一、INHIBITION OF IL-6-INDUCED STAT3 ACTIVATION IN MYELOMA CELLS BY PROTEIN KINASE A（论文文献综述）
贺佳星[1]（2021）在《新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究》文中研究说明背景:宫颈癌是全世界最常见的妇科恶性肿瘤之一,其所致的死亡人数占女性癌症死亡总数的第二位。高危型人乳头瘤病毒（High risk human papillomaviruse,HR-HPV）是导致宫颈癌发生的主要原因。目前,宫颈癌的治疗取决于疾病的分期,局限于子宫的癌症的治疗以手术为基础,同时进行的放疗/化疗是局部晚期癌症的治疗标准。铂类-紫杉醇联合化疗,可能添加贝伐珠单抗是目前晚期宫颈癌的治疗选择,但它仅具有缓解目的。因此改善治疗现状,为患者带来生存获益是目前亟待解决的难题。蜂毒（Bee venom,BV）是一种生物毒素,主要有效成分包括蜂毒肽（melintin,MEL）、酶、生物活性胺等。文献报道MEL具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物学作用,近年来也发现MEL具有调节肿瘤免疫的作用。但MEL是否可抑制宫颈癌进展和调节宫颈癌免疫微环境及其具体机制尚不清楚。由于MEL的毒性、非特异性、易降解、有限的生物利用度和溶血等特点限制了其在癌症中的应用。我们前期构建了以MEL为主体的新型氨基酸融合肽UM-6并且进行了初步研究,发现UM-6不仅发挥了良好的抗肿瘤作用,同时又弥补了MEL的毒性、易降解和溶血等缺点。前期研究证实UM-6具有良好的抗宫颈癌作用,但作用机制尚不明确。目的:探究新型氨基酸融合肽UM-6抗宫颈癌的具体作用机制以及抗宫颈癌免疫的具体作用机制,为宫颈癌药物研发和治疗提供新方向。方法:1.新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及其作用机制研究1)UM-6对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响。用不同浓度的UM-6处理两种宫颈癌细胞系Hela和Caski细胞24、48h后,利用CCK8法来检测细胞活性,并计算出药物的IC50;通过平板克隆实验来检测UM-6对宫颈癌细胞增殖的影响。通过细胞划痕实验、细胞Transwell实验和三维（3D）肿瘤球体侵袭实验检测UM-6对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响。2)利用蛋白组学筛选出UM-6的重要通路PI3K-AKT信号和靶蛋白Eph A2,通过Western Blot、免疫荧光（IF）和q PCR进行验证蛋白和m RNA表达情况。3)UM-6抑制P-AKT和Eph A2相互作用从而介导Eph A2降解的研究。利用免疫共沉淀（CO-IP）和IF检测UM-6处理前后P-AKT和Eph A2的相互作用。应用AKT激活剂（SC79）和抑制剂（LY294002）进一步检测UM-6对Eph A2蛋白表达的影响。4)UM-6诱导Eph A2溶酶体途径降解的研究。通过蛋白生物合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）进行脉冲追踪分析以检测UM-6对Eph A2半衰期和稳定性的影响。IF和CO-IP检测UM-6对Eph A2蛋白亚定位的影响。Western Blot和IF检测UM-6对Eph A2泛素化和Eph A2相关的泛素化连接酶c-Cbl蛋白表达的影响。5)构建Hela细胞宫颈癌皮下荷瘤裸鼠模型,给予UM-6腹腔注射,监测肿瘤生长速度,瘤体体积大小和重量。Western Blot、免疫组织化学染色（IHC）和IF检测体内UM-6对P-AKT和Eph A2表达的影响。2.新型融合肽UM-6抗宫颈癌免疫及其作用机制研究1)UM-6对宫颈癌免疫的影响。构建小鼠宫颈癌U14细胞同源皮下荷瘤C57BL/6小鼠模型,给予UM-6腹腔注射,监测肿瘤生长。IHC和IF检测肿瘤移植物中UM-6处理后PD-L1、cleaved caspase 3（CCA3）和Ki67的表达水平,流式细胞术检测UM-6处理后杀伤CD8+T细胞和衰竭T细胞以及效应CD4+T细胞水平和Treg细胞的数量变化。2)Eph A2与宫颈癌中T细胞相关免疫检查点分子PD-L1的相关性。通过宫颈癌TCGA数据库中基因集合富集分析（GSEA）筛选了与Eph A2相关的T细胞相关免疫检查点分子。通过TIMER数据库研究了Eph A2与宫颈癌免疫抑制信号的相关性。通过Western Blot、流式细胞术和IF检测了Eph A2对T细胞相关免疫检查点分子PD-L1蛋白表达的影响。TCGA数据库和宫颈癌组织芯片IHC评估了Eph A2和PD-L1在宫颈癌中的表达和相关性。3)UM-6影响PD-L1表达的机制研究。Western Blot、流式细胞术和IF检测UM-6对PD-L1总蛋白和膜蛋白的表达情况。N-糖基化抑制剂Tunicamycin（TM）和UM-6共处理检测PD-L1糖基化改变。CHX脉冲追踪分析检测UM-6对PD-L1半衰期和周转率的影响。IF和CO-IP检测UM-6对PD-L1亚定位以及稳定性的影响。结果:1.新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及其作用机制研究1)UM-6有效抑制宫颈癌细胞系Hela和Caski的增殖、迁移和侵袭能力,呈剂量依赖性和时间依赖性,而对Ha Ca T细胞的增殖和毒性影响较小。2)在宫颈癌细胞系中UM-6下调了P-AKT和Eph A2的蛋白表达,但不影响Eph A2的m RNA水平。IF结果显示UM-6处理之前,Eph A2主要定位细胞膜,少数以点状模式定位在细胞质核周区,而UM-6处理后Eph A2表达发生了易位,多数阳性染色位于细胞质内,核周区偏多,而细胞膜表达显着减少。3)UM-6显着降低了Eph A2 Ser897位点的磷酸化水平以及Eph A2和P-AKT的相互作用。AKT抑制剂LY294002能够抑制Eph A2 Ser897磷酸化,AKT激动剂SC79显着增加了Eph A2 Ser897磷酸化并且恢复了UM-6介导的Eph A2 Ser897磷酸化抑制。4)UM-6导致Eph A2周转率显着增加,半衰期显着缩短。UM-6与蛋白酶体抑制剂MG-132或者溶酶体抑制剂氯喹（CQ）共孵育时,仅有CQ能较大程度的逆转UM-6诱导的Eph A2的降解。IF结果显示UM-6显着增加并且延长了Eph A2在早期内吞小体和晚期内吞小体的定位,而显着降低了Eph A2在循环内吞小体上的定位,同时增加了Eph A2在溶酶体的共定位。UM-6还显着增加c-Cbl的磷酸化和与Eph A2的相互作用从而增加Eph A2的泛素化以及Eph A2与多泡体ESCRT复合体的相互作用。5)UM-6抑制了肿瘤异种移植物的生长、体积和瘤重。并且UM-6治疗组显着减少了Eph A2和P-AKT的表达。2.新型融合肽UM-6抗宫颈癌肿瘤免疫及其作用机制研究1)UM-6明显抑制了小鼠U14移植瘤的生长,减少了肿瘤移植物PD-L1蛋白表达水平,而且还增加了抗肿瘤免疫的主要效应因子CD8+T细胞释放的颗粒酶B（GB）的数量。由于抗肿瘤免疫在肿瘤组织中伴随着凋亡,UM-6治疗组肿瘤组织中发生了强凋亡信号,并且增殖标记物Ki67表达也明显降低。流式细胞术结果显示UM-6增强了CD8+T细胞分泌IFNγ的功能,减少了衰竭PD-1+T细胞的比例。UM-6还增加了移植物中效应IFNγ+CD4+T细胞的比例,减少了Treg的数量。2)GSEA显示TCGA数据库中Eph A2和适应性免疫应答信号通路在宫颈癌中高度相关,并且该通路富集的蛋白中CD274（PD-L1）评分较高,并且Eph A2和PD-L1在宫颈癌中存在显着的正相关。TIMER数据库结果显示Eph A2与宫颈癌免疫抑制信号特征相关,如耗尽T细胞信号、效应Treg细胞信号。Eph A2过表达上调了PD-L1蛋白含量以及膜定位,而si-Eph A2沉默降低了PD-L1的蛋白表达和膜定位,并且显着增加PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1的结合。Eph A2 Ser897可能也参与PD-L1和肿瘤免疫的调节。Westernblot和流式分析结果显示Eph A2 WT和Eph A2 S897D过表达明显增加了PD-L1总蛋白和膜蛋白的表达,而Eph A2 S897A过表达下调了PD-L1总蛋白和膜蛋白的水平。TCGA数据库和肿瘤组织芯片IHC结果显示宫颈癌组织中Eph A2和PD-L1在宫颈癌中的高表达,并且高Eph A2表达的患者在肿瘤中的PD-L1表达也会升高,并且Eph A2和PD-L1呈现明显的共定位。3)Westernblot和流式分析结果显示UM-6能够抑制PD-L1的总蛋白表达和膜蛋白表达,抑制了PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1的结合。IF结果表明在对照组中PD-L1主要位于细胞膜上,UM-6处理后PD-L1细胞膜上的信号减弱,伴随着是胞质的点状染色模式增加。在进一步检测中发现未处理的细胞中大多数PD-L1在～45 k Da检测到,而UM-6处理后PD-L1发生了明显的带移,～45kda明显减少而～33 k Da的条带增加,证实了UM-6抑制PD-L1的糖基化。TM处理后导致PD-L1的大部分～45-k Da完全糖基化蛋白迁移到～33 k Da的非糖基化形式。而在UM-6和TM共处理的细胞中,PD-L1的分子量向非糖基化转移更为明显。CHX脉冲追踪分析显示UM-6诱导的～33 k Da非糖基化形式的PD-L1半衰期更短,有更快的周转率,MG132与UM-6共处理后～33 k Da的PD-L1表现出更多的泛素化。IF结果显示在对照组中PD-L1主要位于细胞膜上,而UM-6处理后PD-L1与内质网标记物HSP90B1共定位,未发现PD-L1与高尔基体标记物TGN46共定位,表明UM-6处理后非糖基化形式的PD-L1增多并且滞留在内质网中。Westernblot和CO-IP证实了UM-6能够降低STT3A的蛋白水平以及与PD-L1的相互作用,并且增加了PD-L1与内质网相关性降解途径（ERAD）组分的结合表明UM-6通过ERAD途径促进PD-L1降解。结论:1.UM-6体外和体内均抑制宫颈癌增殖和侵袭,具体作用机制主要是UM-6抑制PI3K-AKT信号通路介导的Eph A2 Ser897磷酸化,随后招募并磷酸化c-Cbl,诱导其与Eph A2相互作用导致Eph A2的泛素化增加,泛素化的Eph A2经ESCRT复合体识别并将其锚定到MVB表面,进而增加了Eph A2转运到溶酶体的数量,促进其在溶酶体中的转运和降解。2.Eph A2可能通过PD-L1参与宫颈癌的肿瘤免疫调节,PI3K-AKT/Eph A2/PD-L1是参与宫颈癌肿瘤免疫的一种新途径。Eph A2的封锁可能代表了免疫治疗难治性癌症的一种新的治疗途径。3.UM-6参与PD-L1/PD-1轴介导的宫颈癌免疫肿瘤微环境的调节。具体机制表现为UM-6抑制PD-L1的起始糖基化,阻碍了PD-L1从内质网向高尔基体的运输和进一步的成熟和折叠,导致PD-L1通过ERAD途径的蛋白酶体降解,最终阻止PD-L1的正确膜定位和与PD-1的相互作用,增加肿瘤对T细胞介导的杀伤作用的易感性,靶向肿瘤的免疫逃逸。
林杉[2]（2021）在《肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制》文中指出研究背景与目的:调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8+T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:（1）磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4+和CD8+T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。（2）使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。（3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。（4）应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8+INFγ+T细胞、CD8+GrB+T细胞、CD25+CD81+B细胞、IL-10+B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。（5）流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24hiCD38hiB细胞和IL-10+B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROS+CD19+B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:（1）乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。（2）乳酸诱导的Breg样细胞显着抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。（3）乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。（4）乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。（5）乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。（6）LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25+CD81+B细胞和MDSCs比例降低,肿瘤组织内B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平降低,同时,肿瘤引流淋巴结、脾脏及肿瘤内CD8+INF-γ+T细胞及CD8+Gr B+T细胞比例增多,而肿瘤内Treg细胞比例降低。（7）肺腺癌患者外周血乳酸含量、CD24hiCD38hiBreg细胞和IL-10+Breg细胞比例高于健康对照组,乳酸上调B细胞CD24、CD38及IL-10的表达,并促进B细胞内NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平,乳酸培养的B细胞通过ROS抑制T细胞增殖。人肺腺癌肿瘤组织内LDHA表达水平高于癌旁组织,并与表达ROS的CD19+B细胞共定位。结论:乳酸通过GPR81/PPARα/NADPH氧化酶信号诱导B细胞分化为Breg样细胞,Breg样细胞通过ROS抑制T细胞增殖,促进肿瘤进展,敲低肿瘤细胞内LDHA减少Breg样细胞的产生及其ROS的表达,提示靶向降低肿瘤微环境内乳酸含量,可以减少Breg样细胞的分化,进而起到抗肿瘤的治疗作用。这为肿瘤内Breg细胞的致病作用提供新的理论依据,为临床治疗肿瘤提供新的思路。
陈乞[3]（2021）在《地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:慢性乙型肝炎相关肝癌发病率及病死率逐年上升。目前肝癌发病机制虽有多种假说,但确切机制至今尚未明确是其妨碍提高防治水平的关键科学问题。多年来防治肝癌的策略主要集中于抗病毒和肝癌细胞本身,忽略了人体内在宿主因素的影响。随着肝癌微环境概念的提出,其作为影响肝癌发生发展的关键因素,逐渐引起研究者的重视。慢性肝病的肝脏炎症和纤维化形成的异常肝再生微环境促进肝癌的发生发展。因此研究通过改善肝再生微环境降低肝癌发生,抑制其进展及转移,具有极大的临床参考价值和深远的科学意义。本文结合临床试验和体外实验两部分,旨在探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制:第一部分,观察地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生率及发生风险的影响。第二部分,揭示共培养条件下TGF-β1活化肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的相关机制,分析其对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡和侵袭能力的影响,探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。方法:1.本试验通过对前期完成的针对HBeAg阴性慢乙肝的随机对照临床试验（中国临床试验注册中心注册号:Chi CTR-TRC-12002962）的单用地五养肝胶囊或单用恩替卡韦或二者联用治疗时间达到48周的患者,进行长达108月前瞻性随访观察（恩替卡韦随访期间不停药）,每6个月检测患者血常规、肝肾功能、凝血功能、乙肝两对半定量、血清HBV DNA水平和甲胎蛋白（AFP）。主要观察评价指标:观察随访期间终点事件肝癌的发生率。次要观察指标:观察随访期间慢乙肝患者生化学及病毒学应答。其中,肝癌累积发病率采用使用乘积限法（Kaplan-Meier）统计,并通过时序检验（log-rank）方法进行比较。2.体外实验通过建立TGF-β1诱导激活的人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞株HCCLM3的共培养模型,模拟肝癌的肝再生微环境。实验分为LX2对照组（LX2-NS）、共培养模型组（Co-culture model）、共培养DWYG组（Co-culture DWYG）,并给予地五养肝胶囊含药血清进行干预,通过CCK-8、流式细胞术、Transwell侵袭实验等细胞生物学方法观察共培养条件下活化人肝星状细胞LX2对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡、侵袭能力的影响,通过Western Blotting、q RT-PCR等分子生物学方法研究共培养条件下活化人肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的机制,分析这一过程中TGF-β/Smad信号通路的Smad2、Smad3、TβRI、Smad7等m RNA和蛋白表达规律,探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。结果:（1）入组基线资料及随访时间比较:对符合纳入标准的170例患者随机分为三组,其中A组为地五养肝胶囊治疗组（56例）,口服地五养肝胶囊;B组为地五养肝胶囊联合恩替卡韦治疗组（57例）,同时应用地五养肝胶囊和恩替卡韦;C组为恩替卡韦对照组（57例）,口服恩替卡韦,对治疗周期达到48周的患者进行108月随访。入组时各组患者在年龄、性别、血常规（包括中性粒细胞NEU、淋巴细胞LYM、中性粒细胞与淋巴细胞比值NLR以及血小板计数PLT）、PT国际标准化比值INR、肝功能包括（ALT、AST、GGT、ALB、TP、TBIL）及血清HBV-DNA水平无显着性差异（P>0.05）。随访从2012年1月1日至2021年1月11日,共随访108个月,平均随访时间84.03个月,中位随访时间94.00个月。地五养肝胶囊组的平均随访时间和中位随访时间分别为90.75个月、99.00个月,地五养肝胶囊联合恩替卡韦组的平均随访时间和中位随访时间分别为78.82个月、92.50个月,恩替卡韦组的的平均随访时间和中位随访时间分别为82.78个月、91.00个月。共计随访患者151例,总计失访率为11.18%（19/170）。其中,地五养肝胶囊组完成随访48例,地五养肝胶囊联合恩替卡韦组完成随访50例,恩替卡韦组完成随访53例,三组失访率依次为14.29%（8/56）、12.28%（7/57）、7.02%（4/57）,失访率组间比较无显着差异（P>0.05）。（2）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的比较:将不同干预方案的三组患者血生化结果进行分析,发现三组组间比较,ALT、AST水平无明显差异（P>0.05）。其他相关ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标,在三组间比较差异不显着（P>0.05）。三组随访患者血生化指标分别与入组时相比,发现三组随访患者肝功能ALT、AST均较前下降（ALT:23.50±15.40 vs 34.70±17.51,25.96±27.45 vs35.87±18.07,28.18±20.30 vs 40.25±21.20;AST:22.08±5.87 vs 28.72±11.24,23.11±11.17 vs 31.91±11.61,27.57±16.85 vs 33.72±14.35）,差异具有统计学意义（P<0.01）,而ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标,较前入组时相比无明显差异（P>0.05）。（3）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的比较:不同治疗方案的各组患者HBV DNA水平均较入组时明显下降（P<0.05）。HBV DNA水平在随访的三组间组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组HBs Ag水平分别与入组时相比,三组HBs Ag水平较前明显降低（P<0.05）。随访结果显示,三组患者中HBs Ag下降>1500 IU/ml依次为34.21%（13/38）、35.71%（10/28）、28.57%（8/28）,经统计学分析三者差异无意义（P>0.05）。（4）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌累积发病率影响:随访至108月,采用Kaplan-Meier（乘积限法）法绘制肝癌发病生存曲线,并计算地五养肝胶囊组、地五养肝胶囊联合恩替卡韦组、恩替卡韦组随访发生肝癌事件的累积发病率依次为0%（0/48）、2%（1/50）、11.32%（6/53）,然后采用时序检验Log Rank（Mantel-Cox）进行分析检验,结果显示:三组患者肝癌累积发病率具有差异（P<0.05）。其中,地五养肝胶囊组肝癌累积发病率（0%）明显低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P<0.05）。地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌累积发病率（2%）低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P<0.05）。地五养肝胶囊组肝癌发病率（0%）低于地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌发病率（2%）,但差异无统计学意义（P>0.05）。提示相对于单独应用恩替卡韦抗病毒治疗,单用地五养肝胶囊或联合应用恩替卡韦均可显着降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率。（5）TGF-β1诱导LX2活化以及LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的形态学观察:LX2活化前形体不规则呈多边星形,胞突生长不发达,细胞间连接紧密;经TGF-β1（10ng/ml）诱导激活后,细胞体积增大,胞突伸展,细胞间连接疏松,细胞增殖速度加快;与人肝癌细胞HCCLM3共培养后LX2胞伪足更加伸展,呈拉伸状两极生长,细胞增殖明显增快。（6）筛选DWYG含药血清最佳给药浓度:采用CCK-8法检测不同浓度DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖能力的影响。实验结果显示:与对照组相比,随着5%、10%、15%、20%等不同含药血清浓度的升高,各组细胞测得的A450值逐渐下降,HCCLM3细胞增殖活力明显下降（P<0.01）,细胞增殖抑制率逐渐增高（P<0.01）,选取10%为最佳实验用血清含药浓度。（7）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖的影响:（1）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖的影响:与M3对照组A450值（0.69±0.03）相比,共培养模型组（0.75±0.01）HCCLM3细胞增殖活力增强（P<0.01）。与M3对照组A450值（0.69±0.03）相比,共培养DWYG组（0.65±0.01）HCCLM3细胞增殖活力下降（P>0.05）。与共培养模型组A450值（0.75±0.01）相比,共培养DWYG组（0.65±0.01）HCCLM3细胞增殖活力显着降低（P<0.01）。由此可见,共培养模型组HCCLM3增殖率（111.45%）,显着高于M3对照组细胞增殖率（100%）,而共培养DWYG组HCCLM3细胞增殖率（90.77%）显着低于共培养模型组（111.45%）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可能促进肝癌细胞HCCLM3的增殖,DWYG含药血清可能抑制LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖。（2）LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的增殖:与LX2对照组（0.62±0.02）相比,共培养模型组（0.71±0.02）LX2细胞增殖活力显着增加（P<0.01）。与LX2对照组（0.62±0.02）相比,共培养DWYG组（0.63±0.01）LX2细胞活力无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组（0.71±0.02）相比,共培养DWYG组（0.63±0.01）LX2细胞增殖能力下降（P<0.01）。与LX2对照组（100%）相比,共培养模型组具有更高细胞增殖率（120.35%）。与共培养模型组（120.35%）相比,共培养DWYG组LX2细胞增殖率（90.77%）显着下降。提示LX2/HCCLM3共培养体系可能促进人肝星状细胞LX2的增殖,DWYG含药血清具有抑制LX2/HCCLM3共培养体系中LX2增殖的作用。（8）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3及LX2两种细胞凋亡的影响:（1）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系HCCLM3细胞凋亡的影响:根据流式细胞仪检测结果显示,与M3对照组（7.52±0.17）相比,共培养模型组（6.23±0.54）细胞凋亡率明显下降（P<0.01）。与M3对照组（7.52±0.17）相比,共培养DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。与共培养模型组（6.23±0.54）相比,共培养DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系抑制HCCLM3的凋亡,而DWYG含药血清可促进LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3的凋亡。与M3阴性对照组（6.23±0.54）相比,M3DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系抑制HCCLM3的凋亡,而DWYG含药血清可促进LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3的凋亡。（2）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞凋亡的影响:与LX2对照组（6.37±0.32）相比,共培养模型组（5.15±0.29）凋亡率明显下降（P<0.01）。与LX2对照组（6.37±0.32）相比,共培养DWYG组（7.36±0.37）细胞凋亡升高（P<0.01）。与共培养模型组（5.15±0.29）相比,共培养DWYG组（7.36±0.37）细胞凋亡显着升高（P<0.01）。表明LX2/HCCLM3共培养体系可一定程度上抑制LX2细胞的凋亡,DWYG含药血清可减弱该抑制作用从而促进LX2/HCCLM3共培养体系中人肝星状细胞LX2的凋亡。（9）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3侵袭能力的影响:与M3对照组（104.00±4.18）相比,共培养模型组（148.80±4.09）HCCLM3侵袭能力明显增强,差异具有统计学意义（P<0.01）。与M3对照组（104.00±4.18）相比,共培养DWYG组（78.00±6.60）侵袭能力下降（P<0.01）。与共培养模型组（148.80±4.09）相比,共培养DWYG组（78.00±6.60）细胞侵袭力显着下降（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可增强HCCLM3侵袭能力,而DWYG含药血清可降低由共培养体系诱导的高HCCLM3侵袭能力。（10）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞EMT相关m RNA的表达的影响:采用RT-PCR检测技术检测EMT相关E-cadherin、Vimentin m RNA的表达,统计结果显示:与LX2对照组相比,共培养模型组E-cadherin m RNA的表达下降（P<0.01）,Vimentin m RNA表达明显升高（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组E-cadherin m RNA的表达增加（P<0.01）,Vimentin m RNA的表达无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组E-cadherin m RNA的表达明显增加（P<0.01）,Vimentin m RNA的表达明显降低（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Vimentin m RNA的表达,抑制E-cadherin m RNA的表达,而DWYG含药血清则促进LX2/HCCLM3共培养体系中LX2细胞E-cadherin m RNA的表达,抑制Vimentin m RNA表达。（11）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞EMT和TGF-β/Smad信号通路相关m RNA的表达的影响:通过实验检测LX2细胞TGF-β/Smad信号通路相关Smad2、Smad3、TβRI、Smad7 m RNA的表达情况,结果分析显示:与LX2对照组相比,共培养模型组Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达升高,Smad7 m RNA表达下降（P<0.01）。与LX2对照组相比共培养DWYG组TβRI m RNA的表达下降（P<0.01）,Smad7 m RNA表达上升（P<0.01）,Smad2、Smad3m RNA表达下降（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达下降（P<0.05）,Smad7 m RNA表达上升（P<0.05）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达,降低Smad7 m RNA的表达,而DWYG含药血清则可促进LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞Smad7 m RNA的表达,抑制Smad2、Smad3、TβRIm RNA表达。（12）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系EMT相关蛋白的表达的影响:与LX2对照组相比,共培养模型组E-cadherin蛋白的表达下降（P<0.01）,Vimentin蛋白表达明显升高（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组E-cadherin蛋白的表达增强（P<0.01）,Vimentin蛋白的表达无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组E-cadherin蛋白的表达增加（P<0.01）,Vimentin蛋白的表达降低（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达,而DWYG含药血清则促进LX2/HCCLM3共培养体系E-cadherin蛋白的表达,抑制Vimentin蛋白表达。（13）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达的影响:通过实验检测LX2细胞TGF-β/Smad信号通路相关Smad2、Smad3、TβRI、Smad7蛋白的表达情况,结果分析显示:与LX2对照组相比,共培养模型组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达升高,Smad7蛋白表达下降（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达下降,Smad7蛋白表达上升（P<0.01）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达下降,Smad7蛋白表达上升（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达,降低Smad7蛋白的表达,而DWYG含药血清则可促进LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞Smad7蛋白的表达,抑制Smad2、Smad3、TβRI蛋白表达。结论:（1）根据170例地五养肝胶囊治疗HBeAg阴性慢性乙型肝炎RCT临床试验资料,随访至108月,单用地五养肝胶囊组与单用恩替卡韦组和联合用药组在生化学应答、病毒学应答方面疗效相当。单用地五养肝胶囊或者联用恩替卡韦能显着降低肝癌发病率。（2）构建的活化的LX2与HCCLM3共培养体系模拟的肝癌肝再生微环境可促进LX2和HCCLM3增殖活力,抑制LX2和HCCLM3凋亡,增强HCCLM3细胞侵袭能力,其机制可能通过激活TGF-β/Smad信号通路促进EMT。DWYG含药血清能显着抑制共培养体系中的LX2和HCCLM3增殖,促进LX2和HCCLM3凋亡,降低HCCLM3细胞侵袭能力,其机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活、调节EMT/MET失衡,改善肝癌肝再生微环境,发挥防治肝癌发生发展的作用。
柳颖[4]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中指出目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
祁月红[5]（2020）在《交感神经浸润促进胃腺癌进展的机制研究》文中研究说明胃癌是一种比较常见的消化道恶性肿瘤,我国的发病率较高,每年新发病例数约40万。胃癌死亡率高的主要原因是肿瘤的转移和复发。尽管手术技术及各种放疗和化疗技术的不断提高,但其预后仍不很理想,其死亡率仍占各类癌症死亡率中第二位,给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来越来越多的研究发现交感神经在肿瘤的发生和转移中起着重要作用。已知交感神经系统（SNS）通过释放递质去甲肾上腺素（NE）来调节神经、内分泌、心血管、消化、呼吸、生殖和免疫系统的基因表达和细胞功能。研究认为应激相关的精神心理压力可能是导致癌症发生的一个重要因素。β肾上腺能受体在食管癌、乳腺癌、鼻咽癌和结肠癌等癌细胞膜上高表达。如果交感神经侵入癌组织,其释放的大量NE可作用于β受体,继而通过β受体下游信号通路而影响癌细胞的行为,包括细胞增殖、凋亡、血管形成及癌细胞转移等。然而,有关交感神经对胃癌的影响,报道很少。我们推测交感神经系统与胃癌的进展、转移及预后有一定的关系,因此在这项研究中我们首先通过一些在线工具（如UALCAN、GEPIA和Timer等）筛选出胃癌组织中的高表达基因及其与胃癌预后的影响;继而收集了46例人胃腺癌根治术后的组织标本,对交感神经侵入胃癌组织作了形态学（交感神经分布）和功能（递质NE,β受体,受体后信号分子,以及胃癌恶化的可能效应分子）鉴定,并在癌组织水平研究了交感神经在胃癌组织中芽生和侵入的分子机制;进一步在胃癌细胞水平研究了异丙肾上腺素（ISO）对胃癌癌细胞增殖、迁移及浸润的影响及机制。第一部分生物信息学分析β肾上腺素能受体信号在胃癌组织中的表达、基因之间的相关性及对胃癌预后的影响目的:利用在线胃癌数据库筛选出胃癌组织中的高表达基因,探讨β肾上腺素能受体信号通路及相关基因与高表达基因之间的相关性及对胃癌预后的影响及其机制。方法:利用在线网络数据库（UALCAN、GEPIA和Timer等网站）进行TGCA数据库数据挖掘和分析。这些在线网络资源是资料相当全面的、用户使用简单方便的用于分析癌症组学的数据库,可以提供:A.方便访问癌症组学数据（TCGA MET500）;B.提供癌症的生物标志物或验证某些潜在感兴趣的基因;C.提供基于基因表达的图表、两个或多个基因相关性分析及病人生存信息等。这些生物信息学分析可为下一步实验研究提供证据。采用Kaplan-Meier法分析基因表达与患者生存时间的关系;用Spearman相关分析评价两两基因间的相关性,计算Spearman秩相关系数（R）,以便反映变量之间相关关系密切程度。结果:筛选出了胃癌患者的癌组织中前50个高表达基因;其中,CHI3L1（YKL-40）是第28位的高表达基因。在RNA水平上CHI3L1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P<0.01）,尤其在胃癌分期中的Ⅰ期升高显着（P<0.01）;神经生长因子（NGF）高表达组的胃癌患者的总生存率与低表达组相比明显下降（P=0.008）;癌组织中巨噬细胞高度浸润的胃癌患者较低浸润患者的累计生存率明显降低（P=0.004）;ADRB1和ADRB3的高表达组与低表达组比较对胃癌患者的生存率无统计学意义（P=0.72,P=0.63）;ADRB2的高表达组显着降低胃癌患者的生存率（P=0.02）;CHI3L1基因与ADRB1基因无明显相关性（Cor=-0.096,P=0.051）,而CHI3L1基因与ADRB2或ADRB3基因相关性分析均有统计学差异,且存在正相关（P=0.00197,Cor=0.152,P=0.0346,Cor=0.104）。基因相关性分析结果:CHI3L1与STAT3正相关（R=0.48,P<0.001）;CHI3L1与MAPK1正相关（R=0.41,P<0.001）;CHI3L1与MAPK3正相关（R=0.35,P<0.001）;CHI3L1与MMP9正相关（R=0.66,P<0.001）;CHI3L1与SDC1正相关（R=0.37,P<0.001）;同时也发现SDC1高表达组总生存率显着降低（P=0.031）。结论:β肾上腺能受体信号可能通过ERK/STAT3-YKL40促进胃癌的进展;MMP9和Syndecan-1是YKL-40的下游效应分子。第二部分交感神经侵入人胃癌组织的证据以及β肾上腺能受体信号通路促进胃癌进展的研究目的:在人胃癌组织水平上研究交感神经浸润癌组织的状况,交感神经递质NE的水平,以及β肾上腺能受体信号调节YKL-40的表达及下游效应分子MMP9和Syndecan-1等的表达变化及其促进胃癌进展的作用机制。方法:收集了46例行胃腺癌（STAD）根治术患者的手术切除标本,标本严格区分为癌组织（STAD）和癌旁组织（adjacent）两类。用免疫组化、HPLC和Western Blot等方法检测交感神经在胃癌组织和癌旁组织的分布、神经递质去甲肾上腺素（NE）水平、β受体（ADRB）及下游的一些信号分子的表达变化;同时用免疫组化和Western Blot检测CD206、CHI3L1、MMP9和Syndecan-1的表达变化。采用SPSS22.0软件进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差表示,两组间比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义的标准。结果:免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,交感神经（以酪氨酸羟化酶（TH）作为标志,S100作为神经髓鞘的标志）严重侵入胃癌组织中,交感神经纤维主要分布于癌巢之间的间质中,且离癌巢越近的部位交感神经分布密度越高。与交感神经芽生有关的NGF、生长相关蛋白43（GAP43）,以及高亲和力NGF受体TrkA在癌巢的边缘或癌巢之间的间质也有高度表达。β2-肾上腺素能受体（β2-AR,ADRB2）在胃癌组织中高表达,且主要分布于癌细胞膜上;?3-AR在胃癌组织中也有一定程度的高表达,而?1-AR在胃癌组织中表达量很低,几乎为阴性。此外,YKL-40、CD206和MMP9均高度表达在癌巢之间的间质区;Syndecan-1和CD31主要表达在癌组织血管内皮上。Western blot结果显示,与癌旁组织相比,癌组织中的NGF、TrkA、ADRB2、GAP43、TH、S100、YKL-40、Syndecan-1、MMP9、CD206和CD31的表达均显着增加（P<0.005）。HPLC-ED检测发现,胃癌组织中的交感神经递质NE水平明显高于癌旁组织。结论:胃癌组织中的高水平NGF通过高亲和受体TrkA促进大量交感神经浸润;浸润的交感神经通过NE-β2-AR-YKL-40-MMP9/Syndecan-1通路促进胃癌的进展。第三部分在体外水平上研究β肾上腺能受体信号通路对胃癌细胞增殖、迁移和浸润的影响及机制目的:在细胞水平上阐明β-AR对胃癌细胞增殖、迁移和浸润的影响及其信号机制。方法:分别培养两种胃癌细胞系SGC-7901和AGS在六孔板中,每种细胞随机分成3组:对照组,异丙肾上腺素（ISO）组（10μmol/L ISO）,ISO+ICI组（10μmol/L ISO和25μmol/L ICI118,551（β2-AR特异性阻滞剂））。加入ISO或ISO+ICI药物处理后处理后24 h后,用CCK8法检测两种细胞的增殖活性;用Transwell检测细胞的迁移和浸润能力,用Western Blot检测检测NGF、CHI3L1、MMP9、Syndecan-1、STAT3、pSTAT3、ERK、pERK的表达变化。采用SPSS22.0软件进行统计学分析,计量资料采用均数?标准差表示,两组间比较用t检验,三组间比较采用单因素方差分析;P<0.05为差异有统计学意义的判别标准。结果:与对照组相比,ISO组的两种胃癌细胞的增殖、迁移和浸润能力明显增加（P<0.05）,且ISO组的NGF、CHI3L1、MMP9、Syndecan-1、pSTAT3和pERK表达均明显升高（P<0.05）;ICI处理抑制了ISO的上述作用（ISO+ICI组）（与ISO组相比,P<0.05或P<0.01）。结论:β2-AR激动剂通过PKA-ERK/STAT3-YKL40信号通路促进两种胃癌细胞的增殖、迁移和浸润（转移）,胃癌细胞产生的MMP9和Syndecan-1主要是通过降解基质和促进血管形成促进胃癌增殖和转移。研究总结1.由于癌组织中的NGF、TrkA和GAP43高表达,导致交感神经严重浸润人胃癌组织。2.侵入胃癌组织的交感神经通过释放其递质NE,激动癌细胞β2-AR及其下游信号通路PKA-ERK/STAT3,促进YKL-40的表达,后者促进MMP9和Syndecan-1的表达,最终促进胃癌的进展。因而NE-β2-AR-PKA-ERK/STAT3-YKL-40信号通路是交感神经浸润促进胃癌进展的主要机制,这一机制在胃癌细胞系上也得到了验证。3.我们首次用金标准HPLC-ED法测定胃癌组织中神经递质NE的水平。4.在胃癌细胞系上证明激动β2-AR可上调NGF的表达,而拮抗β2-AR后NGF的表达显着下调,同时癌细胞的增殖、迁移和浸润能力也被抑制,提示阻断交感神经和β2-AR信号通路可抑制胃癌的进展。5.交感神经浸润促进STAD进展的信号通路可能是:NE-β2-AR-PKA-ERK/STAT3-YKL-40-MMP9/syndecan-1
吴昱青[6]（2020）在《多巴胺在抑制金黄色葡萄球菌感染引起的巨噬细胞炎症反应中的作用研究》文中进行了进一步梳理目的:DA（Dopamine,多巴胺）是一种重要的儿茶酚胺类神经递质,其缺失与帕金森氏病发生密切相关,此外,在调节机体免疫功能中DA也发挥着重要的作用。已有研究表明,帕金森氏病人易发院内菌如金黄色葡葡球菌感染,严重的帕金森氏病人甚至会出现脓毒症症状,然而,目前DA在调控免疫炎症反应中的具体作用机制尚不明确。本研究旨在探索DA在控制金黄色葡萄球菌感染引起的炎症反应中的作用及分子机制,为临床脓毒症、脑膜炎等感染性炎症疾病防治提供新的线索。方法:1)用模拟金黄色葡萄球菌病原分子的TLR2（Toll-like receptor 2,Toll样受体2）受体配体Pam3（Pam3CSK4,三酰脂肽）和金黄色葡萄球菌刺激小鼠BMDMs（Bone marrow derived-macrophages,骨髓来源的巨噬细胞）细胞,检测DA处理后炎症因子的表达情况。2)用RNA测序分析Pam3和DA刺激后BMDMs细胞内与炎症相关通路的变化,并通过Western blot验证相关通路变化。3)运用多巴胺受体敲除小鼠和多巴胺受体激动剂等确定DA发挥作用的主要受体。4)通过免疫共沉淀实验、点突变实验、蛋白质体外结合实验等确定多巴胺受体发挥抑制炎症作用的结构域,对鉴别出的结构域在BMDMs细胞上进行突变体恢复实验来验证结构域功能。5)通过体内脓毒症和脑膜炎小鼠模型检测相关多巴胺信号通路分子在感染性炎症反应中的作用。结果:1)DA处理后Pam3和金黄色葡萄球菌感染激活的炎症因子表达降低。2)RNA测序结果提示主要通过抑制NFkB（Nuclear transcription factor-kB,核转录因子kB）信号通路来抑制炎症反应。Western blot实验验证了这一结果。3)DRD5（Dopamine receptor 5,多巴胺受体5）敲除后,DA抑制炎症作用消失,表明DA通过其受体DRD5发挥抑制炎症作用。4)DRD5通过其结构基序EFD和IYX（X）I/L招募负调节蛋白ARRB2和PP2A进入TLR2信号中的TRAF6-IKK复合物中,负调节TRAF6介导的NFkB炎症反应。5)小鼠体内实验发现DA能够通过DRD5-ARRB2-PP2A轴减轻脓毒血症小鼠的炎症反应并提高其存活率,同时DRD5激动剂SKF38393也能通过该轴减弱脑膜炎引起的神经炎症。结论:DA激活DRD5后,通过DRD5受体EFD和IYX（X）I/L结构基序将负调节蛋白ARRB2/PP2A招募入TLR2信号中的TRAF6-IKK复合物中,进而控制NFkB炎症信号,抑制金黄色葡萄球菌引起的脓毒症和脑膜炎。因此,本研究结果提示DA-DRD5信号轴可作为今后相关炎症疾病的潜在干预靶标。
李三红[7]（2019）在《Bazedoxifene与HPA抗体联合抑制结肠癌侵袭转移分子机制研究》文中提出目的在我国结肠癌为最常见恶性肿瘤之一,死亡率居第5位,死亡的患者有2/3存在肝转移。尽管近年来以手术为主的综合治疗方法已明显改善了结肠癌治疗效果,然而化疗耐药、复发、转移,尤其是肝脏转移,仍然没有被克服。因此,迫切需要寻找一种新的治疗方法降低结肠癌肝脏转移,改善结肠癌病人预后。IL-6在多种肿瘤（包括结肠癌）中均高表达,且与肿瘤的恶性表型相关,因此我们考虑IL-6可能成为治疗结肠癌一个有用的新靶点。研究表明抗IL-6或IL-6受体的抗体作为单一用药不是很有效,迄今为止并没有发现有小分子靶向IL-6Rα/GP130信号为临床癌症治疗是有效的。近来研究发现三代选择性雌激素受体调节剂（SERM）bazedoxifene（BZA）通过抑制IL-6/GP130靶点在头颈部肿瘤和胰腺癌等肿瘤中具有抗癌活性,但对结肠癌治疗是否有效,目前还没有相关报道。乙酰肝素酶（heparanase,HPA）可促进肿瘤侵袭和转移,成为癌症转移治疗的靶点。HPA抗体（HPA-AB）可阻断HPA作用,有很好的临床应用前景。治疗结肠癌、改善预后关键是解决肝脏侵润和转移问题。在结肠癌中HPA也是高表达的,我们推测通过BZA抑制IL-6/GP130靶点可以减少肿瘤侵袭和转移,干扰抑制HPA表达也可以抑制肿瘤侵袭和转移。如果把两者联合,从不同方面同时抑制肿瘤侵袭和转移,将可能很好的改善结肠癌的治疗效果,同时也进一步探讨结肠癌肝脏转移机制,为BZA和HPA-AB转化到临床奠定了理论实践基础,具有重要的临床意义。方法采用CCK-8、MTT和细胞克隆实验检测BZA、IL-6、5-FU、AG490、AZD6244、LY294002和HPA-AB等单独或联合处理方法对LoVo、HT29、SW480和HCT116四株结肠癌细胞的增殖抑制作用;通过transwell实验和划痕损伤实验检测细胞侵袭和迁移能力;使用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;qPCR检测BZA单独或联合其它多种处理方法对Ki-67、Bad和Bcl-2mRNA表达的影响;Western Blot（WB）法检测Bad、Bcl-2、STAT3、P-STAT3（Tyr705）、AKT、P-AKT（Ser473）、ERK、P-ERK（Thr202/Tyr204）和HPA等蛋白的表达变化;AG490、NVP-BEZ235、LY294002、AZD6244、Rapamycin,Bay,BZA,以及IL-6R抗体（IL-6R-AB）等多种方法处理细胞后,qPCR和WB检测Ki-67、Bad、Bcl-2和HPA等表达变化。分别采用siRNA干扰技术沉默HPA基因表达（siRNA组）,HPA-AB中和HPA（HPA-AB组）及外源性重组HPA（RE-HPA组）和BZA单独或者联合处理细胞观察细胞侵袭和迁移能力改变;ELISA法检测IL-6和HPA表达变化。建立裸鼠皮下结肠癌移植瘤模型,再次评估BZA和HPA-AB等联合治疗效果;HE染色观察BZA等多种处理方法对组织器官细胞毒性;免疫组化法检测Ki-67、P-STAT3、P-AKT、P-ERK和GP130等蛋白表达变化,TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡。结果1.Bazedoxifene抑制结肠癌生物学活性及机制研究。在一定范围内BZA呈浓度和时间依赖性抑制HT29、HCT116、SW480和LoVo四株结肠癌细胞生长。BZA抑制细胞增殖与下调Ki-67 mRNA的表达相关,BZA呈剂量依赖性抑制了结肠癌细胞侵袭迁移能力。BZA诱导HT29和SW480结肠癌细胞周期停滞在G2/M期,两细胞凋亡率分别是19.4%±2.49%和26.0%±1.97%,而在DMSO对照组中HT29和SW480细胞凋亡率分别是2.03%±0.23%和2.68%±0.52%,表明BZA可诱导结肠癌细胞凋亡和周期停滞。qPCR和WB结果显示BZA上调Bad的表达,下调Bcl-2的表达,揭示了在结肠癌治疗中BZA诱导细胞凋亡与Bad/Bcl-2信号通路密切相关。进一步WB分析结果显示,与DMSO对照组比较,BZA抑制了GP130、P-STAT3（Tyr705）、P-AKT（Ser473）和P-ERK（Thr202/Tyr204）表达。细胞增殖实验显示与IL-6/BZA联合处理组比较,在BZA单独处理组明显的抑制了细胞生长（在HT29细胞IL-6/BZA vs.BZA,**P=0.0027;在SW480细胞IL-6/BZA vs.BZA,*P=0.0107）,两组相比差异具有统计学意义。而JAK/STAT3、PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路抑制剂AG490、LY294002、Selumetinib对细胞活力抑制能力明显低于BZA。体内实验显示BZA呈剂量依赖性抑制肿瘤生长,诱导肿瘤组织细胞凋亡而没有增加组织器官毒性。免疫组化显示在BZA高剂量组中Ki-67、GP130、P-STAT3、P-AKT和P-ERK蛋白表达明显低于低剂量组和DMSO对照组。2.Bazedoxifene增加5-FU在结肠癌中抗肿瘤活性研究。BZA与5-FU联合明显降低了5-FU的IC50值,两者抗肿瘤活性成协同作用。BZA增加了5-FU对结肠癌细胞增殖,侵袭和迁移能力抑制作用。在HT29和SW480细胞,5-FU/BZA联合组诱导细胞凋亡率分别是32.2%±4.14%和40.4%±2.63%,明显高于BZA单独处理组（在HT29和SW480细胞凋亡率分别是7.71%±1.22%和13.7%±2.18%）和5-FU单独处理组（在HT29和SW480细胞凋亡率分别是12.8%±2.54%和22.8%±3.20%）。与5-FU单独处理组相比,BZA和5-FU联合治疗组细胞周期停滞在G2/M期更加明显,在HT29细胞5-FU vs.BZA+5-FU,**P=0.0089;在SW480细胞5-FU vs.BZA+5-FU,**P=0.0033,两组相比差异具有统计学意义。qPCR和WB结果显示BZA增加5-FU诱导细胞凋亡部分地与Bad/Bcl-2信号通路相关。进一步机制研究发现BZA通过下调IL-6/GP130靶点及抑制下游效应子AKT、ERK和STAT3磷酸化水平增加了5-FU抗肿瘤活性,而IL-6通过激活IL-6/GP130靶点和上调P-AKT、P-ERK和P-STAT3水平可部分逆转5-FU抗肿瘤活性。体内实验进一步验证了5-FU抗肿瘤活性能被BZA增强。3.Bazedoxifene联合HPA抗体对结肠癌的治疗作用。HPA-AB对HT29、HCT116、SW480和LoVo四株结肠癌细胞增殖无明显影响。siRNA组和HPA-AB组明显抑制结肠癌细胞的侵袭和转移,而RE-HPA组明显促进了细胞的侵袭和迁移,表明HPA对结肠癌细胞侵袭和转移起促进作用。此外,BZA/HPA-AB联合组比单独处理组更加明显地抑制了细胞侵袭和迁移。体内实验进一步验证BZA/HPA-AB联合组比单独处理组和对照组更加明显地抑制了肿瘤的肝脏和肺脏转移。ELISA检测发现在siRNA组和HPA-AB组IL-6表达明显减少,而在RE-HPA组IL-6表达明显增加;相反在IL-6处理组HPA表达明显增加,且在一定范围内呈剂量依赖性。LY294002抑制了IL-6分泌和释放,在LY294002处理组HPA表达也明显降低。WB结果显示IL-6可刺激HPA表达,在一定范围内呈剂量依赖性;而IL-6R-AB和BZA处理组HPA表达明显降低。IL-6通过它介导的下游信号级联通路调控HPA表达,其中最主要的可能是通过PI3K/AKT和NF-κB信号通路。结论1.三代SERM BZA在结肠癌通过阻断IL-6/GP130靶点及抑制JAK/STAT3、PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路显示抗肿瘤活性。BZA诱导细胞凋亡与Bad/Bcl-2信号通路密切相关。BZA是一个有效的多信号通路抑制剂,其作用明显优于单信号通路抑制剂。2.BZA增加5-FU在结肠癌的抗肿瘤活性及敏化肿瘤细胞对化疗药物反应,是通过阻断IL-6/GP130靶点及抑制下游信号通路。相反IL-6通过激活IL-6/GP130靶点能够部分逆转BZA作用,表明了抑制IL-6/GP130信号轴可以增强5-FU抗肿瘤作用。3.HPA-AB对结肠癌细胞增殖无影响。BZA联合HPA-AB明显抑制结肠癌细胞的侵袭和转移能力,两者联合治疗结肠癌起协同抑制作用。在一定范围内IL-6可刺激HPA表达,反过来HPA也可增加IL-6表达,形成一个正反馈环路,促进肿瘤转移。IL-6通过它介导的下游信号级联通路调控HPA表达,其中最为关键的可能是通过PI3K/AKT和NF-κB信号通路。
王军胜[8]（2019）在《蒙花苷对破骨细胞的作用及分子机制研究》文中认为研究背景骨质疏松症（osteoporosis）是一种以骨强度下降、脆性增加为特征,继而导致高骨折风险的代谢性骨病。严重的骨质疏松症常伴随着较高的骨折发病率、致残率和死亡率,给患者、家庭、社会带来了巨大的痛苦、负担和压力。随着老龄人口的增加,骨质疏松症已成为最常见的全球性公共卫生问题之一。据估计,到2020年,我国骨质疏松患者将达到2.86亿,到2050年,这一数字将超过5亿,而亚洲将会出现全球约一半以上的骨质疏松性骨折患者。由于没有任何方法能充分补充这种疾病导致的骨密度下降,因此,骨质疏松症目前是无法治愈的。所以,正确认识骨质疏松症,早期采取确实有效的干预措施显得尤为重要和迫切。骨骼是一个高度动态的组织,在各种因素的调节下,它进行着持续的重塑,形成骨稳态,这种稳态由成骨细胞和破骨细胞共同维持。一旦破骨细胞数量增加或骨吸收功能增强,这种稳态即被打破,引起骨量过度丢失,导致骨质疏松症、Paget病、骨关节炎、类风湿性关节炎、恶性肿瘤骨转移等多种疾病。因此,破骨细胞成为治疗骨质过度吸收性病变的主要靶点。破骨细胞由骨髓造血干细胞的单核-巨噬细胞前体,在巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor,M-CSF）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）等作用下逐步增值、分化、融合而形成。核因子-κB受体活化因子（RANK）属于TNF受体家族,核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）与RANK结合,募集并激活衔接分子TRAF6,使IKK2磷酸化并降解IκBα,激活NF-κB转入细胞核启动转录。活化T细胞核因子细胞质1（NFATc1）是破骨细胞形成和维持功能的主要转录和调节因子。因此,NF-κB和NFAT的表达量能够反映RANKL/RANK信号通路的激活情况。目前,临床上抑制破骨细胞的药物有双膦酸盐类、降钙素、雌激素、选择性雌激素受体拮抗剂、RANKL单克隆抗体等。尽管以上药物对于溶骨性病变的治疗均有一定的疗效,但长期使用这些药物可能发生严重的副作用。如双膦酸盐类可引起下颌骨坏死、股骨非典型骨折和食管癌;雌激素可增加乳腺癌和心脏病变等。因此,寻找既安全又能有效地治疗溶骨性疾病的药物一直是研究的热点。由于天然提取物副作用较小,而且与化学合成药物相比,更适合长期使用,因此,中药中潜在的骨活性化合物越来越受到关注。蒙花苷是一种天然黄酮苷,据报道具有促进成骨细胞分化、保护成骨细胞的作用。但其对破骨细胞的影响,尚未见相关研究。因此,本研究通过体外实验,研究蒙花苷对破骨细胞的作用,探讨其发挥作用的分子生物学机制,为临床转化应用提供充分的理论基础。目的1.利用RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMMs）建立破骨细胞分化模型,体外观察蒙花苷对破骨细胞分化和活性是否具有抑制作用。2.初步探讨蒙花苷抑制破骨细胞分化的分子机制。方法1.从8周龄C57BL/6小鼠的长骨中分离骨髓巨噬细胞,构建破骨细胞体外培养体系,经RANKL和M-CSF诱导后,用抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色,3个或3个以上核染色阳性的细胞即为破骨细胞。2.用CCK-8试剂盒测定在24h、48h和5d时蒙花苷对BMMs细胞的毒性,计算半抑制浓度,确定蒙花苷的体外实验浓度。3.将不同浓度（0,0.1,1,and 10 μg/mL）的蒙花苷加入破骨细胞体外培养体系,检测蒙花苷对破骨细胞形成和分化的影响。使用24孔骨吸收板测定不同浓度蒙花苷对破骨细胞骨吸收功能的影响,并对骨吸收面积进行统计分析。4.使用qRT-PCR测定破骨细胞相关基因（NFATc1,TRAP,c-Fos,OSCAR）在不同浓度（0,0.1,1,and 10 μg/mL）蒙花苷作用下的表达量。5.为了检测蒙花苷对NFATc1的蛋白水平影响,RAW264.7细胞经10μg/mL的蒙花苷预处理4小时后再加入50 ng/mL的RANKL共培养,在加入0、1和3天分别用Western blot分析NFATc1的蛋白水平变化。6.RAW264.7细胞经0,0.1,1和10 μg/mL的蒙花苷预处理后,用RANKL诱导,然后用Western blot分析蒙花苷对RANKL诱导的破骨细胞分化过程中NF-κB通路的影响。结果1.当蒙花苷浓度从0.1 μg/mL增加到15 μg/mL时,在24 h至5d内,与对照组相比,BMMs细胞活性无明显影响（P>0.05）;当蒙花苷浓度达到20 μg/mL时,BMMs细胞活性显着减小（P<0.0001）。因此确定蒙花苷浓度在15 μg/mL以内对破骨细胞生成的抑制效应非药物细胞毒性所致。2.骨髓巨噬细胞与蒙花苷共培养后,TRAP染色阳性多核细胞数明显减少,且细胞体积变小。说明蒙花苷能有效抑制破骨细胞的分化,且蒙花苷浓度越大,抑制作用越强（F=300.4,P<0.0001）。骨板吸收试验显示0.1 μg/mL的蒙花苷作用于破骨细胞时,破骨细胞骨吸收面积明显减少,说明蒙花苷能有效抑制破骨细胞的活性（F=277.3,P<0.0001）。3.通过RT-qPCR检测,与阳性对照组相比,蒙花苷明显减少了破骨细胞相关基因mRNA的表达量。当蒙花苷浓度为0.1 μg/mL时,NFATc1、TRAP的表达明显下降（t=12.1 9,P=0.0067;t=5.14,P=0.0358）,而 c-Fos 和 OSCAR 无明显变化（t=0.11,P=0.9213;t=0.01,P=0.9945）。当蒙花苷浓度达到 10μg/mL 时,NFATc1、TRAP、c-Fos 和 OSCAR 的表达量均明显下降（分别为 t=19.44,P=0.0026;t=9.83,P=0.01;t=14.33,P=0.0007;t=8.01,P=0.004）。4.Western blot分析用10 μg/mL的蒙花苷预处理的RAW264.7细胞,在加入RANKL的当天,与阳性对照组（RANKL）相比,NFATc1 的蛋白水平无明显变化（P>0.05）,但在第1天和第3天NFATc1的蛋白表达量却明显减少（F=181.2,P<0.0001）。说明蒙花苷对NFATc1的蛋白表达量不但呈剂量依赖性,且呈时间依赖性。5.RAW264.7细胞向破骨细胞分化模型中加入RANKL后,在5到30分钟时间段内p-p65/p65显着升高,在15分钟时达到顶峰（2.134±0.368）;而加入蒙花苷处理后p-p65/p65显着降低,在15分钟时达到低谷（0.116±0.072）。说明蒙花苷明显抑制了 RANKL诱导的NF-κB信号通路。6.蒙花苷加入破骨细胞培养体系后,RANKL诱导的NF-κBp65的核转位随着蒙花苷浓度的增加而逐渐减低（F=42.7,P<0.0001）,说明蒙花苷抑制NF-κB p65的核转位呈浓度依赖性。结论1.在体外破骨细胞分化模型中,蒙花苷能够明显抑制破骨细胞的形成、分化和骨吸收功能,并能够抑制分化过程中破骨细胞相关基因的表达。2.蒙花苷在破骨细胞形成的早期阶段即可发生抑制作用,其作用机理与抑制RANKL诱导的NF-κB信号通路有关。3.蒙花苷有治疗溶骨性疾病的潜在价值。
王秋果[9]（2019）在《原人参三醇抑制SCD1介导的脂质代谢在多发性骨髓瘤中的作用及机制研究》文中研究表明第一部分SCD1及脂滴在多发性骨髓瘤中的表达及意义目的:既往研究发现在多种肿瘤中通过抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）表达破坏脂质稳态可以杀伤肿瘤细胞,但目前SCD1在多发性骨髓瘤（MM）发生发展中的作用尚不清楚。本部分研究旨在了解脂肪酸组成调节关键酶SCD1在MM中的表达,及其在MM脂质代谢和细胞存活中的作用。方法:收集自2016年10月至2018年5月在华中科技大学同济医学院附属协和医院的16例多发性骨髓瘤患者骨髓标本和5例健康人外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,实时PCR检测脂质合成基因SCD1表达水平,统计分析SCD1表达与MM临床特征的相关性;生物信息学分析比较126名初治骨髓瘤患者的CD138+MM细胞和18名骨髓瘤患者骨髓CD138-CD19+B细胞的SCD1表达;选取两个骨髓瘤细胞系RPMI8226和ARH77,免疫印迹法检测SCD1蛋白水平,BODIPY 493/503荧光染色检测细胞内脂滴（lipid droplets,LDs）的含量。si RNA-SCD1转染MM细胞敲降SCD1表达,检测SCD1对脂滴含量及MM细胞活性的影响,并分别补充外源性油酸（OA）或棕榈酸（PA）,观察脂滴含量及MM细胞活性的变化。结果:在MM患者样本中,SCD1的表达明显高于健康供者,而其表达与患者、年龄或性别无相关性。生物信息学分析显示,初治骨髓瘤患者的CD138+MM细胞的SCD1表达高于患者骨髓中的CD19+B细胞。与正常B细胞相比,MM细胞系RPMI8226和ARH77中SCD1的表达显着升高,且MM细胞中的LDs含量高于正常B细胞。与对照组相比,si RNA-SCD1组细胞凋亡增加,并伴随LDs含量的明显降低。我们发现补充外源性油酸后OA+si RNA-SCD1组凋亡细胞比例较si RNA-SCD1组降低,而且细胞内LDs含量增加。结论:本部分研究表明,多发性骨髓瘤细胞中存在SCD1的高表达和脂质存储水平的增加,且SCD1的表达与MM临床分期相关,SCD1的表达影响MM细胞内脂滴含量和MM细胞存活能力,提示SCD1可能是干扰脂质代谢促进MM细胞凋亡的重要靶点。第二部分原人参三醇通过下调SCD1表达诱导内质网应激促进多发性骨髓瘤细胞凋亡目的:原人参三醇（PPT）是一种人参提取物,具有调节代谢紊乱和抑制脂质合成作用,在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用,而对MM细胞增殖、凋亡的作用尚不清楚。本部分研究探讨了原人参三醇对MM细胞生物学功能的影响和作用机制,及其在MM中对SCD1介导的脂质代谢的调控作用。方法:选取RPMI8226和ARH77两种多发性骨髓瘤细胞株,不同浓度原人参三醇作用于细胞,CCK8检测细胞活力和增殖,计算药物IC50,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期,western blotting检测凋亡蛋白、细胞周期相关蛋白表达。设置PPT干预组和DMSO组,q RT-PCR检测SCD1表达量,检测内质网应激相关基因XBP-1、GRP78、ATF4m RNA表达;western blotting检测SCD1和内质网应激凋亡通路相关蛋白p-PERK,PERK,CHOP的表达;补充油酸或棕榈酸,流式检测细胞凋亡,q RT-PCR和蛋白印迹检测上述蛋白的表达。免疫荧光检测PPT组和对照组细胞内LDs水平,并检测补充外源性油酸或棕榈酸后各组细胞细胞内LDs水平改变。结果:在RPMI8226和ARH77细胞系中PPT剂量依赖性抑制细胞活力和增殖。流式细胞术分析结果显示随着浓度的增加,PPT的促凋亡作用增强,细胞周期检测发现PPT诱导MM细胞周期在G0/G1期停滞。q RT-PCR和western blotting实验结果表明PPT显着下调MM细胞中SCD1的表达,补充棕榈酸的PA+PPT处理组细胞中SCD1的表达显着增加,而OA+PPT组细胞SCD1表达无显着改变。PPT降低了MM细胞中LDs水平,而油酸或棕榈酸的补充使细胞中LDs水平升高。细胞活力和细胞凋亡检测显示油酸的补充不仅补救了PPT处理的MM细胞的活力,而且部分逆转了PPT诱导的MM细胞凋亡。PPT诱导ER应激相关蛋白P-PERK和CHOP高表达,补充油酸逆转了PPT诱导的内质网应激。PPT和ER应激抑制剂TUDCA联合处理组细胞凋亡比例较PPT单独处理组减少,进一步证实PPT可诱导MM细胞ER应激相关细胞凋亡。结论:本实验研究结果表明原人参三醇具有抑制多发性骨髓瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用。SCD1是饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸的关键调节因子,PPT抑制SCD1的表达,下调细胞内LDs含量,干扰细胞脂质稳态,并进一步诱导MM细胞脂毒性相关内质网应激致细胞凋亡。第三部分体内实验验证原人参三醇抗多发性骨髓瘤的作用及机制目的:体外实验已证明原人参三醇通过干扰SCD1介导的脂肪酸合成抑制多发性骨髓瘤细胞增殖及活性的作用,体内实验进一步验证原人参三醇对多发性骨髓瘤的杀伤作用及机制。方法:在NOD/SCID小鼠中皮下注射RPMI8226细胞构建MM小鼠模型,设置PPT治疗组及PBS对照组,观察小鼠的生存状况,瘤体大小及体重变化;取小鼠瘤体,组织石蜡包埋切片标本,免疫组化染色检测Ki67（一种增殖能力的标志物）、凋亡蛋白裂解caspase3、SCD1的表达,免疫荧光检测SCD1、CHOP的表达。结果:与PBS注射对照组相比,PPT治疗组小鼠肿瘤生长显示出中度受抑制,且小鼠的体重明显低于对照组。取小鼠瘤体测量并计算肿瘤体积结果显示PPT治疗组的肿瘤体积明显较小。免疫荧光检测瘤体中SCD1、CHOP水平,我们观察到SCD1和ER应激之间存在显着的反向关系。用IHC染色来检测小鼠肿瘤组织中SCD1的表达结果显示与对照组相比,PPT处理的小鼠肿瘤样本SCD1的表达降低。此外,PPT治疗的肿瘤组织中Ki-67的表达水平降低,且凋亡蛋白裂解caspase3的表达水平升高。结论:小鼠体内实验验证PPT抑制MM瘤体生长,抑制脂质去饱和酶SCD1表达,诱导ER应激促进凋亡。
刘新玲[10]（2019）在《PFKFB3在多发性骨髓瘤中的作用及机制的研究》文中进行了进一步梳理背景:多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种单克隆浆细胞恶性增殖性血液病,高钙血症、肾功能损害、贫血及骨质破坏等是其主要的临床特征。在血液系统肿瘤中,MM的发病率位居第二位,仅次于淋巴瘤。近年来发病率逐年升高,发病年龄也日渐年轻化,严重影响了人们的生存、生活质量。治疗MM的手段主要是传统的化疗药物及不断出现的新药（硼替佐米、来那度胺、daratumumab等）,尽管疾病缓解率得到明显提高,但是复发/难治的现象仍然存在,目前临床上仍然无法治愈。因此从不同角度进一步探索MM疾病发生发展的病理生理机制,寻找新的治疗靶点,期望为最终克服该疾病提供合理有效的治疗策略。近年来,肿瘤细胞的异常高代谢特征引起了广泛关注,也是与正常细胞区别的关键点之一。其中,异常的高糖代谢为肿瘤细胞的生长繁殖提供了充足的能量。从糖代谢途径中寻找靶点,或许是治疗MM的新方向。研究表明,在多种癌症中,参与糖酵解步骤的蛋白质酶类都有不同程度的过表达,其中磷酸果糖激酶-1（phosphofructokinase 1,PFK-1）是关键限速酶之一,将果糖-6-磷酸（fructose 6-bisphosphate,Fru-6-P）转变为果糖-1,6-二磷酸（fructose 1,6-bisphosphate,Fru-1,6-P2）。2,6-二磷酸果糖（fructose 2,6-bisphosphate,Fru-2,6-P2）是 PFK-1 最强有力的激活剂。其中2,6-二磷酸果糖激酶（phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase,PFKFB）的亚型 PFKFB3 促进了 Fru-2,6-P2 合成,进而促进了肿瘤的糖酵解,参与了肿瘤细胞的生存和增殖。目前研究发现,PFKFB3在胃癌、乳腺癌、头颈部肿瘤等多种恶性肿瘤中均有高表达,蛋白水平的升高与疾病的不良预后有密切关系。我们课题组前期研究发现,在MM细胞株中,PFKFB3亦呈高表达,抑制PFKFB3影响了细胞的增殖促进了细胞的凋亡,然而对MM糖酵解的影响和与之相互作用的信号传导机制并不清楚,因此本研究在前期工作的基础上深入探索PFKFB3对MM发生发展的影响及其作用机制,以糖代谢为基础为MM治疗提供新的思路和策略。目的:1.明确在原代MM细胞（患者骨髓CD138+细胞）及MM细胞株中PFKFB3的表达情况;2.抑制PFKFB3酶活性,明确其对MM细胞株糖酵解、细胞增殖等生物学行为的影响;3.构建过表达PFKFB3的慢病毒载体转染MM细胞,探讨PFKFB3影响MM细胞的具体机制;4.体内外实验进一步探索PFKFB3影响MM生长繁殖的机制。方法:1.采用Western blot、qRT-PCR法检测PFKFB3在原代MM细胞及MM细胞株（RPMI8226、OPM2、ARP-1、MM.1S）中的表达情况;2.采用CCK-8法、台盼兰拒染实验检测PFKFB3抑制剂PFK15对MM细胞株生长增殖及凋亡的影响以及相关试剂盒检测抑制PFKFB3前后糖酵解的变化;3.利用过表达PFKFB3的慢病毒转染MM细胞株（RPMI8226、OPM2）,结合抑制剂PFK15探索PFKFB3影响MM涉及的信号网络通路;4.Western blot、qRT-PCR检测高糖环境MM细胞内PFKFB3的表达,基因芯片及Western blot检测降糖药二甲双胍对PFKFB3的影响;进一步CCK-8法检测PFKFB3抑制剂PFK15和二甲双胍的联合作用,利用compusyn软件验证联合效果:联合指数（combination index,CI）<1为协同作用,=1为叠加作用,>1为拮抗作用;同时流式细胞术验证两药合用时细胞凋亡情况;5.利用NOD-SCID小鼠皮下注射MM细胞株RPMI8226（1×107）构建骨髓瘤小鼠模型,加入PFK15及二甲双胍药物抑制PFKFB3,测量小鼠肿瘤体积并采用免疫组织化学染色法验证肿瘤标志蛋白及相关信号通路蛋白的变化情况。结果:1.Western blot、qRT-PCR结果示在原代MM细胞和MM细胞株（RPMI8226、OPM2、ARP-1、MM.1S）中 PFKFB3 高表达;2.CCK-8法、台盼兰拒染实验显示PFKFB3抑制剂PFK15显着抑制了 MM细胞的活力和生长增殖率;PFKFB3受抑制后,葡萄糖的吸收下降,Fru-2,6-P2的含量也下降,说明糖酵解能力减弱;同时,Western blot、qRT-PCR结果示糖酵解中相关的其他酶GLUT1、HK2表达量升高;3.流式细胞术AnnexinV/PI结果示随着PFK15浓度的升高,细胞凋亡显着增加（P<0.05）;PFK15处理MM细胞株后,细胞周期阻滞于S期;凋亡细胞Tunel检测法结果亦验证了 PFK15对细胞的凋亡作用;抑制PFKFB3后,Western blot结果示促凋亡蛋白Caspase3、Bak、PARP-1和周期阻滞蛋白P21表达含量增加,周期进展相关蛋白CyclinD1及抗凋亡蛋白Mcl-1表达含量下降;4.利用过表达PFKFB3的MM细胞株结合抑制剂PFK15进一步研究发现,PFKFB3与MAPKs/STAT1信号家族呈正相关关系,即过表达PFKFB3,MAPKs（JNK P38 Erk）/STAT1信号网络被激活,反之亦然。采用P38抑制剂LY2228820发现磷酸化的P38表达量发生变化,PFKFB3含量未受影响,结果表明MAPKs信号通路位于PFKFB3的下游。此外,抑制PFKFB3,DNA损伤的标志性蛋白γH2AX的表达升高;5.高糖环境MM细胞内PFKFB3表达升高,二甲双胍抑制PFKFB3,CCK-8法、流式细胞术、compusyn软件结果分析二甲双胍和抑制剂PFK15存在联合作用（CI<1）;6.体内骨髓瘤小鼠模型实验结果示:PFKFB3抑制剂PFK15抑制了肿瘤生长,与二甲双胍联用后,抑制效果更显着;免疫组织化学染色结果也取得一致结果。结论:1.骨髓瘤细胞株和原代MM细胞均表达PFKFB3;2.抑制PFKFB3后MM细胞发生凋亡,细胞周期阻滞于S期;同时糖酵解的能力下降,并负反馈调节了糖酵解通路中的相关酶类GLUT1、HK2;3.PFKFB3影响了 MM细胞增殖凋亡的机制与信号网络通路MAPKs/STAT1的异常调控有关;也与DNA损伤相关;4.高糖环境中的MM细胞高表达PFKFB3,而降糖药二甲双胍抑制了 PFKFB3的表达,进一步研究发现PFKFB3抑制剂PFK15与二甲双胍存在联合作用;5.MM荷瘤小鼠体内抑制PFKFB3,小鼠肿瘤负荷降低,PFK15与二甲双胍联用后,抑制肿瘤效果更加显着。
二、INHIBITION OF IL-6-INDUCED STAT3 ACTIVATION IN MYELOMA CELLS BY PROTEIN KINASE A（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、INHIBITION OF IL-6-INDUCED STAT3 ACTIVATION IN MYELOMA CELLS BY PROTEIN KINASE A（论文提纲范文）
（1）新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 蜂毒和蜂毒肽研究进展 |
| 1.1 蜂毒肽(melittin,MEL)简述 |
| 1.2 MEL及其偶联物研究现状 |
| 2 宫颈癌及其免疫治疗的研究进展 |
| 2.1 宫颈癌简述 |
| 2.2 宫颈癌发病机制 |
| 2.3 宫颈癌的肿瘤局部免疫细胞亚群及肿瘤微环境改变 |
| 3 Eph A2 基因研究进展 |
| 3.1 Eph受体简述 |
| 3.2 EphA2 在癌症中的功能 |
| 4 PD-L1-PD-1 免疫检查点研究进展 |
| 4.1 PD-L1-PD-1 免疫检查点的基础生物学 |
| 4.2 在癌症中调控PD-L1 表达的具体分子机制 |
| 4.3 抗PD-L1-PD-1 治疗的前景和局限性 |
| 第2章 新型融合肽UM-6 抗宫颈癌进展及其作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 UM-6 抑制宫颈癌细胞的增殖 |
| 3.2 UM-6 抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移 |
| 3.3 UM-6 抑制宫颈癌细胞HPV E6/7 的蛋白表达 |
| 3.4 UM-6 抑制EphA2 Ser897 磷酸化和其与AKT的相互作用 |
| 3.5 UM-6 促进EphA2 向溶酶体的转运和降解 |
| 3.6 UM-6 介导的 EphA2 溶酶体的降解依赖于AKT介导的 EphA2 Ser897 磷酸化 |
| 3.7 UM-6 在体内抑制宫颈移植瘤的生长 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第3章 新型融合肽UM-6 改善宫颈癌免疫微环境及作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 UM-6 恢复宿主对肿瘤的免疫,增加了CTL活性 |
| 3.2 EphA2与PD-L1 在宫颈癌中呈正相关并调控PD-L1 的表达 |
| 3.3 EphA2和PD-L1 在宫颈癌中高表达,而这两种蛋白在宫颈癌中有高度相关性 |
| 3.4 UM-6 能够抑制PD-L1 糖基化 |
| 3.5 UM-6 能够抑制PD-L1的ER-Golgi易位 |
| 3.6 UM-6 可能通过内质网相关性降解(ERAD)途径下调PD-L1 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所获得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 调节性B细胞概述 |
| 1.2 调节性B细胞与肿瘤 |
| 1.3 肿瘤微环境中调节性B细胞的来源 |
| 1.4 乳酸对肿瘤微环境免疫反应的影响 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 调节性B细胞生物学特性 |
| 2.1.1 调节性B细胞分类及分子标志 |
| 2.1.2 调节性B细胞抑制功能机制 |
| 2.1.3 调节性B细胞的起源及分化 |
| 2.2 调节性B细胞在自身免疫性疾病、感染和肿瘤中的作用 |
| 2.2.1 Breg细胞在自身免疫性疾病中的作用 |
| 2.2.2 Breg细胞在感染性疾病中的作用 |
| 2.2.3 Breg细胞在肿瘤中的作用 |
| 2.3 ROS在B细胞中作为信号分子的作用 |
| 2.3.1 ROS在B细胞中的产生和降解 |
| 2.3.2 ROS调节B细胞的成熟、活化和增殖 |
| 2.3.3 ROS影响B细胞功能 |
| 2.4 乳酸促进肿瘤发生发展机制 |
| 2.4.1 乳酸的来源与代谢 |
| 2.4.2 乳酸在肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.4.3 乳酸/GPR81 信号通路对肿瘤的影响 |
| 2.4.4 乳酸作为肿瘤治疗靶点 |
| 第3章 乳酸诱导小鼠B细胞分化为Breg样细胞的分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 磁珠分选B6 小鼠B220~+B细胞 |
| 3.3.2 磁珠分选CD8~+T细胞 |
| 3.3.3 磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 3.3.4 磁珠分选B6 小鼠na(?)ve CD4~+T细胞 |
| 3.3.5 CFSE染色 |
| 3.3.6 乳酸培养小鼠B220 细胞抑制功能实验 |
| 3.3.7 CFSE法检测细胞增殖 |
| 3.3.8 慢病毒CRISPR/Cas9 技术构建LDHA基因敲除D121 细胞混合克隆稳定株 |
| 3.3.9 小鼠肺腺癌模型的构建 |
| 3.3.10 小鼠肿瘤组织消化 |
| 3.3.11 肿瘤组织B淋巴细胞分选 |
| 3.3.12 组织染色 |
| 3.3.13 流式分析 |
| 3.3.14 qRT-PCR检测 |
| 3.3.15 Western blot |
| 3.3.16 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 乳酸诱导B细胞具有CD25~+CD81~+Breg样细胞的表型 |
| 3.4.2 乳酸诱导的Breg样细胞具有免疫抑制功能 |
| 3.4.3 乳酸诱导的Breg样细胞不能诱导Treg细胞分化及CD4~+T细胞凋亡 |
| 3.4.4 乳酸诱导的Breg样细胞抑制T细胞增殖机制研究 |
| 3.4.5 乳酸激活B细胞表面GPR81 受体诱导ROS表达 |
| 3.4.6 乳酸激活B细胞内PPARα诱导ROS表达 |
| 3.4.7 乳酸通过结合GPR81 受体激活PPARα诱导ROS产生 |
| 3.4.8 降低肿瘤内乳酸浓度对B细胞及其他免疫细胞比例及功能的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 |
| 4.3.2 磁珠分选人外周血CD3~+T/CD19~+B细胞 |
| 4.3.3 乳酸培养人CD19~+B细胞抑制功能试验 |
| 4.3.4 流式检测 |
| 4.3.5 qRT-PCR检测 |
| 4.3.6 人肺腺癌组织及癌旁组织免疫荧光染色 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 肺腺癌患者外周血乳酸含量及Breg细胞比率 |
| 4.4.2 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.4.3 人肺腺癌组织及癌旁组织内乳酸对 B 细胞 ROS 表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的临床研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 分组 |
| 1.5 随访及监测指标 |
| 1.6 观察和评价指标 |
| 1.7 安全性评价 |
| 1.8 检验方法 |
| 1.9 试验流程图 |
| 2 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 三组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者主要基线特征 |
| 3.2 三组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者失访率比较 |
| 3.3 地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的影响 |
| 3.4 地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的影响 |
| 3.5 地五养肝胶囊降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HBeAg阴性慢性乙型肝炎抗病毒治疗的研究进展 |
| 4.2 HBeAg阴性慢乙肝患者存在肝纤维化的异常肝再生微环境是其肝癌发生风险居高不下的重要机制 |
| 4.3 地五养肝胶囊改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用 |
| 4.4 地五养肝胶囊改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发病率的作用 |
| 5 小结 |
| 第二部分 体外实验研究地五养肝胶囊对肝星状细胞与肝癌细胞共培养体系中两种细胞的影响及其改善EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱的相关机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TGF-β1 诱导LX2 活化以及LX2/HCCLM3 共培养体系中LX2的形态学观察 |
| 3.2 筛选DWYG含药血清最佳给药浓度 |
| 3.3 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中两种细胞增殖的影响 |
| 3.4 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中两种细胞凋亡的影响 |
| 3.5 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中HCCLM3侵袭能力的影响 |
| 3.6 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系LX2细胞EMT和 TGF-β/Smad信号通路相关m RNA的表达的影响 |
| 3.7 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系EMT和TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝纤维化的异常肝再生微环境影响肝癌发生发展的作用及其机制 |
| 4.2 地五养肝胶囊改善肝再生微环境防治肝癌发生发展的作用及其机制 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 肝再生信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间论文发表及参与科研情况 |
| 致谢 |
（4）杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（5）交感神经浸润促进胃腺癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 生物信息学分析β肾上腺素能受体信号在胃癌组织中的表达、基因之间的相关性及对胃癌预后的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 方法 |
| 1.2 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 胃癌组织中的高表达基因及YKL-40 的表达 |
| 2.2 NGF的表达和巨噬细胞浸润与胃癌患者的预后 |
| 2.3 β 肾上腺信号与YKL-40 之间的相关性分析及生存预后 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NGF-交感神经相互作用影响胃癌预后 |
| 3.2 交感神经可能是通过YKL-40 调节胃癌的进展 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 交感神经浸润人胃癌组织的证据以及β肾上腺能受体信号通路促进胃癌进展的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样本的收集和处理 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 免疫组织化学染色 |
| 1.5 组织免疫荧光染色 |
| 1.6 Western Blot检测蛋白的表达 |
| 1.7 高效液相色谱-电化学(HPLC-ED)法检测胃癌组织中的NE水平 |
| 1.8 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 胃癌组织内交感神经浸润明显,β-肾上腺素能受体信号显着增强 |
| 2.2 胃癌组织中YKL-40,CD206,Syndecan-1,MMP9和CD31 的表达变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 交感神经和NGF相互作用促进交感神经在胃癌组织中的浸润 |
| 3.2 胃癌组织中的浸润的交感神经可释放大量递质NE,并主要通过激动癌细胞膜上的β2-AR促进胃癌的进展 |
| 3.3 交感神经递质通过调控YKL-40 的表达促进胃癌的增殖和转移 |
| 3.4 交感神经通过调控肿瘤微环境中的巨噬细胞向M2方向转化促进胃癌的进展 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 在细胞水平上研究β肾上腺能受体信号通路对胃癌细胞增殖、迁移和浸润的影响及机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.3.1 细胞复苏 |
| 1.3.2 细胞传代 |
| 1.3.3 细胞冻存 |
| 1.4 细胞增殖实验(CCK-8 法) |
| 1.5 细胞迁移实验 |
| 1.6 细胞浸润实验 |
| 1.7 Western Blot检测细胞蛋白水平 |
| 1.8 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 激活β2-AR 促进胃癌细胞的增殖、迁移和浸润 |
| 2.2 体外激活胃癌细胞的β2-AR导致NGF、YKL-40、Syndecan-1和MMP9 的表达上调以及ERK和STAT3 的磷酸化水平增高 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胃癌细胞是NGF的来源之一 |
| 3.2 激动胃癌细胞的β2-AR可通过STAT3/ERK促进YKL-40 的表达 |
| 3.3 YKL-40 通过增加Syndecan-1和MMP9 的表达促进胃癌细胞增殖、迁移和浸润 |
| 4 结论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）多巴胺在抑制金黄色葡萄球菌感染引起的巨噬细胞炎症反应中的作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.试剂与抗体 |
| 3.M-CSF的获取 |
| 4.小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)的分离与培养 |
| 5.细胞刺激 |
| 6.分离mRNA,实时定量PCR分析 |
| 7.ELISA |
| 8.小干扰RNA沉默基因 |
| 9.慢病毒感染回补实验 |
| 10.免疫荧光 |
| 11.蛋白质免疫印迹实验(Western blot) |
| 12.免疫共沉淀实验 |
| 13.蛋白纯化和pull down实验 |
| 14.高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD法) |
| 15.流式细胞分析实验 |
| 16.RNA-seq转录组基因表达分析 |
| 17.S.A诱导的小鼠脓毒血症模型 |
| 18.S.A诱导的小鼠脑膜炎模型 |
| 19.统计处理 |
| 结果 |
| 1.多巴胺抑制TLR2引起的炎症反应 |
| 2.多巴胺抑制TLR2通路NFkB激活 |
| 3.鉴别多巴胺抑制TLR2通路炎症反应的作用受体 |
| 4.多巴胺通过DRD5 受体抑制TLR2 通路炎症反应 |
| 5.多巴胺抑制TLR2 通路炎症反应不依赖于c AMP-PKA信号 |
| 6.多巴胺抑制TRAF6介导的炎症反应 |
| 7.DRD5与ARRB2和TRAF6 相互作用形成蛋白复合体 |
| 8.DRD5 分别通过IC3 上的IYX(X)I/L结构基序和CT上的EFD结构基序与ARRB2 和TRAF6蛋白作用 |
| 9.IYX(X)I/L和 EFD结构基序物种保守,DRD5 信号激活后招募ARRB2 和TRAF6形成蛋白复合物 |
| 10.DA-DRD5 信号依赖ARRB2/PP2A信号轴抑制TLR2 通路炎症反应 |
| 11.DA-DRD5 信号依赖DRD5的ARRB2和TRAF6 结合基序抑制TLR2通路炎症反应 |
| 12.DA通过DRD5-ARRB2-PP2A信号轴抑制金黄色葡萄球菌感染引起的脓毒血症 |
| 13.DA通过DRD5-ARRB2-PP2A信号轴抑制金黄色葡萄球菌感染引起的脑膜炎 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 神经系统对免疫的调节作用 |
| 1.前言 |
| 2.神经系统 |
| 3.神经系统调节免疫发育 |
| 3.1 神经系统调节骨髓发育 |
| 3.2 神经系统调节胸腺发育 |
| 3.3 神经系统调节外周免疫器官发育 |
| 4.神经系统调节免疫应答 |
| 4.1 神经系统调节固有免疫应答 |
| 4.2 神经系统调节适应性免疫应答 |
| 5.神经系统调节免疫功能 |
| 5.1 神经调节免疫功能的方式 |
| 5.2 神经系统调节免疫防御功能 |
| 5.3 神经系统调节免疫监视功能 |
| 5.4 神经系统调节免疫自稳功能 |
| 6.神经系统调节区域免疫 |
| 6.1 神经调节肺脏区域免疫 |
| 6.2 神经调节肠道区域免疫 |
| 7.神经调节免疫系统疾病 |
| 7.1 神经调节过敏性哮喘 |
| 7.2 神经调节炎症性肠病 |
| 7.3 神经调节类风湿关节炎 |
| 7.4 神经调节感染免疫 |
| 7.5 神经调节肿瘤免疫 |
| 8.多巴胺的免疫调节 |
| 9.总结和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）Bazedoxifene与HPA抗体联合抑制结肠癌侵袭转移分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 SERMs |
| 2.3 SERMs作用机制 |
| 2.4 未来展望 |
| 第三章 Bazedoxifene抑制结肠癌生物学活性及机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 Bazedoxifene增加5-FU在结肠癌中抗肿瘤活性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 Bazedoxifene联合HPA抗体对结肠癌的治疗作用 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表、录用或已投出的学术论文 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）蒙花苷对破骨细胞的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 前言 |
| 第二部分 蒙花苷对破骨细胞的作用观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 破骨细胞培养和鉴定 |
| 2.2.4 蒙花苷对BMMs细胞的毒性试验 |
| 2.2.5 蒙花苷对破骨细胞的形成和分化的影响 |
| 2.2.6 蒙花苷对破骨细胞活性的影响(骨板吸收试验) |
| 2.2.7 蒙花苷对破骨细胞相关基因表达的影响 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 破骨细胞形态学观察 |
| 2.3.2 蒙花苷对BMMs细胞的毒性检测 |
| 2.3.3 蒙花苷抑制破骨细胞的形成和分化 |
| 2.3.4 蒙花苷抑制RANKL诱导的破骨细胞的骨吸收活性 |
| 2.3.5 蒙花苷抑制破骨细胞形成过程中相关基因的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 骨质疏松症与骨免疫 |
| 2.4.2 骨质疏松症的治疗现状 |
| 2.4.3 蒙花苷对成骨细胞的作用 |
| 2.4.4 蒙花苷抑制破骨细胞的分化、形成及功能 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 蒙花苷抑制破骨细胞分化的分子机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 Western blot检测蒙花苷对RANKL诱导的NFATc1蛋白表达的影响 |
| 3.2.3 Western blot检测蒙花苷对RANKL诱导的NF-κB p65蛋白表达的影响 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 蒙花苷抑制RANKL诱导的NFATc1蛋白的表达 |
| 3.3.2 蒙花苷抑制RANKL诱导的NF-κB p65蛋白的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 NF-κB的组成及激活途径 |
| 3.4.2 NF-κB的作用 |
| 3.4.3 NF-κB信号通路与破骨细胞 |
| 3.4.4 蒙花苷通过抑制NF-κB信号通路抑制破骨细胞的形成 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 蒙花苷的药理活性研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 药理学活性 |
| 2.1 抗炎作用 |
| 2.2 抗癌作用 |
| 2.3 器官保护作用 |
| 2.4 调节血压 |
| 2.5 抗骨质疏松 |
| 2.6 其它作用 |
| 3 展望 |
| 4 参考文献 |
| 文献综述二 NF-κB通路研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 在炎症性骨病中的作用 |
| 3 在氧化应激反应中的作用 |
| 4 在肿瘤中的作用 |
| 5 在自身免疫中的作用 |
| 6 展望 |
| 7 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）原人参三醇抑制SCD1介导的脂质代谢在多发性骨髓瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SCD1 及脂滴在多发性骨髓瘤中的表达及其意义 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计和分析 |
| 结果 |
| 一、SCD1 及脂滴在MM中的表达情况 |
| 二、MM细胞存活及脂质存储依赖于SCD1 的表达; |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 原人参三醇通过下调SCD1表达诱导内质网应激促进多发性骨髓瘤细胞凋亡 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计和分析 |
| 结果 |
| 一、原人参三醇抑制MM细胞增殖,促进其凋亡,可被SCD1 产物油酸逆转 |
| 二、原人参三醇抑制MM细胞SCD1 的表达,下调细胞内脂滴含量 |
| 三、原人参三醇诱导MM细胞内质网应激凋亡 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 体内实验验证原人参三醇杀伤多发性骨髓瘤细胞的作用及机制 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计和分析 |
| 结果 |
| 一、体内实验验证原人参三醇抗多发性骨髓瘤作用 |
| 二、体内实验证实原人参三醇抑制SCD1 表达诱导ER应激发挥抗MM作用 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结与展望 |
| 综述 代谢重塑在多发性骨髓瘤中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 附件攻读学位期间发表论文及参与课题情况 |
| 致谢 |
（10）PFKFB3在多发性骨髓瘤中的作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 PFKFB3在多发性骨髓瘤细胞中的表达及作用研究 |
| 引言 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 第二部分 PFKFB3在多发性骨髓瘤中分子机制的研究 |
| 引言 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
四、INHIBITION OF IL-6-INDUCED STAT3 ACTIVATION IN MYELOMA CELLS BY PROTEIN KINASE A（论文参考文献）
- [1]新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究[D]. 贺佳星. 吉林大学, 2021(01)
- [2]肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制[D]. 林杉. 吉林大学, 2021(01)
- [3]地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究[D]. 陈乞. 湖北中医药大学, 2021
- [4]杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制[D]. 柳颖. 浙江大学, 2020(01)
- [5]交感神经浸润促进胃腺癌进展的机制研究[D]. 祁月红. 山西医科大学, 2020(12)
- [6]多巴胺在抑制金黄色葡萄球菌感染引起的巨噬细胞炎症反应中的作用研究[D]. 吴昱青. 南京医科大学, 2020(06)
- [7]Bazedoxifene与HPA抗体联合抑制结肠癌侵袭转移分子机制研究[D]. 李三红. 东南大学, 2019(01)
- [8]蒙花苷对破骨细胞的作用及分子机制研究[D]. 王军胜. 苏州大学, 2019(06)
- [9]原人参三醇抑制SCD1介导的脂质代谢在多发性骨髓瘤中的作用及机制研究[D]. 王秋果. 华中科技大学, 2019(03)
- [10]PFKFB3在多发性骨髓瘤中的作用及机制的研究[D]. 刘新玲. 浙江大学, 2019(03)