一、流式细胞术在移植医学中的应用（论文文献综述）
袁野[1]（2021）在《荧光聚合物点的细胞内吞定量及活体内细胞追踪研究》文中指出随着纳米药物的问世以及人们对各类细胞性能逐步清晰的认知,基于细胞的治疗与药物传递体系逐渐被开发利用,由于其生物相容性高、半衰期长、靶向效果明显、毒副作用低等良好的药代动力学特性被视为是实现未来医学突破的重要手段,在生物医学领域得到了广泛的关注。其中的一些细胞体系甚至已经在某些临床试验中取得了阶段性的成功,比如红细胞能够大幅度延长药物的循环寿命;淋巴细胞能够有效提高药物的靶向安全性;干细胞能够对受损组织进行再生修复等等。虽然这项技术有着美好的未来,但如何对被载药物进行实时地、精准地定量与调控,怎样能明确地获悉细胞在宿主体内完整的代谢过程都是阻碍其在临床上实现系统性应用的关键因素,这些问题都急需我们采用一些分子影像技术进行分析。生物荧光技术以其分辨率高、无电离辐射、操作简易、可多通路复用等优势在分子检测、细胞标记、活体成像等生物应用中优势明显,而这些性能的保证都紧紧依赖于荧光探针的选择和开发。在传统的荧光探针中,有机小分子染料吸收截面小、光稳定性差不利于长期监测,荧光蛋白又存在基因转染带来的潜在风险。而在新型的纳米荧光探针中,无机量子点的重金属毒性、上转换材料的低荧光量子效率以及碳点的弱组织穿透能力等问题都有待解决。聚合物点（Pdots）以其吸收截面大、荧光量子效率高、辐射跃迁速率快、稳定性高、生物相容性好以及表面易功能化等特性在生物传感、活体成像以及光治疗等方面应用广泛,是基于细胞的治疗与传递体系中完美的纳米药物及检测试剂。针对基于细胞的治疗与药物传递体系中被载药物的实时定量以及载体细胞在宿主体内的分布监测这两个问题,本文主要取得了如下研究成果:（1）对细胞内吞的聚合物点实现了荧光定量并将定量结果用于生物成像及光动力治疗应用。我们通过与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的量化结果进行对比,发现以荧光光谱、荧光显微镜以及流式细胞术中获取的荧光信号对细胞内的聚合物点进行定量也能得到相同的结果,即按照我们的标记手法,每个乳腺癌细胞（MCF-7）大致可以内吞1.3×106个直径约为20 nm的聚合物点,并通过亮度对比,我们可以清楚地获得任意特定细胞的内吞数量。另外,我们可以通过改变标记时间的长度对细胞内吞聚合物点的数量进行调控,并利用聚合物点的光动力特性,获取了在特定光能量密度下,光敏剂聚合物点PFBT@Pt对肿瘤细胞MCF-7的半抑制浓度(IC50)。（2）利用掺杂型近红外荧光聚合物点实现了对活体内细胞追踪的三维成像。我们通过将深红光激发聚合物和近红外荧光染料进行掺杂,利用二者之间的F（?）rster共振能量传递,制备出在670 nm处有强吸收、在775 nm处有强荧光,量子效率约为20%的适用于活体成像的近红外聚合物点NIR1,并通过细胞穿膜肽Tat的介导使聚合物点对细胞的标记效率提升了两个数量级。在后续的活体实验中,我们从二维成像和三维成像两种模式采集的图像中均观察到被移植细胞的荧光强度有明显地从肺部向肝部的迁移。（3）设计制备了混杂型近红外聚合物点并利用其观察干细胞与癌细胞在体内的分布差异。我们通过将深红光激发聚合物和近红外荧光聚合物进行掺杂,利用二者之间的F（?）rster共振能量传递,制备出在670 nm处有强吸收、在800 nm处有强荧光,量子效率约为22%的适用于活体成像的混杂型近红外聚合物点NIR2,较于聚合物点NIR1,聚合物点NIR2不仅光谱更红、量子效率更高,同时也避免了染料泄露和聚集的风险。在将细胞穿膜肽Tat介导标记的细胞尾静脉移植入小鼠体内后,我们明显观察到干细胞与癌细胞在活体内的分布差异,通过进一步内脏及冰冻切片的荧光检测,可以细致地分析出干细胞与癌细胞在活体内不同的代谢轨迹。
余怡[2]（2021）在《人胎肝间充质干细胞与成人骨髓间充质干细胞的免疫调节功能的比较研究》文中认为研究背景:自从首次发现间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,经过几十年的研究,MSCs被发现其可通过多种分子作用机制介入免疫调节并在免疫调控时展现出独特的优势。与其他来源的MSCs相比,成人骨髓来源MSCs（Bone marow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）已经成为临床应用的“金标准”。大量的临床前研究和临床应用研究数据证实了这种细胞应用的安全性和有效性,同时也证明了它对T细胞存活和功能有一定的影响作用。然而,我们对MSCs这些功能的潜在作用机制并没有太多深入的了解。现有的研究认为,细胞间的相互接触,可溶性因子的产生,重编程抗原呈递细胞为免疫耐受表型等途径都可能会成为BM-MSCs为Tregs的扩增和发挥其功效提供合适免疫调节环境的机制。前期研究发现,BM-MSCs不仅可直接抑制CD 4+T helper（辅助性T细胞）和CD 8+T cytotoxic（杀伤性T细胞）的增殖,而且也可以间接作用于Tregs（调节性T细胞）的产量来抑制适应性免疫应答反应。在本研究中,我们比较胎肝MSCs（Fetal liver mesenchymal stem cells,FL-MSCs）和 BM-MSCs 的生物学特性,发现 FL-MSCs 可以直接抑制活化的CD 4+T和CD 8+T的增殖,并且表现出较BM-MSCs更为持续的免疫调节能力。本研究还探讨了 FL-MSCs是否会通过诱导产生Tregs从而间接发挥其强大的免疫抑制作用。研究目的:BM-MSCs的获取需要侵入性操作,细胞存活时间较短且易衰老等缺陷,极大的限制了其广泛临床应用。本研究旨在寻找较为合适的MSCs种子细胞替代来源。最终,我们选取了 FL-MSCs,并将之与BM-MSCs进行比较,观察两种细胞的免疫调节功能的差异,评价其是否适合应用于细胞治疗,或者能成为优于BM-MSCs的更好的替代选择。研究方法:1)分别从胎肝和成人骨髓中分离、纯化、培养、传代和体外低温保存MSCs,并从表面抗原表达、多向分化和增殖潜能等三个方面进行细胞鉴定。2)从周龄为6-12周的C57BL/6小鼠脾脏中新鲜分离出单个核细胞,通过磁珠分选法获得较纯的分选后CD 3+CD 25-T细胞,之后对分离获得的细胞进行体外培养、传代和低温保存。3)体外试验将FL-MSCs或BM-MSCs与小鼠CD 3+CD 25-T细胞不同比例共培养,研究两种来源的MSCs对T细胞的作用,进一步研究将细分为分别对CD 4+T传统淋巴细胞和对CD 8+T传统淋巴细胞的免疫抑制作用。4)选择一定比例的MSCs与T细胞继续共培养分组,分别检测T细胞典型的细胞活化表面标记GITR,TNFR 2,ICOS等在CD 4+T传统细胞和CD 8+T传统细胞中的表达情况.5)在上述进行共培养时,我们观察到Tregs在FL-MSCs共培养组中较BM-MSCs共培养组中有所增加,因此我们决定实验量化两种细胞诱导传统T细胞转化为Tregs细胞的能力差别,同时测定诱导产生的Tregs（iTregs）细胞表面典型活化因子的表达量,最后进一步通过设计MLR实验（Mixed Lymphocyte Reaction,体外混合淋巴细胞反应）,以衡量这类诱导型Tregs细胞是否能有效的发挥它们功能的情况。实验结果:1)两种类型的MSCs均成功分离,良好贴壁生长,细胞呈现典型均匀的成纤维样长梭状形态;两种来源的细胞均表达MSCs典型的表面特征标志物,且比例相似;增殖实验结果显示,在观察的实验周期内,FL-MSCs的增殖能力明显优于BM-MSCs,且FL-MSCs持续增殖的时间维持的更长。2)体外成功分离得到的新鲜小鼠脾脏T细胞,获取所需经磁珠分选后的目标分群,待与MSCs体外共培养。3)用anti CD 3/CD 28磁珠刺激,且经CFSE标记后的T细胞,在与MSCs共培养时,不同比例混合情况下的CD 4+传统T细胞和CD 8+传统T细胞的增殖能力均不同程度的受到抑制,但其中,传统T细胞在与FL-MSC共培养分组中受抑制效果均明显强于于BM-MSCs。4)根据检测T细胞表面活化标记物的表达情况,在抑制CD 4+传统T细胞和CD 8+传统T细胞的活化能力方面,FL-MSCs优于BM-MSCs,具有更强的促进它们转变为活性更低表型的能力。5)FL-MSCs具有较BM-MSCs更强的将CD 3+CD 25-Foxp 3-T细胞转化为CD 3+CD 25+Foxp 3+T细胞的能力,同时可作用于CD 3+CD 4+CD 25+Foxp 3+细胞亚群和CD 3+CD 8+CD 25+Foxp 3+细胞亚群。因此,这些FL-MSCs iTregs可以被认为是能更有效地抑制CD 4+传统T淋巴细胞和CD 8+传统T淋巴细胞（统称为“T convs”）,因此更能发挥其免疫调节作用。研究结论:我们的结果表明了与BM-MSCs相比,FL-MSCs的增殖能力和对T细胞的免疫抑制作用更强,并且首次证实了 FL-MSCs的免疫调节的机制与诱导产生的更具活性的功能型Tregs相关。
李骏[3]（2020）在《p75NTR对牙周膜干细胞骨向分化潜能的影响及其机制研究》文中研究说明研究背景:牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）是一种牙源性的间充质干细胞,由Seo等于2004年首次从人牙周膜组织中鉴定并分离得到。研究显示,PDLSCs具有良好的自我更新能力和多项分化潜能,可分化为成骨细胞、成纤维细胞、成牙骨质细胞等特殊的细胞类型。进一步的证据表明PDLSCs还具备一定的免疫调节功能和较低的免疫原性,易于从乳牙、阻生的第三磨牙或正畸拔除的前磨牙中获取,在骨组织工程中具有广阔的应用前景。然而,PDLSCs作为一个复杂而异质性的群体,即使在相同条件下也可能反映出不同的生物学特性,这限制了其作为干细胞的应用。在牙齿的发生发育过程中,起源于颅神经嵴（cranial neural crest,CNC）的外胚间充质干细胞（ectomesenchymal stem cells,EMSCs）迁徙并分化为各种间充质细胞系,最终形成牙髓、牙本质、牙骨质和牙周膜。有学者认为,在牙齿发育完成后,部分CNC源性的祖细胞会留存在牙周膜中,成为PDLSCs中一个更加始祖的亚群;而更精准地分离出这个亚群将促进PDLSCs在未来成功应用于临床治疗。p75神经营养因子受体（p75neurotrophin receptor,p75NTR）是一种高度保守的跨膜的神经营养因子/神经营养因子前体蛋白受体,属于肿瘤坏死因子受体超家族。p75NTR的作用并不局限于神经系统,其在非神经组织的发育和分化过程中也具有多重生物学功能。此外,p75NTR在CNC来源的干细胞中高表达,被认为是CNC源性干细胞的一种特异性表面标志物。在前期研究中,本课题组以p75NTR为细胞表面标志物从大鼠体内分离出CNC源性的p75NTR+EMSCs,发现其具有优良的多向分化潜能;不仅如此,p75NTR还参与了EMSCs成骨分化的正向调控。然而,基于p75NTR表达分选PDLSCs的研究报道较少,p75NTR对PDLSCs生物学特性的影响及其作用机制也尚不清楚。本研究旨在利用p75NTR作为细胞表面标志物分选人PDLSCs,观察p75NTR对PDLSCs再生潜能的影响并进一步探讨其中的潜在机制。我们希望找到一种优化的细胞表面标志物来鉴定和纯化PDLSCs,从而促进其在骨组织工程中的应用。方法:第一部分:PDLSCs的p75NTR流式分选经医院伦理委员会批准及患者知情同意后,收集18至25周岁接受正畸治疗的患者拔除的健康前磨牙,刮取牙周膜组织,采用酶消化法收集原代PDLSCs并进一步体外培养至第3代细胞。以p75NTR为细胞表面标志物,用荧光激活细胞分选术分选PDLSCs并收集p75NTR+PDLSCs和p75NTR-PDLSCs。选取第4代p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs,用流式细胞术检测三种细胞表面p75NTR和间充质干细胞相关表面标志物的表达,并用免疫荧光验证三种细胞中p75NTR的表达。第二部分:p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs生物学特性的研究选取第4代p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs:（1）常规培养10d后,用结晶紫染色观察三种细胞的克隆形成单位,计算其克隆形成率。（2）常规培养7d,每天用CCK-8法检测三种细胞的增殖能力。（3）用流式细胞术检测三种细胞的凋亡率。（4）成脂诱导21d后,用油红O染色观察三种细胞的成脂分化水平。（5）成软骨诱导21d后,用阿利新蓝染色观察三种细胞的成软骨分化水平。（6）成骨诱导7d和21d后,分别用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红染色观察三种细胞的成骨分化水平。（7）成骨诱导前及成骨诱导7d后,分别用荧光定量逆转录聚合酶链反应（fluorescent quantitation reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR）和Western blot检测三种细胞中p75NTR、ALP和Runt相关转录因子2（runt related transcription factor 2,RUNX2）的m RNA和蛋白的表达。第三部分:p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs的RNA测序（RNA Sequencing,RNA-seq）和差异分析选取第4代p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs,常规培养3d后收集三种细胞的总RNA。经RNA质检、文库构建与质检、Illumina测序、测序数据质控、基因定量分析后,用DESeq2软件对数据进行统计学分析,得到三种细胞的差异基因表达谱,并进一步用Cluster Profiler软件对p75NTR+和p75NTR-PDLSCs中的差异表达基因进行富集分析,筛选出存在差异的关键信号通路。最后,从差异基因表达谱中选择五种与该信号通路相关的基因:层粘连蛋白α1（laminin alpha 1,LAMA1）、Ⅳ型胶原蛋白α1（collagen typeⅣalpha 1,COL4A1）、整合素α1（integrin alpha 1,ITGA1）、整合素α7（integrin alpha7,ITGA7）及整合素α8（integrin alpha 8,ITGA8）,用q RT-PCR检测其m RNA的表达,验证RNA-seq的结果。第四部分:p75NTR通过ITGA1优化PDLSCs骨向分化潜能的机制探讨选择ITGA1作为p75NTR+和p75NTR-PDLSCs中与成骨分化有关的关键差异表达基因。选取第4代p75NTR+PDLSCs:（1）利用小干扰RNA转染沉默细胞中的ITGA1,并用免疫荧光验证沉默效果。（2）ITGA1沉默后对细胞成骨诱导3d,用ALP染色观察其骨向分化水平的变化,用q RT-PCR检测其ITGA1、p75NTR、ALP、RUNX2、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达,用Western blot检测其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达。选取第4代p75NTR-PDLSCs:（1）利用腺病毒转染过表达细胞中的ITGA1,并用免疫荧光验证过表达效果。（2）ITGA1过表达后对细胞成骨诱导3d,用ALP染色观察其骨向分化水平的变化,用q RT-PCR检测其ITGA1、p75NTR、ALP、RUNX2、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达,用Western blot检测其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达。结果:第一部分:流式分选结果显示:PDLSCs中p75NTR+PDLSCs的比例为0.99%±0.38%,p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs的形态未见明显差异,大部分呈梭形,具有MSCs的外形特征。分选后的流式细胞表型鉴定结果显示:p75NTR+PDLSCs中p75NTR的表达率为60.59%,而p75NTR-和未分选PDLSCs中p75NTR的表达率分别为0.55%和1.31%;三种细胞均高表达人MSCs阳性表面标志物（CD44/CD73/CD90/CD105）,且均低表达人MSCs阴性表面标志物（CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR）。免疫荧光结果显示:p75NTR+PDLSCs中p75NTR的荧光强度高于p75NTR-和未分选PDLSCs。第二部分:p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs的结晶紫染色结果显示三种细胞的克隆形成率未见明显差异。CCK-8检测结果显示三种细胞连续7天的增殖能力未见明显差异。流式细胞术检测结果显示三种细胞的凋亡率未见明显差异。油红O和阿利新蓝染色结果显示三种细胞均能向成脂肪细胞或成软骨细胞分化。ALP和茜素红染色结果显示三种细胞均能向成骨细胞分化,且p75NTR+PDLSCs的骨向分化水平强于p75NTR-和未分选PDLSCs。q RT-PCR和Western blot检测结果显示:在成骨诱导前,p75NTR+PDLSCs中p75NTR m RNA和蛋白的表达高于p75NTR-与未分选PDLSCs,而三种细胞中ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达未见明显差异;在成骨诱导7d后,三种细胞中p75NTR、ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达均升高,且p75NTR+PDLSCs中p75NTR、ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达高于p75NTR-和未分选PDLSCs。第三部分:RNA-seq结果显示:p75NTR+与p75NTR-PDLSCs相比有713个基因上调,754个基因下调;p75NTR+与未分选PDLSCs相比有458个基因上调,410个基因下调;p75NTR-与未分选PDLSCs相比有214个基因上调,196个基因下调。KEGG通路分析显示:p75NTR+和p75NTR-PDLSCs中的差异表达基因涉及多条信号通路,其中ECM-receptor interaction信号通路可能与PDLSCs的成骨分化密切相关。q RT-PCR检测结果显示:p75NTR+PDLSCs中ITGA1、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达均高于p75NTR-PDLSCs,与RNA-seq结果一致。第四部分:在p75NTR+PDLSCs中沉默ITGA1后,免疫荧光结果显示其ITGA1的表达降低。ALP染色结果显示其骨向分化水平减弱。q RT-PCR检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2 m RNA的表达降低,但其ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1m RNA的表达未见明显变化。Western blot检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达降低。在p75NTR-PDLSCs中过表达ITGA1后,免疫荧光结果显示其ITGA1的表达升高。ALP染色结果显示其骨向分化水平增强。q RT-PCR检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2 m RNA的表达升高,但其ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达未见明显变化。Western blot检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达升高。结论:1、p75NTR可用于分选PDLSCs以获取CNC源性的干细胞亚群。2、p75NTR+PDLSCs较p75NTR-和未分选PDLSCs具备更高的骨向分化潜能。3、p75NTR+和p75NTR-PDLSCs中的差异表达基因涉及ECM-receptor interaction信号通路,且p75NTR+PDLSCs较p75NTR-PDLSCs表达更高水平的ITGA1。4、ITAG1作为ECM-receptor interaction信号通路中的关键受体,在成骨诱导的环境下,可以正向调控PDLSCs的成骨分化。综上所述,本研究首次证实p75NTR可用于分离骨向分化潜能较好的同质的PDLSCs。此外,p75NTR可以通过ECM-receptor interaction信号通路上调ITGA1的表达并优化PDLSCs的骨向分化潜能,提示p75NTR可以作为一种新的细胞表面标志物来识别和纯化PDLSCs,并促进其在骨组织工程中的应用。
蔡梓涵[4]（2020）在《mPEG修饰促进异种脱细胞脂肪基质移植的体内成脂的实验研究》文中提出研究背景与目的自体脂肪移植是当前治疗软组织缺损的首选方法,但存在移植物钙化等问题。利用脱细胞脂肪基质（Acellular adipose matrix,AAM）,是通过脂肪新生实现组织再生的新途径。AAM的再生活性与免疫原性的平衡,是制备方法需要考虑的。本课题组前期通过简化制备方法开发出物理法AAM,保留更多的活性蛋白成分,但对其可能残留的免疫原性未作深入探讨。本研究旨在探究可能存在的免疫反应对于物理法AAM异种移植的体内成脂的影响。对移植物进行免疫修饰以抑制排斥反应,在移植医学领域的发展由来已久。最初的化学交联法,以戊二醛（Glutaraldehyde,GA）应用最广,但其修饰抗原表位的能力有限、细胞毒性大。免疫伪装是另一种免疫修饰手段,以甲氧基聚乙二醇（Methoxypolyethylene glycol,mPEG）应用最广。mPEG 的免疫修饰效果显着,相对无毒,商用广泛,逐步在输血及器官移植领域受到深入研究。本研究旨在利用脂肪移植模型,对比GA与mPEG的免疫修饰能力及其细胞毒性,选择更优的免疫修饰剂。脱细胞基质去除绝大部分细胞成分,但仍残留无法明确定量的抗原,可引起宿主免疫反应。但相较于新鲜组织移植,脱细胞基质更少地诱导促排斥的1型辅助性T淋巴细胞（Type 1 helper T cells,Th1 cells）型免疫反应,获得更好的体内移植结果。本研究旨在探究mPEG修饰对于物理法AAM体内成脂能力的影响,发现其可能的免疫学机制。研究方法1、HE染色行组织学分析;马松染色观察纤维化情况;免疫荧光染色观察脂肪新生、Th1细胞浸润水平。2、qRT-PCR 检测移植物 IL-2、IFN-γ、IL-4、PPAR-γ、CEBP-α 表达水平;ELISA检测宿主IgM、IgG水平。3、活-死细胞染色、CCK-8分析hASCs活率;流式细胞术检测凋亡细胞比例、Th1细胞比例。实验结果1、AAM移植裸鼠较移植BALB/c鼠的脂肪再生结果更好。2、mPEG修饰的脂肪移植物较GA组的纤维化程度低,炎症细胞浸润少,免疫排斥水平低。3、mPEG处理的hASCs较GA组的存活率高,凋亡细胞比例低。4、mPEG修饰的AAM移植物较未修饰组的脂肪再生结果更好,免疫排斥水平低。5、mPEG修饰后AAM对Naive CD4+T细胞向Th1细胞的促分化作用降低。结论1、物理法AAM所诱导的免疫反应,抑制其异种移植的体内成脂结果。2、mPEG比GA更显着地减轻异种脂肪移植的炎症及免疫排斥反应。3、mPEG的细胞毒性显着低于GA的细胞毒性。4、mPEG抑制物理法AAM异种移植的Th1型免疫排斥反应,促进其体内成脂。研究意义本研究首次将FDA批准且应用广泛的mPEG应用于AAM领域,通过其免疫伪装作用,另辟蹊径解决AAM的免疫原性残留问题,具有较高的临床应用价值及商品化潜能。
张英驰[5]（2020）在《电磁场治疗通过促进骨髓间充质干细胞迁移和成骨分化调节骨重塑的机制研究》文中提出目的:骨成熟后,总是处于不断吸收和形成过程,我们称之为骨重塑。骨吸收和骨形成的动态平衡是骨组织应力适应和损伤修复的基础。骨重塑的失调伴随着各种骨疾病的产生。在骨重塑的过程中,破骨细胞溶解骨基质后释放的细胞因子诱导间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）向骨吸收部位定向迁移,然后分化为成骨细胞,并修复被吸收的骨质。故MSC的迁移能力和分化方向对骨重塑的正常运转至关重要。在与骨量减少相关的骨科疾病中,可观察到MSC的迁移能力和成骨分化的减弱。早在20多年前,科学家们发现电磁场可治疗骨折的延迟愈合。因其无创和副作用小的特点,电磁场治疗在骨科疾病中有巨大的应用潜力。已有的研究证实了电磁场可促进MSC的成骨分化,但其机制仍未十分明确。另外,电磁场对MSC的迁移能力是否有一定影响,尚未有研究报导。因此,本研究对电磁场在MSC迁移和成骨分化中发挥的生物学效应进行了实验研究。方法:本研究以人骨髓间充质干细胞（h-BMSC）作为细胞模型,应用的电场磁场为7.5-75 Hz/1 m T正弦交变电磁场,实验分两部分完成。第一部分:研究电磁场对h-BMSC迁移能力的影响及可能机制。首先,我们利用Transwell迁移试验检测不同频率（7.5、15、30、50和75 Hz）电磁场刺激后h-BMSC迁移能力的改变。经过筛选,50 Hz/1 m T的电磁场刺激对h-BMSC的促迁移效应最强。然后,在50 Hz/1 m T电磁场刺激的同时应用L型钙通道阻断剂维拉帕米（10μM）和/或黏着癍激酶（FAK）抑制剂PF573228（5μM）,检测细胞内Ca2+含量、细胞粘附蛋白（FAK、Tailin和Vinculin）的表达、Rho家族GTP酶（Rho A、Rac1和Cdc42）的活性和细胞骨架F-actin的组建,以明确电压门控钙通道（voltage-gated calcium channel,VGCC）、FAK、Rho家族GTP酶（Rho GTPases）在电磁场促h-BMSC迁移效应中扮演的角色,以及他们之间的上下游关系。第二部分:研究电磁场促h-BMSC成骨分化的潜在机制。首先,我们检测了h-BMSC在成骨诱导培养联合不同频率（7.5、15、30、50和75 Hz）电磁场刺激过程中一种配体门控钙离子通道——嘌呤受体P2X7的表达量。用上述实验筛选出15 Hz/1m T电磁场联合成骨诱导培养基刺激h-BMSC 7 d（8 h/d）后,检测P2X7下游的Akt/GSK3β/β-catenin通路的改变。然后,我们利用P2X7特异性抑制剂A740003（5μM）和/或PI3K抑制剂LY294002（10μM）,检测当P2X7和/或PI3K被阻断后电磁场对Akt/GSK3β/β-catenin通路活性和h-BMSC成骨分化的影响。另外,我们还在h-BMSC成骨诱导的过程中,联合应用电磁场和P2X7激动剂（Bz ATP和ATP）,检验二者是否具有协同促成骨效应。结果:第一部分中,我们发现不同频率（7.5、15、30、50和75 Hz）电磁场均具有一定的促h-BMSC迁移的效应,其中50 Hz/1 m T的电磁场刺激对h-BMSC的促迁移效应最强。50 Hz/1 m T电磁场刺激可使h-BMSC 24 h后,细胞内Ca2+含量升高、细胞粘附蛋白（FAK、Tailin、Vinculin）的表达增加、Rho GTPases（Rho A、Rac1、Cdc42）的活性增强和F-actin的组建增加。10μM维拉帕米可部分抑制电磁场介导的促迁移效应和细胞内Ca2+含量的升高。在50 Hz/1 m T电磁场刺激的同时,单独或联合使用维拉帕米（10μM）和PF573228（5μM）,均可部分抑制电磁场对粘附蛋白表达、Rho GTPases活性和F-actin组建的促进作用,其中维拉帕米和PF573228联合使用并未比二者单独使用产生更显着的抑制效果。第二部分中,我们发现不同频率电磁场均可增加成骨分化过程中h-BMSC的P2X7的表达,而对非成骨诱导状态下的h-BMSC中的P2X7表达无明显影响。其中15 Hz/1 m T电磁场诱导P2X7表达的效果最强,这种诱导效应随电磁场刺激时间的增加而增强,并在14 d达到最高点。15 Hz/1 m T电磁场对成骨诱导的h-BMSC刺激7 d后,成骨标志物RUNX2、ALP和OPN的表达增加,钙结节的形成显着增多,而A740003（5μM）和/或LY294002（10μM）可部分逆转这一效应。我们也检测了P2X7下游的Akt/GSK3β/β-catenin通路相关蛋白的表达,结果表明15 Hz/1 m T电磁场刺激7 d可显着升高磷酸化Akt、磷酸化GSK3β和核内β-catenin的水平,而这种效应可被A740003（5μM）或LY294002（10μM）所抑制,其中LY294002的抑制程度更强,且这两种抑制剂联合应用与单独应用LY294002的抑制程度无显着差异。最后,我们还发现电磁场和P2X7激动剂（Bz ATP和ATP）单独或联合应用均可促进成骨诱导的h-BMSC中RUNX2、ALP和OPN等成骨标志物的表达,且联合治疗的促进作用显着强于单独应用电磁场或P2X7激动剂。结论:电磁场可通过增强h-BMSC的迁移能力和成骨分化,促进骨形成,调节骨重塑的平衡。电磁场在促进h-BMSC迁移的过程中,首先激活VGCC,增加细胞内Ca2+浓度,细胞内Ca2+的累积激活FAK,增强了黏着癍的形成。同时FAK通过激活Rho GTPases增强细胞骨架的组建,这些变化共同促进了h-BMSC的迁移。在h-BMSC的成骨分化的过程中,持续的电磁场刺激可诱导钙离子通道受体P2X7的表达,这些表达上调的P2X7激活其下游的Akt/GSK3β/β-catenin通路,促进h-BMSC成骨分化。并且,P2X7激动剂的使用与电磁场治疗有协同促成骨作用。本研究立足于以往研究的基础上,对电磁场治疗调节骨重塑的方式和作用机制做出了补充,为进一步理解电磁场的生物学效应及临床应用电磁场治疗骨科疾病提供了理论依据。
唐环宇[6]（2018）在《人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的免疫原性调控机制研究》文中指出研究背景:视网膜色素上皮（Retinal pigmented epithelium,RPE）细胞是一层位于脉络膜毛细血管和视网膜感光细胞之间的多边形极性细胞,其离子转运、营养分泌、屏障作用以及吞噬代谢产物的功能对于维持视网膜感光细胞内外环境的稳定极其重要。包括糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性等致盲性眼病的发生都与RPE细胞的功能障碍有关,目前国内外对于此类疾病尚无明确有效的药物治疗手段。感光细胞和RPE细胞等终末分化细胞损伤后无法依靠自身再生修复,导致不可逆的视力丧失。近年来大量研究表明,干细胞替代疗法可有效缓解上述视网膜变性疾病的发展[1,2]。目前研究人员利用胚胎干细胞（hESC-RPE）和多能干细胞（iPS-RPE）成功诱导出表型与成RPE相近的治疗细胞,并且通过大量的动物和临床实验中证实,干细胞来源的RPE细胞移植对于视网膜变性疾病有明确的短期疗效[3,4],但研究发现这些治疗细胞在视网膜微环境中的长期生存并不理想,关键问题之一在于宿主对治疗细胞的免疫应答。研究表明:如果对受体的免疫应答不进行有效干预,绝大多数视网膜下腔的外源性RPE细胞在一定时间后都将发生免疫排斥反应[5]。视网膜独特的屏障结构,加上视网膜固有细胞分泌的一系列免疫调节因子,使视网膜在正常情况下处于免疫豁免状态,相对稳定的免疫微环境是神经视网膜发挥功能的重要前提。但视网膜色素变性的发生与炎症和自身免疫反应关系密切,血视网膜屏障的破坏和小胶质细胞的激活进一步改变了视网膜的免疫微环境[6,7]。此外,干细胞移植操作也可以损伤血视网膜屏障并引起炎症反应[8,9]。受到以上因素综合影响,移植后的RPE治疗细胞处于复杂的免疫微环境中,这是影响其移植后长期疗效的不利条件。为克服受体视网膜对外源性RPE细胞的免疫排斥反应,在移植手术前后需要系统应用多种免疫抑制剂。而免疫抑制剂的使用不但效果有限,还可能损伤患者的肝肾功能并且引起机会感染[10-12]。除此之外,干细胞临床转化研究人员正以各种方式探索获得可以逃避受体免疫攻击的“万能细胞”。目前已有科学家通过诱导PDL1和CTLA-4等抑制性配体在干细胞的表达,有效减少免疫细胞对治疗细胞的攻击[13],据此我们提出以下问题:胚胎干细胞来源的色素上皮（hESC-RPE）细胞的免疫原性是否也有关键调控点?能否通过一定手段处理治疗细胞以减少免疫排斥反应?研究目的:通过研究视网膜色素变性免疫微环境的变化,寻找威胁hESC-RPE细胞治疗细胞移植后长期生存的关键因素,并据此探索调控hESC-RPE细胞免疫原性的重要信号通路,找到干预hESC-RPE细胞免疫原性的有效方法,以改善细胞生存、保护细胞功能,更好地实现干细胞治疗视网膜色素变性的临床转化。研究方法:本研究分为三个部分:第一部分:视网膜色素变性的免疫微环境研究按照RCS大鼠发育与视网膜色素变性不同阶段的关系,将RCS分为变性早期（出生后20天,P20d）变性中期（出生后40天,P40d）、和变性晚期（出生后60天,P60d）。利用大鼠细胞因子蛋白芯片研究变性晚期RCS大鼠视网膜免疫微环境的变化;利用RT-PCR技术对变性早、中、晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞相关细胞因子和趋化因子的mRNA表达水平进行评估。利用流式细胞术定量分析变性晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞的数量和激活状态并以免疫组织化学染色技术研究变性晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞分布;通过ELISA技术定量分析变性不同阶段RCS大鼠视网膜匀浆中IFN-γ的浓度,研究视网膜中IFN-γ浓度与视网膜色素变性的关系。第二部分:hESC-RPE细胞的诱导分化与细胞免疫原性研究将hESCs诱导为hESC-RPE细胞,并通过细胞免疫荧光染色和流式细胞术鉴定色素上皮细胞特异性标记物在hESC-RPE细胞的表达情况;利用RT-PCR技术检测胚胎干细胞特征基因和色素上皮细胞特征基因在hESC-RPE细胞的mRNA表达情况;流式细胞术检测hESC细胞向hESC-RPE细胞分化后人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）的表达变化,以及细胞因子IFN-γ处理hESC-RPE细胞前后HLA抗原的表达变化,研究IFN-γ对hESC-RPE细胞免疫原性的影响。第三部分:Ruxolitinib对hESC-RPE细胞的免疫原性调控机制研究利用RNA-Sequence（RNA-Seq）技术对IFN-γ和Ruxolitinib处理后hESC-RPE细胞中基因表达谱进行分析;在不同Ruxolitinib浓度阻断预处理后,再以IFN-γ刺激hESC-RPE细胞:流式细胞术检测药物作用下HLA-ABC、HLA-DR、HLA-E和HLA-G的表达水平变化,研究Ruxolitinib与hESC-RPE细胞HLA表达的量效关系,利用RT-PCR技术从mRNA水平证实Ruxolitinib对hESC-RPE细胞HLA相关基因表达的影响,并利用Western-Blot验证Ruxolitinib对hESC-RPE细胞免疫原性的调控机制。通过共培养实验评估Ruxolitinib预处理对hESC-RPE细胞免疫原性的调控:ELISA试剂盒检测hESC-RPE细胞与CD4+T淋巴细胞共培养后上清中IFN-γ的浓度,评估hESC-RPE细胞对CD4+T淋巴细胞的激活;LDH实验检测hESC-RPE细胞与CD8+T淋巴细胞和NK细胞共培养后上清中乳酸脱氢酶水平,评估hESC-RPE细胞对细胞毒性免疫细胞的激活;细胞免疫化学技术分析Ruxolitinib预处理后hESC-RPE细胞对CD8+T淋巴细胞和NK细胞趋化作用的变化。利用两种动物模型验证Ruxolitinib对免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用:用Ruxolitinib预处理后将Luc慢病毒标记的hESC-RPE细胞移植于人源化免疫系统小鼠皮下,IVIS Spectrum活体成像系统观察并记录移植后不同时间点细胞代谢荧光素底物后产生的生物发光信号,以评估Ruxolitinib对人免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用;将Ruxolitinib预处理的hESC-RPE细胞移植于RCS大鼠视网膜下腔,分别在移植后不同时间点利用fERG检测大鼠视网膜电生理功能,以间接评估移植后在RCS大鼠视网膜下腔hESC-RPE细胞的存活和功能。研究结果:第一部分:视网膜色素变性的免疫微环境研究1.出生后60天RCS大鼠视网膜中IL-2和IFN-γ等淋巴细胞相关细胞因子的浓度显着升高,提示变性晚期视网膜中可能存在淋巴细胞的浸润和激活。2.CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11等趋化因子和IFN-γ、IL-2等细胞因子在RCS大鼠视网膜中mRNA表达水平显着高于相应天龄对照大鼠,且以上炎症因子在RCS大鼠视网膜中随天龄增加而表达上调。3.变性晚期RCS大鼠内层视网膜中有大量淋巴细胞的浸润,其中CD4+T淋巴细胞和NK细胞是视网膜中IFN-γ的重要来源。4.RCS大鼠视网膜中IFN-γ浓度随天龄增加而升高,且在出生后60天与对照大鼠视网膜中IFN-γ浓度形成统计学差异。第二部分:hESC-RPE细胞的诱导分化与细胞免疫原性研究1.分化诱导第70天的hESC-RPE细胞高表达色素上皮细胞特异性标记物Bestrophin、CRALBP、MITF和RPE65,其中Bestrophin主要表达于细胞膜,CRALBP主要表达于胞浆,RPE表达于细胞膜和胞浆,MITF主要表达于细胞核。2.在hESC向hESC-RPE细胞分化的过程中,干细胞特征性基因OCT4、Nanog和SOX2表达显着下调,而色素上皮细胞特征性基因表达显着上调。3.HLA-ABC、HLA-DR、HLA-E和HLA-G抗原在正常培养条件下hESC和hESC-RPE细胞的表达均较低;但在IFN-γ处理后,hESC-RPE细胞所有HLA抗原表达均显着上调。第三部分:Ruxolitinib对hESC-RPE细胞的免疫原性调控机制研究1.IFN-γ对hESC-RPE细胞的主要生物学效应为上调HLA抗原的表达,增强细胞抗原提呈作用、促进免疫排斥反应的发生。2.IFN-γ可通过提高hESC-RPE细胞STAT1蛋白表达和磷酸化水平诱导细胞HLA抗原表达,而一定浓度的Ruxolitinib预处理细胞可有效阻断IFN-γ的效应。3.IFN-γ对hESC-RPE细胞的紧密连接和吞噬功能都有损害,但一定浓度Ruxolitinib预处理可以保护细胞功能。4.IFN-γ可上调hESC-RPE细胞免疫原性,表现为hESC-RPE细胞对免疫细胞的趋化和激活,而Ruxolitinib预处理可降低hESC-RPE细胞的免疫原性。5.Ruxolitinib预处理可延长细胞在人源化免疫系统小鼠体内的存活时间;将Ruxolitinib预处理的hESC-RPE细胞移植于RCS大鼠视网膜下腔,在移植后早期（6周内）视网膜fERG检测结果与系统服用免疫抑制剂无显着差别,均能延缓RCS视网膜色素变性大鼠视功能的衰退。研究结论:1.视网膜色素变性改变了视网膜内相对免疫豁免的微环境,视网膜中淋巴细胞趋化因子和细胞因子表达水平逐渐升高,并在病变后期引起淋巴细胞的浸润和激活。淋巴细胞分泌的细胞因子IFN-γ在视网膜中浓度显着增加,表明细胞免疫的参与是其病变发生机制之一。2.胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化后,细胞免疫原性维持极低水平,但IFN-γ的刺激可显着提高hESC-RPE细胞免疫原性。IFN-γ对hESC-RPE细胞的主要生物学效应为上调HLA抗原的表达增强细胞抗原提呈作用、促进免疫排斥反应的发生。3.首次将JAK-STAT信号通路抑制剂Ruxolitinib应用于干细胞免疫原性研究,并且在hESC-RPE细胞上验证了Ruxolitinib调节细胞免疫原性的机制:通过阻断STAT1的蛋白表达和磷酸化抑制细胞在IFN-γ刺激下HLA抗原的上调,降低细胞的免疫原性,有效减少其对CD4+辅助性T淋巴细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的趋化和激活作用。4.创新性地运用人源化免疫系统小鼠模型,证明Ruxolitinib预处理对免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用;并通过RCS大鼠视网膜下腔细胞移植实验证明Ruxolitinib可以改善hESC-RPE细胞在变性视网膜免疫微环境中的存活,更好地保护RCS大鼠视觉功能。
黄叶全[7]（2017）在《Ku70蛋白在牙髓干细胞增殖与凋亡中作用机制的研究&病例报告》文中认为第一部分低剂量LPS反复刺激下诱导牙髓干细胞发生DNA双链断裂的研究目的:探讨低剂量条件下脂多糖诱导牙髓干细胞DNA损伤方法,为研究脂多糖诱导牙髓干细胞DNA双链断裂及DNA修复提供实验模型。方法:10ng/ml脂多糖连续刺激牙髓细胞1、3、6次后,采取MTT及TUNEL分别检测其对牙髓细胞增殖及凋亡的作用;采用RT-PCR及免疫印迹检测γ-H2A.X的mRNA及蛋白水平的表达;使用免疫荧光及免疫组化法观测γ-H2A.X在体内、外的表达。结果:与对照组相比,1Ong/ml脂多糖连续刺激对牙髓干细胞增殖及凋亡均无显着性差异（P>0.05）;脂多糖连续刺激6次后细胞免疫荧光显示在细胞核检测到γ-H2A.X的阳性表达,且蛋白及mRNA水平的表达较对照组有显着性增加（P<0.05）;免疫组化结果表明在脂多糖诱导4、6、8天后,γ-H2A.X在大鼠牙髓组织较对照组表达水平显着升高（P<0.05）。彗星实验显示实验组DNA拖尾现象显着（P<0.05）,细胞DNA损伤程度为中度损伤（细胞损伤率为20%-40%）。结论:低剂量脂多糖连续刺激可诱导牙髓干细胞产生DNA双链断裂。第二部分炎症状态下牙髓干细胞DNA损伤修复通路表达的研究目的:研究炎症环境下,牙髓干细胞发生DNA双链断裂后经典的修复信号通路的表达。方法:RT-PCR及免疫印迹检测NHEJ修复通路中重要基因与蛋白Ku70和Xrcc4,以及HR修复通路中重要基因与蛋白Rad51和Rad54的表达。结果:RT-PCR及免疫印迹结果均表明Ku70和Xrcc4在mRNA及蛋白水平均有显着升高（P<0.05）,而Rad51表达虽有显着升高（P<0.05）,但作为HR通路后续阶段的Rad54表达却未有显着变化（P>0.05）。结论:炎症状态下,牙髓干细胞DNA双链断裂发生后,NHEJ修复通路发挥重要作用。第三部分炎症环境下Ku70调节牙髓干细胞增殖和凋亡目的:探讨炎症状态下,NHEJ修复通路中关键蛋白Ku70在牙髓干细胞增殖和凋亡中的作用。进一步理解Ku70在维护基因组稳定中的作用,为今后研究Ku70是如何发挥作用奠定基础。方法:实验分为六组,正常对照组（con组）:牙髓干细胞只加生理盐水;siRNA对照组（nc组）:牙髓干细胞中加入一段无义序列;实验组一（1ps组）:牙髓干细胞中加入LPS,每24小时刺激一次,每次6小时,共刺激6次;实验组二（siRNA组）:DPSCs在接种后的第三日转染Ku70siRNA;实验组三（nc+lps组）:牙髓干细胞中加入LPS,每24小时刺激一次,每次6小时,共刺激6次并在接种后第三日转染一段无义序列;实验组四（siRNA+lps组）:DPSCs中加入LPS,每24小时刺激一次,每次6小时,共刺激6次并在细胞接种于培养皿后第三日转染Ku70siRNA。MTT检测细胞活力;采用RT-PCR及免疫印迹检测DNA双链断裂标志物γ-H2A.X,NHEJ修复通路中Ku70和Xrcc4以及HR修复通路中Rad51和Rad54的mRNA及蛋白水平的表达;通过流式细胞术检测细胞凋亡;利用TUNEL法与细胞免疫荧光共染法检测γ-H2A.X与凋亡小体在细胞核中的共表达。结果:MTT结果显示与实验组三（nc+lps组）相比,Ku70基因沉默后牙髓干细胞增殖显着降低（P<0.05）;γ-H2A.XmRNA及蛋白的表达显着升高（P<0.05）;Ku70,Xrcc4,Rad54表达减低明显（P<0.05）,而Rad51表达显着升高（P<0.05）;细胞出现20%左右的早期凋亡与晚期凋亡,γ-H2A.X与凋亡小体出现在细胞核的同一位置。结论:炎症环境下Ku70调节牙髓干细胞的增殖和凋亡。
张静静,吕红霞,杨岩,周栋,黄丹,刘虹辰,王娇,王睿,闫金松[8]（2017）在《外周造血干细胞采集与冻存质量分析》文中研究表明目的监测自体外周造血干细胞采集与冻存质量,提高自体造血干细胞移植的疗效。方法选取本院2014年7月至2016年7月收治的41例自体外周造血干细胞移植患者为研究对象,经化疗联合粒细胞集落刺激因子进行造血干细胞动员,应用血细胞分离机进行86例次自体外周造血干细胞采集,经流式细胞术检测干细胞含量,采用以羟乙基淀粉为主的冻存体系,定期检测干细胞活率,结合自体干细胞移植的成功率,评价造血干细胞采集及冻存的有效性和安全性。结果化疗间歇第911天,CD34+≥15个/μl,达到采集标准;经13次采集CD34+细胞≥2×106/kg,单个核细胞数≥2×108/kg,符合自体干细胞移植标准;16个月冻存活率≥94%,回输前1周复测干细胞活率≥96%。移植后平均+9天粒系植入,平均+13天巨核系植入。中位随访12个月,患者无病生存率达98%。结论自体外周造血干细胞采集冻存质量符合标准,为自体造血干细胞植活及移植的成功提供了根本保障。
王垒,彭贵主,王彦峰[9]（2016）在《肾移植术后BK病毒感染的诊治进展》文中研究指明BK病毒感染是肾移植术后常见的并发症,也是近年移植肾丢失的主要原因之一。因此,早期检测和诊断BK病毒感染对阻断疾病的进展至关重要。本文主要综述了近年来国内外肾移植术后BK病毒感染的诊断与治疗的研究进展。
李海滨,孙煦勇,秦科,邓添薪,黄晓诞,覃音红,黄晨,黄莹,曹嵩,蔡文娥,郭海鸽[10]（2015）在《肺移植术后T淋巴细胞亚群动态变化及意义（附2例报告）》文中提出目的:探讨肺移植术后T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+比值水平的表达及意义。方法:采用流式细胞术检测2例肺移植患者术前、术后3个月内与术后3个月后外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+与CD8+的连续变化情况。结果:2例肺移植患者术前T淋巴细胞绝对计数接近正常水平,术后3个月内T淋巴细胞绝对计数低于正常值,3个月以后绝对计数趋向于正常范围,而CD4+/CD8+在术前、手术3个月后均较术后3个月内低。结论:肺移植患者术后T淋巴细胞亚群的动态检测,可及时了解患者的免疫状态,为及时调整治疗方案提供参考。
二、流式细胞术在移植医学中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、流式细胞术在移植医学中的应用（论文提纲范文）
（1）荧光聚合物点的细胞内吞定量及活体内细胞追踪研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 荧光探针 |
| 1.2.1 有机小分子染料 |
| 1.2.2 荧光蛋白 |
| 1.2.3 荧光纳米粒子 |
| 1.3 聚合物点 |
| 1.3.1 共轭聚合物 |
| 1.3.2 共轭聚合物的发光机理 |
| 1.3.3 聚合物点的制备方法 |
| 1.3.4 聚合物点的特性表征 |
| 1.3.5 聚合物点的表面功能化 |
| 1.3.6 荧光聚合物点的生物应用 |
| 1.4 论文选题意义及主要内容 |
| 第2章 细胞内吞聚合物点的荧光定量及其生物应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂及仪器 |
| 2.2.2 聚合物点的制备及纯化 |
| 2.2.3 聚合物点的荧光稳定性与生物相容性测试 |
| 2.2.4 聚合物点的细胞穿膜肽修饰及其细胞标记 |
| 2.2.5 细胞内吞聚合物点的荧光光谱定量 |
| 2.2.6 细胞内吞聚合物点的电感耦合等离子体质谱定量 |
| 2.2.7 细胞内吞聚合物点的共聚焦显微镜定量和流式细胞术定量 |
| 2.2.8 聚合物点光敏剂对肿瘤细胞半抑制浓度的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 聚合物点PFBT与 PFBT@Pt的制备与表征 |
| 2.3.2 细胞内吞聚合物点的荧光光谱定量和电感耦合等离子体质谱定量 |
| 2.3.3 细胞内吞聚合物点的共聚焦显微镜定量与流式细胞术定量 |
| 2.3.4 聚合物点PFBT@Pt对于肿瘤细胞MCF-7 的半抑制浓度测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 掺杂型近红外荧光聚合物点应用于活体内细胞追踪三维成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂及仪器 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 聚合物点的制备及纯化 |
| 3.2.4 聚合物点生物相容性测试 |
| 3.2.5 聚合物点的细胞穿膜肽修饰及其细胞标记 |
| 3.2.6 细胞体内追踪 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 聚合物点的制备与表征 |
| 3.3.2 细胞穿膜肽介导的聚合物点高效标记 |
| 3.3.3 细胞体内追踪 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 混杂型近红外荧光聚合物点的制备及其活体内多种细胞的追踪应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂及仪器 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 聚合物点的制备及纯化 |
| 4.2.4 聚合物点生物相容性测试及对肿瘤细胞的标记 |
| 4.2.5 人类脐带间充质干细胞的提取 |
| 4.2.6 聚合物点生物相容性测试及对干细胞的标记 |
| 4.2.7 肿瘤细胞与干细胞体内动态追踪 |
| 4.2.8 组织学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 深红光激发、近红外发射聚合物点的制备与表征 |
| 4.3.2 聚合物点的细胞标记与生物相容性测试 |
| 4.3.3 体内肿瘤细胞与干细胞的动态追踪 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）人胎肝间充质干细胞与成人骨髓间充质干细胞的免疫调节功能的比较研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:不同来源间充质干细胞在再生医学中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录一 耗材与试剂 |
| 附录二 主要的溶液的配制 |
| 附录三 常见的英文缩写和代码 |
| 附录四 在学期间发表文章 |
| 附录五 在学期间参与课题 |
| 致谢及憧憬 |
（3）p75NTR对牙周膜干细胞骨向分化潜能的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 PDLSCs的 p75NTR流式分选及鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs生物学特性的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs的 RNA测序和差异分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四章 p75NTR通过ITGA1 优化PDLSCs骨向分化潜能的机制探讨 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 牙周膜干细胞在再生医学中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）mPEG修饰促进异种脱细胞脂肪基质移植的体内成脂的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 异种脱细胞脂肪基质移植裸鼠的结果研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 GA与mPEG处理的异种Coleman脂肪移植的结果比较 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 mPEG修饰对异种脱细胞脂肪基质的移植结果的影响及其机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）电磁场治疗通过促进骨髓间充质干细胞迁移和成骨分化调节骨重塑的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 电磁场通过激活电压门控钙通道促进骨髓间充质干细胞迁移 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 电磁场促进间充质干细胞P2X7表达从而增强成骨分化 |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 电磁场与干细胞治疗在骨组织工程中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录2 人骨髓间充质干细胞购买证明 |
（6）人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的免疫原性调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 视网膜色素变性的免疫微环境研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 hESC-RPE细胞的诱导分化与免疫原性变化研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Ruxolitinib对免疫微环境中hESC-RPE细胞的免疫原性调控机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 视网膜变性疾病的细胞替代治疗与免疫排斥反应 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的与课题相关的论文及获奖情况 |
| 致谢 |
（7）Ku70蛋白在牙髓干细胞增殖与凋亡中作用机制的研究&病例报告（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一部分 低剂量LPS反复刺激下诱导牙髓干细胞发生DNA双链断裂的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 炎症状态下牙髓干细胞DNA损伤修复通路表达的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 炎症环境下Ku70调节牙髓干细胞增殖与凋亡 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验部分总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 临床工作总结 |
| 读博期间成果 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）外周造血干细胞采集与冻存质量分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 干细胞动员 |
| 1.3 采集前准备 |
| 1.3.1 患者准备 |
| 1.3.2 血管评估及置管 |
| 1.4 外周造血干细胞采集 |
| 1.4.1 仪器与管路 |
| 1.4.2 干细胞采集过程 |
| 1.4.3采集后护理 |
| 1.5 干细胞冻存与活率监测 |
| 2 结果 |
| 2.1 干细胞动员效果 |
| 2.2 造血干细胞采集质量 |
| 2.3 自体造血干细胞冻存活率监测 |
| 2.4 采集的不良反应及处理 |
| 2.5 血管通路选择 |
| 2.6 异常报警及处理 |
| 2.7 自体外周造血干细胞移植后造血重建及生存情况 |
| 3 讨论 |
（9）肾移植术后BK病毒感染的诊治进展（论文提纲范文）
| 1 BK病毒的生物学特点 |
| 2 肾移植术后BK病毒的感染 |
| 2.1 肾移植术后BK病毒的感染机制 |
| 2.2 肾移植术后BK病毒的感染时间 |
| 2.3 肾移植术后BK病毒感染的危险因素 |
| 3 肾移植术后BK病毒感染及BKVN的检测与诊断 |
| 3.1 BK病毒感染的临床表现 |
| 3.2 BK病毒的实验室检查 |
| 3.2.1尿细胞学检查 |
| 3.2.2 定量PCR检测 |
| 3.2.3 移植肾活检 |
| 3.2.4 流式细胞术 |
| 3.2.5 尿液VP1mRNA检测 |
| 3.2.6 BK病毒特异性免疫应答 |
| 4 BKVN的预防与治疗 |
| 4.1 BKVN的预防 |
| 4.2 BKVN的治疗 |
| 4.2.1 适当减少免疫抑制药物 |
| 4.2.2 更换免疫抑制剂方案 |
| 4.2.3 抗病毒治疗 |
| 4.2.4 BKVN后移植物丢失的再次移植 |
| 4.2.5 其他 |
（10）肺移植术后T淋巴细胞亚群动态变化及意义（附2例报告）（论文提纲范文）
| 1材料和方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
四、流式细胞术在移植医学中的应用（论文参考文献）
- [1]荧光聚合物点的细胞内吞定量及活体内细胞追踪研究[D]. 袁野. 吉林大学, 2021(01)
- [2]人胎肝间充质干细胞与成人骨髓间充质干细胞的免疫调节功能的比较研究[D]. 余怡. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]p75NTR对牙周膜干细胞骨向分化潜能的影响及其机制研究[D]. 李骏. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [4]mPEG修饰促进异种脱细胞脂肪基质移植的体内成脂的实验研究[D]. 蔡梓涵. 南方医科大学, 2020(02)
- [5]电磁场治疗通过促进骨髓间充质干细胞迁移和成骨分化调节骨重塑的机制研究[D]. 张英驰. 华中科技大学, 2020(01)
- [6]人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的免疫原性调控机制研究[D]. 唐环宇. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [7]Ku70蛋白在牙髓干细胞增殖与凋亡中作用机制的研究&病例报告[D]. 黄叶全. 武汉大学, 2017(07)
- [8]外周造血干细胞采集与冻存质量分析[J]. 张静静,吕红霞,杨岩,周栋,黄丹,刘虹辰,王娇,王睿,闫金松. 中国医学前沿杂志(电子版), 2017(01)
- [9]肾移植术后BK病毒感染的诊治进展[J]. 王垒,彭贵主,王彦峰. 武汉大学学报(医学版), 2016(04)
- [10]肺移植术后T淋巴细胞亚群动态变化及意义（附2例报告）[J]. 李海滨,孙煦勇,秦科,邓添薪,黄晓诞,覃音红,黄晨,黄莹,曹嵩,蔡文娥,郭海鸽. 广西医科大学学报, 2015(03)