一、血清(浆)酶传统活性测定存在的问题及酶蛋白测定的意义（论文文献综述）
胡小祥[1]（2021）在《极光螺杆菌丙氨酸脱氢酶的酶学性质研究、改造及应用》文中研究表明丙氨酸脱氢酶（ADH;EC.1.4.1.1）属于氧化还原酶类,该酶可以利用NAD（P）+和NAD（P）H作为辅酶,催化丙氨酸和丙酮酸之间的相互转化。它在细菌、真菌和植物中普遍存在,是糖代谢和氨基酸代谢过程中非常重要的酶,在食品、医药、生物技术领域已被广泛应用。本研究对致病菌Helicobacter aurati的基因序列进行分析,发现它存在两个潜在的ADH蛋白序列,我们将其命名为HaADH1和HaADH2,采用不同拷贝数的质粒在分子伴侣蛋白的协助下促进其可溶性表达,以丙酮酸为底物,发现HaADH1能够催化丙氨酸和丙酮酸之间的相互转化,但HaADH2对丙氨酸和丙酮酸都没有显示出催化活力。对HaADH1的酶学性质进行研究,得到其最适温度为55℃,还原反应的最适p H为8.0,在p H 5.0的时候只有最大活力的17%,但其比酶活却有45.6 U·mg-1,氧化反应的最适p H为9.0。所有测定的金属离子对HaADH1都有不同程度的抑制,说明这个酶属于非金属依赖型的酶。在还原反应中,HaADH1对丙酮酸表现出最高的底物亲和力(Km=0.56 m M,kcat/Km=364.1 s-1·m M-1),与丙酮酸相比,HaADH1对草酰乙酸,3-氟丙酮酸,α-酮戊二酸,乙醛酸的相对活性分别为93.3%,5.6%,2.6%,2.5%,而氧化反应只对丙氨酸具有氧化活性。对丙酮酸、3-氟丙酮酸、丙氨酸、NH4+的Km值分别为0.6、15.0、2.3、31.0 m M,kcat/Km值分别为364.1、0.6、8.1、7.1 s-1·m M-1。系统发育树分析表明HaADH1与他人已报道的丙氨酸脱氢酶的序列相似性较低,说明这是一种新型的丙氨酸脱氢酶。将HaADH1与葡萄糖脱氢酶连接到p RSFDuet-1载体上,转化进大肠杆菌中进行共表达,通过全细胞催化50 m M的3-氟丙酮酸,12 h的转化率达到98.3%。与以往已经报道的丙氨酸脱氢酶进行序列比对,发现Arg 15,Lys 74,His 95,Asp 268这四个位点是非常保守的,对这四个保守氨基酸进行定点突变,发现突变体均丧失了活性,并且有文献报道这四个位点是催化中心,因此推测在HaADH1中这四个位点可能也是催化中心。利用同源建模得到的模型结构对底物周围5（?）范围内的氨基酸进行丙氨酸扫描,发现只有Y93A对丙酮酸的催化活力上升,上升为野生型（Wild type,WT）的106%。对丙氨酸侧链甲基所在疏水口袋的三个氨基酸Tyr 93、Leu 128、Met 131进行饱和突变,发现Y93R和Y93K对丙酮酸的还原反应酶活力分别上升为野生型的164.5%和155.0%,半衰期由野生型的2.5 h分别提高到3 h和3.4 h,对3-氟丙酮酸的kcat/Km值由野生型的0.6 s-1·m M-1分别提升至2.5和1.8 s-1·m M-1。
王岳[2]（2018）在《双芳基酮还原酶立体选择性的半理性改造及蛋白结晶研究》文中研究指明(R)-（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）-甲醇[（R）-CPMA]是合成抗组胺药物倍他司汀的关键手性中间体。目前化学法合成（R）-CPMA占主要地位,但生物酶催化法由于其反应条件温和、选择性高和转化率高等优点,逐渐成为国内外研究的热点。在前期工作中,本课题组通过基因挖掘技术从Kluyveromyces polyspora中成功筛选得到NADPH依赖型的短链醇脱氢酶KpADH,其不对称还原（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）-甲酮（CPMK）生成（R）-CPMA的选择性达到82%。本论文以KpADH为出发酶,对其进行了半理性设计,活性位点研究,底物谱分析,蛋白结晶等研究工作。主要研究内容如下:首先,利用半理性设计提高醇脱氢酶KpADH的对映选择性。利用氨基酸密码子的简并性,设计疏水性分类组合饱和诱变（hydroclassified combinatorial saturation mutagenesis,HCSM）策略构建组合饱和突变库。筛选得到最优突变体50C10（C165F/E214Y/S237A）,其不对称还原CPMK的e.e.值为99.4%（R）,kcat/Km从16.7提高到至59.3 s–1·mM–1。对于8种双芳基酮底物,50C10显示出高于WT的比活力和对映选择性,尤其是对溴二苯甲酮,对硝基二苯甲酮和二苯乙酮的光学纯度都大于99%。利用50C10不对称合成（R）-CPMA。采用分批法补加500 mM CPMK,12 h反应转化率99%,回收率为88.6%,e.e.值>99%。基于HCSM文库筛选结果,发现214和237位点是KpADH立体选择性调控的关键位点。结合定点饱和突变和组合突变的方法,研究214和237位点氨基酸残基极性和位阻的变化对立体选择性的影响。经过两轮突变后,得到突变体E214Y/S237A,其不对称还原CPMK生成（R）-CPMA的e.e.值达到了99.1%;同时筛选得到了构型反转的突变体E214G/S237C,e.e.值为75.6%（S）。在单点突变的研究中,仅E214G单突变的立体选择发生了轻微反转（6.71%（S））,说明了组合效应对于KpADH的选择性反转的重要性。突变体E214Y/S237A和E214G/S237C对CPMK的Km较WT（0.78 mM）有所降低,是0.62和0.31 mM。为深入探索KpADH的手性识别机制,解析了KpADH-NADP复合物晶体结构。利用座滴法进行晶体的初筛及优化,在0.2 M醋酸铵,0.1 M HEPES,pH 7.0,31%PEG3,350,1 mM NADPH,5%异丙醇条件下得到高质量蛋白晶体。通过X-ray衍射得到分辨率1.98?的晶体数据,并利用分子置换法解析了KpADH-NADP的复合物结构。基于晶体结构和计算机分析,214和237位点空间位阻的改变是导致E214Y/S237A和E214G/S237C选择性的提高和反转主要原因。综上,本研究本设计了高效突变策略对KpADH的立体选择性进行了改造,并基于热点分析和晶体结构初步探索了其的手性识别机制。
白娟娈[3]（2017）在《苏北海岸带典型盐生植物根际放线菌多样性及其耐盐促生作用研究》文中研究表明本研究以江苏省连云港海岸带7种典型盐生植物根际土壤为材料,利用纯培养的方法总共分离得到45株放线菌,并在纯培养分离的基础上,利用免培养技术对盐生植物根际土壤放线菌多样性进行了研究,并对分离的菌株进行16S rRNA基因测序、系统发育分析以及潜在促生活性检测。根据根际放线菌促生潜在性检测,筛选出2株放线菌进行了盆栽实验,研究盐胁迫下根际土壤放线菌对小麦生长的影响。菌株16S rRNA基因测序结果显示,可培养的放线菌分别属于链霉菌属（Streptomyces）、节杆菌属（Arthrobacter）、诺卡氏菌属（Nocardia）、戈登氏菌属（Gordonia）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、微杆菌属（Microbacterium）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、壤霉菌属（Agromyces）、微球菌属（Micrococcus）、原小单孢菌属（Promicromonospora）、野野村氏菌属（Nonomuraea）、小单孢菌属（Micromonospora）12个属。通过Miseq PE300平台对7份根际土壤样品中细菌16S rRNA基因的高变异区V5-V7区进行测序,共获得有效序列138541条,共6641个OTU。通过与数据库进行比对分析,7份根际土壤中共探测到66个放线菌属,其中分枝杆菌属（Mycobacterium）、链霉菌（Streptomyces）、小单孢菌属（Micromonospora）和节杆菌属（Arthrabacter）最为丰富。高通量测序结果与我们纯培养分离的结果基本一致,但盐生植物根际土壤中还存在大量未培养的放线菌类群。通过对菌株KLBMP S0027和KLBMP S0039的形态特征观察、生理生化特征、化学分类、16S rRNA与gyrB基因系统发育分析以及DNA-DNA分子杂交的多相分类学研究,证实了2株菌属于诺卡氏菌属的新物种,KLBMP S0027和KLBMP S0039分别命名为江苏诺卡氏菌（Nocardia jiangsuensis sp.nov.）,根际栖居诺卡氏菌（Nocardia rhizosphaerihabitans sp.nov.）。对分离得到的放线菌进行解磷、固氮、产吲哚乙酸（IAA）、产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（ACC脱氨酶）、产铁载体等潜在促生长特性,以及产淀粉酶、木聚糖酶和几丁质酶等酶活性和耐受NaCl能力检测,研究结果发现分离的菌株至少有一种甚至多种促生潜在特征。以菌株KLBMP S0051和KLBMP S0019为材料,通过盐胁迫下接种土壤放线菌对小麦种子萌发及生长的影响初步探究了盐胁迫下两株菌对小麦的促生效应。研究结果发现,盐胁迫下接种菌株KLBMP S0051和KLBMP S0019后分别提高了小麦种子的萌发率1.41和1.98倍,并用KLBMP S0019菌悬液浸种的小麦继续盆栽试验,2%的盐胁迫下发现菌株KLBMP S0019能显着促进小麦植株的生长。本研究对海岸带盐生植物根际土壤的微生物组进行了分析,发现盐生植物根际土壤蕴含着丰富的放线菌资源和促生功能菌株,结合盆栽实验初步探究了盐胁迫下盐生植物根际放线菌对小麦幼苗的促生作用。本研究为后续深入探究盐生植物根际放线菌的生态功能提供了良好的前期基础与材料。
余晓丹[4]（2015）在《黄芩苷与野黄芩苷抑制幽门螺杆菌脲酶作用及其机理研究》文中提出目的：幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）感染与消化性溃疡、胃炎、甚至胃癌等疾病的产生发展密切相关。当前,治疗H. pylori感染的药物主要以抗生素为主,但日益凸显的H. pylori耐药问题、胃肠道菌群失调及不良反应等问题,让各国研究者从未停止寻找安全有效的抗H. pylori药物的研发步伐。由于脲酶为H. pylori的重要定植因子与致病因子,基于H. pylori脲酶抑制研发抗H. pylori药物,为当前国际上探求治疗H. pylori感染主要药物的一种有效途径。前期对植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的两个主要活性成分——黄芩苷（Baicalin）与野黄芩苷（Scutellar in）的研究中发现,它们具有良好的体外抑制洋刀豆脲酶作用,而且,野黄芩苷抑制效果比黄芩苷强。由于H. pylori脲酶不同于洋刀豆脲酶,其与疾病相关,因此,本研究从前期以植物性脲酶为工具酶的研究,转向与疾病相关的脲酶——. pylori脲酶为切入点,应用酶学方法,探讨黄芩苷与野黄芩苷抑制H. pylori脲酶活性的相关作用机理。本研究将阐明黄芩苷与野黄芩苷抑制H. pylori脲酶的作用机理,将有助阐明黄芩治疗H. pylori感染相关胃肠道疾病应用的药效物质基础；同时可为在研发用于治疗H. pylori感染的新型脲酶抑制剂方面,提供基源于中药的新的先导化合物、研究资料与思路。方法：1.幽门螺杆菌脲酶的提取及活性测定：通过Berthelot比色法（靛酚蓝显色法）,以洋刀豆脲酶活性作标准对照,对H. pylori酶活性进行测定。2.黄芩苷与野黄芩苷抑制H. pylori脲酶活性作用试验：通过半数抑制浓度实验,以乙酰氧肟酸（acetohydroxmic acid, AHA）为阳性药,探讨黄芩苷与野黄芩苷对H.pylori脲酶活性的抑制程度。3. H. pylori脲酶动力学研究试验： 根据Lineweaver-Burk plot及其方程,求得动力学参数vmax及米氏常数KM；通过两种不同的方法,即Dixon plot和Lineweaver-Burk plot勺二次作图法,分别求出抑制常数Ki值。此外,运用Dixon作图法及Lineweaver-Burk plot的二次作图法,进一步确证黄芩苷／野黄芩抑制H. pylori脲酶的作用类型。4.黄芩苷与野黄芩苷对H. pylori脲酶抑制位点分析试验：利用两类化合物,第一类为含巯基化合物,包括二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、半胱氨酸（cysteine, Cys）);第二类为脲酶活性中心抑制剂,包括硼酸（boric acid,B0）与氟化钠（sodium fluoride, NaF）,这两类化合物与脲酶活性部位的结合的异质性,通过脲酶-巯基保护试验、脲酶的再活化试验,初步探讨黄芩苷与野黄芩苷抑制幽门螺杆菌脲酶的作用位点。5. H. pylori脲酶分子对接研究：通过分子对接运行软件Auto-Dock version 4.0,分别对黄芩苷、野黄芩苷,与幽门螺杆菌脲酶的相互作用情况进行模拟,进一小验证抑制位点。结果：1.黄芩苷与野黄芩苷抑制H pylori脲酶活性作用研究黄芩苷与野黄芩苷对H pylori脲酶的半数抑制浓度（IC50）分别为0.82士0.07 mM与0.47士0.04 mM,为乙酰氧肟酸AHA （IC50=0.14 ± 0.05 mM）的半数抑制率的6倍与3倍。表明黄芩苷与野黄芩苷抑制H. pylori脲酶活性的效力虽不及AHA强,但显示良好的体外抑制H. pylori脲酶活性。实验结果还提示,黄酮类C环上的4’-OH有助于抑制作用。2. H. pylori脲酶动力学研究黄芩苷与野黄芩苷,两者对H pylori脲酶的抑制动力学均表现出米氏常数KM不变,最大反应速率vmax降低的动力学参数变化特征,表明黄芩苷与野黄芩抑制H.pylori脲酶均为非竞争性抑制类型。通过Dixon Plot作图法,求得黄芩苷与野黄芩抑制H. pylori脲酶的抑制常数Ki分别为0.14 ± 0.01 mM 与 0.18 ± 0.02 mM,提示黄芩苷对H. pylori脲酶的亲和力优于野黄芩苷对H. pylori脲酶的亲和力。。3.抑制位点分析（1）脲酶活性中心抑制剂（硼酸、氟化钠）对脲酶活性的保护作用极弱；而含巯基化合物（二硫苏糖醇、谷胱甘肽、半胱氨酸）能保护H. pylori脲酶,使其不受黄芩苷与野黄芩苷的抑制作用,提示黄芩苷与野黄芩苷对H. pylori脲酶的抑制位点主要在巯基部位。（2）加入二硫苏糖醇,可恢复已被黄芩苷与野黄芩苷抑制的H. pylori脲酶活性,提示黄芩苷与野黄芩苷对H. pylori脲酶的抑制作用为可逆反应。4.分子对接研究分子对接研究显示,黄芩苷与野黄芩苷以氢键的形式与H. pylori脲酶flap区域上的必需基团结合,特别是Cys-321,影响脲酶活性构象,从而抑制H. pylori脲酶活性。结论：黄芩苷与野黄芩苷能有效抑制H. pylori脲酶活性,且抑制作用具有浓度依赖的特点。动力学研究表明,黄芩苷与野黄芩苷以非竞争性、可逆的抑制方式对H. pylori脲酶进行抑制。抑制位点及分子对接研究表明,通过抑制H. pylori脲酶的巯基这一作用位点,黄芩苷与野黄芩苷发挥H. pylori脲酶活性抑制作用。本研究成果为从天然药物中寻找有效且安全的脲酶抑制剂,提供机理研究思路；为黄芩苷及野黄芩苷,作为脲酶抑制剂,在H. Pylori感染相关疾病上的应用开发,提供研究基础与资料。
邓满凤[5]（2015）在《磁性纳米颗粒固定化漆酶的制备及在含酚废水处理中的应用》文中研究说明为了提高漆酶在应用体系中的稳定性和重复使用性,本论文以磁性纳米颗粒为载体,通过多巴胺（DA）聚合过程中的原位包埋法制备出磁性Fe3O4纳米颗粒固定化漆酶（Fe3O4-PDA-Lac）和磁性SiO2纳米颗粒固定化漆酶（Fe3O4@SiO2-PDA-Lac）,并用于催化降解4-氯苯酚（4-CP）。主要内容及结果如下:（1）首先用热分解法制备出磁性Fe3O4纳米颗粒,以制备的磁性Fe3O4纳米颗粒为核,通过溶胶-凝胶法获得具有核壳结构的磁性SiO2纳米颗粒（Fe3O4@SiO2）。扫描电子显微镜（SEM）的结果表明,Fe3O4@SiO2纳米颗粒呈球状分布、尺寸均一,平均粒径在120 nm左右。Fe3O4@SiO2纳米颗粒的磁响应高（14.68 emu/g）,便于从反应体系中回收利用。从X-射线衍射仪（XRD）和红外光谱仪（FTIR）的分析结果可知,制备的磁性纳米材料是Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4@SiO2纳米颗粒。（2）采用中心复合响应面法优化了Fe3O4-PDA-Lac的制备条件,并考察了Fe3O4-PDA-Lac的酶学性质。当漆酶浓度为0.25 mg/mL,DA浓度为12.74 mg/mL,溶液pH为5.92时,Fe3O4-PDA-Lac的总酶活回收率能达到88.17%。与游离漆酶相比,Fe3O4-PDA-Lac的稳定性明显提高。在4 oC下储存40 d后,Fe3O4-PDA-Lac仍剩余89%的活性,重复使用10次后,酶活性仍保持70%。（3）利用正交试验法优化了Fe3O4@SiO2-PDA-Lac的制备条件,并对其酶学性质进行了探究。与传统的戊二醛（GA）交联法所制备出的磁性SiO2纳米颗粒固定化漆酶（Fe3O4@SiO2-GA-Lac）相比较,在最优制备条件下,Fe3O4@SiO2-PDA-Lac的总酶活回收率可达到43.28%,而Fe3O4@SiO2-GA-Lac的总酶活回收率仅为3.33%。与Fe3O4@SiO2-GA-Lac相比,Fe3O4@SiO2-PDA-Lac具有更宽的pH稳定性范围,并且热稳定性、储存稳定性和重复使用性均显着提高。（4）使用固定化漆酶去除4-CP,并探究溶液pH,漆酶浓度和ABTS介质对4-CP去除率的影响。当溶液pH为6,漆酶浓度为1.2 U/mL,反应8 h后,4-CP去除率为95%。当体系中加入50 umol/L的2,2’-连氮基-双（3-乙基苯并二氢噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）,反应10 min后,固定化酶对4-CP的去除率为99%,由此可知,ABTS可促进固定化漆酶催化降解4-CP。固定化漆酶在重复使用10次后,4-CP的去除率仍可达67%。
张平艳[6]（2014）在《桃蚜抗药性监测及对噻虫嗪的抗性生化机制研究》文中进行了进一步梳理桃蚜[Myxus persicae]是全世界重要的农业害虫之一,对蔬菜、棉花、玉米等植物造成危害,在过去几十年全球很多地区都深受其害。在防治过程中,长期施药使桃蚜产生了不同程度的抗药性,其中包括噻虫嗪。本文对华南六个地区的桃蚜种群进行抗药性监测、桃蚜对噻虫嗪抗性生化机制研究,噻虫嗪与不同增效剂混用对桃蚜的防治效果研究。1、本研究采用浸叶法监测了湖南和广东两省六个地区桃蚜种群对7种杀虫剂的抗性,结果表明桃蚜六个田间种群对吡虫啉的抗性最高,达到高抗；郴州、韶关、梅县和惠阳四个监测点的桃蚜种群对硫丹为低水平抗性或者敏感性下降；天河区小白菜和惠阳区甘蓝上的桃蚜对联苯菊酯分别产生了9.6倍和7.7倍的抗性；湖南郴州市监测点甘蓝上的桃蚜对丁硫克百威产生了低水平的抗性（抗性倍数8.1）。2、测得湖南省郴州市安仁县熊蜂山自然保护区野生桃树上采集的桃蚜品系对噻虫嗪敏感,作为相对敏感品系,用25%噻虫嗪可湿性粉剂进行抗性选育得到了抗性为75.6倍的桃蚜抗性种群,测得桃蚜敏感和抗性品系的GST比活力分别为3.1275和3.2159μmol/（min·mg pro）,差异不显着；酸性磷酸酯酶的比活力分别是105.2736和164.9327μmol/（30min·mg pro）,差异显着；碱性磷酸酯酶的比活力分别是1.6863和3.5481μmol/（30min·mg pro）,差异显着；羧酸酯酶的比活力分别是0.4635和2.8376μmol/（30min·mgpro）,差异显着；多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基比活力抗性种群是敏感种群的2.03倍。3、测定了三种酶抑制剂（TPP, DEM, PBO）对噻虫嗪的增效作用。结果表明PBO对噻虫嗪增效作用显着,达到了2.35倍；TPP对噻虫嗪也有较好的增效作用,增效了1.48倍；但DEM对噻虫嗪无明显的增效效果。在田间试验施药后168h发现、噻虫嗪1g/667m2与PBO混用后的防效超过噻虫嗪1.25g/667m2的防效。
刘佳[7]（2013）在《甜菜夜蛾抗药性监测及对氯虫苯甲酰胺的抗性机理研究》文中研究说明甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hubner）]是全世界重要的农业害虫之一,对包括蔬菜、棉花、玉米等在内的植物造成危害,全球很多地区在过去几十年都深受其害,长期的施药使害虫产生了不同程度的抗药性,其中包括氯虫苯甲酰胺。本文对四个地区的甜菜夜蛾种群进行抗性监测、生理抗性机制,GSTsl基因的表达特征及氯虫苯甲酰胺对幼虫影响的探究。1、本研究采用浸叶法监测了湖南和广西两省（区）四个地区甜菜夜蛾种群对I0种杀虫剂的抗性,结果表明甜菜夜蛾四个田问种群对高效氯氰菊酯的抗性最高,达到高抗；对甲维盐和硫丹的抗性处于低水平；对甲氧虫酰肼、氯虫苯甲酰胺、溴虫腈、氟虫腈和阿维菌素处于低抗至中抗水平；对杀虫单、毒死蜱产生了中等程度的抗性。2、测定了三种酶抑制剂（TPP,DEM,PBO）对氯虫苯甲酰胺的增效作用,结果表明在敏感品系和长沙田问品系中,DEM对氯虫苯甲酰胺的增效作用较小,增效比分别是1.33和1.72,湖南岳阳田间品系基础上筛选的品系中,增效作用显着增效比为3.42。比较了氯虫苯甲酰胺抗性与敏感种群三种解毒酶系（羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶和细胞色素P450）的比活力,结果表明：岳阳品系羧酸酯酶比活力在1-2龄最低,长沙品系3龄最低,三个品系在5龄时体内CarE的活性显着升高；岳阳品系GST比活力在3龄处于最高达到3.64,在1-2龄期为1.73处于最低；长沙种群田间品系比活力在3龄期达到2.53处于最高,在1-2龄为1.64处于最低；岳阳品系细胞色素P450比活力3龄最高为1.197,5龄最低为1.131,长沙品系细胞色素P450活力比值在4龄期处于最高达到1.138,5龄期最低为1.052。3、采用实时荧光定量RT-PCR测定了甜菜夜蛾GSTsl基因mRNA表达特征及低剂量氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾3龄幼虫GSTs1基因mRNA相对表达量的影响。结果表明：甜菜夜蛾幼虫GSTs1基因在3龄期的相对表达量最高且是5龄期的7.4倍；3龄幼虫的GSTs1基因在脂肪体的mRNA相对表达量最高,胸部的相对表达量高于头部和腹部；使用0.05mg/L氯虫苯甲酰胺处理甜菜夜蛾3龄幼虫,GSTs1基因相对表达量是未处理组的2.31倍。
曾晨杰[8]（2013）在《大型溞NAGase多克隆抗体检测水生节肢动物丰度的适用性研究》文中研究表明为定量测量个体生长和繁殖过程中所释放的几丁质酶,经过0.1mol/L PBS缓冲液（pH=7.4,含0.2mol/L NaCl）提取,35%-75%硫酸铵沉淀,DEAE Sephadex A-25阴离子交换柱层析和Sephadex G-150分子筛柱层析,从大型溞Daphnia magna体内提纯了N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）。被提纯的NAGase达到了电泳纯。以粗提物为起点,酶的纯化倍数和纯化回收率为20.09和25.2%,纯化产物（大约6.5mg）的比活力为2243380U/mg。酶分子中各亚基的分子量分别为128、99和71kD。酶促反应的米氏常数Km为0.300mmol/L,最大反应速度Vm为0.072μmol/mg/min;酶催化底物分解的最适pH为7.0,最适反应温度为45℃；酶在pH4.2-7.8的范围内活性处于高位；在不高于35℃的温度下处理30min,酶活性下降不明显。至于大型溞培养液中的游离态NAGase,其催化底物分解的最适pH为7.4,最适反应温度为40℃,该酶在pH4.6-7.8的范围内活性处于高位,在不高于40℃的温度下处理30min,酶活性下降不明显。这显示被提纯的酶和培养液中的酶在对温度和pH的反应方面具有相似性,它们可能属于相同分子型。用纯化的NAGase免疫BALB/c小鼠,得到了小鼠抗NAGase多克隆抗血清。在此基础上建立了用抗血清定量检测大型溞NAGase免疫含量（NAGase-IR）的间接非竞争ELISA方法。方法学研究表明所用抗原最适浓度为9.1ug/mL,抗血清最适稀释倍数为1：8000；用以测定NAGase-IR的标准曲线为：Y=1.650（1-e-0172x）,相关系数r=0.9984,标准误差S=0.0255,灵敏度为2.12ng/mL;建立的ELISA方法在不同蛋白浓度的批内、批间和整体的变异系数均小于10%,回收率介于95.4-97.6%之间,变异系数在1.67-9.27%之间。以本实验获得的抗血清与包括大型溞在内的几种水生节肢动物所释放的游离态NAGase进行反应。测得的交叉反应率,对大型溞、蚊子、摇蚊、剑水蚤、棘爪低额溞、绿藻分别为：87.5%、7.75%、6.25%、72.5%、80%、0.25%。这预示所制得的抗血清在甲壳纲内部特异性不高而在甲壳纲和昆虫纲之间具有较强特异性。作为抗原,来自大型溞体内和来自包括大型溞在内的几种水生节肢动物所释放的游离态NAGase与兔抗人基因重组N-乙酰β-D-氨基葡萄糖苷酶多肽抗体的交叉反应率均比较低（0.25%-19.09%）。利用间接非竞争ELISA方法研究了亚致死剂量（0.02μg/L、0.12μg/L、0.81μg/L）的硫脲类杀虫剂丁醚脲对大型溞群体发育进程的影响,21d的试验结果表明：在所设置的试验浓度下,大型溞群体的NAGase释放量与对照相比有明显的下降,且下降率与酶活性基本一致。这说明NAGase-IR可以作为群体生物量的指示因子。
李昵[9]（2012）在《降胆固醇乳酸菌的筛选及其降解机理研究》文中研究说明胆固醇摄入过量带来的高脂血症已经严重危害到人体健康，如何降低人体血清胆固醇水平的研究越来越受到广泛关注。近年来许多研究表明某些益生元及乳酸菌具有调节血脂代谢、降低人体血清胆固醇的能力，但具体的筛选指标、去除机理等尚不明确。本研究旨在筛选出具有高降胆固醇能力的乳酸菌，研究该菌株的降胆固醇机理以及优化益生元与菌株结合的降胆固醇能力，并研究在人工胃肠道环境下该菌株的降胆固醇能力，为开发具有降胆固醇功能的乳制品提供理论指导。首先通过选择性培养基平板涂布法从人体肠道、自制泡菜及海鱼肠道中筛选得到66株菌株，测定其体外去除胆固醇能力，并评价其耐酸性、耐胆盐性及胆盐水解酶（BSH）活性等生物学性能，再经生理生化鉴定得到具有高胆固醇去除率且生物学性能较好的乳酸菌。共获得14株胆固醇去除率为7-30%的乳酸菌，其中来源于人体肠道的编号为MPCF7-3菌株体外胆固醇去除率为23.29%，在0.3%的胆盐环境下及2h内在pH为2.0的环境中存活能力较好，经16S rDNA分子生物学鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。研究了植物乳杆菌MPCF7-3的降胆固醇机理，结果表明该菌去除胆固醇主要是通过共沉淀作用实现的，其次是菌体吸收作用，胆固醇掺入细胞膜的作用效果最小，三种途径的胆固醇去除率比重分别为56.78%、39.89%、3.35%。另外，该乳杆菌的休眠体细胞与热灭活细胞也能去除少量的胆固醇，去除率分别为2.54%与1.4%。研究了将益生元与菌株结合促进体外降胆固醇能力的优化条件，用响应面设计法中的Box-Behnken法分析了某些益生元与胆盐浓度对植物乳杆菌MPCF7-3降胆固醇能力的影响。确定了优化条件为：牛胆盐、低聚果糖及山梨糖醇浓度分别为0.17%、0.90%与1.88%时，菌株胆固醇去除率为34.04%，与优化前相比提高了10.75%，且该响应面模型能很好地描述菌株胆固醇去除率与牛胆盐、低聚果糖及山梨糖醇的关系。此外，研究了植物乳杆菌MPCF7-3在人工胃肠道环境下的耐受性及其降胆固醇能力。经人工模拟胃环境处理2h后，菌体数目由1010cfu/mL下降到108cfu/mL，再经人工模拟肠环境处理10h后，添加了益生元的实验组菌体存活率和体外胆固醇去除率分别为5.14%和17.54%，未添加益生元的实验组分别为为2.81%和3.45%。说明将益生元与乳酸菌结合在人体内也具有提高菌体的降胆固醇的潜力。
李翠翠[10]（2012）在《水体中甾体雌激素水平对生物群落的毒性与生物降解特性研究分析》文中指出本文以原生动物为靶生物的毒性实验显示：雌二醇（E2）对生物群落12h急性毒性最大无致死和最小全致死浓度范围是1-150mg/L；半致死浓度为67.4mg/L；长时间暴露在低剂量E2时会使原生动物群落变得单一本文从南京污水处理厂的活性污泥中分离到1株E2高效降解菌株。通过形态及生理生化鉴定,确定该菌株为肺炎克雷伯菌（K.pneum.pneumoniae）。菌株生长和降解特性分析表明,在1mg/L E2的液体培养基中,反应72h后,E2的降解率达到89.8%；菌株生长和降解的最适温度、pH和浓度分别为30℃、7.0和1-2mg/L。金属离子Fe3+、Na+、Ca2+对菌株生长以及降解能力的影响不大；Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ag+的影响较大；葡萄糖、乳糖有助于菌体的生长和E2的降解,淀粉没有影响；蛋白胨、酵母有助于E2的降解,降解率分别达到了83%、85%；硫酸铵并没有显着影响。对降解酶的定位显示：胞内酶对E2具有较好的降解作用,为诱导性酶。酶促反应最适条件：温度30℃、pH 7.0（蛋白含量266.67μg/mL,反应时间30mmin）。过酸过碱的环境会导致酶提取液不稳定。该酶蛋白在30-35℃时热稳定性良好,但温度高于35℃,酶活性降低,热不稳定；温度低于15℃,酶逐渐失活。酶提取液降解动力学分析得到,酶促反应的Vmax为0.265mmol/h, Km为3.68×104mol/L,Km值较小,说明该酶提取液对E2的亲和力较强,经不断培养和驯化后,可快速有效降解E2。用GC/MS分析E2的中间代谢产物,结果显示：E2最主要的降解产物为E1,但在初始阶段出现了一个具有内酯结构的不稳定化合物,经初步推测可能结构是5-羟基-15-甲基-13-杂氧四环[8.7.0.0<2,7>.0.<11,15>]十七烷基-2（7）,3,5-三烯-14-酯,并推断出一种可能的降解途径。
二、血清(浆)酶传统活性测定存在的问题及酶蛋白测定的意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血清(浆)酶传统活性测定存在的问题及酶蛋白测定的意义（论文提纲范文）
（1）极光螺杆菌丙氨酸脱氢酶的酶学性质研究、改造及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 极光螺杆菌 |
| 1.2 氨基酸脱氢酶 |
| 1.2.1 氨基酸脱氢酶概述 |
| 1.2.2 氨基酸脱氢酶的催化机理 |
| 1.2.3 氨基酸脱氢酶的应用 |
| 1.3 丙氨酸脱氢酶 |
| 1.3.1 丙氨酸脱氢酶概述 |
| 1.3.2 丙氨酸脱氢酶的亚基组成 |
| 1.3.3 NAD~+结合结构域 |
| 1.3.4 丙酮酸结合结构域 |
| 1.3.5 丙氨酸脱氢酶的定向进化 |
| 1.3.6 丙氨酸脱氢酶的催化机制 |
| 1.3.7 丙氨酸脱氢酶的应用 |
| 1.4 NADH辅酶再生 |
| 1.5 外源基因表达 |
| 1.6 全细胞催化 |
| 1.7 论文的研究意义和主要研究内容 |
| 1.7.1 论文的研究意义 |
| 1.7.2 论文的研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 试剂与材料 |
| 2.1.4 培养基和缓冲液配置 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.2.1 酶活检测方法 |
| 2.2.2 蛋白检测方法 |
| 2.2.3 3-氟丙氨酸检测方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因来源 |
| 2.3.2 基因的克隆及重组载体的构建 |
| 2.3.3 感受态细胞的制备方法 |
| 2.3.4 转化过程 |
| 2.3.5 蛋白的可溶性表达 |
| 2.3.6 目的蛋白的表达 |
| 2.3.7 目的蛋白的纯化 |
| 2.3.8 酶学性质研究 |
| 2.3.9 共表达质粒的构建及全细胞生物转化 |
| 2.3.10 生物信息学分析 |
| 2.3.11 HaADH1 单点突变体的构建 |
| 2.3.12 实验数据处理分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 HaADH在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1.1 pRSFDuet-HaADH的表达 |
| 3.1.2 重组质粒的构建以及重组表达 |
| 3.1.3 重组蛋白的表达和纯化 |
| 3.1.4 Ha ADH酶活力测定 |
| 3.1.5 系统进化树分析 |
| 3.1.6 酶学性质测定 |
| 3.2 HaADH1 的全细胞催化 |
| 3.3 HaADH1 的定向进化 |
| 3.3.1 活性中心残基的推测 |
| 3.3.3 定点突变菌株的构建和活性测定 |
| 3.3.4 突变体的热稳定性测定 |
| 3.3.5 突变体的动力学测定 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录2:蛋白序列 |
| 附录3:突变引物 |
| 附录4:质粒图谱 |
（2）双芳基酮还原酶立体选择性的半理性改造及蛋白结晶研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 手性化合物 |
| 1.1.1 手性的概念 |
| 1.1.2 手性药物 |
| 1.1.3 手性仲醇的作用及合成方法 |
| 1.1.4 (R/S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇[(R/S)-CPMA]的研究进展 |
| 1.2 醇脱氢酶的简介 |
| 1.2.1 醇脱氢酶 |
| 1.2.2 短链醇脱氢酶的一般结构性质 |
| 1.2.3 短链醇脱氢酶的催化机制 |
| 1.2.4 醇脱氢酶不对称还原反应的立体选择性 |
| 1.3 醇脱氢酶的分子改造 |
| 1.3.1 定向进化 |
| 1.3.2 理性设计 |
| 1.3.3 半理性设计 |
| 1.4 蛋白质的结晶及结构解析 |
| 1.4.1 X射线衍射的原理 |
| 1.4.2 蛋白质的结晶过程及方法 |
| 1.4.3 相位的确定 |
| 1.5 本论文的研究意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 课题来源 |
| 1.5.2 本课题的研究意义与研究背景 |
| 1.5.3 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂及来源 |
| 2.1.2 实验器材及来源 |
| 2.1.3 实验所用引物 |
| 2.1.4 主要培养基 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.2.1 酶活力的测定方法 |
| 2.2.2 蛋白含量测定 |
| 2.2.3 SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.2.4 液相色谱(HPLC)检测法 |
| 2.2.5 气相色谱(GC)检测法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HCSM饱和突变库的构建 |
| 2.3.2 定点突变菌株的构建 |
| 2.3.3 组合突变文库的构建 |
| 2.3.4 通量筛选方法 |
| 2.3.5 目的蛋白的过表达 |
| 2.3.6 KpADH蛋白纯化 |
| 2.3.7 KpADH突变体动力学参数测定 |
| 2.3.8 底物谱分析 |
| 2.3.9 冻干酶粉制备(R)-CPMA |
| 2.3.10 KpADHC端His-Tag切除 |
| 2.3.11 KpADH结晶蛋白的制备与纯化 |
| 2.3.12 KpADH晶体筛选与优化 |
| 2.3.13 KpADH晶体数据收集 |
| 2.3.14 KpADH晶体数据处理及解析 |
| 2.3.15 蛋白结构与底物分子对接 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 HCSM策略提高醇脱氢酶KpADH的对映选择性 |
| 3.1.1 HCSM文库的建立 |
| 3.1.2 HCSM文库的筛选 |
| 3.1.3 KpADH突变体纯化 |
| 3.1.4 动力学分析 |
| 3.1.5 底物谱分析 |
| 3.1.6 突变体50C10冻干酶粉制备(R)-CPMA |
| 3.2 Glu214和Ser237位点研究 |
| 3.2.1 KpADH单点突变体的构建 |
| 3.2.2 KpADH单点突变体催化性质和立体选择性分析 |
| 3.2.3 KpADH单点突变体动力学参数 |
| 3.2.4 KpADH214和237位点组合突变文库的建立 |
| 3.2.5 KpADH214和237位点组合突变文库的筛选 |
| 3.2.6 KpADH最优双突变体的表征 |
| 3.2.7 KpADH最优双突变体的底物特异性 |
| 3.2.8 KpADH最优突变体对不同底物选择性比较 |
| 3.3 KpADH蛋白结晶及结构解析 |
| 3.3.1 KpADHC端His-Tag切除 |
| 3.3.2 KpADH结晶蛋白制备 |
| 3.3.3 KpADH蛋白结晶初筛 |
| 3.3.4 KpADH蛋白结晶优化 |
| 3.3.5 KpADH晶体衍射数据收集 |
| 3.3.6 KpADH晶体结构解析 |
| 3.4 KpADH的晶体结构分析 |
| 3.4.1 KpADH的整体结构 |
| 3.4.2 KpADH的结构比较 |
| 3.4.3 KpADH的辅酶结合中心 |
| 3.4.4 KpADH的催化中心 |
| 3.4.5 分子模型解释手性识别机制 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1：HCSM建库引用的引物 |
| 附录2：定点突变引用的引物 |
| 附录3：最优突变体组合突变引物和混合质粒 |
| 附录4：KpADH突变体蛋白纯化SDS-PAGE分析图 |
| 附录5：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）苏北海岸带典型盐生植物根际放线菌多样性及其耐盐促生作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 选题背景和意义 |
| 1.1.1 江苏海岸带现状分析 |
| 1.1.2 土壤盐渍化的危害 |
| 1.1.3 盐生植物 |
| 1.2 放线菌的研究概况 |
| 1.3 植物根际土壤细菌多样性的研究方法 |
| 1.3.1 纯培养方法 |
| 1.3.2 免培养方法 |
| 1.4 植物根际促生菌的促生作用 |
| 1.4.1 固氮作用 |
| 1.4.2 溶磷作用 |
| 1.4.3 产IAA |
| 1.4.4 ACC脱氨酶 |
| 1.4.5 产生铁载体 |
| 1.4.6 产生抗病原菌的水解酶 |
| 1.5 本论文研究目的与意义 |
| 1.6 本研究方法与内容 |
| 1.7 研究技术路线 |
| 2 盐生植物根际土壤放线菌多样性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要设备 |
| 2.1.2 实验样品的采集 |
| 2.1.3 培养基的配制 |
| 2.1.4 土壤样品的预处理 |
| 2.1.5 土壤放线菌的纯化与保藏 |
| 2.1.6 基因组DNA的提取 |
| 2.1.7 16S rRNA基因PCR扩增 |
| 2.1.8 构建分离菌株的系统发育树 |
| 2.1.9 高通量测序结果分析 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 盐生植物根际土壤纯培养分离结果 |
| 2.2.2 盐生植物根际土壤免培养测序结果 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 潜在新物种的多相分类研究 |
| 3.1 实验与材料 |
| 3.1.1 试验菌株及所用仪器 |
| 3.1.2 形态特征鉴定 |
| 3.1.3 生理生化特征鉴定 |
| 3.1.4 化学分类试验 |
| 3.1.5 分子系统学试验 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 诺卡氏菌属菌株KLBMP S0027T的多相分类研究 |
| 3.2.2 诺卡氏菌属菌株KLBMP S0039T的多相分类研究 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 菌株促生长特征评价 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 解磷作用 |
| 4.1.4 固氮作用 |
| 4.1.5 纤维素酶活性检测 |
| 4.1.6 木聚糖酶活性检测 |
| 4.1.7 淀粉酶活性检测 |
| 4.1.8 产氨活性检测 |
| 4.1.9 蛋白酶活性检测 |
| 4.1.10 菌株耐盐性检测 |
| 4.1.11 产铁载体活性检测 |
| 4.1.12 几丁质酶活性检测 |
| 4.1.13 菌株产植物生长激素(IAA)活性检测 |
| 4.1.14 菌株产ACC脱氨酶活性检测 |
| 4.1.15 盆栽实验 |
| 4.1.16 数据测量与统计 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 菌株促生潜在活性检测 |
| 4.2.2 菌株对小麦促生效果的初步评价 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 总结展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 学位论文数据集 |
（4）黄芩苷与野黄芩苷抑制幽门螺杆菌脲酶作用及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 幽门螺杆菌研究进展 |
| 一、H.pylori简介及其危害 |
| 二、H.pylori感染的药物治疗 |
| 三、H.pylori脲酶致病机理的研究 |
| 第二节 脲酶及脲酶抑制剂研究进展 |
| 一、脲酶研究进展 |
| 二、脲酶抑制剂的研究概况 |
| 第三节 黄芩苷及野黄芩苷的研究进展 |
| 一、黄芩在中医药治疗H.Pylori感染中的应用 |
| 二、黄芩苷及野黄芩苷的药理研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 幽门螺杆菌的培养与脲酶的提取 |
| 一、试验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果与讨论 |
| 四、小结 |
| 第二节 黄芩苷与野黄芩苷抑制幽门螺杆菌脲酶活性作用研究 |
| 一、试验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果与讨论 |
| 四、小结 |
| 第三节 黄芩苷与野黄芩苷抑制脲酶动力学研究 |
| 一、试验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果与讨论 |
| 四、小结 |
| 第四节 黄芩苷与野黄芩苷对脲酶的抑制位点研究 |
| 一、试验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果与讨论 |
| 四、小结 |
| 第五节 黄芩苷与野黄芩苷抑制脲酶分子对接研究 |
| 一、分子对接方法 |
| 三、结果与讨论 |
| 结语 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件1 |
（5）磁性纳米颗粒固定化漆酶的制备及在含酚废水处理中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景介绍 |
| 1.2 固定化酶 |
| 1.2.1 固定化酶技术的简介 |
| 1.2.2 固定化酶的方法 |
| 1.2.3 固定化酶的载体 |
| 1.3 漆酶 |
| 1.3.1 漆酶的来源 |
| 1.3.2 漆酶的结构 |
| 1.3.3 漆酶的催化特性 |
| 1.3.4 漆酶的活性测定 |
| 1.3.5 漆酶在氯酚废水中的应用 |
| 1.4 立题目的和意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 第二章 磁性纳米颗粒的制备及表征 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 实验试剂和仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 磁性纳米颗粒的表面形貌 |
| 2.2.2 磁性纳米颗粒的磁滞曲线 |
| 2.2.3 磁性纳米颗粒的结构分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 磁性Fe_3O_4纳米颗粒固定化漆酶的制备及酶学性质的研究 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 实验试剂和仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 中心复合响应面法优化固定化漆酶制备过程 |
| 3.2.2 磁性Fe_3O_4纳米颗粒固定化漆酶的形貌分析 |
| 3.2.3 磁性Fe_3O_4纳米颗粒固定化漆酶的酶学性质 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 磁性SiO_2纳米颗粒固定化漆酶的制备及酶学性质的研究 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 实验试剂和仪器 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 正交试验法优化固定化漆酶制备过程 |
| 4.2.2 磁性SiO_2纳米颗粒固定化漆酶的形貌分析 |
| 4.2.3 磁性SiO_2纳米颗粒固定化漆酶的酶学性质 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 磁性纳米颗粒固定化漆酶处理氯酚废水 |
| 5.1 实验部分 |
| 5.1.1 实验试剂和仪器 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 溶液pH对4-CP去除率的影响 |
| 5.2.2 漆酶浓度对4-CP去除率的影响 |
| 5.2.3 ABTS对4-CP去除率的影响 |
| 5.2.4 固定化漆酶降解4-CP的重复使用性 |
| 5.3 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 (攻读学位期间发表的论文) |
（6）桃蚜抗药性监测及对噻虫嗪的抗性生化机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 桃蚜及其抗药性研究进展 |
| 1.1.1 发生与危害 |
| 1.1.2 桃蚜的生物学特性 |
| 1.1.3 桃蚜抗药性研究现状 |
| 1.1.4 桃蚜的抗药性机制 |
| 1.2 桃蚜抗性的综合治理 |
| 1.2.1 加强早期监测和预测,建立健全桃蚜整体防控体系 |
| 1.2.2 加强现代农业种植培训和宣传,培养现代新型农民 |
| 1.2.3 采用环境友好型方式进行科学防治 |
| 1.2.4 加强产学研相结合,开发绿色高效环保的杀虫剂 |
| 1.3 噻虫嗪及其研究进展 |
| 1.3.1 噻虫嗪的理化性质与生物活性 |
| 1.3.2 噻虫嗪的抗药性研究 |
| 1.4 杀虫剂增效作用机制研究进展 |
| 1.4.1 杀虫剂增效作用研究 |
| 1.4.2 杀虫剂增效机理研究 |
| 1.4.3 影响增效作用的因素研究 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 华南六个地区桃蚜对7种杀虫剂的抗药性测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 生物测定方法 |
| 2.1.3 数据统计 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 敏感毒力基线的建立 |
| 2.2.2 抗药性测定结果 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 第三章 桃蚜对噻虫嗪代谢抗性生化机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试虫源 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 萝卜苗种植方法 |
| 3.1.4 生物测定方法 |
| 3.1.5 蛋白质含量的测定 |
| 3.1.6 谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性测定 |
| 3.1.7 桃蚜磷酸酯酶活性测定 |
| 3.1.8 桃蚜羧酸酯酶(CarE)活性测定 |
| 3.1.9 桃蚜多功能氧化酶(MFO)O-脱甲基活性测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 生物测定结果 |
| 3.2.2 桃蚜噻虫嗪抗敏品系谷胱甘肽-S-转移酶活性测定结果 |
| 3.2.3 桃蚜噻虫嗪抗敏品系磷酸酯酶活性测定结果 |
| 3.2.4 桃蚜噻虫嗪抗敏品系羧酸酯酶测定结果 |
| 3.2.5 桃蚜噻虫嗪抗性和敏感品系多功能氧化酶(MFO)O-脱甲基活性测定结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 噻虫嗪与不同增效剂混用对桃蚜的防治效果 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 供试杀虫剂及试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 增效剂增效作用测定 |
| 4.1.5 试验数据统计与处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 三种增效剂对噻虫嗪的增效作用测定结果 |
| 4.2.2 三种增效剂对噻虫嗪的增效作用田间试验 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）甜菜夜蛾抗药性监测及对氯虫苯甲酰胺的抗性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 甜菜夜蛾及其研究进展 |
| 1.1 甜菜夜蛾的发生与危害 |
| 1.2 甜菜夜蛾暴发的原因 |
| 1.2.1 农业种植结构的变革及栽培管理 |
| 1.2.2 气候条件的变化 |
| 1.2.3 自身生物学特性 |
| 1.2.4 天敌和食物因素 |
| 1.2.5 抗药性的产生 |
| 1.3 甜菜夜蛾抗药性研究现状与发展 |
| 1.3.1 国内外甜菜夜蛾抗药性现状 |
| 1.3.2 甜菜夜蛾的抗性选育 |
| 1.4 甜菜夜蛾抗药性机理 |
| 1.4.1 表皮穿透速率降低 |
| 1.4.2 解毒代谢作用增强 |
| 1.4.3 靶标部位敏感性下降 |
| 1.5 甜菜夜蛾的抗性遗传 |
| 1.6 甜菜夜蛾的综合治理 |
| 1.6.1 建立健全甜菜夜蛾整体防控体系与完善抗药性监测手段 |
| 1.6.2 培养现代新型农民,将科学知识与传统好经验相结合 |
| 1.6.3 加强产学研相结合,开发绿色环保的高效药剂 |
| 1.6.4 采用环境友好型方式进行科学防治 |
| 2 氯虫苯甲酰胺及其研究进展 |
| 2.1 氯虫苯甲酰胺发展简介 |
| 2.1.1 氯虫苯甲酰胺生物特性 |
| 2.1.2 氯虫苯甲酰胺杀虫活性与防治谱 |
| 2.2 氯虫苯甲酰胺作用方式 |
| 3 实时荧光定量PCR技术 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第二章 甜菜夜蛾对10种杀虫剂的抗性监测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 供试药剂 |
| 1.3 测定方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 甜菜夜蛾对10种杀虫剂的敏感性毒力基线 |
| 2.2 甜菜夜蛾对10种杀虫剂的抗药性监测结果 |
| 2.2.1 甜菜夜蛾对甲维盐和阿维菌素的抗性 |
| 2.2.2 甜菜夜蛾对高效氯氰菊酯和氯虫苯甲酰胺的抗药性 |
| 2.2.3 甜菜夜蛾对毒死蜱和甲氧虫酰肼的抗性 |
| 2.2.4 甜菜夜蛾对氟虫腈和溴虫腈的抗性 |
| 2.2.5 甜菜夜蛾对杀虫单和硫丹的抗性 |
| 3 结论与讨论 |
| 第三章 甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性生化机制分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 供试杀虫剂及试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 增效剂增效作用测定 |
| 1.5 蛋白质含量的测定 |
| 1.6 甜菜夜蛾解毒酶活性测定 |
| 1.6.1 常用试剂的制备 |
| 1.6.2 甜菜夜蛾羧酸酯酶(CarE)测定 |
| 1.6.3 甜菜夜蛾谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的测定 |
| 1.6.4 甜菜夜蛾细胞色素P450 O-脱甲基活性的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 增效剂的增效作用 |
| 2.2 甜菜夜蛾代谢酶活性测定结果 |
| 2.2.1 甜菜夜蛾不同品系中羧酸酯酶(CarE)活力比较 |
| 2.2.2 甜菜夜蛾不同品系谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活力比较 |
| 2.2.3 细胞色素P450 O-脱甲基活性比较 |
| 3 讨论 |
| 第四章 甜菜夜蛾GSTs1基因mRNA表达特征及氯虫苯甲酰胺对其表达量的影响 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.1.1 供试试虫 |
| 1.1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.2 常用溶液的制备 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 甜菜夜蛾总RNA提取与cDNA第一链的合成 |
| 1.3.2 甜菜夜蛾3龄幼虫不同组织和部位材料的准备 |
| 1.3.3 氯虫苯甲酰胺处理甜菜夜蛾 |
| 1.3.4 引物设计与合成 |
| 1.3.5 实时荧光定量PCR |
| 1.4 试验数据的统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GSTs1基因在不同发育阶段mRNA相对表达量的差异 |
| 2.2 甜菜夜蛾3龄幼虫GSTs1基因在不同组织中mRNA表达量的差异 |
| 2.3 甜菜夜蛾3龄幼虫GSTs1基因在不同部位mRNA表达量的差异 |
| 2.4 氯虫苯甲酰胺处理对GSTs1基因mRNA相对表达量的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）大型溞NAGase多克隆抗体检测水生节肢动物丰度的适用性研究（论文提纲范文）
| 术语和缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究概况 |
| 1.1.1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶概述 |
| 1.1.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化和性质研究 |
| 1.1.3 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分子生物学研究 |
| 1.1.4 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在水生生态毒理学中的应用 |
| 1.2 大型溞(Daphnia magna)的研究进展 |
| 1.2.1 大型溞(Daphnia magna)概述 |
| 1.2.2 以大型溞为试验生物的生态毒性测定方法的研究进展 |
| 1.3 蛋白的分离纯化方法 |
| 1.3.1 盐析法(Salt fractionation) |
| 1.3.2 色谱法(Chromatography) |
| 1.4 抗体的制备方法 |
| 1.4.1 常规血清技术 |
| 1.4.2 杂交瘤技术 |
| 1.4.3 基因工程抗体技术 |
| 1.4.4 抗体库技术 |
| 1.5 酶联免疫吸附测定 |
| 1.6 本研究的研究目的意义和研究的主要内容 |
| 1.6.1 研究目的意义 |
| 1.6.2 研究的主要内容 |
| 1.6.3 研究的预期目标 |
| 第2章 大型溞(DAPHNIA MAGNA)N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶纯化产物的动力学特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 酶的分离纯化 |
| 2.2.2 酶催化反应的动力学性质研究 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 大型溞NAGASE多克隆抗体的制备和ELISA方法的建立 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试剂及ELISA缓冲液 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 生物材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 抗体的制备 |
| 3.2.2 间接非竞争ELISA法的质量控制 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 抗血清的效价 |
| 3.3.2 确定最适抗原抗体工作浓度 |
| 3.3.3 标准曲线 |
| 3.3.4 测定大型溞NAGase的间接非竞争ELISA法的质量控制 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 大型溞NAGASE抗血清特异性研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试剂及ELISA缓冲液 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 生物材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 大型溞及其他节肢动物水中游离NAGase酶液制备 |
| 4.2.2 大型溞及其他节肢动物体内NAGase制备 |
| 4.2.3 体内NAGase水中游离NAGase蛋白含量及活性测定 |
| 4.2.4 体内NAGase和水中游离NAGase间接非竞争ELISA法测定操作步骤 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 丁醚脲对水中大型溞NAGASE释放量的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 实验仪器与设备 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 丁醚脲生物测定 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 5.3.1 丁醚脲生物测定 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 大型溞NAGase的分离纯化和理化性质 |
| 6.2 大型溞NAGase多克隆抗体的制备和水中游离NAGase-IR ELISA检测方法的建立 |
| 6.3 丁醚脲暴露对水中大型溞NAGase释放量的影响 |
| 6.4 展望与不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）降胆固醇乳酸菌的筛选及其降解机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 胆固醇与人体健康 |
| 1.1.1 胆固醇的生理功能与代谢 |
| 1.1.2 防治高血脂症的对策 |
| 1.2 降胆固醇乳酸菌 |
| 1.2.1 降胆固醇乳酸菌的筛选 |
| 1.2.2 降胆固醇乳酸菌的应用研究 |
| 1.2.3 乳酸菌降胆固醇作用机理探讨 |
| 1.2.4 降胆固醇乳酸菌研究存在的问题 |
| 1.3 课题研究意义及实验方案 |
| 1.3.1 研究意义 |
| 1.3.2 实验内容 |
| 1.3.3 技术路线图 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 材料来源 |
| 2.1.2 主要药品与试剂 |
| 2.1.3 常用仪器设备 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 初步筛选菌株 |
| 2.2.2 降胆固醇乳酸菌的筛选及初步鉴定 |
| 2.2.3 降胆固醇乳酸菌的综合评价 |
| 2.2.4 16S rDNA 分子生物学鉴定 |
| 2.2.4.1 样品预处理及核酸（DNA）的提取 |
| 2.2.4.2 PCR 扩增 |
| 2.2.4.3 PCR 产物检测 |
| 2.2.4.4 菌株系统发育分析 |
| 2.2.5 目标菌株降胆固醇机理初步分析 |
| 2.2.6 菌体生长条件的确定 |
| 2.2.7 目标菌株降胆固醇能力的优化 |
| 2.2.8 模拟胃肠道环境下菌株降胆固醇能力测定 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1. 降胆固醇乳酸菌的初步分离与鉴定 |
| 3.1.1 初步筛选单一菌株 |
| 3.1.2 体外筛选降胆固醇菌株的结果 |
| 3.1.3 生理生化实验结果 |
| 3.1.4 菌株的耐酸性结果 |
| 3.1.5 菌株的胆盐耐受性结果 |
| 3.1.6 Ca2+沉淀法定性测定胆盐水解酶活力 |
| 3.1.7 分子生物学鉴定结果 |
| 3.2 植物乳杆菌 MPCF7-3 降胆固醇机理的初步研究 |
| 3.2.1 菌株去结合胆盐能力及胆盐水解酶活力分析 |
| 3.2.2 菌体吸收胆固醇及胆酸盐与胆固醇共沉淀的测定 |
| 3.2.3 菌体细胞对超声波的抗性 |
| 3.2.4 热灭活菌体及休眠菌体去除胆固醇的测定 |
| 3.3 菌体生长条件的确定及降胆固醇能力的优化 |
| 3.3.1 菌体最适生长温度的确定 |
| 3.3.2 菌体最适生长 pH 的确定 |
| 3.3.3 菌体生长曲线的测定 |
| 3.3.4 菌株降胆固醇能力的优化 |
| 3.3.5 响应面法优化 |
| 3.3.6 响应面模型验证 |
| 3.4 模拟胃肠道环境下菌株降胆固醇能力测定 |
| 第4章 讨论与结论 |
| 4.1 降胆固醇乳酸菌的筛选 |
| 4.2 植物乳杆菌 MPCF7-3 降胆固醇机理分析 |
| 4.3 植物乳杆菌 MPCF7-3 降胆固醇能力优化 |
| 4.4 模拟胃肠道环境下的菌株降胆固醇能力测定 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的学术论文 |
（10）水体中甾体雌激素水平对生物群落的毒性与生物降解特性研究分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 环境内分泌干扰物的概况 |
| 1.1.1 环境内分泌干扰物的定义 |
| 1.1.2 EDCs的生物学效应 |
| 1.2 EDCs的种类及来源 |
| 1.2.1 EDCs的种类 |
| 1.2.2 EDCs的来源 |
| 1.3 废水中甾体雌激素的概况 |
| 1.3.1 废水中甾体雌激素的种类及性质 |
| 1.3.2 甾体雌激素的分布及污染现状 |
| 1.4 甾体雌激素的检测及去除方法 |
| 1.4.1 甾体雌激素的检测方法 |
| 1.4.2 甾体雌激素的去除方法 |
| 1.5 课题来源及、研究内容及技术路线 |
| 1.5.1 课题来源 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 2 E2的生物毒性研究 |
| 2.1 实验药品和仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 试验内容及方法 |
| 2.2.1 最佳培养时间的确定 |
| 2.2.2 急性毒性实验 |
| 2.2.3 慢性毒性实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 3 E2高效降解菌的筛选、分离及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 方法与步骤 |
| 3.2.1 菌株的富集与分离纯化 |
| 3.2.2 菌株降解能力分析 |
| 3.3 高效降解菌的鉴定 |
| 3.3.1 实验方法与步骤 |
| 3.4 结果与分析 |
| 4 E2降解菌降解能力测定及生长条件优化 |
| 4.1 实验方法与步骤 |
| 4.1.1 菌株的生长曲线测定 |
| 4.1.2 初始pH对菌株生长以及降解率的影响 |
| 4.1.3 培养温度对菌株生长以及降解率的影响 |
| 4.1.4 不同底物浓度对菌株生长以及降解率的影响 |
| 4.1.5 重金属离子对菌株生长以及降解率的影响 |
| 4.1.6 不同营养物质对菌株生长以及降解率的影响 |
| 4.2 实验结果与小结 |
| 5 E2高效降解菌降解酶的定位及基本特性 |
| 5.1 实验方法与步骤 |
| 5.1.1 粗酶液的制备 |
| 5.1.2 蛋白质含量测定 |
| 5.1.3 降解酶的定位 |
| 5.1.4 降解酶的诱导性实验 |
| 5.2 酶的提纯 |
| 5.2.1 酶的层析原理 |
| 5.2.2 实验器材 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 实验方法 |
| 5.2.5 样品分析 |
| 5.3 酶性质研究 |
| 5.3.1 酶提取液蛋白含量测定 |
| 5.3.2 酶提取液作用的最适pH值 |
| 5.3.3 酶提取液的酸碱稳定性 |
| 5.3.4 酶提取液的最适温度 |
| 5.3.5 酶提取液的温度稳定性 |
| 5.3.6 酶提取液降解E2的动力学分析 |
| 5.4 E2降解途径初探 |
| 5.5 结果与讨论 |
| 6 结论、展望及不足 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望及不足 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
四、血清(浆)酶传统活性测定存在的问题及酶蛋白测定的意义（论文参考文献）
- [1]极光螺杆菌丙氨酸脱氢酶的酶学性质研究、改造及应用[D]. 胡小祥. 江南大学, 2021(01)
- [2]双芳基酮还原酶立体选择性的半理性改造及蛋白结晶研究[D]. 王岳. 江南大学, 2018(01)
- [3]苏北海岸带典型盐生植物根际放线菌多样性及其耐盐促生作用研究[D]. 白娟娈. 江苏师范大学, 2017(10)
- [4]黄芩苷与野黄芩苷抑制幽门螺杆菌脲酶作用及其机理研究[D]. 余晓丹. 广州中医药大学, 2015(12)
- [5]磁性纳米颗粒固定化漆酶的制备及在含酚废水处理中的应用[D]. 邓满凤. 长沙理工大学, 2015(03)
- [6]桃蚜抗药性监测及对噻虫嗪的抗性生化机制研究[D]. 张平艳. 湖南农业大学, 2014(09)
- [7]甜菜夜蛾抗药性监测及对氯虫苯甲酰胺的抗性机理研究[D]. 刘佳. 湖南农业大学, 2013(07)
- [8]大型溞NAGase多克隆抗体检测水生节肢动物丰度的适用性研究[D]. 曾晨杰. 浙江大学, 2013(08)
- [9]降胆固醇乳酸菌的筛选及其降解机理研究[D]. 李昵. 集美大学, 2012(02)
- [10]水体中甾体雌激素水平对生物群落的毒性与生物降解特性研究分析[D]. 李翠翠. 南京理工大学, 2012(07)