微囊化和非微囊化胰岛移植的差异,研究了门静脉内胰岛移植后胰岛在肝脏血管中的分布和胰岛移植后的微血管重建,研究和建立了一种bFGF促进胰岛移植后微血管重建和提高胰岛移植效率的新方法。
王洪,李金成,李政,孙海峰,殷慧[3]（2013）在《从胰岛细胞移植到胰腺干细胞移植,治愈糖尿病还有多远?》文中提出背景:胰岛细胞移植和胰腺干细胞移植是近年来糖尿病治疗的研究热点,也是治愈糖尿病最有希望的途径。目的:探讨胰岛细胞移植和胰腺干细胞移植治疗糖尿病的可行性、优势、面临的问题及解决的办法。方法:收集胰岛细胞移植和胰腺干细胞移植治疗糖尿病的相关实验和临床研究,进行实验数据分析两种细胞移植途径治疗糖尿病的影响因素,从细胞分子生物学水平认识胰岛细胞移植和胰腺干细胞移植治疗糖尿病的优势和缺点。结果与结论:胰岛细胞移植治疗糖尿病受供体不足的制约,胰腺干细胞移植解决了胰岛细胞供体短缺的有效途径,但胰腺干细胞移植的研究还停留在动物实验阶段,需要进行广泛的临床研究。首先要明确胰腺干细胞的特异性标志物,其次要掌握将相关干细胞诱导分化为胰腺干细胞的方法和技术。
李华青[4]（2010）在《Exendin-4在骨髓间充质干细胞治疗糖尿病中作用的实验研究》文中研究说明2型糖尿病（T2DM）是由遗传和环境共同作用而引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征,由于胰岛素分泌、作用或两者同时存在缺陷引起碳水化合物、脂肪、蛋白质、水和电解质等代谢紊乱,可以引起多个系统器官同时损伤的慢性并发症,是致残致死的主要原因。目前的治疗以降糖为主,一定程度上能够改善胰岛素抵抗、代谢综合征,但不能根治糖尿病,尤其是对包括胰岛细胞在内的多器官组织的损伤疗效甚微,间充质干细胞（MSCs）因其具有损伤修复和多向分化潜能,成为糖尿病及其并发症治疗领域的研究热点。研究显示,骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植后对大多数组织损伤的修复起效快,具有直接的修复能力,课题组前期的研究结果显示,BMSCs对T2DM多种器官组织的损伤具有良好的直接修复作用,对T2DM并发症及一般状况的改善非常明显,对胰岛的修复也有一定的作用,但是短期内还未能观察到胰岛功能的完全恢复,也未见到同类报道。同时我们看到,BMSCs还具有一定的改善胰岛素抵抗及降糖作用,但是短期内直接降糖作用较弱。杨卫红等的研究显示,高糖可以抑制BMSCs的增殖,促进BMSCs的凋亡,我们的研究也显示,高糖高脂培养的BMSCs凋亡增加,高糖高脂还可以导致β细胞分泌胰岛素的能力下降。因此,如果无辅助的治疗,移植入体内的BMSCs在发挥作用时可能会受到T2DM病因的影响,而且在T2DM病因的作用下不利于BMSCs向胰岛细胞分化,单独使用BMSCs治疗还具有一定的局限性。Exendin-4是从蜥蜴唾液腺分离出来的GLP-1 （glucagon-like peptide-1）的类似物,具有较长的血浆半衰期和较强的生物活性。它能够针对T2DM的多个病理生理靶点发挥降糖效应,改善胰腺局部的微环境,同时能够促进胰岛细胞的再生及干细胞向胰岛细胞的分化。但是,它进入体内发挥作用相对较慢,刺激胰岛细胞再生需较长周期,而且对于全身并发症的改善是一种间接的作用,依赖体内的干细胞体系,BMSCs与Exendin-4在T2DM及其并发症的治疗上具有很好的互补作用。为探索一条副作用低的、有效的治疗T2DM胰岛细胞损伤的方法,本研究课题将探讨在BMSCs移植的过程中联合使用Exendin-4是否有利于BMSCs进入体内更好地发挥作用,Exendin-4在体外是否能够促进BMSCs向胰岛素分泌细胞（IPCs）的分化,Exendin-4是否能够促进BMSCs在体内分化为IPCs, BMSCs是否通过促进胰岛β细胞再生,减少β细胞凋亡发挥治疗作用,联合使用Exendin-4是否能协同增强BMSCs的治疗作用。各部分研究结果分别简述如下。一、正常大鼠BMSCs的分离培养和鉴定采用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠BMSCs,观察细胞在光镜下的生长特征并记录其生长曲线,对所获得的细胞进行成骨及成脂肪细胞诱导分化,流式细胞仪分析其表面标记（CD34, CD44, CD45, CD71, CD105）。结果显示,BMSCs呈梭形、漩涡状生长,BMSCs成骨和成脂诱导可以使BMSCs出现钙盐沉积和脂滴,表达成骨细胞、脂肪细胞特征,表面标志鉴定CD34、CD45呈阴性,CD44、CD71、CD105呈阳性,确定所获细胞绝大多数为BMSCs。本部分实验建立了大鼠BMSCs的体外培养体系,为后续的干细胞研究提供了稳定的细胞模型。二、Exendin-4在BMSCs转分化为胰岛样细胞中作用的体外研究本部分研究中我们采用两步法诱导BMSCs分化为胰岛样细胞,同时加入不同浓度的Exendin-4 （5、10、20、40、80nM）,观察其对分化的影响。双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团,免疫细胞化学染色法对胰岛素分泌细胞进行鉴定,用放射免疫分析法观察诱导后细胞对葡萄糖刺激试验的反应,Real time-PCR检测胰岛β细胞相关基因Ngn3、PDX-1、Insl及Glut2的表达。结果表明,在Exendin-4作用下,BMSCs向胰岛样细胞转化增多,体外培养细胞上清液中胰岛素含量明显升高,胰岛β细胞相关基因Ngn3、PDX-1、Insl及Glut2 mRNA的表达增加,在一定范围内呈剂量依赖性。三、Exendin-4在BMSCs移植治疗T2DM中的作用建立T2DM大鼠的模型,分为正常对照组、T2DM模型组、BMSCs移植组、Exendin-4处理组及BMSCs+Exendin-4治疗组,将Brdu标记的BMSCs从大鼠尾静脉移植入T2DM模型大鼠体内,观察不同的干预措施对各组大鼠的体重、血糖、血脂及血浆胰岛素、脂联素水平的影响,并通过免疫组化、免疫荧光双标技术观察BMSCs在大鼠胰腺组织的分布及分化情况。结果表明,BMSCs能够迁移至T2DM模型大鼠胰腺组织,并转化为胰岛素分泌细胞。BMSCs移植的同时使用Exendin-4可以更好地降低血糖,增加大鼠胰腺组织中胰岛素染色阳性区域的面积,改善β细胞功能。四、Exendin-4在BMSCs移植治疗T2DM中作用的机制研究探讨BMSCs移植治疗T2DM的机制,TUNEL方法观察各组胰岛细胞的凋亡情况,Real-time PCR与Western blot方法检测各组胰腺组织PDX-1与胰岛素mRNA及蛋白的表达,免疫组化与Western blot方法检测各组胰腺组织Caspase3与Bax的蛋白水平。结果显示,BMSCs移植能够通过增加胰岛PDX-1与胰岛素mRNA及蛋白的表达促进胰岛β细胞的再生,同时能够减少胰岛Caspase3与Bax的蛋白水平,减少胰岛细胞的凋亡,联合使用Exendin-4能够协同增强治疗效果。结论1.通过全骨髓贴壁法,成功分离、培养了大鼠BMSCs,通过对该细胞生物学特性的观察及应用流式细胞检测其表面抗原,证实了所得到的贴壁细胞为BMSCs,为后续的实验提供了充足的BMSCs和良好的实验基础。2.体外研究结果显示Exendin-4可以促进BMSCs分化为功能性胰岛样细胞,该细胞DTZ染色阳性,经葡萄糖刺激能够分泌一定数量的胰岛素,并能表达胰岛细胞的相关基因Ngn3、PDX-1、Insl及Glut2。Exendin-4的促分化作用在一定范围内呈剂量依赖性。3.利用高糖高脂饮食加小剂量注射STZ的方法成功建立T2DM大鼠模型,该T2DM模型具有肥胖、高血糖、血脂异常、高胰岛素血症及胰岛素抵抗的特点,接近人类T2DM的发病特征,可以用于T2DM的实验研究。4.同种异体BMSCs移植能够在一定程度上治疗大鼠T2DM,移植的BMSCs能够迁移至T2DM大鼠的胰腺组织,并分化为胰岛素分泌细胞,同时应用Exendin-4,能够更好地降低T2DM大鼠的血糖,增加胰岛β细胞胰岛素染色阳性区域的面积,改善β细胞功能。5.BMSCs移植通过增加PDX-1与胰岛素的表达,促进β细胞再生,同时,能够下调Caspase3、Bax的表达,减少β细胞的凋亡,联合Exendin-4能够协同增强BMSCs移植治疗T2DM的作用,为T2DM的细胞治疗提供了新的思路。
陈晓波[5]（2007）在《负载供体凋亡脾细胞的受体耐受性树突状细胞延长协调性异种胰岛移植物存活时间的实验研究》文中进行了进一步梳理随着Edmonton方案的出台,胰岛移植已成为一种使1型糖尿病患者摆脱胰岛素依赖的安全有效的治疗方法,但该方案要求每个受者至少要接受2个以上供体的胰岛才能恢复血糖正常,这更加剧了供体短缺,胰岛来源有限已成为当前胰岛移植的主要障碍。异种胰岛有望改善胰岛匮乏的局面,但其面临强烈的反应,目前抑制排斥反应的常用方法就是大剂量的免疫抑制剂,但其为非特异性免疫抑制,有继发感染、肿瘤的危险。诱导抗原特异性耐受是器官移植中的理想策略,也是当前的研究热点。异种胰岛移植排斥反应主要由抗原识别“间接途径”激活的T淋巴细胞所介导。树突状细胞（dendritic cell, DC）是唯一能够激活初始T细胞反应的抗原递呈细胞,在激发免疫应答或在诱导免疫耐受中DC起着枢纽作用,其功能主要与其成熟状态有关。未成熟DC能有效提呈凋亡细胞抗原并转向成熟。近期研究显示,细胞因子信号抑制因子-1（suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1）在抑制DC活化中起重要作用,因此,通过基因转染的方法上调SOCS1的表达能抑制DC成熟,维持其耐受原性。本研究中,我们用SOCS1基因修饰的受体DC负载供体凋亡脾细胞,然后于胰岛移植前7天注入受体,观察能否诱导T细胞耐受及延长异种胰岛移植物存活时间,本研究分以下七部分:第一部分小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体的构建、鉴定目的:构建含小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体,并予以鉴定。方法:以pEF-FLAG-1/mSOCS1质粒为模版,PCR扩增SOCS1序列,PCR产物经AgeI和NheI酶切,再定向插入到AgeI和NheI酶切的pDC316-LacZa质粒中,获得穿梭质粒pDC316-SOCS1,经PCR、AgeI和NheI酶切及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-SOCS1与腺病毒骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,经位点特异性重组获得含目的基因的重组腺病毒Ad5F35-SOCS1,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度。结果:PCR、酶切及测序证实穿梭质粒构建正确,PCR鉴定证实小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体构建正确,病毒的感染滴度为1.4×109 IU/ml。结论:成功构建了含小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体,为基因转染制备耐受性树突状细胞奠定了基础。第二部分小鼠骨髓源性树突状细胞体外培养及鉴定目的:建立一种简单经济的体外扩增、培养小鼠骨髓源性树突状细胞（bone marrow derived dendritic cell, BM-DC）的方法,并从形态学、免疫表型和细胞功能方面予以鉴定。方法:分离小鼠骨髓中DC前体细胞,用5ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）来扩增、培养小鼠BM-DC。培养体系分4天组和8天组组。培养第4天,收集疏松贴壁的细胞即为DC,用倒置显微镜、扫描电镜和透射电镜观察其形态特征,流式细胞仪分析其细胞表型,通过抗原吞噬实验和混合淋巴细胞反应（MLR）来观察其生物学功能。结果:培养所得的细胞具有典型的DC形态,4天组所得细胞其表型为、MHCⅡlow、CD40low、CD86low,具有很强的吞噬能力;而8天组所得细胞其表型为MHCⅡhigh、CD40high、CD86high,可显着刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论:用rmGM-CSF体外诱导培养可获得小鼠BM-DC。第三部分SOCS1基因转染对小鼠树突状细胞生物学特性的影响目的:研究SOCS1基因转染对小鼠树突状细胞生物学特性的影响。方法:用携带小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体转染小鼠DC,用免疫组化和Western blot检测DC中SOCS1的表达。用FCM检测DCs的细胞表型变化,通过混合淋巴细胞反应（MLR）观察DCs对T细胞增殖的影响,以ELISA检测细胞因子分泌水平,实验分为对照组、Ad-EGFP组、Ad-SOCS1组。结果:Ad-SOCS1组DCs中SOCS1表达明显,Ad-SOCS1组DCs中MHCⅡ分子及共刺激分子表达明显低于对照组及Ad-EGFP组;Ad-SOCS1组DCs IL-12的分泌与对照组DCs无显着差别,在LPS刺激时,Ad-SOCS1组IL-12的分泌均明显低于对照组DCs（P<0.05）。Ad-SOCS1组DCs对T细胞的增殖有抑制作用,而对照组及Ad-EGFP组DCs能明显激发T细胞增殖（P<0.05）。在MLR中,Ad-SOCS1组DCs明显抑制了Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌,而促进Th2类细胞因子IL-10的分泌（P<0.05）。结论:SOCS1基因转染能抑制DCs成熟,诱导T细胞向Th2方向分化,是制备耐受性DCs的有效方法。第四部分SOCS1基因转染小鼠树突状细胞负载大鼠凋亡脾细胞后的免疫特性研究目的:研究SOCS1基因修饰的小鼠树突状细胞负载大鼠凋亡脾细胞后的免疫特性。方法:用紫外线照射的方法来诱导大鼠脾细胞凋亡,FCM检测细胞凋亡。将大鼠凋亡脾细胞（Apo-SCs）与SOCS1基因转染的小鼠DC（SOCS1-DC）共培养48h,以使SOCS1-DC负载Apo-SCs（SOCS1-Apo-SCs DC）。FCM检测DC负载Apo-SCs前后共刺激分子的表达,通过初次MLR了解SOCS1-Apo-SCs DC刺激T细胞增殖的能力,用SOCS1-Apo-SCs DC预致敏小鼠后行再次MLR,观察SOCS1-Apo-SCs DC能否诱导抗原特异性T细胞低反应性。结果:小鼠DC可有效吞噬大鼠Apo-SCs,负载大鼠Apo-SCs的DC（Apo-SCs DC）其表面MHCⅡ分子及共刺激分子明显升高,刺激T淋巴细胞增殖的能力增强,而SOCS1-Apo-SCs DC其表面MHCⅡ分子及共刺激分子升高不明显,不能刺激T淋巴细胞增殖,再次MLR显示,SOCS1-Apo-SCs DC预处理的T细胞对与凋亡细胞同源的抗原产生低反应性。结论:SOCS1基因修饰的小鼠树突状细胞负载大鼠凋亡脾细胞后可诱导T细胞抗原特异性低反应性。第五部分大鼠胰岛的分离、纯化及鉴定目的:对大鼠胰岛分离、纯化条件进行优化,为下一步胰岛移植实验奠定基础。方法:通过胆总管逆行灌注胶原酶P溶液来消化大鼠胰腺,分离胰岛,采用不连续密度梯度Ficoll离心法纯化胰岛,观察胶原酶浓度、消化时间对大鼠胰岛分离结果的影响。双硫腙染色鉴定胰岛,丫啶橙/碘丙啶染色鉴定胰岛细胞活率,糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛功能。结果:胶原酶浓度、消化时间对胰岛分离结果有重要影响。1mg/ml胶原酶P在37℃静止消化45分钟条件下,胰岛分离效果最佳,效果较其他酶浓度和消化时间条件下好（P<0.05）,在此条件下分离的胰岛其纯度超过90%,胰岛细胞活率接近90%,胰岛体外培养3天后在低糖（2.8mmol/L）、高糖（16.7mmol/L）刺激下胰岛素释放量分别为（0.67±0.14）μg/L/10islets,（5.44±0.09）μg/L/10islets,两组间有显着性差异（P<0.05）,刺激指数为8.25±1.87。结论:胶原酶浓度、消化时间影响胰岛分离结果,优化分离条件可改善大鼠胰岛分离结果,1mg/ml胶原酶P静止消化45分钟条件下胰岛分离效果较好。第六部分糖尿病小鼠异种胰岛移植模型的建立和疗效观察目的:建立糖尿病小鼠模型及大鼠对小鼠异种胰岛移植模型,观察异种胰岛移植对小鼠糖尿病的疗效。方法:采用单次腹腔注射链脲霉素（200mg/kg）来制备糖尿病小鼠模型,以非空腹血糖连续超过16.7mmol/L视为造模成功。将600个大鼠胰岛移植到糖尿病小鼠肾被膜下,观察异种胰岛移植物的功能,以非空腹血糖连续超过11.2mmol/L视为移植物被排斥,功能丧失,并通过组织病理学观察异种胰岛移植物形态学的变化。结果:异种胰岛移植能使糖尿病小鼠血糖恢复正常,在无任何免疫抑制处理的情况下,异种胰岛移植物存活时间为6.50±1.05天,病理组织学检测证实,异种胰岛移植物被排斥。结论:成功建立糖尿病小鼠异种胰岛移植模型,为研究异种胰岛移植排斥或耐受奠定了基础。第七部分SOCS1基因修饰的受体树突状细胞负载供体凋亡细胞延长协调性异种胰岛移植物存活的实验研究目的:探讨负载供体凋亡脾细胞的受体耐受性树突状细胞在诱导协调性异种胰岛移植耐受中的作用。方法:建立Lewis大鼠对C57BL/6小鼠肾被膜下异种胰岛移植模型。胰岛移植前7天经尾静脉输注2×106个不同方法处理的受体DC来预处理受体小鼠,据输注DC的不同将实验分为6组:①对照组:单纯注射磷酸盐缓冲液;②DC组:单纯受体DC;③SOCS1-DC组:SOCS1基因转染的受体DC;④Apo-SCs DC组:负载供体凋亡脾细胞（Apo-SCs）的受体DC;⑤SOCS1-Apo-SCs DC组:负载供体Apo-SCs且已转染SOCS1基因的受体DC;⑥无关第三供体组:SD大鼠为供体,余处理同第5组。观察各组胰岛移植物存活时间及组织病理学改变,非空腹血糖低于11.2mmol/L视为血糖正常,血糖连续2天高于11.2mmol/L视为移植物排斥,功能丧失。结果:对照组、DC组、SOCS1-DC组、Apo-SCs DC组、SOCS1-Apo-SCs DC组及第三供体（SD）胰岛移植物存活时间分别为6.50±1.05天、6.14±1.57天、6.67±1.03天、4.86±1.35天、17.29±4.54天、6.17±1.17天,SOCS1-Apo-SCs DC组存活时间明显比其他各组长（P<0.01）。术后7天病理组织学检测发现,SOCS1-Apo-SCs DC组排斥反应明显较其他各组轻,该组移植物胰岛素染色明显较其他组强,提示移植物功能较好。结论:SOCS1基因修饰的受体DC负载供体凋亡脾细胞可延长协调性异种胰岛移植物存活时间。总结转染SOCS1基因能抑制DC成熟,SOCS1基因修饰的受体DC负载供体凋亡脾细胞可诱导T细胞抗原特异性低反应性,并能延长协调性异种胰岛移植物存活时间。
信照亮,贾延杰,胡海涛,任惠民[6]（2002）在《犬脑内移植大鼠胰岛细胞的凋亡状况》文中进行了进一步梳理目的 观察生物半透膜包裹异种胰岛样细胞团（ICCs） ,结合相对免疫特赦部位脑实质内移植的凋亡状况 .为异种胰岛细胞脑内移植可能的临床应用提供实验依据 .方法 SD大鼠ICCs分离、纯化与培养 ,生物半透膜包裹后犬脑实质内移植 .电镜观察移植后的细胞形态 ,胰岛素 TUNEL双标记染色鉴定胰岛β细胞凋亡 ,免疫组化染色观察凋亡相关基因bcl 2和bax的表达 .结果 胰岛素 TUNEL双标记染色证明了胰岛β细胞发生了凋亡 ,电镜下可见典型的凋亡细胞 ,有凋亡小体形成 .移植 1mo和 2mo,白细胞数分别为 2 4± 5和 93± 9（P <0 .0 1） ,白细胞数 /胰岛素阳性细胞数之比为 8± 3和2 0± 8（P <0 .0 1） ,随着移植时间的延长 ,白细胞增多 ,胰岛细胞减少 .Bcl 2和bax基因均有不同程度的表达 ,bax染色更浓 .结论 异种移植后的胰岛细胞死亡与凋亡有关 .半透膜包裹异种ICCs结合免疫特赦部位脑内移植的方法对克服免疫排斥反应有一定的作用 .
陈良[7]（2006）在《辛开苦降、活血通络法改善2型糖尿病胰岛功能的临床和实验研究》文中指出2型糖尿病的发病机制主要为胰岛素抵抗及β细胞功能受损两方面,目前认为只有胰岛素抵抗不足以引发糖尿病,必须同时有β细胞功能受损,胰岛素抵抗为始动因子,β细胞功能异常为决定因子。β细胞功能受损普遍存在,不但在糖尿病发生时,β细胞功能已经明显受损,而且在糖尿病发病前期以及糖尿病家系的非糖尿病一级亲属等高危人群,其β细胞功能受损已经存在。胰岛β细胞功能受损的发生是非常复杂的多因素作用的结果,主要是糖毒性、脂毒性、遗传因素等使得β细胞负荷加重,或/和β细胞数量减少,从而使胰岛β细胞在葡萄糖、氨基酸或化学药物等物质的刺激下分泌的质量、数量和时相均发生了变化而出现了维持血糖水平稳定的功能紊乱。近年来胰高糖素样肽-1（GLP-1）成为糖尿病研究的一大热点,它通过复杂的机制调节血糖,其中包括对胰岛素和胰高血糖素的分泌、胃的排空及外周胰岛素敏感性的调节,而且可以调节脂肪组织和肌肉的糖原合成,增加胰岛β细胞数量及抑制其凋亡等途径改善胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗。中医药是由许多复合成分组成,作用的机理往往是多途径、多因素、多环节的,因此中药符合已公认的需通过降糖、调脂,纠正代谢紊乱等综合因素来改善胰岛β细胞功能受损的治疗指导原则。因此本研究从临床观察和动物实验两方面阐明辛开苦降、活血通络法改善胰岛β细胞功能的疗效并初步探讨其作用机制。理论研究部分全面总结了2型糖尿病β细胞功能受损的发病机理,研究方法及中西药物治疗的研究现状;通过中医各派各家学术观点的古今文献资料回顾和总结,根据导师多年的临证经验总结,阐明了辛开苦降、活血通络法论治糖尿病胰岛β细胞功能受损的作用机理和证治规律。临床研究部分基于导师长期的临床实践经验,选用《伤寒论》中的干姜黄芩黄连人参汤合抵挡汤、丸加减组成的辛开苦降方,以体型偏胖且具有脾虚肝郁血瘀证为主要表现的代谢综合征患者为研究对象,采用临床单盲随机对照实验研究设计方法,通过观察辛开苦降方对体重、体重指数、腰臀围比、血糖、胰岛素、胰岛素分泌指数、胰岛素敏感指数以及临床症状的影响,阐明该法具有明显的疗效,并且初步探讨了辛开苦降、活血通络法改善以2型糖尿病为主要表现的代谢综合征患者胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能受损的作用机理。动物实验研究部分以高脂饲养的SD大鼠腹腔注射小剂量的STZ造成的实验性糖尿病大鼠模型,在疗效观察的基础上,通过免疫组化的方法观察胰岛细胞内胰岛素和胰高糖素的表达和小肠GLP-1-R细胞（即L细胞）内GLP-1的表达,并探讨了三者之间的关系,目的在于初步揭示辛开苦降、活血通络
李永翔[8]（2006）在《腺病毒载体转染HO-1基因胰岛移植的实验研究》文中研究表明目的：1、建立腺病毒载体转染人HO-1（heme oxygenase-1，血红素氧合酶—1，热休克蛋白32）基因的技术方法。2、建立获得大量成年SD（Sprague-Dawley，斯普拉-道来）大鼠胰岛及成人胰岛技术方案，为胰岛的体外培养及体内移植实验奠定基础。3、建立以腺病毒为载体转染人HO-1基因至胰岛细胞的方法确定最佳的MOI（multiplicities of infection，感染复数）。4、了解HO-1基因对胰岛细胞的作用，及腺病毒对胰岛细胞形态和功能的影响。并确定人HO-1基因在转染胰岛细胞中的表达情况。5、建立同种异体成年大鼠门静脉内胰岛移植模型。了解HO-1基因对移植胰岛是否具有抗凋亡、延长移植物存活时间、减少淋巴细胞浸润、抑制免疫排斥反应的功能，为基因转染胰岛细胞移植的临床应用奠定基础。方法：1、使用测序仪对质粒载体pobtt进行测序，并和人HO-1基因序列进行比对，通过PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）对构建好的腺病毒载体Ad-HO-1进行鉴定，鉴定质粒载体和腺病毒载体是否包含人HO-1基因的ORF（open reading frame，开放式阅读框架），对腺病毒载体Ad-HO-1进行扩增、纯化并进行滴度鉴定。2、采用Ricordi等报道的方法，分离纯化成人胰岛。采用胆总管原位插管，胶原酶P液（1mg／ml）灌注，37℃水浴消化、分离大鼠胰岛，Ficoll400（菲科尔400，水溶性聚蔗糖400）间断密度梯度方法纯化胰岛。采用DTZ（Dithizon，双硫棕）染色鉴定胰岛并计算IEQ（islet equivalent，胰岛当量）、AO／PI（acridine orange／Propidium iodide，吖啶橙-碘丙啶）双色荧光染色法测定胰岛活率，胰岛素释放试验鉴定胰岛细胞胰岛素分泌功能。3、使用不同MOI（MOI分别为2、5、10及20）的Ad-EGFP（携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体）转染成人及成年大鼠胰岛，通过荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白表达强度和表达时间，将转染EGFP基因的胰岛使用0.05％胰蛋白酶（含0.53mmol EDTA，ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸）短暂消化并吹打成单个细胞后使用流式细胞仪检测EGFP表达效率，结合参考文献确定转染胰岛Ad-HO-1的最佳MOI。4、将分离纯化获得的胰岛分为3组：HO-1组（胰岛使用Ad-HO-1进行转染，MOI=20）；EGFP组（胰岛使用Ad-EGFP进行转染，MOI=20）；对照组（不使用任何载体进行转染，其余处理同上述2组）。使用新分离大鼠胰岛作阴性对照，通过Western blot（蛋白质印迹）实验检测基因转染后2d的成人胰岛（HO-1组、EGFP组）及大鼠胰岛（HO-1组、EGFP组）细胞中人HO-1基因的表达情况，进一步鉴定基因载体的正确性、了解转染是否成功。5、EGFP组、HO-1组及对照组成人胰岛体外培养7d后，使用低糖（1.67mmol／L）1640培养液、高糖（16.7mmol／L）1640培养液刺激，收集上清液，使用125I人血清胰岛素放射免疫分析药盒检测胰岛素浓度，计算刺激指数。了解几组胰岛的胰岛素分泌功能变化。6、对照组、EGFP组及HO-1组成人胰岛基因转染、体外培养24h后（大鼠胰岛基因转染、体外培养7d后），培养液中加入rTNFa（recombinant tumor necrosis factor-a重组人肿瘤坏死因子a，5000u／ml）及CHX（cycloheximide，放线菌酮，50μg／ml）诱导凋亡。诱导48h后使用0.05％胰蛋白酶（含0.53mmol EDTA）短暂消化，并将胰岛吹打成单个细胞，流式细胞仪检测体外培养胰岛细胞诱导后的凋亡情况。7、腹腔内注射STZ（streptozocin，链脲菌素，65mg／Kg体重）建立SD糖尿病大鼠模型，观察成模后血糖变化情况。将移植受体糖尿病大鼠随机分为3组：对照组（单纯胰岛移植组），接受1200IEQ胰岛，该胰岛不转染任何基因（n=9）；HO-1组，接受1200IEQ胰岛，移植胰岛采用Ad-HO-1转染（n=9）：PBS（phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲液）组，大鼠门静脉内仅注射0.8mlPBS（n=6）。观察移植后大鼠的血糖、体重等方面的变化。8、移植后第7d（移植有效时）及移植后第21d（移植物失功），取HO-1组及对照组的肝脏，石蜡包埋后进行连续切片，行HE（hematoxylin／eosin，苏木素／伊红）染色、免疫组织化学染色（胰岛素染色），确定带有胰岛的切片；通过其相邻切片进行免疫组织化学染色观察2组受体肝脏内HO-1蛋白、CD3抗原表达情况，并和HE染色切片进行比较判断淋巴细胞浸润情况并根据相关标准进行分级；使用TUNNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase btotin-dUTPnick end labeling，末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP切口末端标记法）试剂盒检测移植胰岛细胞的凋亡情况。结果：1、纯化后每只大鼠平均胰岛收获量为629±102IEQ，胰岛纯度大于85％，胰岛细胞活率大于90％。大鼠胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在低糖和高糖刺激下的浓度分别为3.70±0.49 mIU／L和10.48±2.23 mIU／L，刺激指数为2.84±0.10，体外培养1d后开始贴壁，培养1周后几乎完全贴壁，培养1月生长状况仍良好。使用Ad-EGFP转染大鼠胰岛，MOI=2、5、10、20时，EGFP细胞阳性率分别为32.14％±4.94％、40.21％±2.84％、45.30％±2.36％及51.35％±2.91％。2、测序结果显示质粒载体pobtt含有人HO-1基因的ORF；腺病毒载体PCR结果显示该载体含有人HO-1基因的基因序列；绿色荧光蛋白在成人胰岛及大鼠胰岛细胞中的表达能够持续4周以上，表达强度以转染后第7d为最强。3、转染HO-1基因的成人胰岛在高糖刺激下胰岛素分泌量明显升高270.09±89.37 mIU／L，和对照组182.36±58.96 mIU／L及转染EGFP基因的胰岛175.95±75.05 mIU／L相比，具有显着性差异（P＜0.05）；使用rTNFa及CHX诱导，成人胰岛HO-1组胰岛细胞凋亡发生率为63.08％±10.86％，明显低于对照组的90.86％±11.25％（P＜0.01）；大鼠胰岛HO-1组诱导后凋亡细胞的发生率为4.22％±2.38％，显着低于EGFP组的28.76％±14.76％及对照组的23.81％±8.51％（P＜0.05）；EGFP组的胰岛凋亡率虽然高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。4、STZ诱导的大鼠糖尿病模型稳定，观察2个月维持高血糖状态，并具有糖尿病的“三多一少”典型症状。5、糖尿病大鼠移植当天血糖水平分别为：对照组，23.67±2.57 mmol／L；HO-1组，22.05±2.57 mmol／L；PBS组，24.06±3.57 mmol／L；组间血糖水平差异无显着性（P＞0.05）。移植后，HO-1组移植物存活时间为10.56±4.33 d，显着长于对照组移植物存活时间的5.33±4.18d（P＜0.05），PBS组血糖未见明显降低。移植3周时，HO-1组糖尿病大鼠体重增加明显。移植3周时HO-1组的体重增加指数为19.82％±12.4％，显着高于对照组的0.66％±6.24％及PBS的0.25％±9.16％（P＜0.05）。6、使用Ad-HO-1转染的胰岛移植后第7天仍可见HO-1蛋白明显表达。移植后第7天转染HO-1基因的胰岛内淋巴细胞浸润程度为0～1级，单纯胰岛移植组淋巴细胞浸润程度为2～3级。单纯胰岛移植组移植到肝脏内后胰岛细胞凋亡发生率为4.2％±2.3％，转染HO-1基因胰岛移植组胰岛细胞未见明显凋亡。移植3周后2组大鼠肝内移植胰岛无胰岛素表达，淋巴细胞浸润程度为3级。结论：1、采用胶原酶P消化、Ficoll400非连续密度梯度离心法可获得高纯度、高活率的大鼠胰岛。2、携带人HO-1基因的腺病毒载体构建成功，能在体外培养的胰岛细胞中表达。3、腺病毒载体对成人胰岛及大鼠胰岛具有较高的转染效率，在胰岛细胞内表达时间较长。4、使用携带人HO-1基因腺病毒载体（Ad-HO-1）转染体外培养的胰岛细胞能够增加胰岛细胞的抗凋亡能力，HO-1基因能够促进成人胰岛细胞胰岛素的分泌。5、HO-1基因能够明显延长肝内移植胰岛的存活时间，减少移植物的凋亡。6、HO-1基因转染移植胰岛能够明显减轻淋巴细胞对移植胰岛的浸润、减轻免疫排斥反应。7、使用腺病毒载体转染HO-1基因胰岛移植具有潜在的临床应用价值。
林波[9]（2003）在《糖尿病发病机理的探讨以及相关治疗方法的研究》文中进行了进一步梳理目的 ： 检测在糖尿病的发生过程中 Fas 和 FasL 的作用。 方法 ： 我们利用 hFasL 的转基因小鼠， 用低剂量的 STZ 来诱导糖尿病。 通过 RT—PCR 和 Western 我 们鉴定了 hFasL 在转基因小鼠的胰岛中的表达。 利用血糖的测定和组织切片 的观察来认定糖尿病的程度。 Il—1β， TNF—α， Fas 的表达都通过 RT—PCR 来鉴定。 结果 ：hFasL 转基因小鼠在胰岛上可以表达 FasL,它们相对于普通 的同品系的小鼠更容易被低剂量的 S T Z 诱导得病。在同时取标本的胰腺的 mRNA 的半定量 PCR 中，转基因小鼠的 Il—1β，TNF—α 的表达明显高于普 通小鼠。在体外实验中，发现 β 细胞株 RIN-5F 在 STZ 或者 Il—1β，TNF —α，IFNγ 的诱导下，可以表达 Fas，然后导致凋亡。 结论 ：Fas 和 FasL 在糖尿病的发生过程中起着很重要的作用。
潘雪[10]（2020）在《多囊卵巢综合征与心理应激相关性及补肾解郁调冲法干预的实验研究》文中研究指明目的1系统查阅、整理国内外多囊卵巢综合征（PCOS）相关文献,并通过对PCOS与心理应激相关性的分析阐释,为临床诊治PCOS提供参考依据及新思路。2通过横断面研究分析PCOS的中医证候分布特点;以慢性心理应激为切入点,对各中医证型与生活质量、心理状态及人格特征进行相关性分析,探讨PCOS中医各证型与慢性心理应激的关系,明确“肾虚肝郁”在PCOS中的重要病机作用,为中医辨证治疗提供理论基础。3应用来曲唑联合慢性温和不可预知应激（CUMS）法建立动物模型证实慢性心理应激对PCOS的重要影响;以此模型为研究对象,结合生殖与心理应激方面指标,探讨补肾解郁调冲方对模型大鼠的治疗作用及疗效机制;以内质网应激（ERS）诱导的卵巢颗粒细胞凋亡通路PERK-ATF4-CHOP为研究新靶点,探讨补肾解郁调冲方对PCOS合并慢性应激大鼠的疗效机制。方法1临床研究对309例PCOS患者的临床信息进行采集及整理;采用健康调查简表（SF-36）、焦虑/抑郁自评量表（SAS/SDS）、艾森克人格问卷简式量表中国版（EPQ-RSC）对患者的生活质量、焦虑及抑郁情绪变化、人格特征进行调查;分析PCOS患者的中医证候特点及不同证型PCOS患者在生活质量、心理健康、人格特征方面的差异性;应用Logistic回归分析,探究肾虚肝郁型PCOS与发病相关因素、焦虑抑郁情况及人格特征的依存关系。2实验研究以CUMS方法模拟慢性心理应激,以来曲唑构建PCOS大鼠模型。将大鼠随机分为空白组、慢性应激组（CUMS）、PCOS组、PCOS合并慢性应激组（PCOS+CUMS）。以行为学、卵巢组织病理学、血清性激素、海马组织神经递质等为指标进行模型对比及评价。应用PCOS+CUMS动物模型进行疗效机制研究。除正常组外,将成模大鼠随机分为模型组、达英-35组、单纯补肾（即补肾）组、补肾解郁调冲（即补肾解郁）低、中、高剂量组。进行行为学检测,测定各组大鼠卵巢体积、卵巢质量;以HE染色观察卵巢组织病理形态;ELISA法测定血清LH、FSH、FT水平;HPLC-ECD测定海马组织中NE、5-HT 及 5-HIAA 水平。选取补肾解郁低、中、高剂量组中疗效较佳的组别与其余各组进行疗效机制研究,以Tunel法检测卵巢颗粒细胞凋亡情况;免疫组化法检测GRP78、CHOP蛋白在卵巢组织中的表达及定位;Western Blot法检测卵巢组织中CHOP、GRP78、PERK、ATF4蛋白的表达水平。结果1临床研究（1）本研究有效病例为309例,27-33岁年龄段患者所占比例最高（55.34%）,文化程度以大专及以上为主（91.26%）,脑力劳动者居多（75.4%）;肥胖患者占比为36.89%,67.96%的患者无运动习惯,月经紊乱者占比为95.47%,有不孕病史者占29.13%,其中原发性不孕者占不孕症患者的64.44%,继发性不孕者为35.56%;（2）309例PCOS患者中,肾虚肝郁证占比最高（37.22%）,其次为痰瘀互结证（23.30%）、脾虚痰湿证（20.39%）、肾虚血瘀证（19.09%）;（3）不同证型间文化程度、工作性质、BMI存在差异（p<0.05）;大专及以上者在肾虚肝郁证中占比最高（95.65%）;脑力劳动者在肾虚肝郁证、脾虚痰湿证中占比较高,分别为80.95%、80.87%;脾虚痰湿证、痰瘀互结证PCOS患者BMI高于肾虚肝郁证、肾虚血瘀证（p<0.05）;（4）在SF-36方面,总体健康（GH）、情感职能（RE）、精神健康（MH）、活力（VT）维度得分较低;存在焦虑状态者占PCOS患者总人数的28.8%,抑郁状态者占40.13%;（5）不同中医证型在VT及MH方面存在统计学差异（p<0.05）;肾虚肝郁证VT维度及MH维度得分低于脾虚痰湿证（p<0.05）;肾虚肝郁型PCOS患者SF-36心理健康总分低于其余3个证型,SAS及SDS评分高于其余3个证型（p<0.05）;（6）各中医证型间EPQ-RSC中E、N、P维度得分差异具有统计学意义（p<0.05）。脾虚痰湿证的E维度得分最高,肾虚肝郁证最低;肾虚肝郁证的N、P维度得分最高,脾虚痰湿证最低;（7）进一步对中医证型占比最高之肾虚肝郁证进行Logistic回归分析,年龄、文化程度、工作性质、BMI、抑郁情况、神经质N与肾虚肝郁证有关（p<0.05）。年龄偏小（以34-40岁为参照）、体重偏低（以超重、肥胖为参照）、抑郁状态与肾虚肝郁证呈正相关;高中及中专学历（以大专及以上为参照）、工作以体力劳动为主（以无业参照）、情绪稳定或人格为神经质中间型（以情绪不稳定者为参照）与肾虚肝郁证呈负相关。2实验一PCOS组、PCOS+CUMS组大鼠体质量、血清FT水平、LH/FSH比值高于空白组（p<0.05）;PCOS+CUMS组较PCOS组卵巢组织多囊样改变更加明显;CUMS组、-PCOS+CUMS组大鼠水平运动得分、垂直运动得分、蔗糖偏嗜度及海马组织中NE、5-HT含量低于空白组（p<0.05）,5-HIAA含量、5-HIAA/5-HT比值高于空白组（p<0.05）;3实验二（1）体质量、卵巢体积及卵巢质量:模型组大鼠体质量、左侧卵巢体积及卵巢质量较正常组明显增加（p<0.05）;与模型组比较,达英-35组、补肾组及补肾解郁中剂量组大鼠体质量明显降低（p<0.05）,补肾解郁中剂量组大鼠左侧卵巢体积及卵巢质量明显减小（p<0.05）;（2）卵巢组织病理学:模型组可见多个囊状扩张卵泡,颗粒细胞排列松散,层数减少;补肾解郁中、高剂量组可见正常形态的卵泡及黄体,囊性扩张卵泡少见,颗粒细胞排列整齐,层数较模型组增多;（3）性激素:模型组大鼠LH、FT水平及LH/FSH比值较正常组升高（p<0.05）;与模型组比较,达英-35组及补肾解郁中剂量组大鼠FT水平明显降低（p<0.05）,达英-35组及补肾解郁中、高剂量组大鼠LH水平、LH/FSH比值明显降低（p<0.05）;补肾组在LH水平方面较模型组降低（p<0.05）;4实验三（1）行为学:模型组大鼠水平、垂直运动得分及蔗糖偏嗜度低于正常组（p<0.05）;与模型组比较,补肾组及补肾解郁中剂量组大鼠水平运动得分明显升高（p<0.05）;各治疗组大鼠垂直运动得分、蔗糖偏嗜度虽与模型组无显着差异（p>0.05）,但补肾解郁中剂量组、补肾组大鼠垂直运动得分较治疗前呈升高趋势;补肾解郁中剂量组蔗糖偏嗜度升高幅度最大;（2）神经递质:模型组大鼠NE、5-HT含量较正常组降低,5-HIAA含量升高（p<0.05）,而5-HIAA/5-HT比值呈升高趋势,但无统计学意义（p>0.05）;与模型组比较,补肾组及补肾解郁各剂量组NE含量明显升高（p<0.05）,各治疗组大鼠5-HT、5-HIAA含量及5-HIAA/5-HT比值与模型组无显着差异（p>0.05）,补肾解郁中剂量组5-HT含量最高,补肾解郁高剂量组5-HIAA含量最低;5实验四（1）颗粒细胞凋亡情况:与正常组比较,模型组较正常组卵巢颗粒凋亡指数明显增高（p<0.05）;与模型组相比,达英-35组及补肾解郁中剂量组大鼠卵泡凋亡指数明显降低（p<0.05）;（2）GRP78、CHOP、PERK、ATF4蛋白表达:模型组大鼠卵巢组织中GRP78、CHOP蛋白主要表达于颗粒细胞层中;与正常组比较,模型组GRP78、CHOP、ATF4蛋白表达明显上调（p<0.05）,模型组PERK蛋白表达水平升高,但差异无统计学意义（p>0.05）;与模型组相比,达英-35组、补肾组及补肾解郁中剂量组GRP78、ATF4蛋白表达明显降低（p<0.05）,补肾解郁中剂量组CHOP蛋白表达水平明显降低（p<0.05）,各治疗组PERK蛋白表达水平下降,但差异无统计学意义（p>0.05）。结论1通过文献综述,PCOS是一种生殖功能障碍与代谢异常并存的内分泌紊乱性疾病,心理应激在PCOS的发生发展中具有重要作用。中医药在治疗PCOS方面积累了丰富的经验,应结合心理应激因素进一步研究中医药治疗PCOS的作用机制及优势。2临床研究证实,肾虚肝郁证是PCOS常见的中医证型;肾虚肝郁型PCOS患者存在更大的精神压力及心理负担,且易具有内向,情绪不稳定,焦虑紧张等人格倾向,“肾虚肝郁”与PCOS患者的慢性心理应激状态具有密切关联;年龄偏小、体重偏低、存在抑郁状态、情绪不稳定者辨证为肾虚肝郁证的可能性更大,临证治疗中应重视患者的精神心理状态。3来曲唑联合CUMS诱导的PCOS合并慢性应激状态动物模型较传统PCOS模型大鼠卵巢病理改变、内分泌及行为学变化、神经递质方面更贴近临床,可作为研究PCOS合并心理应激的病理及药效学机制的可靠动物模型,并进一步证实了慢性心理应激与PCOS相互影响。4补肾解郁调冲方可促进模型大鼠体内生殖内分泌环境恢复平衡,促进卵泡发育及排卵,改善行为学表现;该方的疗效作用机制可能与调节模型大鼠脑内单胺类神经递质,抑制PERK-ATF4-CHOP信号通路,下调GRP78表达,进而延缓ERS介导的卵巢颗粒细胞凋亡有关。
二、犬脑内移植大鼠胰岛细胞的凋亡状况（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、犬脑内移植大鼠胰岛细胞的凋亡状况（论文提纲范文）
（1）人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 人乳牙牙髓干细胞经不同输注途径治疗糖尿病大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第二部分 人乳牙牙髓干细胞治疗不同血糖水平糖尿病大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第三部分 人乳牙牙髓干细胞治疗糖尿病大鼠机制初探 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第四部分 SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗1型糖尿病的机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（2）胰岛移植关键技术探索及动物体内移植研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 糖尿病防治形势严峻 |
| 1.2 胰岛移植治疗糖尿病的研究 |
| 1.3 微囊化胰岛移植的研究 |
| 1.4 非微囊化胰岛移植 |
| 1.4.1 肾被膜下胰岛移植 |
| 1.4.2 门静脉内胰岛移植 |
| 1.5 胰岛移植后微血管重建的研究 |
| 1.6 小结 |
| 1.7 本论文研究思路和内容 |
| 1.7.1 总体思路 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 2 微囊化胰岛经腹腔移植治疗糖尿病的研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 APA微囊的制备装置及一般制备工艺 |
| 2.2.2 海藻酸钠的纯化 |
| 2.2.3 APA微囊的制备 |
| 2.2.4 微囊膜厚度的评价 |
| 2.2.5 微囊冻干后膜表面及断面的评价 |
| 2.2.6 微囊的通透性评价 |
| 2.2.7 小鼠胰岛的分离 |
| 2.2.8 胰岛的纯度、计数和当量计算 |
| 2.2.9 静态糖刺激胰岛素释放试验 |
| 2.2.10 小鼠糖尿病模型的建立 |
| 2.2.11 微囊化胰岛的腹腔内移植 |
| 2.2.12 微囊回收 |
| 2.2.13 统计学处理 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 纯化后的海藻酸钠 |
| 2.3.2 APA微囊的制备结果 |
| 2.3.3 微囊膜厚度测定结果 |
| 2.3.4 囊膜表面及断面结构观察 |
| 2.3.5 微囊的通透性结果 |
| 2.3.6 小鼠胰岛的分离结果 |
| 2.3.7 静态葡萄糖刺激胰岛素释放结果 |
| 2.3.8 微囊化胰岛移植的降血糖效果 |
| 2.3.9 微囊的回收 |
| 2.3.10 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 微囊化胰岛经人造血管移植的效果初探 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 大鼠胰岛的分离 |
| 3.2.2 胰岛的纯度、数量和当量 |
| 3.2.3 家兔糖尿病模型的建立 |
| 3.2.4 人造血管移植装置的改进 |
| 3.2.5 复式微囊的制备 |
| 3.2.6 微囊化胰岛经改良后的人造血管移植至家兔颈动脉 |
| 3.2.7 移植后微囊的扫描电镜检查 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 大鼠胰岛的分离结果 |
| 3.3.2 家兔糖尿病造模结果 |
| 3.3.3 复式微囊的制备结果 |
| 3.3.4 改良的人造血管移植装置 |
| 3.3.5 复式微囊经改进后的人造血管装置移植的结果 |
| 3.3.6 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 胰岛肾被膜下移植疗效和肝内移植分布的研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 小鼠糖尿病模型的建立 |
| 4.2.2 啮齿动物胰岛的分离 |
| 4.2.3 人胰岛的分离 |
| 4.2.4 胰岛计数和当量的测定 |
| 4.2.5 胰岛活性 |
| 4.2.6 肾被膜下胰岛移植 |
| 4.2.7 胰岛移植疗效的监测 |
| 4.2.8 口服葡萄糖耐量试验 |
| 4.2.9 胰岛素浓度测定 |
| 4.2.10 含胰岛移植物的肾切除 |
| 4.2.11 透射电子显微镜检查 |
| 4.2.12 啮齿动物肝脏去细胞支架的制备 |
| 4.2.13 小鼠含胰岛肾的组织学评价 |
| 4.2.14 胰岛染色并通过门静脉输注 |
| 4.2.15 胰岛在肝脏中的栓塞和分布 |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 胰岛的分离纯化和活性结果 |
| 4.3.2 肾被膜下胰岛移植的结果 |
| 4.3.3 移植的疗效 |
| 4.3.4 移植胰岛的组织学研究 |
| 4.3.5 口服糖耐量试验结果 |
| 4.3.6 肾被膜下胰岛的透射电镜检查结果 |
| 4.3.7 肝脏去细胞生物支架的制备结果 |
| 4.3.8 小鼠胰岛在小鼠肝脏去细胞生物支架中的分布 |
| 4.3.9 大鼠胰岛在大鼠肝脏去细胞生物支架中的分布 |
| 4.3.10 人胰岛在大鼠肝脏去细胞生物支架中的分布 |
| 4.3.11 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 小鼠胰岛与含bFGF生物胶共移植治疗小鼠糖尿病的研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 含不同浓度bFGF细胞培养液的配制 |
| 5.2.2 小鼠胰岛分离纯化及计数 |
| 5.2.3 胰岛在含不同浓度bFGF培养液共培养后的活性检测 |
| 5.2.4 胰岛组织透射电镜检查 |
| 5.2.5 含不同浓度bFGF透明质酸钠生物胶的制备 |
| 5.2.6 小鼠糖尿病模型的建立 |
| 5.2.7 实验分组设计 |
| 5.2.8 移植前胰岛的准备 |
| 5.2.9 肾被膜下胰岛移植 |
| 5.2.10 糖耐量试验 |
| 5.2.11 组织学评价 |
| 5.2.12 Western Blot检测CD31、VEGF、C-caspase-3、Bax、Bcl2的含量 |
| 5.2.13 统计学分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 不同浓度bFGF培养液对胰岛内部结构及胰岛内血管内皮修复的影响 |
| 5.3.2 不同浓度bFGF培养液对胰岛细胞团活性的影响结果 |
| 5.3.3 胰岛移植后小鼠血糖变化结果 |
| 5.3.4 口服糖耐量试验结果 |
| 5.3.5 各组HE和Insulin免疫组化染色结果 |
| 5.3.6 各组胰岛移植后CD31和VEGF表达的Western Blot检测结果 |
| 5.3.7 含bFGF生物胶对移植后的胰岛抗凋亡作用 |
| 5.3.8 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 总结 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 创新之处 |
| 6.3 展望 |
| 6.3.1 我国糖尿病患者人数众多,防治任重而道远 |
| 6.3.2 推广胰岛移植技术,利国利民 |
| 6.3.3 机遇与挑战并存,吾将全力探索 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
（3）从胰岛细胞移植到胰腺干细胞移植,治愈糖尿病还有多远?（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 细胞移植与糖尿病 |
| 1.1胰岛细胞移植与糖尿病 |
| 1.2胰腺干细胞移植与糖尿病 |
| 1.3胰岛细胞移植治疗糖尿病的适应症 |
| 2 胰岛细胞核胰腺干细胞移植治疗糖尿病的相关研究以及影响因素 |
| 2.1 国内外关于胰岛细胞移植治疗糖尿病的实验与临床研究 |
| 2.2 胰腺干细胞移植治疗糖尿病的实验研究进展 |
| 2.3 影响胰岛细胞移植治疗糖尿病的相关因素分析 |
| 2.3.1 移植部位 |
| 2.3.2 移植数量 |
| 2.4 影响胰腺干细胞移植治疗糖尿病的相关因素分析 |
| 2.4.1 胰十二指肠同源异型盒基因 |
| 2.4.2 巢素蛋白 |
| 2.4.3 细胞角蛋白 |
| 2.4.4 kit基因 |
| 2.4.5 细胞核内转录因子 |
| 2.4.6 波形蛋白 |
| 2.4.7 成对盒基因4 |
| 3 胰岛细胞移植与胰腺干细胞移植治疗糖尿病面临的问题及对策 |
| 3.1 胰岛细胞移植治疗糖尿病面临的问题及对策 |
| 3.2 胰腺干细胞移植治疗糖尿病面临的问题及对策 |
| 4 小结 |
（4）Exendin-4在骨髓间充质干细胞治疗糖尿病中作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 正常大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Exendin-4在大鼠骨髓间充质干细胞转分化为胰岛样细胞中作用的体外研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Exendin-4在骨髓间充质干细胞治疗2型糖尿病中的作用 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 Exendin-4在骨髓间充质干细胞治疗2型糖尿病中作用的机制研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）负载供体凋亡脾细胞的受体耐受性树突状细胞延长协调性异种胰岛移植物存活时间的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英语缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠SOC51 基因重组腺病毒载体的构建、鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠骨髓源性树突状细胞体外培养及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SOC51 基因转染对小鼠树突状细胞生物学特性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 SOC51基因转染小鼠树突状细胞负载大鼠凋亡脾细胞后的免疫特性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 大鼠胰岛的分离、纯化及鉴定 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六部分 糖尿病小鼠异种胰岛移植模型的建立和疗效观察 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七部分 SOC51基因修饰的受体树突状细胞负载供体凋亡细胞延长异种胰岛移植物存活时间的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 攻读学位期间参加的学术活动 |
| 上海交通大学学位论文答辩决议书 |
（7）辛开苦降、活血通络法改善2型糖尿病胰岛功能的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 文献和理论研究 |
| 2 型糖尿病胰岛功能损伤的发病机理和药物治疗研究现状 |
| 中医对2 型糖尿病胰岛功能受损的研究概况 |
| 存在的问题和展望 |
| 辛开苦降、活血通络法改善2 型糖尿病胰岛功能的理论探讨 |
| 第二部分 辛开苦降、活血通络法对代谢综合征患者胰岛β细胞功能及胰岛素敏感性的临床研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 辛开苦降、活血通络法改善实验性糖尿病大鼠胰岛功能的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）腺病毒载体转染HO-1基因胰岛移植的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、糖尿病及胰岛细胞移植 |
| 二、腺病毒基因治疗 |
| 三、HO-1基因在胰岛移植中的保护作用 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠胰岛的分离纯化及腺病毒载体转染大鼠胰岛细胞效率的测定 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 转染HO-1基因增强成人胰岛细胞抗凋亡和胰岛素释放功能 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 腺病毒载体转染人HO-1基因对大鼠同种胰岛移植的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录一 综述 |
| 附录二 英文缩写 |
| 附录三 在读期间发表的论文及获得的奖励 |
| 致谢 |
（9）糖尿病发病机理的探讨以及相关治疗方法的研究（论文提纲范文）
| 第一部分 ：糖尿病发病机理的研究 |
| 第一章 ：Fas-FasL途径在STZ诱导的糖尿病发病中的作用 |
| 第二章 ：乙酰胆碱脂酶（AChE）在STZ所诱导的I型糖尿病中的作用 |
| 第三章 ：综述:FasL与I型糖尿病的关系 |
| 第二部分 ：糖尿病的相关治疗方法的研究 |
| 第一章 ：hFasL转基因小鼠胰岛异种移植治疗糖尿病SD大鼠的研究 |
| 第二章 胰腺原位注射A20基因抑制小鼠链脲佐菌素（STZ）诱发的糖尿病的发生 |
| 第三章 ：综述：I型糖尿病的新型治疗方法 |
| 在读期间完成的论文 |
| 致谢 |
（10）多囊卵巢综合征与心理应激相关性及补肾解郁调冲法干预的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 多囊卵巢综合征的现代医学研究进展 |
| 1 患病情况 |
| 2 病因 |
| 3 发病机制 |
| 4 临床表现 |
| 5 并发症 |
| 6 诊断标准 |
| 7 治疗 |
| 8 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医学对多囊卵巢综合征的认识 |
| 1 病名源流 |
| 2 中医病因病机 |
| 3 中医证型分布特点 |
| 4 中医治疗 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 多囊卵巢综合征与心理应激的相关性研究进展 |
| 1 PCOS发病的社会心理因素 |
| 2 PCOS患者的心理特征 |
| 3 心理应激与PCOS之间的内分泌关联 |
| 4 心理障碍是PCOS的重要并发症 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于心理社会因素、人格特征探讨多囊卵巢综合征中医证型与心理应激的相关性 |
| 前言 |
| 1 研究材料 |
| 2 研究内容及方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 补肾解郁调冲方干预多囊卵巢综合征合并慢性应激大鼠疗效机制的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 多囊卵巢综合征合并慢性应激状态大鼠模型的建立及评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 补肾解郁调冲方对多囊卵巢综合征合并慢性应激大鼠卵巢形态学、性激素水平的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 补肾解郁调冲方对多囊卵巢综合征合并慢性应激大鼠行为学、海马神经递质的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 补肾解郁调冲方对多囊卵巢综合征合并慢性应激大鼠卵巢PERK-ATF4-CHOP凋亡通路的影响PERK-ATF4-CHOP凋亡通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
四、犬脑内移植大鼠胰岛细胞的凋亡状况（论文参考文献）
- [1]人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究[D]. 谢俊豪. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]胰岛移植关键技术探索及动物体内移植研究[D]. 傅红兴. 南京理工大学, 2018(06)
- [3]从胰岛细胞移植到胰腺干细胞移植,治愈糖尿病还有多远?[J]. 王洪,李金成,李政,孙海峰,殷慧. 中国组织工程研究, 2013(18)
- [4]Exendin-4在骨髓间充质干细胞治疗糖尿病中作用的实验研究[D]. 李华青. 山西医科大学, 2010(12)
- [5]负载供体凋亡脾细胞的受体耐受性树突状细胞延长协调性异种胰岛移植物存活时间的实验研究[D]. 陈晓波. 上海交通大学, 2007(06)
- [6]犬脑内移植大鼠胰岛细胞的凋亡状况[J]. 信照亮,贾延杰,胡海涛,任惠民. 第四军医大学学报, 2002(24)
- [7]辛开苦降、活血通络法改善2型糖尿病胰岛功能的临床和实验研究[D]. 陈良. 北京中医药大学, 2006(01)
- [8]腺病毒载体转染HO-1基因胰岛移植的实验研究[D]. 李永翔. 复旦大学, 2006(02)
- [9]糖尿病发病机理的探讨以及相关治疗方法的研究[D]. 林波. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）, 2003(03)
- [10]多囊卵巢综合征与心理应激相关性及补肾解郁调冲法干预的实验研究[D]. 潘雪. 北京中医药大学, 2020(04)