一、HIV/HCV共感染患者病毒特异性CTL细胞定量研究（论文文献综述）
林铃[1]（2021）在《cART联合雷公藤治疗对HIV急性期感染者病毒储存库、慢性期感染者免疫重建的影响》文中提出[目的]全血样本与外周血单个核细胞（PBMCs）样本用以总HIV-1 DNA水平的评估;探索联合抗逆转录病毒疗法（cART）联合雷公藤多苷片对HIV-1急性期感染者总HIV-1 DNA的影响;探索cART联合雷公藤多苷片对HIV-1慢性期感染者免疫重建不全的作用。[方法]本研究共纳入在我院艾滋病免疫功能低下门诊随访的急性期患者27例,根据cART方案分为三联组,四联组,四联+雷公藤组。急性期加用雷公藤的中位时间为cART第6个月左右,持续治疗约12个月,在cART第18个月时三组患者皆改为三联治疗。符合免疫重建不全的慢性期感染者27例,加用雷公藤的中位时间为抗病毒治疗第30个月左右,持续治疗约12个月。患者随访时间为除基线、治疗第1个月外,前48个月每3个月随访一次,48个月后每半年随访一次。另纳入慢性期患者44例用以评价两种样本检测HIV-1 DNA的一致性。记录患者临床就诊情况并留取外周血,分离血浆、PBMCs冻存,检测常规,HIV血浆载量,淋巴细胞亚群11项等。总HIV-1 DNA的检测采用实时定量PCR的方法,对两种样本的检测结果进行统计分析,随后的检测使用全血样本进行。选择恰当的方式进行统计学分析。[结果]1.44例患者同一时间点全血与PBMCs两种样本检测总HIV-1 DNA水平十分接近（3.05±0.40 vs 3.02±0.39 log10拷贝/106 PBMCs）;两种样本检测所得总HIV-1 DNA结果高度相关（r=0.887）;两种样本检测所得总HIV-1 DNA一致性较好,95%一致性界限为-0.340～0.390 log10 拷贝/106 PBMCs。2.急性期HIV-1感染者HIV-1 RNA在抗逆转录病毒治疗第6个月时下降到检测不到水平,四联治疗的两个组较标准三联治疗组HIV-1 RNA在治疗前期下降的速度更快,cART第3个月时低于检测水平。三组患者CD4+T、CD8+T细胞计数、CD4/CD8比值、CD38+CD8+/CD8+%分别在治疗后第3、6、12、18个月时接近或进入正常值范围。四联+雷公藤治疗组患者CD8+T细胞计数在治疗第6-18个月有上升趋势,18-72又呈下降趋势。三组患者HLA-DR+CD8+/CD8+%在治疗过程中有所下降,但至随访第72个月时仍然高于正常值。三联组和四联组患者HIV-1 DNA水平在整个随访期间呈下降趋势,其中以抗病毒治疗前6个月下降速率最快;四联+雷公藤组HIV-1 DNA前6个月变化与四联组一致,第12个月后出现上升趋势并维持至第72个月。3.27例雷公藤干预的免疫重建不全患者,有20例（74.1%）在加用雷公藤1年时获得了良好的CD4+T细胞计数的回升（>50cells/μL）,增长的CD4 T细胞主要为记忆性CD4+T细胞。相关性分析显示雷公藤干预后CD4+T细胞上升有效性与加用雷公藤前cART时间长短与呈负相关,与基线CD4+T细胞计数无相关性。COX回归分析显示年龄与合并HCV感染是影响干预有效性的两个独立危险因素。[结论]1.使用全血样本检测患者总HIV-1 DNA的结果与使用PBMCs样本基本一致,储存库研究中可使用全血样本替代PBMCs样本。2.急性期患者使用雷公藤干预可影响HIV-1 DNA水平,雷公藤可能是一个潜伏储存库的激活剂。3.慢性期患者使用雷公藤干预可有效改善免疫重建不全现象,这种作用可能是通过激活EIF2信号通路,抑制IFN通路产生的。
陈璐斯[2]（2019）在《MSM人群HIV+/AIDS进程影响因素及梨支原体共感染的流行病学研究》文中提出研究背景与目的:男男性行为人群（Men who have sex with men,MSM）作为公认的HIV感染和传播的高危人群,是我国艾滋病防控工作的重点目标人群之一。自“四免一关怀”政策实施以来,我国全面推行免费艾滋病抗病毒治疗,在一定程度上延缓了HIV感染者的病程,降低了病死率。然而,不同个体的疾病进程依然存在差异,且有研究显示MSM人群中HIV+/AIDS者的疾病进程进展较快。HIV感染的疾病进程受到包括生物医学、社会心理等多种相关因素的影响,其他病原体的合并感染也可能对病程产生影响。前期研究显示,该人群中梨支原体（Mpi）感染与患者的免疫功能存在关联,但此种合并感染对机体及病程产生的影响并不明确。深入探究病程的影响因素及作用机制,有助于制定更有针对性的防治对策和措施,进一步降低HIV感染率和艾滋病病死率。因此本论文在既往研究的基础上,开展人群与实验室研究,一方面以江苏省接受抗病毒治疗的MSM人群为研究对象,了解该人群HIV感染的疾病进程,分析影响病程的相关生物、社会心理等因素;另一方面建立HIV与Mpi感染细胞模型,利用转录组测序,结合生物信息学方法,分析合并感染对免疫功能的影响及与病程的可能关联。旨在为MSM人群中HIV+/AIDS者更好地控制病程发展以及在该人群中更有效地实施艾滋病控制和干预提供科学依据。研究方法:1、回顾性收集国家实行免费艾滋病抗病毒治疗（2003年）至2016年6月期间,江苏省南京、无锡两地接受抗病毒治疗的MSM人群的随访资料,分别以观测终点是否死亡、是否发展为AIDS为结局,应用Cox比例风险模型分析影响该人群死亡及疾病进展的相关因素。另外,运用线性混合效应模型探索抗病毒治疗后CD4+T淋巴细胞计数变化情况及相关的影响因素。2、以南京市某艾滋病抗病毒治疗门诊接受抗病毒治疗的MSM人群为研究对象,运用流行病学调查结合访谈收集其基本信息、个人社会网络信息及是否告知HIV感染情况及性行为特征等社会心理相关信息。运用logistic回归分析与HIV感染疾病进程的社会心理相关因素;了解该人群HIV感染及同性性行为告知情况,并结合个人特征及社会网络特征,采用GEE模型分析影响告知行为的相关因素。3、利用HIV感染者及健康者的外周血单核细胞（PBMC）和梨支原体脂质相关膜蛋白（LAMPs）,建立Mpi与HIV共感染的体外细胞模型共四组,分别为Mpi与HIV共感染组、单纯HIV感染组、单纯Mpi感染组和正常组,每组设立两个平行样。采用Illumina平台对不同感染组的总RNA测序获得相应的转录本,分析筛选不同感染条件下表达水平显着差异的基因。运用GO、KEGG等数据库,对筛选出的差异基因进行富集分析,探讨与差异基因显着相关的生物功能或通路。主要研究结果:1、回顾性收集了 2096例接受抗病毒治疗的MSM人群,平均年龄为39.51±12.27岁,54.47%调查对象未婚,77.05%有高中及以上学历。开始接受抗病毒治疗时（基线）75.29%为HIV感染者,24.71%为AIDS患者;至观测终点时,57.42%为HIV感染者,42.58%为AIDS患者。平均随访时间为52.30±25.18月,随访最短为5个月,最长为148个月,随访至观测终点时,共有41例患者死亡,其中艾滋病相关死亡为19例。2、分析该人群的艾滋病相关死亡因素显示,基线CD4+T淋巴细胞水平越高,死亡的风险越低（HR=0.026,95%CI 0.003-0.198）。分析影响该人群疾病状态的相关因素显示,相对于基线CD4+T淋巴细胞计数<350cells/mm3的感染者,基线CD4+T淋巴细胞计数在350-500cells/mm3及>500cells/mm3的患者发展为AIDS 的风险更低（HR=0.594,95%CI0.469-0.754）（HR=0.281,95%CI0.195-0.407）;按照不同抗病毒治疗标准实施时间进行亚组分析显示,不同的抗病毒治疗方案与AIDS的发展也存在关联,相对于包含TDF的治疗方案,包含AZT的治疗方案发展为AIDS的风险更大（HR=1.541,95%CI1.097-2.166）;有STIs感染史的患者及开始接受抗病毒治疗的年龄越大的患者,发展为AIDS的风险越高（HR=1.725,95%CI1.153-2.580）,（HR=1.028,95%CI1.003-1.053）。3、线性混合效应模型分析显示,随着治疗时间的增加,CD4+T淋巴细胞计数也增加;基线CD4+T淋巴细胞水平越高,后期CD4+T淋巴细胞计数越高,但增长速度更慢。4、现场调查纳入87例HIV感染的MSM人群,平均年龄为35.87±13.81岁,58.5%的人具有大学及以上的学历,第一次发生同性性行为的年龄为24.05±9.87岁。55.17%的患者告知了自己感染了 HIV,58.62%的患者告知了自己发生过同性性行为。该人群共提名了 309名社会网络成员,平均社会网络大小为3.49±2.15人,网络成员中男性占56.96%,主要的类型为家庭成员（39.81%）,朋友（38.51%）及同学或同事（21.68%）。5、HIV感染的告知与否与其疾病进程相关,相比较不告知者,告知者CD4+T淋巴细胞计数更高（OR=2.62,95%CI1.10-6.26）。分析与HIV感染告知的相关因素显示,告知自己同性性行为的患者也更愿意告知自己的疾病状态（OR=6.59,95%CI4.08-10.55）,且主要告知对象为朋友（OR=5.16,95%CI2.03-13.10）或家人（OR=6.22,95%CI 2.52-15.33）。6、体外建立的共感染模型显示,梨支原体的LAMPS刺激最佳条件为终浓度0.5mg/ml,刺激时间为6小时。与正常组相比,Mpi感染组中,表达上调的基因369个,下调基因331个。表达升高的基因包括IL6、IL1β、ISG15、IFIT3和HERC5等细胞因子及干扰素诱导相关因子。对差异基因进行GO功能富集分析,结果显示主要差异基因的功能为对细菌感染和其他微生物的防御反应及Ⅰ型干扰素激活等。对差异基因进行KEGG富集分析显示,差异基因主要富集在细胞因子与受体之间的相互作用（hsa04060）,IL-17信号通路（hsa04657）等通路。7、与单纯HIV感染组相比,Mpi与HIV共感染组中上调基因197个,下调基因277个。上调基因包括HERC5、MX2和TRIM22等干扰素诱导相关基因,GO功能富集分析显示差异基因的主要功能为对病毒的防御反应和对其他微生物的防御反应等;利用KEGG进行通路分析显示,显着的通路为细胞因子及细胞因子受体的相互作用（hsa04060）、NOD样受体信号通路（hsa04621）等。主要研究结论和建议:1、利用江苏省接受抗病毒治疗的MSM人群的随访资料回顾性分析显示,基线CD4+T淋巴细胞水平越低,开始接受抗病毒治疗时的年龄越大,发展为AIDS的风险越大,提示应尽早发现HIV感染者,及时给予规范的抗病毒治疗,有助于控制病情发展,降低死亡风险。2、愿意告知HIV感染状态的MSM人群免疫状态更好,提示良好的社会支持和心理状态对控制病程有一定的作用。而调查显示该人群社会网络偏小,仅部分患者告知过自己的疾病状态或性行为特征,提示社会文化环境中依然存在对HIV感染及MSM人群的歧视和偏见,限制了该人群的告知行为。为了更好地在该人群中进行艾滋病管理和干预,除了针对患者实施早发现早治疗等措施,也应结合家庭、社区等力量,营造宽容支持的氛围,鼓励该人群主动及时地告知疾病及性行为特征的情况,使其可以积极应对HIV感染,更好地控制病情发展。3、Mpi可以在HIV感染的PBMC中刺激HERC5、MX2、TRIM22等基因表达增多,这些基因编码的蛋白具有激活或上调机体细胞免疫水平的作用,提示Mpi与HIV共感染时,能够在一定程度上限制病毒的复制,从而影响病程的发展,但该结论有待进一步验证。
余婷[3]（2019）在《MicroRNA-146a在HIV-1慢性感染中与耗竭标志物相关性及其抑制细胞免疫功能的研究》文中进行了进一步梳理目的:随着HAART治疗的广泛应用,HIV-1感染者的病毒载量基本能获得有效的控制,但无法彻底清除病毒。造成病毒难以清除的根本原因在于机体免疫系统的功能紊乱,不能有效清除病毒,而免疫耗竭就在其中扮演了重要角色。如何通过去改善细胞的耗竭状态来增强HIV-1患者免疫系统的功能,达到更好地去清除病毒的目的是我们一直关注的核心问题。鉴于miR-146a在免疫负调控中发挥的重要作用,本研究探讨miR-146a在慢性HIV患者CD8+T细胞反应功能障碍中的作用及可能的机制。方法:首先通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）比较109例慢性HIV-1感染患者和35例性别和年龄与之匹配的HIV-1血清阴性健康供体的PBMCs中miR-146a的表达水平的差异。然后检测耗竭标志物如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、T细胞免疫球蛋白和含黏液域的分子-3（TIM-3）、淋巴细胞活化基因3（LAG-3）和效应功能相关基因如颗粒酶B（GZMB）和穿孔蛋白（Perforin）以及CD107a的表达水平,并对miR-146a水平和耗竭标志物之间的相关性进行了分析。接着为了研究miR-146a对CD8+T细胞功能的作用和对PBMCs的作用是否一致,用miR-146a mimics或miR-146a inhibitors转染CD8+T细胞后采用RT-qPCR和酶联免疫吸附法（ELISA）检测其抗病毒细胞因子的分泌情况和细胞毒功能。最后对慢性HIV-1患者的PBMCs体外进行miR-146a阻断,去恢复这些患者抗病毒细胞因子分泌以及缓解免疫耗竭状态。结果:慢性HIV-1感染者的PBMCs中miR-146a水平高于对照组（p<0.01）,且与CD4+T细胞计数呈负相关（P<0.05）。我们发现这些HIV-1感染患者的PBMC中CTLA-4、TIM-3和LAG-3水平升高（P<0.01）,并且与miR-146a的相对水平呈正相关（P<0.05）。与此同时患者PBMCs中GZMB、perforin水平降低。过表达miR-146a会降低CD8+T细胞抗病毒细胞因子的产生,抑制其细胞毒功能。慢性HIV-1患者PBMCs中miR-146a的阻断增加了抗病毒细胞因子的产生及GZMB和Perforin的表达,与此同时也降低了程序性细胞死亡因子1（PD-1）、CTLA-4、TIM-3和LAG-3等抑制受体的表达。结论:慢性HIV-1感染者miR-146a表达量的升高抑制了细胞的免疫功能,在一定程度上促进了细胞的耗竭。因此,miR-146a可能被视作一种能够评估艾滋患者细胞免疫功能的潜在预测分子。
李雯[4]（2017）在《HCV对HIV/HCV共感染病情进展的影响分析》文中提出目的探讨HCV对HIV/HCV共感染病情进展的影像分析。方法选取2015年2月2016年12月我院收治的的25例HIV/HCV共染患者、18例HIV单感染患者。对比两组患者外周血T细胞绝对系数、肝脏功能及纤维化系数。结果 HIV/HCV共感染组各项肝功能指标均高于HIV单感染组（P<0.05）,两组肝脏纤维化指标（P>0.05）,HIV/HCV共感染组CD4+T淋巴细胞计数显然低于HIV单感染组（P<0.05）。结论研究显示,HCV对HIV/HCV共感染病情具有一定促进作用,增加患者肝脏损伤及HIV复制,促使患者病情加重,免疫功能受损加重。
杨晓钰[5]（2016）在《庚型肝炎病毒与HIV、HCV相互作蛋白的筛选及E2与LTα蛋白互作验证》文中研究说明庚型肝炎病毒（GB Virus C,GBV-C）属于黄病毒科、Pegivirus病毒属,是一种单股正链RNA病毒,其基因组特征与丙型肝炎病毒较为相似,全长约9.4kb主要编码七种蛋白（E1/E2/NS1/NS2/NS3/NS4/NS5）。GBV-C的传播途径与艾滋病病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）极为相似,主要通过血液传播、性传播和母婴传播,因此GBV-C与HIV和HCV的双重感染以及三重感染普遍存在。临床数据表明,GBV-C本身不致病,但与HIV-1共感染可以延缓HIV患者的疾病进程,其表现为降低了艾滋病患者的病毒载量,提高了其CD4＋细胞数,改善了 HIV患者的生活质量。此外,近期研究表明在丙型肝炎病毒导致的肝硬化患者中,GBV-C的共感染可以延缓肝硬化的疾病进程,同时我们前期的研究也发现在慢性HCV患者中,GBV-C共感染可以改善丙型肝炎患者的肝功能。因此,阐明GBV-C与HIV-1,GBVC与HCV之间的作用机制是该领域的研究热点,其中明确GBV-C与HIV-1和HCV之间相互作用的蛋白又是揭示其相互作用机制的关键。基于此,本论文利用第四代Gold酵母双杂交系统,就GBV-C对HIV-1和HCV相互作用的蛋白进行了初步研究。首先,我们选择云南主要7型GBV-C、CRF08BC型HIV-1和2a型HCV毒株和文库质粒pGAD-T7,利用RT-PCR、产物纯化、酶切、连接、转化等实验技术分别构建了 GBV-C编码的7种蛋白、HIV-1编码的16种蛋白和HCV编码的8种蛋白对应的文库重组质粒。该重组质粒分别经双酶切和测序验证均无移码突变和缺失突变,表明各质粒构建成功。其次,利用酵母毒性和自激活实验对构建成功的上述重组质粒进行了验证,结果表明,除HIV-1的Vpu、gp41存在自激活外,其余质粒均适合利用该酵母双杂交体系进行筛选。再次,利用酵母双杂交体系筛选结果表明,GBV-C与HIV-1互作蛋白为GBV-C E2与LT-α、GBV-C**与 HIV**、GBV-C**与 HIV**、GBV-C**与 HIV**和 GBV-C**与 HIV**;GBV-C与HCV互作蛋白为GBV-C**与**和**与HCV**;GBV-C自身互作蛋白为**与**、**与**、**与**和**与**。最后,分别利用免疫共沉淀技术（Co-JP）和双色荧光免疫法证实了 GBV-C E2蛋白与LT-α蛋白互作,进而利用荧光定量PCR技术证明E2与LT-α的表达呈正相关。综上所述,本研究针对我国主要流行的GBV-C、HIV-1和HCV毒株,利用酵母双杂交系统对GBV-C与HIV-1,GBV-C与HCV和GBV-C自身互作蛋白进行了筛选和初步研究,该结果首次发现GBV-C与HIV-1和HCV直接相互作用的蛋白,为今后深入展开GBV-C与HIV-1和GBV-C与HCV相互作用机制的研究提供了重要依据。
孙焕芹,孙坚萍,刘宁,刘金花,覃岭,韩珍,张永宏[6]（2014）在《HCV/HIV共感染者T细胞表面CD38分子的表达水平》文中认为丙型肝炎病毒（HCV）/人类免疫缺陷病毒（HIV）共感染对丙型病毒性肝炎的病情进展有影响[1-3],其机制尚不清楚。CD38分子是T细胞表面活化标志之一[4,5],在HCV/HIV共感染者中T细胞的活化是否发生变化尚无定论。我们于2012-2013年通过对比分析单独HCV感染组和HCV/HIV共感染组患者T细胞表面CD38分子的表达水平,了解HCV/HIV共感
李凤磊[7]（2013）在《肝脏抗病毒免疫应答及其调控机制》文中研究指明肝脏是一个独特的免疫器官,它含有大量的天然免疫细胞和获得性免疫细胞,并能诱发多种复杂而又精细的免疫反应。肝脏同时也是一个病毒易感性器官,肝脏免疫系统与嗜肝性病毒之间的角逐往往会产生截然不同的结果,比如免疫排斥和免疫耐受。对肝脏抗病毒免疫应答调节机制的研究具有重要的意义,它能加深人们对肝脏免疫学的理解,为病毒相关的肝脏疾病的预防和治疗提供理论依据。研究表明,多种因素的综合作用导致了如此迥异的肝脏抗病毒免疫应答反应,比如共生菌、病毒特性、外周预存免疫等等。肝脏持续接受来自门静脉的肠道回流血,为了保护自身不会因共生菌代谢组分的过度活化而诱导损伤,肝脏免疫系统会表现出免疫耐受的特性。经典的观点认为共生菌维持了肝脏独特的免疫微环境,此微环境会驯化多种肝脏免疫细胞使其具有免疫负调的特性。然而最新的研究表明共生菌还具有更广泛的促进免疫应答的作用,比如诱生淋巴组织、维持粘膜免疫稳态、促进多种细胞亚群的发育分化等。尽管如此,共生菌在肝脏抗病毒免疫应答中的作用依然是未知的。不同病毒入侵肝脏会诱发不同的免疫反应进程。比如甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus, HAV）和腺病毒通常诱导肝脏发生急性的免疫排斥反应,而乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）则通常会诱导肝脏免疫耐受而形成慢性携带。这说明病毒本身具有调节肝脏抗病毒免疫反应的能力,比如HBV慢性感染会诱导自然杀伤细胞（Natural Killer cell, NK cell）的活化程度和杀伤功能降低。这是一个很有趣的话题,对其机制的研究将有助于我们理解病毒调控肝脏免疫的机制,也有可能会为临床治疗带来新的靶标。当外周免疫系统含有病毒特异性的记忆细胞时,机体能够很好的清除入侵肝脏的病毒。利用这一特性,部分肝脏病毒疫苗取得了成功。但是,仍旧有部分免疫功能低下的人群无法形成有效的疫苗应答反应,所以新型免疫佐剂和免疫方案的建立就显得尤为重要。本文主要从以上三个角度对肝脏抗病毒免疫的调节机制进行研究,并取得了以下结果。Ⅰ、共生菌促进肝脏丫6T-17抗病毒免疫应答本研究采用对5-6周龄C57BL/6小鼠饲喂抗生素的方法清除其共生菌群,以嗜肝性腺病毒感染为模型检测其抗病毒免疫变化,并确定起主要作用的细胞和细胞因子,最后又进一步探究了共生菌对此细胞作用的机制。实验中采用流式细胞术（FACS）分析淋巴细胞表型、活化状态及细胞因子分泌,采用定量PCR（Real-time PCR）检测病毒和免疫分子的基因表达,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清中细胞因子的表达,采用冰冻切片观察病毒荧光蛋白表达,采用细胞清除研究特定细胞群体的功能,采用外源细胞因子和刺激剂注射研究其抗病毒功能及作用机制。本研究通过上述方案取得了以下结果：1.共生菌缺失小鼠腺病毒易感性增加共生菌小鼠外周疫苗免疫应答正常,但是感染腺病毒后发现其肝脏病毒基因和病毒蛋白的表达明显高于正常小鼠,说明共生菌缺失导致肝脏腺病毒易感性增加。2.γδT细胞分泌IL-17降低导致共生菌缺失小鼠抗腺病毒能力降低辐射清除小鼠免疫系统后,共生菌群缺失小鼠腺病毒易感性不再增加,表明其病毒易感性与免疫系统相关；共生菌缺失小鼠NK细胞比例和活化不受影响,PK136抗体清除NK/NKT细胞不影响共生菌缺失小鼠肝损伤,说明NK细胞在此模型中不起作用；腺病毒感染5天后共生菌缺失小鼠CTL比例和活化程度低于野生型小鼠；共生菌缺失小鼠肝脏γδT细胞分泌IL-17显着降低,并且其肝脏单个核细胞培养上清中IL-17蛋白和肝脏组织中的IL-17mRNA的表达也降低；而且外源IL-17可以恢复共生菌群缺失小鼠抗病毒能力。3.共生菌诱导成年小鼠肝脏富集γδT-17细胞FACS检测成年小鼠各脏器γδT细胞分泌IL-17的能力,发现其从强到弱顺序如下：肝脏>腹腔>肺脏>脾脏>胸腺>小肠内皮；与其他高表达γδT-17的脏器不同,肝脏γδT细胞表达IL-1R较低,暗示其维持可能不依赖于IL-1信号；成年小鼠肝脏γδT-17细胞及相关分子的表达高于幼龄小鼠,说明成年小鼠肝脏后天富集γδT-17细胞。4.共生菌缺失小鼠γδT-17细胞减少与IL-7和IL-1信号无关给予共生菌缺失小鼠外源IL-7并不能恢复其肝脏γδT细胞分泌IL-17能力；虽然共生菌缺失小鼠Kupffer细胞的IL-1p分泌有所下调,但是体内清除Kupffer细胞后肝脏γδT-17细胞不但没有降低反而有所上调；这些结果说明共生菌不通过经典的IL-7和IL-1信号促进肝脏γδT-17细胞。5.共生菌来源的多种TLR刺激剂促进肝脏γδT细胞分泌IL-17给共生菌缺失小鼠单种TLR刺激剂或Curdlan均不能恢复其肝脏γδT细胞分泌IL-17,但是同时给予TLR2、TLR4和TLR9刺激剂则会显着恢复其IL-17的分泌能力,而且TLR2/4/9三缺陷小鼠γδT-17细胞不受共生菌影响；对应的,单种抗生素处理不能导致小鼠肝脏γδT-17下调,但是任意两种抗生素联合使用均可达到下调肝脏γδT-17的效果。综上,本研究发现共生菌通过促进肝脏γδT细胞分泌IL-17而增强肝脏的抗腺病毒能力。共生菌通过多种TLR信号的联合作用维持肝脏γδT-17细胞,而且此过程不依赖于IL-1和IL-7信号途径。本研究首次发现共生菌可促进肝脏抗病毒免疫应答,并对其中的机制进行了解析,对临床的诊断治疗有一定指导意义。Ⅱ、HBV相关的NK细胞高表达抑制性受体NKG2A的机制本研究采用对5-6周龄C57BL/6小鼠高压注射pAAV/HBV1.2质粒的方法构建HBV携带小鼠以模拟人类HBV慢性感染患者,然后检测其NK细胞表型、功能的变化并对其中的机制进行探究。实验中采用FACS分析淋巴细胞表型及细胞因子分泌,采用细胞转输研究特定细胞群体对NK细胞的调节功能,采用抗体阻断研究特定信号对NK细胞抗病毒功能的影响,采用BrdU掺入法检测淋巴细胞体内增殖,采用细胞体外刺激或共培养检测特定因子对NK细胞表型功能的影响。本研究通过上述方案取得了以下结果：1.HBV携带小鼠NK细胞NKG2A表达增加HBV携带小鼠NK细胞,特别是肝脏NK细胞表面NKG2A表达显着提高,肝脏NKG2A+NK细朐高表达CXCR6可能是其肝脏趋向性的原因之一；HBV携带小鼠自发转阴后其NK细胞NKG2A表达也随之降低,说明NKG2A表达和病毒载量正相关。2. NKG2A抑制HBV携带小鼠NK细胞的抗病毒功能对HBV携带的Rag1-/-小鼠体内注射NKG2A阻断抗体后,其血清HBsAg含量持续降低,而注射同型抗体组则没有如此变化,此结果说明体内阻断NKG2A能够恢复HBV携带小鼠NK细胞的抗病毒能力。3.HBV小鼠CD4+调节性T细胞通过分泌IL-10上调NK细胞NKG2A表达HBV携带小鼠肝脏NKG2A+NK细胞而非NKG2A-NK细胞比对照小鼠摄入更多的BrdU,这说明NKG2A+NK细胞在HBV携带小鼠体内被诱导扩增；体外培养和体内转输实验发现HBV携带小鼠CD4+调节性T细胞能够促进NK细胞上调表达NKG2A,而且此过程依赖于其上调分泌的IL-10；体外诱导实验表明重组人IL-10也可以直接诱导人NK细胞上调表达NKG2A。综上,本研究发现慢性HBV感染会上调肝脏CD4+调节性T细胞分泌IL-10,后者可以直接诱导NK细胞高表达NKG2A从而使肝脏NK细胞抗病毒活性下调,而阻断NKG2A信号可以显着增强NK细胞介导的抗HBV反应。本研究揭示了慢性HBV感染中NK细胞耐受的机制,为乙肝患者的治疗提供了新的靶标。Ⅲ、IL-12促进HBsAg疫苗免疫应答本研究以IL-12为共佐剂对成年C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠进行HBsAg疫苗免疫,并衡量不同IL-12给药方案下的促HBsAg疫苗的效果。实验中采用放射免疫的方法检测小鼠血清HBV相关指标,采用ELISA检测HBsAg特异性抗体亚型,采用ELISPOT检测HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞,采用高压注射pAAV/HBV1.2质粒的方法模拟HBV感染。本研究通过上述方案取得了以下结果：1.确立IL-12和Alum作为HBsAg疫苗联合佐剂的方案传统Alum佐剂比IL-12能诱导更高的anti-HBs产生,而IL-12则比Alum能更好的促进IgG2a型抗体产生,同时使用IL-12和Alum作为HBsAg疫苗共佐剂可以同时获取两者的优点。2.IL-12作为联合佐剂方案的优化IL-12与HBsAg疫苗混合注射而非分开单独注射可有效诱导Thl型极化反应；IL-12的促进作用仅在初次免疫中体现,二次或者三次免疫中重复使用IL-12不能增强其Thl型极化反应；IL-12促进HBsAg疫苗反应具有剂量依赖性。3.IL-12联合HBsAg疫苗免疫小鼠具有更强的抗病毒能力与常规HBsAg疫苗免疫小鼠相比,IL-12联合免疫小鼠在HBV感染后可以更快速的产生高浓度anti-HBs,并更加迅速的降低HBsAg和HBeAg表达,表明其具有更强的抗病毒能力。综上,IL-12作为HBsAg疫苗的新型佐剂可以通过诱发Thl型反应增强机体抗HBV能能力,IL-12最佳的给药方式是在初次免疫中与疫苗混合使用,而且其促进作用具有剂量依赖性。此研究对临床疫苗佐剂的开发和利用有一定的指导意义。
赵月莹[8]（2012）在《白血病NASCT患者CTL克隆细胞的初步研究》文中认为目的恶性肿瘤所致的死亡率中,白血病在男性中居第六位,女性中居第八位,儿童及35岁以下成人中则居第一位。白血病的治疗目前包括放、化疗药物降低瘤负荷获得缓解；移植和免疫治疗。CTL （Cytotoxic T cell, CTL）细胞目前在血液临床方面主要应用于外周血干细胞移植和其他过继免疫治疗中。根据移植物的来源不同移植分为自体移植和同型异体移植。自体外周血干细胞移植（Auto-HSCT）无GVHD,移植后生活质量较高,但因无GVLE （graft-versus gost effect,GVLE）,易复发。自体外周血干细胞移植主要靠自身CTL细胞杀灭肿瘤细胞。如果在移植后辅助性输注一定量的自身体外诱导的白血病抗原特异性的CTL细胞,复发问题可能会在一定程度上得以解决。或自体移植的基础上输入一定量的供者来源的白血病细胞特异性的CTL细胞,增加GVLE,在某种程度上可能会改变自体移植的效果。异基因造血干细胞移植（Allogeneic stern cell transplantion, Allo-SCT）,由于存在GVLE,使得一些患者能够得以长期生存,然而伴随而来的移植物抗宿主病（Graft versus host disease,GVHD）-.严重感染,植入失败,造血重建延迟等相关并发症成为移植成功的巨大障碍。CTL细胞是GVHD及GVLE的效应细胞,也是预防移植后感染、促进植入和造血重建的重要免疫细胞。供者淋巴细胞输注（Donor lymphocyte transfusions, DLT）能诱导出GVLE消除白血病复发,CTL细胞是它的主要效应细胞。DLI在受者体内也会产生多种移植相关并发症,如何得到最佳疗效,使DLI得到更好的应用,是现在临床面临的一大课题。ALL细胞表面缺乏淋巴细胞功能性抗原（LFA-1）,ALL对NK的治疗效果差,CTL细胞似乎成了除了药物唯一能针对ALL肿瘤的效应细胞了。CTL细胞在免疫治疗思想及技术路线上已经展示出了它的重要性。临床上发现,植入是否成功以及GVHD的严重程度与移植后供、受体T细胞比例显着相关。异基因干细胞移植即便是完全供者型,也并没有彻底去除受者的效应细胞及记忆细胞,找出针对自身肿瘤细胞的受者的CTL克隆,发挥RVLE （Recepient-versus leukemi effect, RVTE）,在排斥及RVLE之间找到最佳平衡点,不仅能发挥自身识别肿瘤的免疫清除功能,而且协同供者成分发挥杀瘤效应,同时有助于了解代替免疫与过继免疫的理念,分析临床上见到的一些患者移植失败后并无疾病复发获得长时间生存,而一些患者在完全供者嵌合（FDC）状态下出现原疾病复发的原因。Wilms tumor antigen-1（WT1）过度表达在70%-90%的ALL病人中,而这样的病人有着高的复发率。体外及小鼠研究中的证实,WT1是一个有意义且广泛表达的白血病抗原靶标。髓性白血病和健康供者中有WTl特异性的T细胞,说明WTl的表达很容易诱导出T细胞反应。WT1特异性的CD8+的T细胞和白血病肿瘤负荷减轻密切相关。高度纯化CD8+T细胞混合骨髓移植会产生高GVL效应低的致死性GVHD已得到证实。如果能够培养分离出具备高度选择性杀伤白血病细胞的CTL克隆,对正常细胞无明显作用,无GVHD,无排斥,宿主完全耐受,扩增率高并能在体内增殖,具有强大的细胞毒性及白血病细胞清除能力,那么分离GVHD与GVL即将成为可能,改善自体移植效果成为可能,增进过继免疫治疗成为可能。那么如何在体外得到高度纯化的抗原特异性CTL细胞?这就是本实验的主要研究目标：拟在体外分离培养CD8+WT1特异性的CTL细胞克隆,并从多方位鉴定其功能特性及其来源,为进一步的研究及应用打下坚实的基础。方法一、体外DC培养树突状细胞（dendritic cell, DC）主要的功能就是特异性抗原提呈。成熟DC加工处理抗原肽-MHC-1复合物,并提呈给T细胞。DC传统培养方法大致需要4-10天,前几天为诱导分化期,最后一天为诱导成熟期。DC成熟所需时间太长,与体外CTL培养不能同步。我们改进了DC培养为2天诱导成熟法。与传统培养法及7天培养法方法比较：（1）利用四色流式细胞技术进行表型分析。（2）利用倒置显微镜及瑞-吉染色行形态观察。（3）通过HLA-A*0201同型的Tc细胞对WT1/HLA-A*0201阳性肿瘤细胞NB4的杀伤率来评价DC的提呈功能。二、健康供者CTL细胞单个克隆培养（1）免疫磁珠分选CD56-CD8+细胞：HLA-A*0201健康供者外周血单个核细胞（PBMNC）行免疫磁珠去CD56+的细胞（NK）细胞,再行CD8阳选,PHA/WTI肽间段性刺激下行体外扩增。（2）流式细胞分选：以CD19-细胞群中设门,WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞为目的CTL细胞,收集。（3）饲养细胞的制备：三人份非HLA-A*0201阳性的健康供者PBMNC进行γ-射线50Gy照射,制备成饲养细胞。（4）CTL细胞克隆制备：所分选的目的细胞行有限稀释法制备单个克隆,按比例与抗原负载的DC及饲养细胞混合后体外扩增培养。（5）CTL克隆细胞表型鉴定：流式检测CD45RA/CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a分子的表达率。（6）CTL克隆胞内分子检测：流式检测胞浆毒性颗粒GranzymeB、Perforin的阳性率。（7）分泌功能检测：CBA法检测IL-2、IL-4、1L-6、IL-10、TNF-α、IFN-y、IL-17在CTL细胞培养上清的浓度。（8）细胞毒性的检测：克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗杀伤率来鉴定其细胞毒功能。三、白血病NASCT患者外周血来源的CTL单个克隆培养（1）体外刺激扩增：加用刺激因子与WT1肽进行体外特异性Tc细胞诱导扩增。（2）扩增后的Tc细胞流式分选：CD3+CD19-细胞群设门,WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞分选后收集（CTL细胞）。（3）三人份非HLA-A*0201阳性的健康供者外周血单个核细胞进行Y-射线50Gy照射,制备成饲养细胞。（4）有限稀释法制备克隆细胞,按比例混合抗原负载的DC及饲养细胞体外扩增培养。（5）流式检测克隆表型分子CD45RA/CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a的表达率。（6）CTL克隆细胞胞浆毒性颗粒GranzymeB、Perforin的阳性率检测。（7）CBA法检测克隆细胞分泌的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17的浓度。（8）克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗杀伤率的检测来鉴定其功能（CFSE/PI双标法）。四、白血病NASCT患者与健康供者体外培养CTL克隆的比较研究利用上述方法体外平行培养两类不同来源的CTL克隆,进行表型、毒性颗粒、分泌及杀伤功能鉴定。五、CTL克隆细胞来源与功能的镜下研究（一）性别染色体荧光原位杂交（FISH）区别CTL克隆的来源选用5例供受者性别差异的白血病移植后患者体外CTL克隆细胞进行性别探针杂交,荧光显微镜下观察杂交信号,根据x,Y染色体的不同信号来鉴定克隆来源。（二）激光共聚焦扫描镜下观察CTL克隆的形态与功能选取受者为HLA-A*0201阳性、供者非HLA-A*0201阳性的白血病HLA半相合NASCT后患者体外培养WTl特异性CTL克隆细胞,WT1/HLA-A*0201/Pentamer-PE标记CTL细胞,PKH26标记DC, CFSE标记靶细胞NB4（WT1及HLA-A*0201双阳性的人急性早幼粒细胞白血病瘤株）,共同孵育2h,镜下观察形态与功能。（三）扫描电镜观察克隆细胞细微结构与功能白血病移植后患者WT1阳性的CTL克隆细胞体外培养4-6周后,收集细胞并依次与DC及NB4细胞以一定比例混合培养2h后,收集处理细胞,镜下观察克隆细胞的功能。六、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆蛋白表达差异分别选取三份健康人及白血病患者移植后体外扩增培养6周后的CTL克隆细胞,收集细胞裂解、提取蛋白、测浓度、双项电泳、染色、扫锚、图像分析。建立蛋白差异谱,确定差异蛋白,酶切,质谱分析。健康人外周淋巴细胞及白血病移植后外周血未培养的淋巴细胞做为基础蛋白差异谱对照,生物信息检索分析找出反应蛋白。结果一、体外树突状细胞培养1、3种方法培养的未成熟及成熟DC在形态上无差别；2、3种培养法未成熟DC表型存生明显差异：传统培养法CD1a,CD86（P<0.01）,CD83,HLA-DR（P<0.05）的表达均明显高于2天法；传统培养法CD1a（P<0.01）的阳性表达率明显高于7天法；7天培养法CD83,HLA-DR（P<0.05）的表达明显高于2天法；7d法的CD83（P<0.05）明显高于传统法；成熟DC表型差异：2天培养法与7天培养法无差异；2天培养法CDla,CDllc,CD80,HLA-DR的表达明显高于传统培养法（P<0.05）；7天培养法CD80,CD83的表达明显高于传统培养法（P<0.05）；3、3种培养法成熟DC的抗原活性：2天及7天培养法DC辅助Tc对靶细胞的杀伤率（75.8±7.1）%,（74.6±3.2）%明显高于传统法（65.2±1.3）%（P<0.01）。二、健康供者CTL克隆细胞培养与鉴定1、表型：CD3+CD8+的细胞占（98.7±0.2）%,CD27占（62.3±10.0）%,CD28占（71.9±7.9）%；CD107a占（49.0±11.0）%,CD45RA占（65.1±8.4）%,CD45RO占（34.3±±4.2）%,CCR7占（18.1±5.2）%。2、胞内毒性颗粒表达率：颗粒酶B：（43.9±7.4）%,穿孔素：（32.7±6.8）%。3、CTL克隆亚群比例：CD45RA+CD27+CCR7+细胞群占（9.0±2.0）%；CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+的细胞群占（13.0±2.4）%；CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-细胞群占（26.1±±5.9）%；CD45RA+CD27+/-CD28+/-占（61.3±7.9）%。4、五聚体检测：WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在（76±3.9）%。5、分泌功能（pg/ml）：IL-2浓度为（2129.5±±414.7）、IL-4（17.5±9.1）、IL-6（21.6±9.7）、IL-10（24.8±8.6）、TNF-α（40.8±21.5）、IFN-γ（102.3±61.0）、IL-17（18.5±8.6）。6、对NB4的杀伤率（89.7±7.6）%明显高于对U937和K562杀伤率（19.0±4.3）%,（19.7±5.2）%,P<0.05。对白血病原始瘤苗AML和ALL的杀伤率（54.0±16.6）%,（56.5±12.4）%,无差别P>0.05。三、白血病NASCT患者CTL克隆细胞的培养与鉴定1、表型：CD3+CD8+的细胞占（98.6±0.5）%,CD27占（66.3±8.1）%,CD28占（70.1±7.8）%；CD107a占（51.4±7.7）%,CD45RA占（65.7±6.3）%,CD45RO占（33.9.1±4.5）%,CCR7（17.1±2.7）%。2、胞内毒性颗粒表达率：颗粒酶B：（40.6±9）%,穿孔素（30.9±6.2）%。3、克隆亚群比例：CD45RA+CD27+CCR7+占（12.6±3.2）%CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+占（17±4.6）%；CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-占（19.5±3.6）%；CD45RA+CD27+/-CD28+/-占（62.1±7.4）%。4、五聚体检测：WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在（70.2±8.5）%。5、分泌功能：IL-2（2365.0±246.1）%、IL-4（40.5±8.3）%、IL-6（1705.3.6±416.2）%、IL-10（63.2±22.2）、TNF-α（121.3±35.3）%、IFN-γ（219.5.3±65.1）%、IL-17（14.5±5.0）%。6、对NB4的杀伤率（84.5±5.1）%明显高于对U937和K562杀伤率（21.5±5.5）%,（22.3±6.5）%,P<0.05。对白血病原始瘤苗AML和的杀伤率（66.4±7.6）%明显高于对ALL的杀伤率（58.6±5.6）%,P<0.05。四、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆比较两者表型无差异：毒性颗粒表达率无差异；患者分泌的细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ明显高于健康供者（P<0.01）,IL-17无差别（P>0.05）；细胞毒功能未发现明显差别。五、白血病NASCT患者CTL克隆来源与功能研究1、FISH发现了白血病NASCT患者体外培养CTL克隆中有受体的CTL细胞；2、LMST发现白血病NASCT后受者的CTL细胞并直接观察到其细胞毒性。2、高分辨扫锚电镜下观察,发现培养的CTL克隆细胞呈典型T细胞形态,与DC细胞间有丝状物交通联络,并杀伤溶解靶细胞的功能。六、两类单克隆CTL细胞蛋白表达差异1、NASCT患者与健康供者外周血未培养的淋巴细胞蛋白差异点有30个,鉴定出13个功能明确的蛋白。2、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆细胞差异蛋白点44个,鉴定出25个功能蛋白,明显上调的18个,下调的12个,4个为未命名蛋白。3、白血病及移植相关的共同反应蛋白有4个,分别为Coactosin-like protein、Septin-1]、 Purine nucleoside phosphorylase, GATA3。结论（1）2天诱导成熟的DC形态功能都达到功能DC的标准,这种培养方法是成功的。（2）健康人与白血病患者体外CTL单个克隆培养方法是成功的、在体外能有效扩增（单个细胞扩增到1-5×107个细胞）,扩增成功率为78%。经一系列鉴定,培养的克隆细胞表型、功能均为功能性CTL细胞。（3）培养的CTL克隆细胞亚群包括一定比例的记忆细胞表型,说明克隆细胞是由一个细胞分化增殖形成不同阶段的细胞亚群组成。（4）白血病NASCT患者来源的CTL克隆分泌功能明显比健康供者的CTL克隆旺盛。（5）免疫磁珠分选结合五聚体流式分选可以得到高纯度的CD8+的CTL细胞,可以做为单个克隆培养的备用细胞。（6）HLA限制性肽特异性的五聚体与FISH相互补充,可以鉴定一部分NASCT患者CTL克隆的来源。（7）健康供者与白血病NASCT患者之间的PBMNC及CTL克隆在蛋白表达上存生着明显差异。
曹孟丽[9]（2012）在《HIV-1单纯及合并HCV感染对HIV-1特异性细胞免疫应答的影响》文中认为人类免疫缺陷病毒1型（Human Immunodeficiency Virus Type1，HIV-1）与丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）合并感染的临床治疗和相关致病机制研究是目前临床面临的难题和研究热点。由于HIV-1和HCV的传播途径相同，均通过血液及血液制品、性途径、母婴途径传播，HIV-1/HCV合并感染的现象非常普遍。随着高效抗逆转录病毒治疗（Highly Active Anti-RetroviralTherapy,HAART）在艾滋病中的广泛和规范应用，机会性感染的发病率和死亡率都已显着下降，而合并HCV感染所致的肝损害已经成为艾滋病患者死亡的主要原因之一；抗HCV治疗的低有效率和HAART治疗中不良反应的增加；中国国内流行的HCV基因型及准种复杂而又难治，这些都使得对HIV-1/HCV合并感染者的治疗更加棘手。但究其原因，至今并不完全明了，很有必要从病毒学和免疫学角度对HIV-1/HCV合并感染者进行深入研究。既往很多研究已证实细胞因子在HIV-1感染疾病进展过程中发挥了重要的作用，有研究表明：在HIV-1感染过程中IL-4可抑制体内的病毒水平，IL-7对维持淋巴细胞的存活发挥了重要的作用，IL-17可能参与HIV-1病毒的免疫反应，IL-21可以促使CD8+T细胞增殖及保持活性，IFN-γ是机体免疫系统抵抗病毒感染的重要细胞因子之一。我们推测合并HCV感染会对HIV-1感染者上述细胞因子产生影响，而有关HCV合并感染对HIV-1感染者上述细胞因子的影响阐述得并不多，所以有必要对HCV合并感染对HIV-1感染者上述细胞因子的分泌状况展开研究。既往有关HIV-1感染和HCV感染的特异性细胞免疫应答的研究，结果均提示特异性CTL反应对HIV-1感染和HCV感染的控制均具有重要作用，国内外也有少部分关于HIV-1/HCV合并感染者的特异性细胞免疫应答的研究报道。但由于地域和种族的差异，有必要对华南地区HIV-1/HCV合并感染者的特异性细胞免疫应答进行研究。前期我们用ELISPOT方法检测HIV-1感染者的CD8+T细胞对HIV-1合成表位的免疫主导应答发现：HIV-1Gag区域肽段诱导产生的CD8+T细胞的IFNγ分泌细胞频率最高。故我们选用HIV-1P24区域（Gag133191）的氨基酸序列人工合成的12个重叠肽段组成的肽段库作为特异性肽段表位，对HIV-1/HCV合并感染者和HIV-1感染者的HIV-1特异性CTL应答进行研究。实验一HIV-1单纯及合并HCV感染的CD4+T细胞、CD8+T细胞及PBMC内IL-7、IL-21、IFN-γmRNA水平测定实验对象：以中国华南地区的已HAART治疗的25例HIV-1单纯感染和22例HIV-1/HCV合并感染者，及20例健康对照者为研究对象。实验方法：分别采用免疫磁珠分选技术、实时荧光定量PCR方法，以上述HIV-1P24区域重叠肽段库作为HIV-1特异性肽段表位，刺激从上述三组研究对象的外周血单个核细胞（PBMC）分选出的CD4+T淋巴细胞，CD8+T淋巴细胞，分别检测CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及PBMC在刺激前后IL-7、IL-21、IFN-γ，β-actin的mRNA水平，统计IL-7、IL-21、IFN-γ与β-actin的比值，并用单因素方差分析方法进行统计分析。实验结果：已接受HAART治疗的HIV-1单纯感染组和HIV-1/HCV合并感染组及健康对照组细胞内IFN-γ、IL-7、IL-21的mRNA水平比较P24抗原表位刺激培养后，HIV-1单纯感染组CD8+T细胞的IFN-γ mRNA水平明显高于CD4+T细胞（P<0.05）。无论有无P24特异性抗原表位刺激，健康对照组PBMC中IFN-γ的mRNA水平均明显高于HIV-1单纯感染组和HIV-1/HCV合并感染组（P<0.05）； P24抗原表位刺激后，HIV-1/HCV合并感染组PBMC中IL-7mRNA水平明显高于HIV-1单纯感染组（P<0.05）；无论有无P24特异性抗原表位刺激，各组PBMC中IL-21mRNA水平相比均无明显差异（P>0.05）。实验二ICS检测HIV-1单纯及合并HCV感染者分泌IL-4，IL-17A，IL-21，IL-21R，IFN-γ的CD3+T淋巴细胞比例实验对象：以未HAART治疗的24例HIV-1单纯感染者和21例HIV-1/HCV合并感染者，及20例健康对照组为研究对象。实验方法：采用细胞内细胞因子染色法（intra-cellular CK staining，ICS），以上述HIV-1P24区域重叠肽段库作为特异性肽段表位，刺激上述研究对象的PBMC，检测使用与未使用P24抗原表位刺激后细胞内分泌IL-4、IL-17A、IL-21、IL-21R、IFN-γ的CD3+T淋巴细胞比例，并用单因素方差分析方法进行统计分析。实验结果：未接受HAART治疗的HIV-1单纯感染组和HIV-1/HCV合并感染组及健康对照组细胞内分泌IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-21、IL-21R的T淋巴细胞比例比较比较使用与未使用P24抗原表位刺激后的结果显示，三组T淋巴细胞内的分泌IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-21、IL-21R的比例变化不显着（P>0.05）。在无P24抗原表位刺激培养后，HIV-1单纯感染组的CD3+IL-4+/T淋巴细胞明显高于健康对照组（P<0.05），HIV-1/HCV合并感染组CD3+IL-4+/T淋巴细胞也高于健康对照组，但差异不显着（P>0.05）；而在P24抗原表位刺激培养后，三组CD3+IL4+/T淋巴细胞差异不显着（P>0.05）。无论有无P24抗原表位刺激培养，HIV-1单纯感染组CD3+IL17-A+/T淋巴细胞>HIV-1/HCV合并感染组>健康对照组，且HIV-1单纯感染组明显高于其他两组（P<0.05）； HIV-1单纯感染组CD3+IFN-γ+/T淋巴细胞> HIV-1/HCV合并感染组>健康对照组，三组差异不显着（P>0.05）；三组CD3+IL-21+/T淋巴细胞差异不显着（P>0.05）；HIV-1单纯感染组CD3+IL-21R+/T淋巴细胞比例>健康对照组> HIV-1/HCV合并感染组，HIV-1单纯感染组明显高于其他两组（P<0.001）。实验三ELISPOT检测HIV-1单纯及合并HCV感染的HIV-1特异性细胞免疫应答实验对象：以上述实验一和实验二中的单纯感染者和合并感染者为研究对象。实验方法：采用酶联免疫斑点吸附技术（enzyme-linked immunosorbent spot，ELISPOT），以上述HIV-1P24区域重叠肽段库作为特异性肽段表位，分别检测研究对象PBMC中HIV-1特异性CTL应答频数，并用卡方检验方法进行统计分析。分析合并HCV感染对HIV-1感染细胞免疫的影响，HAART对HIV-1感染细胞免疫的影响。实验结果：HIV-1单纯感染组和HIV-1/HCV合并感染组HIV-1特异性CTL应答比较已接受HAART治疗HIV-1单纯感染组HIV-1特异性细胞免疫应答率（13/25）明显高于HIV-1/HCV合并感染组（5/22）（P<0.05）；未接受HAART治疗HIV-1单纯感染组HIV-1特异性细胞免疫应答率（8/22）高于HIV-1/HCV合并感染组（6/21），但差异不显着（P>0.05）；已治疗单纯感染组的HIV-1特异性细胞免疫应答率（13/25）高于未治疗单纯感染组（8/22），但差异不显着（P>0.05）；已治疗合并感染组HIV-1特异性细胞免疫应答率（5/22）与未治疗合并感染组（6/21）的相比无明显差异（P>0.05）。结论：1.合并HCV感染可能使HIV-1感染者HIV-1特异性细胞免疫应答水平下降，这可能是HIV-1/HCV合并感染者HAART治疗疗效差的原因之一。2.细胞因子IL-7、IL-17、IL-21R在HIV-1特异性细胞免疫中发挥重要作用。HIV-1感染还可以通过Th17和Tfh途径影响感染者的细胞免疫，而HCV合并感染会对此产生干扰；IL-7在HIV-1/HCV合并感染者的细胞免疫中起重要作用。
屈静[10]（2011）在《人Ⅰ型免疫缺陷病毒Rev蛋白促进丙型肝炎病毒翻译的分子机制研究》文中认为在全世界范围内,大约有1.8亿人感染丙型肝炎病毒（HCV）,大约有4千万人感染人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV-1）。由于具有相同的感染途径,大约有4-5百万人共感染这两种病毒。HCV感染被认为是HIV-1感染病人的高发病率和高死亡率的重要原因。有研究报道HIV-1感染可能增强HCV的复制,因为共感染患者的HCV RNA水平显着增加,而且HIV-1的血清转化伴随着持续的HCV病毒载量的增加。共感染这两种病毒的病人与HCV单感染的病人相比具有更严重的肝疾病并伴随着更快的纤维化进程。然而,HIV-1与HCV之间能够增加HCV的持续性和加速肝纤维化的相互作用的机制还不清楚。在本论文中研究了HIV-1对HCV基因表达的影响,通过共转染的方法将HIV-1的感染性克隆质粒和HCV带有海参荧光报告基因的全长复制子RNA一起转染到细胞中,通过检测海参荧光素酶活性,我们发现HIM-1能够增强HCV基因的表达。然后我们筛选了能够增强HCV表达的HIV-1的单个基因。我们将HIV-1的各个基因的RNA与HCV全长复制子RNA共转染到细胞中,我们发现HIV-1的Rev基因能够有效增强HCV基因的表达。为了证明Rev增强HCV基因表达的特异性,我们构建了两个功能突变的Rev基因,并通过共转染实验证明了突变的Rev不能增强HCV基因的表达。为了研究Rev上调HCV基因表达的机制,我们研究了Rev是否能与HCV的RNA结合。通过蛋白与RNA体内免疫共沉淀实验,证实了Rev确实能够与HCV的RNA结合。我们通过电泳迁移率变动实验（EMSA）,证明了Rev蛋白能够直接与HCV5’-UTR RNA结合,并且在Rev蛋白上的结合位点位于其精氨酸富集的41-44位区域。为了探明Rev蛋白在HCV5’-UTRRNA上的结合位点,我们构建了HCV5’-UTRRNA的一系列突变并且分析了野生型和这些突变与Rev蛋白相互作用的关系。通过EMSA结果表明Rev蛋白能够直接与HCV5’-UTRRNA上的Ⅲb内部环结构结合。本论文还研究了Rev在HCV IRES介导的翻译中的功能。首先我们构建了一系列的HCV RNA单顺反子报告因子,结果发现Rev能够特异性的刺激HCVIRES介导的翻译。因为我们已经证明了Rev能够直接地与HCV5’-UTRRNA上的Ⅲb内部环结合。为了探明Rev调控HCV IRES介导的翻译的机制,我们构建了两个Ⅲb内部环结构突变的HCV RNA单顺反子报告因子,实验结果表明Rev刺激HCV IRES介导的翻译依赖于一个完整的Ⅲb内部环结构。因此,我们得出这样一个结论,Rev通过与HCV5’-UTR RNA相结合增强了HCV IRES介导的翻译。这些研究结果为HIV-1在HCV感染中所起的作用提供了证据,并揭示了两种病毒共感染过程中HIV-1调控HCV基因表达的机制。
二、HIV/HCV共感染患者病毒特异性CTL细胞定量研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HIV/HCV共感染患者病毒特异性CTL细胞定量研究（论文提纲范文）
（1）cART联合雷公藤治疗对HIV急性期感染者病毒储存库、慢性期感染者免疫重建的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 研究对象、材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 材料 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 耗材 |
| 2.3 仪器设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 全血及分离外周血PBMC的冷冻和保存 |
| 3.2 复苏PBMCs |
| 3.3 全血、PBMCs中HIV-1 DNA提取 |
| 3.4 HIV-1 DNA的检测和换算 |
| 3.5 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 3.6 HIV肽段库预混 |
| 3.7 ELISPOT检测IFN-γ |
| 3.8 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分: 全血与PBMCs中HIV-1 DNA检测结果的一致性研究 |
| 1 入组患者基本特征 |
| 2 全血和PBMCs样本中总HIV-1 DNA高度相关,两组平均值之间无差异 |
| 3 全血和PBMCs样本中总HIV-1 DNA水平的一致性 |
| 第二部分: cART联合雷公藤对HIV急性期感染者HIV-1 DNA的影响 |
| 1 入组患者基本特征 |
| 2 急性期HIV-1感染者使用不同治疗方式对HIV-1 RNA的影响 |
| 3 急性期HIV-1感染者使用不同治疗方式对CD4+T和CD8+T细胞的影响 |
| 4 急性期HIV-1感染者使用不同治疗方式对细胞免疫激活和CD4/CD8的影 |
| 5 急性期HIV-1感染者使用不同治疗方式对HIV-1 DNA的影响 |
| 6 急性期HIV-1感染者使用不同治疗方式对IFN-γ的影响 |
| 第三部分: cART联合雷公藤对HIV慢性期感染者免疫重建的影响 |
| 1 患者基线特征 |
| 2 加用雷公藤患者CD4+T各亚群细胞计数变化 |
| 3 加用雷公藤多苷片患者CD8+T细胞、CD4/CD8比例和细胞免疫激活的变化 |
| 4 雷公藤干预后CD4+T细胞增长有效性的独立影响因素 |
| 5 雷公藤干预前后测序分析 |
| 讨论 |
| 第一部分：对比分析全血与PBMCs两种类型样本所提取核酸并定量检测的总HIV-1 DNA水平 |
| 第二部分：急性期HIV感染者联合雷公藤治疗对外周血HIV-1 DNA储存库的影响 |
| 第三部分:慢性期HIV-1感染者联合雷公藤治疗对免疫重建不全作用的影响 |
| 研究的不足 |
| 本研究的创新性和临床应用价值 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 cART及其治疗时机对HIV特异性T细胞免疫应答的影响 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（2）MSM人群HIV+/AIDS进程影响因素及梨支原体共感染的流行病学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词中英文对照 |
| 前言 |
| 第一章 江苏省MSM人群HIV+/AIDS进程及影响因素 |
| 1.1 研究对象与方法 |
| 1.1.1 研究对象与资料 |
| 1.1.2 数据调查时间 |
| 1.1.3 数据调查地点及方式 |
| 1.1.4 研究对象纳入和排除标准 |
| 1.1.5 研究结局及定义 |
| 1.1.6 影响因素及其测量 |
| 1.1.7 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 数据筛选的基本情况 |
| 1.2.2 接受抗病毒治疗的MSM人群社会人口学情况 |
| 1.2.3 抗病毒治疗MSM人群的生存分析 |
| 1.2.4 不同疾病状态的相关因素分析 |
| 1.2.5 不同抗病毒治疗标准的MSM人群疾病状态的影响因素分析 |
| 1.2.6 线性混合效应模型分析艾滋病病程发展的影响因素 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 MSM人群HIV+/AIDS进程相关的社会行为因素研究 |
| 2.1 研究对象与方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 调查方法与内容 |
| 2.1.3 研究结局及定义 |
| 2.1.4 伦理学原则 |
| 2.1.5 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 研究对象基本特征及艾滋病相关信息 |
| 2.2.2 研究对象艾滋病知识知晓率情况 |
| 2.2.3 研究对象的社会网络成员的基本特征 |
| 2.2.4 HIV感染疾病进程的相关因素分析 |
| 2.2.5 疾病告知情况及影响因素分析 |
| 2.2.6 同性性行为告知情况及影响因素分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 梨支原体、HIV感染对免疫功能相关基因表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及细胞来源 |
| 3.1.2 主要仪器设备及试剂 |
| 3.1.3 液体SP-4培养基配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 梨支原体复苏和培养 |
| 3.2.2 梨支原体脂质相关膜蛋白(LAMPs)的提取 |
| 3.2.3 BCA测定蛋白浓度 |
| 3.2.4 THP-1细胞培养 |
| 3.2.5 外周血提取PBMC |
| 3.2.6 LAMPs刺激细胞最佳时间和最佳剂量的确定 |
| 3.2.7 LAMPs刺激PBMC |
| 3.2.8 细胞总RNA提取与检测 |
| 3.2.9 RT-qPCR检测 |
| 3.2.10 RNA-seq文库构建 |
| 3.2.11 上机测序 |
| 3.2.12 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 qPCR确定LAMPs刺激细胞的最佳时间和最佳浓度 |
| 3.3.2 RNA-seq测序的样本质量评估 |
| 3.3.3 测序数据质控结果 |
| 3.3.4 比对分析 |
| 3.3.5 基因表达分布 |
| 3.3.6 各样本间相关性分析及主成分分析 |
| 3.3.7 差异基因与富集分析 |
| 3.3.7.1 Mpi感染组与正常组(NPvsNC)的差异基因表达及富集分析 |
| 3.3.7.2 HIV感染组与正常组的(DC vs NC)差异基因与富集分析 |
| 3.3.7.3 Mpi与HIV共感染组与正常组(DP vs NC)差异基因与富集分析 |
| 3.3.7.4 Mpi与HIV共感染组和HIV感染组(DPvsDC)差异基因与富集分析 |
| 3.3.7.5 Mpi与HIV共感染组和Mpi组(DPvsNP)差异基因与富集分析 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）MicroRNA-146a在HIV-1慢性感染中与耗竭标志物相关性及其抑制细胞免疫功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 1.1 HIV-1 与获得性免疫缺陷病 |
| 1.1.1 人类免疫缺陷病毒简介 |
| 1.1.2 人类免疫缺陷病毒的基因组结构 |
| 1.1.3 人类免疫缺陷病毒的传播 |
| 1.1.4 人类免疫缺陷病毒的发病机制 |
| 1.1.5 HIV致病性的特征 |
| 1.1.6 HIV感染过程中伴随的机会性感染 |
| 1.2 miR-146a |
| 1.2.1 miRNA的简介 |
| 1.2.2 miRNA的生成过程 |
| 1.2.3 miRNA特性 |
| 1.2.4 miRNA与 PD-1/PD-L1 通路 |
| 1.2.5 miR-146a感染与HIV-1 感染 |
| 1.3 HIV感染中的免疫耗竭 |
| 1.3.1 免疫耗竭 |
| 1.3.2 耗竭的特征 |
| 1.3.3 耗竭状态和影响因素 |
| 1.3.4 抑制受体 |
| 1.3.5 耗竭和HIV感染 |
| 1.3.6 耗竭状态的逆转 |
| 2.实验材料和实验方法 |
| 2.1 仪器设备 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞培养和细胞转染所需材料 |
| 2.2.2 逆转录聚合酶链反应和qPCR试剂 |
| 2.2.3 蛋白印迹试剂和抗体 |
| 2.2.4 ELISA检测 |
| 2.2.5 其他试剂 |
| 2.2.6 试剂配制及储存 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 制备感受态细胞 |
| 2.3.2 转染 |
| 2.3.3 HIV-1 病毒扩增及滴度测定 |
| 2.3.4 RNA提取 |
| 2.3.5 RNA逆转录 |
| 2.3.6 Real-time PCR反应 |
| 2.3.7 单核细胞分离 |
| 2.3.8 CD8+T 细胞的分离 |
| 2.3.9 巨噬细胞培养 |
| 2.3.10 HIV-1 病毒感染Jurkat细胞 |
| 2.3.11 免疫印迹实验(以12 孔板为例) |
| 2.3.12 酶联免疫吸附实验(以IL-2 为例) |
| 2.3.13 统计学分析及图形绘制 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 慢性HIV-1 患者的PBMCs呈现出耗竭状态 |
| 3.2 miR-146a在慢性HIV患者的PBMCs中高表达且与免疫耗竭相关 |
| 3.3 miR-146a抑制CD8+T 细胞抗病毒细胞因子的分泌并抑制其细胞毒功能 |
| 3.4 HIV感染能持续诱导miR-146a的表达 |
| 3.5 细胞活化能诱导miR-146a的上调 |
| 3.6 体外miR-146a的阻断能回复慢性HIV感染者的PBMCs的免疫功能 |
| 3.7 Fos在慢性HIV患者体内表达低且与miR-146a有关 |
| 3.8 HIV-1 感染者的机会性感染模式 |
| 4.讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 已发表论文 |
| 致谢 |
（4）HCV对HIV/HCV共感染病情进展的影响分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对比两组肝功能指标 |
| 2.2 对比两组肝脏纤维化指标 |
| 2.3 两组CD4+T淋巴细胞计数比较 |
| 3 讨论 |
（5）庚型肝炎病毒与HIV、HCV相互作蛋白的筛选及E2与LTα蛋白互作验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 庚型肝炎病毒 |
| 1.2 庚型肝炎病毒的分子生物学 |
| 1.2.1 庚型肝炎病毒结构 |
| 1.2.2 庚型肝炎病毒基因结构 |
| 1.3 人类免疫缺陷病毒的分子生物学 |
| 1.3.1 人类免疫缺陷病毒的结构 |
| 1.4 丙型肝炎病毒的分子生物学 |
| 1.4.1 丙型肝炎病毒的结构 |
| 1.5 GBV-C、HIV与HCV的传播 |
| 1.5.1 GBV-C、HIV与HCV的传播途径 |
| 1.5.2 GBV-C、HIV与HCV的血液传播 |
| 1.5.3 GBV-C、HIV与HCV的性传播 |
| 1.5.4 GBV-C、HIV与HCV的母婴传播 |
| 1.6 GBV-C研究意义 |
| 1.6.1 GBV-C研究现状 |
| 1.6.2 GBV-C对HIV-1相互作用机制研究现状 |
| 1.6.3 GBV-C对HCV的临床意义 |
| 1.7 蛋白质相互作用研究方法 |
| 1.7.1 验证蛋白质之间相互作用实验的方法 |
| 1.7.2 数据库比对以及计算机分析预测蛋白质的相互作用 |
| 1.8 本研究的主要目的 |
| 1.9 技术路线图 |
| 第二章 HIV-1、HCV (J6/JFH-1-6u)及GBV-C-7文库质粒的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和毒株 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基及其他缓冲液的配制 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血清中HIV病毒总RNA提取 |
| 2.2.2 目的片段的克隆 |
| 2.2.3 目的基因与载体的双酶切 |
| 2.2.4 目的片段与载体连接 |
| 2.2.5 目的片段的连接与转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取及双酶切验证 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组质粒的双酶切验证及测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 构建文库所用毒株选择 |
| 2.4.2 文库片段划分 |
| 2.4.3 酵母双杂交文库构建方法选择 |
| 2.4.4 展望 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 酵母双杂交筛选与GBV-C诱饵相互作用的HIV-1、HCV及GBV-C 蛋白 |
| 3.1 试剂与材料 |
| 3.1.1 菌株及载体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 酵母的复苏及感受态的制备 |
| 3.2.2 质粒转化酵母感受态细胞、自激活及毒性检测 |
| 3.2.3 诱饵质粒与HIV、HCV及GBV-C文库的杂交实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 文库质粒的自激活毒性检测 |
| 3.3.2 相互作用蛋白的筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 酵母双杂交体系选择 |
| 3.4.2 文库质粒自激活及毒性验证 |
| 3.4.3 阳性对照与阴性对照的设置 |
| 3.4.4 假阴性与假阳性的排除 |
| 3.4.5 酵母转化方法选择 |
| 3.4.6 互作蛋白分析 |
| 3.4.7 展望 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 GBV-C包膜糖蛋白E2与肿瘤坏死因子LTα相互作用验证以及E2对LTα mRNA量化关系研究 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 载体与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 缓冲液的配制 |
| 4.2.2 动物细胞表达质粒的构建 |
| 4.2.3 动物细胞内蛋白质相互作用的验证 |
| 4.2.4 GBV-C E2对LTαmRNA量化关系研究 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 重组质粒双酶切验证 |
| 4.3.2 蛋白定量结果 |
| 4.3.3 转染效率的优化 |
| 4.3.4 免疫共沉淀结果 |
| 4.3.5 激光共聚焦实验结果 |
| 4.3.6 细胞内总RNA提取结果 |
| 4.3.7 Jurkat细胞内LTα基因的PCR检测以及定量引物检测 |
| 4.3.8 相对定量结果 |
| 4.3.9 GBV-C E2对Jurkat细胞中LTα mRNA表达量的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 实验细胞的选择 |
| 4.4.2 蛋白定量的方法选择 |
| 4.4.3 转染的方法选择 |
| 4.4.4 免疫共沉淀抗体的选择以及抗体轻重链的去除 |
| 4.4.5 定量方法选择 |
| 4.4.6 定量实验结果分析 |
| 4.4.7 展望 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（6）HCV/HIV共感染者T细胞表面CD38分子的表达水平（论文提纲范文）
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
（7）肝脏抗病毒免疫应答及其调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论肝脏抗病毒免疫应答的研究现状 |
| 1.1 肝脏免疫系统 |
| 1.1.1 肝脏独特生理结构 |
| 1.1.2 肝脏独特微环境 |
| 1.1.3 肝脏免疫细胞 |
| 1.2 肝脏抗病毒免疫的调节 |
| 1.2.1 典型嗜肝性病毒 |
| 1.2.2 肝脏抗病毒免疫正向调节——免疫排斥 |
| 1.2.3 肝脏抗病毒免疫负向调节——免疫耐受 |
| 1.3 共生菌维持肝脏免疫稳态 |
| 1.3.1 共生菌维持粘膜免疫稳态 |
| 1.3.2 共生菌促进肝脏免疫应答 |
| 1.3.3 共生菌诱导肝脏免疫耐受 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 临床标本 |
| 2.1.3 腺病毒 |
| 2.1.4 质粒 |
| 2.1.5 细胞 |
| 2.1.6 淋巴细胞分离试剂 |
| 2.1.7 人NK细胞分离试剂盒 |
| 2.1.8 小鼠Treg细胞分离试剂盒 |
| 2.1.9 细胞清除试剂 |
| 2.1.10 流式细胞术检测相关试剂 |
| 2.1.11 胞内染色相关试剂 |
| 2.1.12 定量PCR检测相关试剂 |
| 2.1.13 抗生素 |
| 2.1.14 放免检测试剂盒 |
| 2.1.15 细胞因子检测试剂盒 |
| 2.1.16 TLR激动剂 |
| 2.1.17 细胞因子及阻断抗体 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌群缺失小鼠构建 |
| 2.3.2 HBV携带小鼠构建 |
| 2.3.3 HBsAg疫苗免疫小鼠 |
| 2.3.4 腺病毒感染小鼠及预处理 |
| 2.3.5 人外周血单个核细胞分离 |
| 2.3.6 小鼠各脏器淋巴细胞分离 |
| 2.3.7 流式细胞术 |
| 2.3.8 逆转录PCR及定量PCR |
| 2.3.9 ELISA检测 |
| 2.3.10 放射性免疫检测 |
| 2.3.11 淋巴细胞清除 |
| 2.3.12 冰冻切片 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 第三章 实验结果Ⅰ 共生菌促进肝脏γδT-17抗病毒免疫应答 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 菌群缺失小鼠腺病毒易感性增加 |
| 3.2.1 菌群缺失小鼠肝脏免疫细胞分布变化 |
| 3.2.2 菌群缺失小鼠外周免疫应答正常 |
| 3.2.3 菌群缺失小鼠肝脏抗病毒能力降低 |
| 3.3 γδT分泌IL-17降低导致菌群缺失小鼠抗腺病毒能力降低 |
| 3.3.1 菌群缺失小鼠病毒易感与免疫系统相关 |
| 3.3.2 菌群缺失小鼠肝脏抗病毒能力降低与NK细胞无关 |
| 3.3.3 菌群缺失小鼠肝脏CTL细胞功能降低 |
| 3.3.4 菌群缺失小鼠γδT细胞表达IL-17水平降低 |
| 3.3.5 IL-17可逆转菌群缺失小鼠抗病毒能力 |
| 3.4 菌群诱导成年小鼠肝脏富含γδT-17细胞 |
| 3.4.1 小鼠肝脏较其他脏器富含γδT-17细胞 |
| 3.4.2 成年小鼠较新生小鼠肝脏富含γδT-17细胞 |
| 3.4.3 菌群缺失小鼠肝脏γδT细胞IL-17的降低无亚群特异性 |
| 3.5 菌群缺失小鼠γδT-17细胞减少与IL-7和IL-1信号无关 |
| 3.5.1 菌群缺失小鼠胸腺发育过程不受影响 |
| 3.5.2 IL-7无法恢复菌群缺失小鼠γδT-17细胞 |
| 3.5.3 菌群缺失小鼠Kupffer细胞表达IL-1β降低 |
| 3.5.4 菌群缺失小鼠Kupffer细胞清除不影响γδT细胞分泌IL-17 |
| 3.6 共生菌来源的多种TLR刺激剂促进肝脏γδT分泌IL-17 |
| 3.6.1 多种而非单种TLR信号刺激可恢复菌群缺失小鼠肝脏γδT-17细胞 |
| 3.6.2 TLR2/4/9三缺陷小鼠肝脏γδT-17细胞不受菌群影响 |
| 3.6.3 多种菌群共同缺失导致菌群缺失小鼠γδT-17细胞降低 |
| 3.7 讨论和总结 |
| 第四章 实验结果Ⅱ HBV相关的NK细胞高表达抑制性受体NKG2A的机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 HBV携带小鼠NK细胞高表达抑制性受体NKG2A |
| 4.2.1 HBV携带小鼠NK细胞NKG2A表达增加 |
| 4.2.2 HBV自发转阴小鼠NK细胞NKG2A表达降低 |
| 4.2.3 HBV非耐受型BALB/C小鼠NK细胞NKG2A低表达 |
| 4.3 NKG2A抑制HBV携带小鼠NK细胞抗病毒功能 |
| 4.4 HBV小鼠肝脏CD4+调节性T细胞通过分泌IL-10上调NK细胞NKG2A表达 |
| 4.4.1 HBV携带小鼠肝脏NKG2A+NK细胞被诱导扩增 |
| 4.4.2 HBV携带小鼠CD4+调节性T细胞诱导NK细胞上调NKG2A |
| 4.4.3 肝脏CD4+调节性T细胞分泌IL-10上调NK细胞NKG2A表达 |
| 4.4.4 人重组IL-10可诱导人NK细胞NKG2A上调 |
| 4.5 讨论和总结 |
| 第五章 实验结果Ⅲ IL-12促进HBsAg疫苗免疫应答 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 IL-12和Alum作为HBsAg疫苗联合佐剂方案的确立 |
| 5.2.1 Alum佐剂较IL-12诱导更高水平的anti-HBs抗体产生 |
| 5.2.2 IL-12较Alum佐剂诱导更高水平的Th1亚型抗体产生 |
| 5.2.3 IL-12对Alum诱导的anti-HBs表达水平无影响 |
| 5.3 IL-12作为联合佐剂方案的优化 |
| 5.3.1 IL-12最佳注射部位的确立 |
| 5.3.2 IL-12最佳注射时象的确立 |
| 5.3.3 IL-12最佳注射剂量的确立 |
| 5.4 IL-12联合HBsAg疫苗免疫小鼠具有更强的抗病毒能力 |
| 5.5 讨论和总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
| 已发表论文 |
| 待发表论文 |
| 学术会议 |
| 获得奖励 |
| 附录 |
（8）白血病NASCT患者CTL克隆细胞的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 树突状细胞的体外培养 |
| 一、健康供者树突状细胞（Dendritic cells. DC)的体外培养 |
| 四、统计学方法 |
| 五、结果 |
| 小结 |
| 第二章 健康供者体外CTL克隆培养与鉴定 |
| 一、标本来源 |
| 二、主要仪器设备及试剂 |
| 三、方法与步骤 |
| 四、统计学分析 |
| 五、结果 |
| 小结 |
| 第三章 白血病Allo-HSCT后体外CTL单克隆培养与鉴定 |
| 一、标本来源及HLA配型 |
| 二、设备与试剂 |
| 三、DG的分离与培养与照射 |
| 四、词养细胞的制备与照射 |
| 五、CTL细胞的分离与培养 |
| 六、HLA-A*0201/WT1/pentamer的流式检测与分 |
| 七、WT1肽特异性CTL单克隆细胞的制备 |
| 八、培养克隆五聚体检测 |
| 九、培养克隆表型(CD28/GD27/GD107a)检测 |
| 十、培养克隆表型 GD8/Granzyme B/Perfor i n)检测 |
| 十一、CD45R0/CD45RA/CCR7 的检测 |
| 十二、特异性CTL克隆膜内细胞因子水平的检测 |
| 十三、CTL细胞毒效应检测 |
| 十四、统计处理 |
| 十五、结果 |
| 小结 |
| 第四章 白血病患者与健康供者体CTL克隆细胞的比较 |
| 一、标本来源 |
| 二、设备与试剂 |
| 三、DC的分离培养与照射 |
| 四、饲养细胞的制备与照射 |
| 五、CTL细胞的分离与培养 |
| 六、HLA-A*0201/WTl/pentamer的流式检测与分选 |
| 七、FTl肽特异性CTL单克隆细胞的制备 |
| 八、五聚体检测 |
| 九、克隆表型(CD28/CD27/CD107a)检测 |
| 十、克隆胞内颗粒的(CD8/Granzyme B/Perforin)检测 |
| 十一、CD45RO/CD45RA/CCR7 的检测 |
| 十二、特异性CTL克隆分泌功能的检测 |
| 十三、CTL克隆毒性功能的检测 |
| 十四、统计处理 |
| 十五、结果 |
| 小结 |
| 第五章 白血病患者移植后CTL克隆细胞的来源及功能研究 |
| 一、标本来源 |
| 二、主要仪器设备及试剂 |
| 三、白血病患者移植后外周血CTL克隆FISH检测 |
| 四、激光扫锚共聚焦（LCDM)观察患者CTL克隆的功能 |
| 五、扫锚电镜观察患者CTL克隆的微细胞结构与功能 |
| 六、结果 |
| 小结 |
| 第六章 白血病患者与健康供者CTL克隆细胞蛋白表达差异 |
| 一、标本来源 |
| 二、主要仪器 |
| 三、主要试剂 |
| 四、具体操作 |
| 五、统计学处理 |
| 六、结果 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表及撰写的论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）HIV-1单纯及合并HCV感染对HIV-1特异性细胞免疫应答的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 研究背景 |
| 实验内容 |
| 主要仪器 |
| 主要试剂及耗材 |
| 实验一 HIV-1 单纯及合并 HCV 感染的 CD4+T 细胞、CD8+T 细胞及 PBMC 内 IL-7、IL-21、IFN-γmRNA 水平测定 |
| 实验二 ICS 检测 HIV-1 单纯及合并 HCV 感染者分泌 IL-4，IL-17A，IL-21，IL-21R，IFN-γ的 CD3+T 淋巴细胞比例 |
| 实验三 ELISPOT 检测 HIV-1 单纯及合并 HCV 感染的 HIV-1 特异性 CTL 应答 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历及研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）人Ⅰ型免疫缺陷病毒Rev蛋白促进丙型肝炎病毒翻译的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 人免疫缺陷病毒的研究进展 |
| 1.1 艾滋病毒的结构 |
| 1.2 艾滋病毒的复制周期 |
| 1.2.1 病毒入侵 |
| 1.2.2 早期(整合前)的艾滋病毒复制事件：反转录和核输入 |
| 1.2.3 病毒整合 |
| 1.2.4 晚期(整合后)事件：病毒基因的表达 |
| 1.3 艾滋病毒的包装和释放 |
| 1.4 艾滋病毒的潜伏 |
| 第二章 丙型肝炎病毒分子生物学、复制和免疫反应概述 |
| 2.1 HCV结构蛋白 |
| 2.1.1 核心蛋白 |
| 2.1.2 包膜糖蛋白 |
| 2.1.3 P7蛋白 |
| 2.2 HCV非结构蛋白 |
| 2.2.1 NS2 |
| 2.2.2 NS3 |
| 2.2.3 NS4A |
| 2.2.4 NS4B |
| 2.2.5 NS5A |
| 2.2.6 NS5B |
| 2.3 HCV病毒学 |
| 2.4 病毒入侵 |
| 2.5 病毒RNA的复制和翻译 |
| 2.6 治疗丙型肝炎病毒 |
| 第三章 丙型肝炎病毒和人免疫缺陷病毒共感染的研究进展 |
| 3.1 丙型肝炎病毒对艾滋病毒感染的影响 |
| 3.2 艾滋病对丙型肝炎病毒感染毒的影响 |
| 3.3 在HCV/HIV共感染中细胞介导的免疫 |
| 3.3.1 丙型肝炎病毒特异性免疫反应 |
| 3.3.2 肝损伤是细胞介导的免疫应答的结果 |
| 3.4 HIV-HCV共感染病人的治疗 |
| 3.5 未来：更新、更有效的药物和靶向治疗 |
| 第四章 人免疫缺陷病毒REV蛋白功能简介 |
| 4.1 REV蛋白和REV应答元件(RRE) |
| 4.2 REv穿梭和病毒RNA输出 |
| 4.3 REV和翻译 |
| 4.3.1 Rev和翻译有关 |
| 4.3.3 Rev调控翻译的证据 |
| 4.3.4 HIV-1基因组RNA上第二个Rev的结合位点 |
| 4.4 REV和基因组包装 |
| 第五章 HIV-1上调HCV基因表达的研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 质粒和细菌菌株 |
| 5.2.2 哺乳动物细胞系 |
| 5.2.3 工具酶 |
| 5.2.4 试剂和抗体 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 感受态细菌的制备及转化 |
| 5.3.2 碱裂解法质粒的提取 |
| 5.3.3 凝胶回收DNA片段 |
| 5.3.4 Rev蛋白突变质粒的构建 |
| 5.3.5 RNA的体外转录 |
| 5.3.6 细胞培养基配置 |
| 5.3.7 细胞培养、复苏和冻存 |
| 5.3.8 细胞脂质体转染 |
| 5.3.9 检测荧光素酶活性 |
| 5.3.10 蛋白免疫印迹实验 |
| 5.3.11 体内免疫共沉淀 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 HIV上调HCV基因表达 |
| 5.4.2 筛选上调HCV基因表达的HIV蛋白 |
| 5.4.3 HIV Rev蛋白突变体的构建 |
| 5.4.4 HIV Rev蛋白特异性的上调HCV基因的表达 |
| 5.4.5 HIV Rev蛋白能与HCV RNA相互作用 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 REV蛋白与HCV 5'UTR相互作用的研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 质粒和细菌菌种 |
| 6.2.2 工具酶 |
| 6.2.3 试剂、抗体和蛋白 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 感受态细菌的制备及转化(见上一章) |
| 6.3.2 碱裂解法质粒提取(见上一章) |
| 6.3.3 凝胶回收DNA片段(见上一章) |
| 6.3.4 Rev蛋白及其突变蛋白表达质粒的构建 |
| 6.3.5 Rev蛋白及其突变蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 6.3.6 pHCV 5’+3’质粒的构建 |
| 6.3.7 RNA的制备 |
| 6.3.8 RNA探针的制备 |
| 6.3.9 EMSA实验 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 Rev及其突变蛋白的原核表达、纯化及鉴定 |
| 6.4.2 EMSA实验所需RNA的制备 |
| 6.4.3 Rev蛋白与HCV 5'-UTRRNA结合 |
| 6.4.4 Rev蛋白与HCV 5'-UTRRNA结合的蛋白特异性 |
| 6.4.5 Rev蛋白与HCV 5'-UTRRNA结合的RNA特异性 |
| 6.4.6 Rev蛋白与HCV 5'-UTR截短RNA的相互作用 |
| 6.4.7 Rev蛋白与HCV 5'-UTR第三区域缺失突变RNA的相互作用 |
| 6.4.8 Rev蛋白与HCV 5'-UTR第三区第一个内部环结构域突变RNA的相互作用 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 REV上调HCV IRES介导的翻译 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验材料 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 单顺反子报告因子RNA制备 |
| 7.4 实验结果 |
| 7.4.1 单顺反子报告因子RNA制备 |
| 7.4.2 Rev蛋白激活HCV IRES RNA的翻译 |
| 7.4.3 Rev蛋白激活HCV IRES RNA的翻译依赖于HCV结合位点 |
| 7.5 讨论 |
| 研究意义和创新 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表与待发表论文 |
| 致谢 |
四、HIV/HCV共感染患者病毒特异性CTL细胞定量研究（论文参考文献）
- [1]cART联合雷公藤治疗对HIV急性期感染者病毒储存库、慢性期感染者免疫重建的影响[D]. 林铃. 北京协和医学院, 2021(02)
- [2]MSM人群HIV+/AIDS进程影响因素及梨支原体共感染的流行病学研究[D]. 陈璐斯. 东南大学, 2019(05)
- [3]MicroRNA-146a在HIV-1慢性感染中与耗竭标志物相关性及其抑制细胞免疫功能的研究[D]. 余婷. 武汉大学, 2019(06)
- [4]HCV对HIV/HCV共感染病情进展的影响分析[J]. 李雯. 临床医药文献电子杂志, 2017(49)
- [5]庚型肝炎病毒与HIV、HCV相互作蛋白的筛选及E2与LTα蛋白互作验证[D]. 杨晓钰. 昆明理工大学, 2016(01)
- [6]HCV/HIV共感染者T细胞表面CD38分子的表达水平[J]. 孙焕芹,孙坚萍,刘宁,刘金花,覃岭,韩珍,张永宏. 北京医学, 2014(09)
- [7]肝脏抗病毒免疫应答及其调控机制[D]. 李凤磊. 中国科学技术大学, 2013(10)
- [8]白血病NASCT患者CTL克隆细胞的初步研究[D]. 赵月莹. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(12)
- [9]HIV-1单纯及合并HCV感染对HIV-1特异性细胞免疫应答的影响[D]. 曹孟丽. 广州医学院, 2012(08)
- [10]人Ⅰ型免疫缺陷病毒Rev蛋白促进丙型肝炎病毒翻译的分子机制研究[D]. 屈静. 武汉大学, 2011(04)
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