一、电压依赖性钾通道抗体与获得性神经性肌强直（论文文献综述）
张献[1]（2021）在《Nav1.2小分子抑制剂的发现及其抗癫痫活性研究》文中研究说明电压门控钠离子通道是生物电信号传导过程中的重要蛋白,是癫痫、心律不齐等神经兴奋性失调疾病的重要靶点。Nav1.2是特异性高表达在中枢神经系统谷氨酸能神经元中的一种电压门控钠通道亚型,与癫痫、自闭症、智力障碍等疾病密切相关。Nav1.2通道的功能增强（gain of function）会导致神经兴奋性增加。编码Nav1.2的基因SCN2A突变会导致具有各种临床表型的癫痫,包括良性家族性新生儿-婴儿癫痫（Benign familial neonatal‐infantile seizures,BFNIS）和发育性癫痫脑病（Developmental and epileptic encephalopathy,DEE）,Nav1.2可能是潜在的抗癫痫靶点。然而,目前已经发现的Nav1.2小分子抑制剂很少,已有的抑制剂存在体外IC50值高,或者体内没有抗癫痫活性等问题。因此,亟需发现新的Nav1.2小分子抑制剂,探索以Nav1.2通道作为癫痫治疗靶点的可行性。我们利用基于电流检测的Ion Works Barracuda高通量筛选系统进行Nav1.2小分子抑制剂的高通量筛选,然后和药物化学家合作进行结构改造,发现了多个Nav1.2通道的强效抑制剂,从中选择了部分分子在最大电休克诱导的癫痫动物模型上评价了它们的抗癫痫活性,发现多个分子表现出良好的抗癫痫保护作用。此外,我们发现,处于二期临床试验的抗癫痫新药氯桂丁胺是Nav1.2通道的抑制剂。氯桂丁胺（10-30μM）可以剂量依赖地抑制海马神经元动作电位的发放,主要影响的是动作电位的振幅。亚型选择性研究表明氯桂丁胺更倾向于抑制中枢神经系统分布的Nav1.2亚型。与其他靶向钠通道的抗癫痫药物一样,氯桂丁胺对Nav1.2通道也表现出状态依赖和频率依赖的抑制。而且氯桂丁胺可以使电压依赖的激活曲线向去极化方向转移,使电压依赖的失活曲线向超极化方向转移,促进通道进入无功能状态发挥抑制作用。值得注意的是,氯桂丁胺可以抵消癫痫相关的Nav1.2功能获得性突变增加的电流。我们的研究提示,氯桂丁胺可以作为先导化合物,对氯桂丁胺及其衍生物进行进一步的构效关系研究可能是开发靶向Nav1.2亚型的新型抗癫痫药物的有效策略。氯桂丁胺也可以抑制癫痫相关的Nav1.2功能获得性突变体增大的电流,提示它可能作为Nav1.2引起的遗传性癫痫的备选药物。我们还发现临床上用于治疗脑血管疾病的长春西汀也是Nav1.2通道的抑制剂。长春西汀（1-30μM）可以明显地抑制海马神经元动作电位的发放,使神经元膜电位发生显着去极化。在进一步研究了长春西汀对神经元钾电流的影响后,发现长春西汀（10μM）能抑制延迟整流钾电流,而对瞬时外向钾电流几乎没影响。长春西汀对Nav1.2通道的抑制作用也同样具有状态依赖性和频率依赖性。通过和药物化学家合作,对长春西汀进行结构修饰,我们发现了两个活性更强的衍生物VC11和VC13。
赵腾[2]（2021）在《NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究》文中指出研究背景:N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体（NR）是脑内兴奋性神经递质-谷氨酸的主要受体。其作为一种配体门控型的离子通道,在突触内主要参与介导兴奋性突触后电流（EPSC）的产生及传递,在突触外还可参与γ-氨基丁酸（GABA）能中间神经元突触前GABA释放,进而影响抑制性突触后电流（IPSC）的产生。而构成神经元网络的兴奋性突触信号和抑制性突触信号的失衡是形成癫痫的重要原因。因此,NR应该是影响神经元网络兴奋/抑制平衡的关键因素。通过一些临床病例及细胞水平受体功能分析证实,NR功能增强型（Go F）基因突变和功能丧失型（Lo F）基因突变均可导致癫痫。而作为NR的亚基之一,GluN2A/GRIN2A突变的患者中78%表现为癫痫,是目前NR基因变异相关癫痫研究的重点。目前,Lo F型NR基因突变所致癫痫的发病机制尚不明确,在转基因动物水平进行在体、离体电生理及行为学研究,进而明确该型基因突变致病的特点和机制意义重大。另外,一些变构调节剂可以逆转部分基因变异所致的NR功能异常。通过细胞水平筛选并在动物水平干预,可能筛选出对Lo F型NR较为有效的正向变构调节剂（positive allosteric modulator s,PAMs）,从而为临床精准化治疗提供重要理论和实践支持。研究方法:本课题以临床报道及细胞水平受体功能分析证实较为典型的Lo F型突变GluN2A/GRIN2A-V685G为研究位点。首先利用非洲爪蟾卵母细胞在细胞水平进行NR功能验证,并根据文献资料选择了孕烯醇酮硫酸酯（PS）、24（S）羟基胆固醇（24（S）-HC）、妥布霉素、花生四烯酸、D-丝氨酸、精胺以及谷氨酸、甘氨酸做为备选药物在细胞水平进行敏感药物筛选,选出1-2种最为敏感的药物作为干预药物。利用胚胎显微注射法制备GluN2A/GRIN2A-V685G转基因小鼠,而后将小鼠分为空白组（WT）、功能丧失型突变组（Lo F）、空白治疗组（WT+drug）、突变治疗组（Lo F+drug）。在行为学方面,观察各组小鼠自发癫痫发作的情况,进行癫痫等级评分。若无自发癫痫的表型,则在各组建立高热癫痫模型,评估癫痫发作的阈值（发作潜伏期）。应用新颖物体识别实验（NOR）以及新颖物体位置识别（NOL）实验评估各组小鼠的认知状况;应用悬尾实验、糖水偏好实验和强迫游泳实验评估各组小鼠的抑郁行为状况。在体检测各组小鼠皮层脑电图异常放电水平,并将各组小鼠断头取脑,应用膜片钳技术检测海马CA1区锥体神经元突触后膜NR所介导的电流（EPSC）以及GABA能中间神经元所介导的m IPSC水平,同时检测全锥体神经元动作电位的变化。最后利用Real-time PCR和Western blot技术检测GluN2A亚基的表达情况。研究结果:本课题利用非洲爪蟾卵母细胞在细胞水平进行了NR功能验证,结果显示转染GRIN2A-V685G突变c DNA的蛙卵表面NR电流较对照组明显下降,功能基本丧失。将备选药物应用到转染细胞,结果显示24（S）-HC可以部分逆转该突变的NR功能。结合相关文献,最终选择可以增加脑内及血清24（S）-HC水平且已经临床应用于抗HIV治疗的依法韦仑（efavirenz,EFV）作为干预药物。而后将动物分为了WT组、Lo F组、WT+EFV组、Lo F+EFV组。行为学评价显示,各组小鼠均未出现自发性癫痫发作,在建立高热惊厥模型后,Lo F组小鼠癫痫发作潜伏期较短,而Lo F+EFV组癫痫发作潜伏期则较Lo F组明显延长,各组小鼠的发作强度和发作时持续时间无明显差异。在认知功能评价中,各组在新颖物体识别实验（NOR）中无明显差异,在新颖物体位置识别实验（NOL）中,Lo F组与WT组差异也无显着性,但观察趋势可见Lo F组小鼠较WT组识别指数稍有降低。而Lo F+EFV组的NOL识别指数较Lo F组明显增高,差异有显着性,可见Lo F小鼠可能存在空间记忆能力减退,而EFV可以逆转这种趋势。在抑郁行为评估中,各组小鼠均未发现明显差异,且Lo F组和Lo F+EFV组小鼠在悬尾不动实验中不动时间反而更短。在体电生理学检测显示Lo F组小鼠的皮层脑电图出现癫痫样放电（seizure-like events,SLEs）的频率明显增加,而Lo F+EFV组则较少出现SLEs,说明EFV可以部分抑制突变小鼠的脑内异常放电。随后利用膜片钳进行突触内NR电流（EPSC）水平检测显示Lo F组电流幅度和最大电流面积均明显降低,Lo F+EFV组则较Lo F组明显升高,差异均有显着性。m IPSC水平检测显示各组电流的振幅峰值（peak amplititude）检测中未发现明显差异,但在电流发放频率（event frequency）检测中,Lo F组较WT组明显下降,而Lo F+EFV组则无下降。随后进行全细胞动作电位检测显示与WT组相比,Lo F组小鼠海马CA1区锥体细胞动作电位阈值有所下降,动作电位幅度值增加,动作电位输入电阻增加,相同电流刺激下动作电位根数明显增加,差异有显着性。而Lo F+EFV组较Lo F组在动作电位上述指标中有逆转的趋势,但差异无显着性。而后进行的Real-time PCR和Western blot检测显示各组在GluN2A表达中无明显差异。研究结论:（1）GRIN2A-V685G突变可使GluN2A亚基配体结合结构域（ABD）功能障碍,致谷氨酸效力丧失,进而导致NMDA受体功能障碍。（2）GluN2A/GRIN2AV685G转基因小鼠海马CA1区锥体神经元突触内NR介导的EPSC降低,而由突触外NMDAR参与的GABA能中间神经元所介导的m IPSC也下降。使神经元网络的兴奋/抑制平衡失调,最终导致锥体神经元兴奋性增高。（3）GluN2A/GRIN2A-V685G转基因小鼠容易出现癫痫发作,其皮层脑电图可见异常放电增多。（4）抗HIV药依法韦仑（EFV）可以通过增加脑内24（S）羟基胆固醇水平来部分恢复GluN2A/GRIN2A-V685G突变所致的NMDAR功能丧失,减少皮层的异常放电,抑制转基因小鼠的癫痫发作。
柯才华[3]（2020）在《西藏玛氏琵蝎四种钾毒素的克隆、表达、纯化与功能鉴定》文中进行了进一步梳理钾离子通道几乎在所有的生物体及其所有的细胞类型中有表达,它们是一类特殊的跨膜蛋白,介导着钾离子的跨膜运输而维持细胞的静息膜电位,在人体的生理和病理过程中起着非常重要的调控作用。其中电压门控钾离子（Kv）通道占迄今发现的所有钾离子通道的50%左右,同时Kv通道是多种蝎毒素多肽作用的靶标,近年来研究表明Kv1.3通道是自身免疫疾病治疗的有效靶点。因而筛选出强活性、高特异性的Kv1.3通道的调节蝎钾毒素成为研究热点。目的:以西藏玛氏琵蝎为研究对象,研究其毒液中的钾毒素功能及其作用机制,以期筛选出强活性、高特异性的Kv1.3通道调节蝎钾毒素,促进自身免疫性疾病的多肽药物开发。方法:（1）提取玛氏琵蝎物种RNA经测序后构建玛氏琵蝎的cDNA文库,从中筛选出有潜在功能活性的钾毒素编码序列。（2）利用基因工程技术对钾毒素编码基因进行克隆并构建重组表达载体。（3）采用原核表达体系,获取GST融合蛋白后酶切纯化制备高纯度毒素多肽,使用MALDI-TOF-MS进行分子量鉴定。（4）采用全细胞膜片钳技术,分别初步检测表达的毒素多肽对Kv1.3、Kv1.2和Kv1.1通道的阻断活性,找到其中强活性、高特异性的Kv1.3通道阻断剂作为活性分子。（5）利用活性分子,检测其对Jurkat T细胞上内源性Kv1.3通道的阻断活性,采用活细胞钙成像技术检测其对Jurkat T细胞内Ca2+的影响,ELISA检测其对Jurkat T细胞释放炎性因子IL-2的影响,深入研究其免疫调节作用机制。结果:（1）成功构建玛氏琵蝎cDNA文库,并筛选出四条钾毒素KTX-SM4、KTX-SM6、KTX-SM7和KTX-SM9序列。（2）完成钾毒素基因的克隆并成功构建对应的重组表达载体。（3）经重组肠激酶切割、高效液相分离纯化获得高纯度毒素多肽,质谱分子量鉴定与理论值一致。（4）全细胞膜片钳结果发现,3μM浓度的KTX-SM4、KTX-SM9对Kv1.3、Kv1.2和Kv1.1通道均无抑制活性。其中,1μM浓度的KTX-SM7可以抑制40%左右的Kv1.2通道电流,其IC50值约为1.8μM,但是其对Kv1.3和Kv1.1通道没有明显的抑制效果。与此同时,我们看到100nM的KTX-SM6有着50%的Kv1.2通道抑制效果和65%的Kv1.3通道抑制效果,而对Kv1.1通道没有明显抑制效果。我们发现了其中强活性、高特异性Kv1.3通道阻断剂KTX-SM6。（5）我们以多肽KTX-SM6为活性分子,活性鉴定发现,KTX-SM6作用于293T细胞上Kv1.3和Kv1.2通道的IC50值分别为19.81±2.05 nM、55.79±8.49nM,而作用于Jurkat T细胞上Kv1.3通道的IC50值为48.97±5.31 nM。KTX-SM6抑制了Jurkat T细胞内Ca2+信号及炎性因子IL-2的合成释放。结论:我们成功从西藏玛氏琵蝎中筛选出特异性阻断Kv1.3通道的钾毒素KTX-SM6,它能够降低Jurkat T细胞中的自由Ca2+浓度并且抑制Jurkat T细胞炎性因子IL-2的释放,提示了KTX-SM6调控自身免疫反应的活性及机制。
李倩[4]（2020）在《化合物QO-83对KCNQ通道开放作用研究》文中研究表明KCNQ（Kv7）通道是电压依赖的钾离子通道,目前发现五个亚型,KCNQ1分布于心肌,KCNQ2和KCNQ3主要分布于神经系统,KCNQ4分布于内耳毛细胞及血管平滑肌,KCNQ5分布于神经和骨胳肌。KCNQ2、KCNQ5与KCNQ3基因形成的Kv7.2/Kv7.3或Kv7.3/Kv7.5通道是构成神经系统M电流的分子基础,在调节神经兴奋性上发挥着重要作用。QO-83是经高通量筛选优化的小分子化合物,对KCNQ通道有很好的调节活性,有望开发成治疗癫痫、疼痛等神经系统疾病的药物。目的:利用电生理膜片钳技术,研究QO-83对Kv7通道各亚型的开放作用,结合点突变观察以及动力学变化过程分析,阐明其作用机制。方法:1 用电生理膜片钳技术,在表达细胞系CHO上,观察QO-83（10μM）对Kv7通道不同亚型的开放活性。2 在表达系统用膜片钳记录Kv7通道全细胞电流,观察不同的浓度梯度0.1、1、3、10、30、100μM的QO-83对电流的影响,绘制量效曲线。3 用电生理膜片钳记录通道电流,分析电压依赖特征,观察QO-83（10μM）对通道激活曲线的影响。4记录Kv7通道全细胞电流,分析激活与失活动力学参数,观察QO-83（10μM）对Kv7通道动力学参数的影响。5选取点突变KCNQ2通道位点Kv7.2（W236L）、Kv7.2（Y284C）和Kv7.2（A306T）,研究QO-83对瑞替加滨（Retigabine,RTG）敏感作用位点的作用。结果:1.化合物QO-83对Kv7.2、Kv7.4、Kv7.2/Kv7.3、Kv7.3/Kv7.5通道亚型选择性高,对Kv7.1和Kv7.3通道作用不明显,对Kv7.2、Kv7.4、Kv7.2/Kv7.3、Kv7.3/Kv7.5通道电流开放倍数分别为1.65±0.16、1.41±0.07、1.61±0.21、1.27±0.13。2.QO-83在100μM浓度下对于Kv7.1通道无明显开放作用,对Kv7.2/Kv7.3和Kv7.4通道开放的EC50值分别为1.9±0.8μM和1.8±0.4μM。3. 化合物QO-83（10μM）可以使Kv7.2、Kv7.2/Kv7.3、Kv7.4、Kv7.3/Kv7.5通道的稳态激活曲线向着超极化的方向移动,△V1/2值分别为19.3±3.6 m V、16.5±1.8 m V、13.0±2.3 m V、6.0±1.8 m V,与对照组比较,各亚型V1/2值均有显着性差异（P<0.05）。4. 化合物QO-83在10μM的浓度下,可以显着延长Kv7.2、Kv7.2/Kv7.3、Kv7.4、Kv7.3/Kv7.5通道的去活时间:在-30 m V激活电压下分析通道激活时间常数(τact值,ms)分别为:331.4±49.2、368.9±56.4、368.6±55.4、325.0±29.8,与对照组τdeact值相比,没有统计学差异;通道的去活时间常数(τdeact值,ms)分别为110.9±21.7、79.8±10.2、46.8±9.3、84.1±10.2,与对照组τdeact相比,均具有统计学差异（P<0.05）。5. 比较RTG敏感的Kv7.2（W236L）突变位点,QO-83（10μM）也没有影响,对于癫痫敏感的突变位点Kv7.2（Y284C）和Kv7.2（A306T）,QO-83与RTG均有效,QO-83（10μM）既可以增大Kv7.2（Y284C）和Kv7.2（A306T）通道电流,也可以使通道激活曲线左移,△V1/2（m V）分别为:11.8±2.6、14.5±3.0;对激活动力学常数无明显影响,τact值分别为138.6±30.1 ms、334.6±57.7 ms,但可以显着延长去活时间,τdeact值分别为:116.4±29.1 ms、118.5±17.2 ms（P<0.05）。结论:化合物QO-83对Kv7通道开放作用表现出明显的亚型选择性、浓度依赖性、电压依赖特征;对Kv7.2和Kv7.4选择性高,对Kv7.1和Kv7.3无明显作用;其开放通道的机制主要是通过延长去活动力学过程;与RTG比较一个显着的区别是其对Kv7.3亚型无明显选择性。
林珊[5]（2019）在《结节性硬化症及轴索型腓骨肌萎缩症的基因诊断及表型相关性研究》文中研究表明背景:结节性硬化症（Tuberous Sclerosis Complex;TSC）是一种以累及全身多器官系统的错构瘤样病变为特征的神经皮肤综合征,主要累及的器官组织可涉及颅脑、皮肤、心、肺、肾等。目前发现该病的致病基因为TSC1及TSC2基因,二者构成的复合物是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）通路上游的关键分子,其功能缺失突变可引起下游mTORC1通路过度激活,从而引起下游异常的细胞生长、增殖与存活等功能代谢。其突变类型多样,可具有微小突变,拷贝数变异,嵌合体变异等,具有高度临床和遗传异质性。该病的确诊主要依据2012年国际结节性硬化症共识会议提出的诊断标准。目前,基于中国人群的TSC患者基因型特征及临床表现的系统分析研究较少,研究多为个案报道或儿童患者队列。本研究对临床确诊或疑诊的TSC患者进行基因诊断并探讨患者基因型与表型相关性。方法:本研究先应用Sanger测序对94例临床确诊或疑诊的结节性硬化症患者的TSC1和TSC2基因进行微小突变的筛查,筛查结果阴性患者再利用多重连接依赖性探针扩增技术（Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）对其进行拷贝数变异的筛查。对于微小突变及拷贝数变异结果均为阴性的患者,建议行嵌合体变异分析,阴性疑诊患者排除诊断或进行后续的全外显子或全基因组测序分析。结果:在纳入的患者中,室管膜下结节（67%）、癫痫（65%）、面部血管纤维瘤（62%）、色素脱失斑（60%）为TSC患者最常见的几种症状及影像学所见,可见于50%以上的病例。此外,88.2%患者都有神经系统表现。本研究基因变异检出率为80.8%（76/94）,确诊和疑诊患者的突变检出率分别为80.9%及80%。其中24例基因变异位点位于TSC1基因,且大部分为无义突变（9/24,37.5%）和移码突变（7/24,29.1%）,其中基因突变多分布于8号外显子及15号外显子。52例患者检出TSC2基因变异,大部分为错义突变（16/46,32%）,且突变多位于TSC2基因第34至40号外显子的GTP酶激活蛋白结构域（GAP）和雷帕霉素结合结构域。其中6例患者检出有大片段杂合缺失变异,占所有突变类型的7.9%。但仍有19.15%的患者分子遗传学诊断仍不明确。对患者的基因型与表型关系分析结果提示检出TSC2基因突变患者较TSC1基因突变患者更常见色素脱失斑及肾血管平滑肌脂肪瘤。结论:我们建立了94例结节性硬化症的队列,结合MLPA和Sanger测序检测基因变异,为TSC1/TSC2基因的检测提供初步筛选策略,突变检出率为80.8%,可以筛查出大部分临床确诊的TSC患者,为患者遗传咨询提供依据,确诊和疑诊患者的基因突变检出率无明显差异,疑诊TSC的患者也应纳入TSC相关致病基因检测。肾血管平滑肌脂肪瘤及色素脱失斑更常见于TSC2基因突变的患者。通过分析基因型与表型相关性为该病的病情监测和控制,预后评估提供方向。背景:腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth,CMT）是一种最常见的遗传性周围神经病,临床上主要表现为以双下肢远端为主的肌肉无力、萎缩伴或不伴有感觉减退、腱反射减弱或消失、手足畸形（如高弓足、足下垂、马蹄内翻足、关节挛缩畸形等）及步态姿势异常等周围神经受累症状。根据其肌电图的正中神经传导速度可将其分为CMT1型（脱髓鞘型;MNCV<25m/s）;ICMT型（中间型,25m/s<MNCV<45m/s）和CMT2型（轴索型;MNCV≥45m/s）。迄今为止,已有100余种CMT相关致病基因被发现,但仍有约75%的临床诊断CMT2的患者分子遗传学诊断仍不明确。该病的致病基因主要累及周围神经系统,轴索型的致病基因主要是编码线粒体结构和功能的相关蛋白如MFN2,GDAP1等,以及与轴索运输相关的动力蛋白及轴索转运调节蛋白等如HSPB1,NEFL等。该病具有高度的临床和遗传异质性。在我们的前期研究中,脱髓鞘型患者结合拷贝数变异分析及全外显子测序,这部分患者的基因检出率高达90%以上,故本研究旨在进一步探索轴索型患者优化的基因诊断流程及基因型表型的关系,并分析线粒体DNA拷贝数与患者疾病严重程度的关系。方法:我们收集35例临床诊断CMT2的患者,利用全外显子测序及Sanger测序技术对患者进行致病基因筛查及位点验证。同时利用数字PCR技术对患者及正常对照进行线粒体拷贝数的检测和分析。结果:本研究中大部分患者于青少年期起病（25/35）。病人首发症状多为双下肢远端无力（71.4%）。随着病程进程,大部分患者还可出现上肢无力（31.4%,11/35）、手足畸形（37.1%,13/35）、肌肉萎缩（54.3%,19/35）、腱反射减弱或消失（65.7%,23/35）、肢体感觉障碍（20%,7/35）等表现。此外,还有3例患者表现为听力下降,2例患者表现有神经性肌强直。CMT2患者基因突变检出率为60%（21/35）,其中MFN2基因突变最常见,占所有患者42.9（15/35）,有13个突变（86.6%）位于GTPase结构域。其余检出突变还包括HINT1,HSPB1,YARS,GARS,GDAP1。有2个位点为新发变异分别为p.205V>A（MFN2）及p.360P>Q（YARS）。2例有神经性肌强直表现的患者检出有HINT1基因复合杂合突变。此外,通过对患者及对照的线粒体DNA拷贝数（mitochondrial DNA,mt-DNA）分析提示正常对照组与CMT2患者或伴有MFN2和GDAP1突变的CMT2患者之间mt-DNA水平没有显着差异,但患者的CMTNS评分和线粒体DNA拷贝数水平存在负相关趋势。结论:我们建立优化的诊断流程,提高了患者的突变检出率。此外,HINT1基因突变的患者多伴有神经性肌强直。血液细胞中线粒体DNA拷贝数水平可能与CMT2严重程度相关,但仍需进一步扩大样本量研究。
骆滨[6]（2019）在《基于龙血素B结构的新化合物的设计、合成与活性测定》文中提出血竭总黄酮化合物龙血素B,属于二氢查尔酮类化合物,在后续含量研究和质量测定中,普遍被认为是鉴别龙血竭的指标性成分。随着研究不断深入,以龙血素B为主的黄酮类化合物,在药理学实验分析以及临床试验中充分展现出了龙血竭的活性,这也暗示了独立存在的小分子化合物龙血素B也存在其相关活性。体外实验表明,龙血素B单体化合物可有效抑制电压门控性钠通道,在对机体的疼痛实验模型中表现出优良的镇痛活性。而对于钾离子通道,特别是Kv1.3钾离子通道,被认为与机体的自身免疫性疾病密切相关,给药龙血素B后机体能有效缓解自身免疫性疾病症状。同样在疼痛信号传导中,钙离子通道的TRP通道超家族也非常活跃,龙血素B单体化合物对其作用也不可忽视。为此本课题通过对TRPV1通道的特异性激活剂辣椒素结构入手,以龙血素B结构为基础对其进行结构改造,设计出新化合物4-羟基-N-（2,4,6-三甲氧基苄基）苯甲酰胺,然后测定其对钠、钾及钙离子通道的作用,判断此次改造思路是否可行。本课题前期工作（第二章）以初始原料1,3,5-三甲氧基苯,通过胺化反应、还原催化、脱水缩合等手段合成4-羟基-N-（2,4,6-三甲氧基苄基）苯甲酰胺前体化合物,再通过酯键的水解反应得到最终产物,化合物结构经过核磁共振,质谱等测定方法验证。第二部分（第三章）以四周龄小鼠DRG细胞作为实验对象进行钙成像实验,发现改造后的新化合物对TRPV1离子通道的特异性降低,表现出其特异性抑制剂AMG9810并不能抑制由新化合物引起的胞内钙离子浓度上升现象,相对应的TRPA1阻断剂HC030031能明显抑制,说明经过结构改造之后,新化合物保留了对钙离子通道的作用活性,但相对的提高了对TRPA1通道的选择性。第三部分（第四章）主要以HEK293-T细胞为实验对象,探讨了新化合物对钾离子通道的作用,发现经过改造后的新化合物对Kv1.1、Kv1.2及Kv1.3通道几乎都没有明显的抑制效果,在经过对龙血素B的结构改造之后,其对钾离子通道的选择性几乎完全消失,这也意味着其对其他通道的特异性提高。本课题第四部分（第五章）着重研究了新化合物对钠离子通道的药理作用,以DRG细胞为基础,确定了新化合物可对DRG钠通道电流最大峰电流产生抑制效果,并且最大激活电压向去极化方向偏移了10mV左右,表明在新化合物作用下,钠通道电流更难被激活出来。此外,新化合物抑制电流与河豚毒素抑制电流效果保持一致,说明新化合物可抑制TTX-S型钠通道,为此,以Nav1.7钠通道为TTX-S型钠通道代表以测定新化合物的活性,结果显示,不同浓度新化合物作用下,Nav1.7钠通道电流被抑制程度也不尽相同,即新化合物可呈浓度依赖性的抑制Nav1.7钠通道电流,IC50为54.026±4.79。本部分研究确定经过改造后的化合物保留了对钠离子通道的选择性,而钠离子通道与机体疼痛信号传导密切相关,说明新化合物有相当良好的镇痛活性。最终部分（第六章）以两种疼痛模型为基础,测定了新化合物对机体的镇痛活性,发现在福尔马林致痛模型中,新化合物在第一时相与第二时相均有良好的镇痛效果,辣椒素直接刺激引起的疼痛也可被有效缓解,说明在可激活钙离子通道的情况下新化合物也可表现出良好的镇痛活性。综上所述,本课题在剖析辣椒素结构后以龙血素B结构为基础进行的结构改造思路是可行的,新化合物对钠离子通道选择性明显提高,主要表现药理活性为镇痛。这揭示了龙血素B结构在三种离子通道中的作用基础,为后续研究提供了有效思路。
张凡[7]（2015）在《作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究》文中提出电压门控钠离子通道亚型Nav1.7和Nav1.8参与炎症性和神经病理性疼痛的调节,是治疗慢性疼痛的新型药物靶点。Nav1.7和Nav1.8的抑制剂显示优于吗啡的镇痛活性,然而其非专一性的靶点活性产生严重的副作用。作用于疼痛相关钠通道专一性抑制剂的筛选和结构与功能的研究,有助于新型镇痛药物先导分子的研发和利用专一性多肽探针探究钠离子通道参与疼痛的调节。中华眼镜蛇（Naja atra）,属眼镜蛇科,主要分布于我国南方地区。本课题成功从中华眼镜蛇毒液分离纯化出Nav1.8抑制剂,命名为μ-EPTX-Na1a（Na1a）。电喷雾质谱鉴定和Edamn降解测序结果显示,Na1a相对分子质量为7053.63 Da,由62个氨基酸残基组成,含有8个半胱氨酸。结构预测符合典型的蛇毒毒素的三指结构模型,8个半胱氨酸组成的4对二硫键连接方式为I-III、II-IV、V-VI和VII-VIII。大鼠背根神经节（DRG）细胞上河豚毒素不敏感型（TTX-R）钠通道活性检测,Na1a显示对Nav1.8的强抑制活性,IC50为167 nM,1μM的浓度几乎能够抑制全部的Nav1.8钠电流。对DRG上河豚毒素敏感型（TTX-S）钠通道和非失活的Nav1.9活性检测,10μM的Na1a仅具有较弱的抑制活性。检测Na1a对DRG上Nav1.8电生理特性的影响,200 nM Na1a使得Nav1.8的最大激活电压向去极化方向漂移约+10 mV,同时使稳态激活向去极化方向漂移约+11 mV,使稳态失活的向超极化方向漂移约9 mV。洗脱实验显示Na1a能快速结合靶点通道,具有稳定结合活性,同时能够被洗脱。钠离子通道亚型选择性实验结果显示,Na1a能够抑制ND7/23细胞上表达的Nav1.8,IC50为386 nM,10μM的Na1a对Nav1.3,Nav1.7和海马神经元TTX-S钠通道（Nav1.1-1.3）具有较弱抑制活性,10μM Na1a抑制Nav1.4电流约48%,对Nav1.5有抑制作用,IC50为8.51μM,该结果显示Na1a具有较高的专一性。药效学活性实验,Na1a在醋酸扭体疼痛模型,福尔马林疼痛模型和完全弗氏佐剂疼痛模型上具有强于吗啡的镇痛活性,在热板疼痛模型和坐骨神经结扎模型上均具有类似于或略优于吗啡的镇痛活性。同时对Na1a的副作用进行评价:运动功能,30倍镇痛剂量腹腔注射小鼠显示其对其游泳运动时间无明显影响;心脏毒性,对SD新生大鼠心肌Nav1.5的毒性实验显示1μM Na1a约抑制15%的电流;溶血活性和细胞毒活性,35μM浓度下均无两种副作用的表现;心脏安全性评价,10μM Na1a抑制hERG通道电流约为18%。酿酒酵母表达体系成功获得Na1a的异源制备。Na1a的靶点专一性,显着的镇痛活性,弱副作用反应和成功异源制备使其成为一个具有巨大潜力的镇痛药物先导分子。海南捕鸟蛛（Haplopelma hainanum）,属捕鸟蛛科,一种主要分布在我国海南省通什县山区的毒性很强的大型蜘蛛。本课题成功地从海南捕鸟蛛毒液中筛选得到Nav1.8的专一性延缓失活剂,命名为δ-TRTX-Hhn1a（Hhn1a）。质谱鉴定和Edamn降解测序结果显示,Hhn1a相对分子质量为3977.62 Da,由34基酸残基组成,含有6个半胱氨酸。结构预测符合抑制剂半胱氨酸节（ICK）模体,6个半胱氨酸组成的3对二硫键连接方式为I-IV,II-V和III-VI。大鼠DRG细胞钠通道活性检测,0.5μM Hhn1a抑制DRG上Nav1.8的峰电流,而2μM Hhn1a则延缓Nav1.8的失活。Hhn1a能够抑制DRG上TTX-S钠离子通道,IC50为4.1μM。亚型选择性结果显示:对异源表达的Nav1.8,Hhn1a同样表现为低浓度抑制峰电流和高浓度延缓失活的特性;对Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5和Nav1.7均表现为抑制活性,IC50分别为3.1±0.08μM、4.2±0.08μM、5.8±0.06μM和2.9±0.03μM。亚型选择性实验证实Hhn1a为Nav1.8的专一性延缓失活剂。Hhn1a可用于探究Nav1.8参与疼痛信号通路调节的分子机制有待进一步探究。海南捕鸟蛛是我国海南省特有的大型剧毒蜘蛛,本实验室在该蜘蛛毒液中发现多种具有重要药理学活性的多肽分子。分析海南捕鸟蛛毒腺的cDNA文库发现,Nav1.7专一性抑制剂μ-theraphotoxin-Hhn2a（HNTX-III）的家族多肽在两个位点存在高突变,即Tyr20突变为His,Ser24突变为Asn。通过色谱分离技术和质谱检测,不能检测到该突变体的天然存在,而HNTX-III在毒液中的含量则可达到1%,这种基因水平存在的天然突变体的生物学活性如何以及其存在的生物学意义是什么。同时,同属HNTX-III家族的HNTX-I,Nav1.7弱抑制活性的HNTX-I的第26位酸性残基组氨酸与强抑制活性的HNTX-III相比突变为碱性天冬氨酸残基,是否这一突变改变HNTX-I对Nav1.7的抑制活性。本实验通过固相化学方法合成了HNTX-III和四个突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N。通过氧化折叠使得二硫键配对,圆二色谱结果检测显示四个突变体CD谱吸收曲线与HNTX-III基本重叠,表明突变没有明显改变其二级结构。因而,正确二级结构的HNTX-III和四个突变体成功制备。本课题检测5个多肽分子对DRG上TTX-S,TTX-R钠离子通道的活性,以及对异源表达钠通道亚型Nav1.3-1.5,Nav1.7,Nav1.8的活性。结果表明,HNTX-III及其天然突变体对TTX-R钠离子通道无抑制活性,对TTX-S钠离子通道具有不同程度的抑制活性。其中,HNTX-III及其突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N对DRG细胞上TTX-S钠通道的IC50分别为0.044μM,4.37μM,0.138μM,2.6μM和1.95μM。因而,Y20,S24,H26的突变降低对DRG TTX-S钠通道的亲和性分别为99.3倍,3.14倍,61.1倍,而双突变-Y20H/S24N降低亲和力仅为44.3倍。对钠离子通道亚型Nav1.7的抑制活性检测显示,HNTX-III及其突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N的IC50分别为0.15μM、9.56μM、1.28μM、7.58μM和2.99μM,因而,Y20,S24,H26和-Y20H/S24N的突变分别降低亲和力为62、8.4、4.9和19.5倍。Nav1.3的抑制活性检测显示,HNTX-III的IC50为0.89μM,突变体-S24N,-Y20H/S24N的IC50则为6.31μM和10.72μM,分别降低7倍和12倍,HNTX-III-Y20H,-H26D则在50μM浓度分别抑制Nav1.3峰电流43%和49%。另外,对Nav1.4,Nav1.5和Nav1.8的抑制活性检测,HNTX-III和四个突变体在10μM浓度下均无抑制活性。同时对分别检测了HNTX-III和四个突变体对DRG-TTX-S钠通道,Nav1.7和Nav1.3的I-V,激活和失活的影响,发现均无显着改变。突变体活性的显着差异表明Try20,Ser24和His26是HNTX-III抑制钠通道的关键残基。HNTX-III的三维结构解析证实了这一结果。综上结果推测,自然选择帮助和保留了最强抑制钠离子通道活性的毒液主要组分HNTX-III,用以防卫和捕食。同时,HNTX-III的三维结构数据的测定和分析,表明其结合钠离子通道的关键残基位于C末端的2个活性区域,为基于结构和活性位点的分子改造和靶点药物设计提供了良好的的前期研究。
丛柏林[8]（2014）在《钾离子通道在鲈鱼巨噬细胞中非特异性免疫功能研究》文中进行了进一步梳理钾离子通道是细胞膜上控制钾离子进出的孔道,几乎存在于所有类型的细胞中,在细胞生物学范畴内是种类最多,分布最广的离子通道。。钾离子通道在非免疫细胞信息传递、细胞分泌、增殖、分化和维持正常功能等方面发挥着重要作用。之前,在几种哺乳动物如仓鼠和人中克隆得到了大量的钾离子通道基因。但是在低等生物特别是鱼类中的相关研究很少,特别是对于钾离子通道有多少种类型,在免疫细胞中发挥着何种作用等科学问题的研究几乎无人进行。众所周知,非特异性免疫应答机制是鱼类等海洋生物应对外来病原体侵染的主要应对方式,离子通道被证实在哺乳动物巨噬细胞激活中发挥着重要作用,但是离子通道在免疫应答过程中的调控功能的研究在国际海洋生物学领域基本上还是空白。本研究以花鲈（Lateolabrax japonicus）为样本,采用分子生物学、生物化学等技术手段,从不同类型的钾离子通道基因家族入手,首先克隆了分别归属于电压门控型钾离子通道（Kv） shaker和shaw家族的4种类型的钾离子通道基因全长序列（spKvl.1,spKv1.2, spKvl.5和spKv31）,研究了这几种基因在鲈鱼不同组织的分布和在LPS刺激条件下在腮、脾脏、头肾、肝脏、肌肉、脑、肠、皮肤、血液等9种组织中不同时间段的表达情况。研究发现,在鲈鱼感染后spKv1.1、spKv31基因的表达量在头肾、血液等免疫相关组织器官中大量增加,表明这两种钾离子通道与鱼类免疫相关器官组织的功能发挥有着明显的关联性。随后在对鲈鱼巨噬细胞进行了原代培养的基础上,研究了spKv1.1, spKv1.2, spKv1.5和spKv3.1基因在LPS刺激下和LPS与钾离子通道阻断剂TEA共同作用下的表达情况。结果表明,这4种基因在LPS刺激2小时后表达量全部升高,其中spKv1.2和spKv1.5的表达量升高了将近6倍,spKv1.1的表达量升高了近35倍。由于先天性免疫防御为鱼类主要的免疫反应,在抗微生物侵染的过程中首先启动,所以结果提示,上述离子通道,特别是spKvl.1积极参与了鲈鱼巨噬细胞的先天性免疫防御过程中。研究还发现,在LPS与钾离子通道阻断剂TEA共同作用下,spKv1.5表达量先被抑制而后急速上升,说明spKv1.5可能存在反馈调节机制,以应对通道阻断剂的负面影响。本研究还开展了电压门控型钾离子通道阻断剂TEA和4-AP对IL-1β、TNFα等免疫细胞因子基因的表达、巨噬细胞增殖、巨噬细胞呼吸爆发等非特异性免疫功能的影响研究。研究发现,LPS刺激后IL-1β、TNFα基因的表达量大幅上升,而在LPS和通道阻断剂共同作用下4h之前细胞因子基因的表达量还不如LPS处理组中上升迅速,但在4h到12h之间,细胞因子基因的表达量却迅速上升,增长量达4-7倍。先前,在哺乳动物细胞中通道阻断剂对免疫细胞因子的表达有抑制与反馈作用,而我们的研究结果对哺乳动物的研究结果做了进一步的证实,提示在鱼类中也可能存在类似的机制。。随后的生理学实验表明,钾离子通阻断剂对鲈鱼巨噬细胞的增殖和呼吸爆发活性有明显的抑制作用,提示巨噬细胞正常功能的发挥与钾离子通道的活性有明显的关联性。上述结果说明：电压门控型钾离子通道参与了鲈鱼巨噬细胞的非特异性免疫反应,不同类型的钾离子通道基因的表达量的变化存在程度上的差异,提示其在不同的阶段可能执行不同的生理功能。而在克隆得到的4种钾离子通道中,spKv1.1在免疫反应中可能发挥着更为积极的作用。本项研究的结果丰富了海洋鱼类免疫学的内容,为鱼类养殖的防病抗病提供了理论依据。
白素格[9]（2014）在《TDP-25对运动神经元延迟整流钾电流电生理特性的影响及双甲氧姜黄素的保护作用》文中研究说明肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）是一个逐渐进展的、具有严重致死性的神经变性疾病，以进行性运动神经元丢失为特征，发病机制不明。TDP-43（TAR DNA bingding protein of43kDa）被认为是在肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）及额颞叶痴呆患者大脑中发现的泛素化包涵体的主要成分，主要功能为参与特定的前mRNA的剪接、转录、维持其稳定性及微小mRNA的生物合成。目前在TDP-43上发现了40种与散发性及家族性ALS有关的显性突变，为TDP-43的功能异常及神经变性病之间的直接联系提供了强有力的证据。TDP-25是在ALS患者的受累大脑区域中发现的分子量为25kDa的TDP-43的C末端片段。研究发现，TDP-25可以促进TDP-43包涵体形成，对运动神经元具有毒性作用，引起神经元变性，在疾病的发病过程中起重要作用，但其机制尚未明确。最初的观点认为：兴奋性毒性可以引起运动神经元损伤。然而，对ALS患者的神经传导的研究发现，轴索膜兴奋性的提高，及过兴奋性的程度与病人的生存期呈负相关。兴奋性的提高包括持续性钠电流的增加及钾电流的减小。然而对TDP-43模型是否存在高兴奋性尚不清楚。随着对ALS研究的不断深入及对K+通道的进一步了解，ALS与钾通道的关系日益受到人们的关注，延迟整流电流（delayed rectifierpotassium current，IKdr）是影响动作电位复极化过程的主要的电流,但有关ALS模型细胞水平上对钾电流的研究甚少。同时，双甲氧姜黄素（Dimethoxy Curcumin, DMC）是姜黄素的类似物，近年来因其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等功效而受了广泛关注，本实验室研究也发现其对转染TDP-43的运动神经元样细胞线粒体有保护作用，可以增强其自噬清除毒性蛋白的能力，此外姜黄素还可以上调Nrf2和II相酶的水平，减少氧化应激产生的损害，进而保护细胞。目的：检测在稳定转染TDP-25基因的运动神经元的延迟整流钾电流性质是否发生改变及动作电位相关指标的改变，以探讨TDP-25对运动神经元产生毒性作用的机制；进一步探讨DMC对电压门控钾通的道调节作用。方法：应用稳定转染TDP-25基因和空质粒（Empty vector）的两种细胞，该细胞系由本实验室构建，参考NSC34细胞株的培养方法进行培养，采用抗生素加压的方法筛选单克隆细胞，将筛选所得单克隆细胞系进行培养、传代。在全细胞膜片钳技术电压钳模式下记录上述两种细胞延迟整流钾电流并分析其性质改变。在电流钳模式下测定两种细胞的动作电位，分别给予两种细胞20pA、40pA、60pA和80pA4个阶梯递增的电流刺激动作电位发生，并记录其阈电位、潜伏期、幅度及动作电位半峰时程（action potential duration at50%repolarization，APD50）等指标以进行比较。将成功培养的稳定转染TDP-25和Empty的NSC34细胞系传代，接种于六孔板的小玻璃片上，12小时后给予换液并给予上述两种细胞浓度为10mΜ的DMC24小时。给予与对照组相同的刺激程序，观察DMC对延迟整流钾通道电流的影响。结果：1、TDP-25组细胞的电流密度小于Empty组，在60mV时有统计学意义（TDP-25组10.65±3.24，Empty组13.26±6.51P<0.05）。2、与Empty组相比，TDP-25组半数激活电压V1/2向超极化方向移动3.73mV左右（TDP-25组8.18±4.95mV，n=14, Empty组11.91±4.34mV，n=19,P<0.05），表明TDP-25组细胞的钾通道更容易在较负的电位下被激活。斜率K无统计学差异（TDP-25组11.46±2.41，Empty组12.82±1.89. P>0.05）。3、TDP-25组（n=14）与Empty（n=11）组细胞的动作电位的阈电位值在各个刺激电流下无统计学差异；TDP-25组细胞的潜伏期值高于Empty组，在40pA时两组相比有统计学意义（分别为38.99±9.48ms和30.13±6.96ms,P<0.05）；TDP-25组细胞的幅度低于Empty组，其中在20pA时有统计学差异（分别为42.96±7.29mV和47.10±8.69mV, P <0.05）。TDP-25组细胞的APD50显着长于Empty组，在40pA、60pA、80pA时有统计学差异（分别为80.41±25.51ms,64.03±23.35ms,55.16±18.97ms和53.18±7.65ms,44.13±5.58ms,36.56±9.24ms）。推断主要与TDP-25组细胞IKdr的激活动力学发生改变有关。4、在给予TDP-25组细胞10uM的DMC处理24小时后，电流密度大于未给药组细胞，表明DMC有增加延迟整流钾电流的趋势，但两组相比无统计学差异。5、给药后IKdr的稳态激活曲线发生了正向偏移，相应地，半数激活电压V1/2向去极化方向移动了8.93mV左右，未给药组V1/2=8.18±4.96mV，给药组V1/2=17.11±7.99mV（P＜0.05），表明DMC改变了延迟整流钾电流的激活性质，具有促进钾通道开放的作用；激活曲线的斜率k由11.46±2.4增加为16.12±2.40（P＜0.01），表明DMC使此钾通道对电压的敏感性增强。结论：在本实验中，我们在运动神经元样细胞上成功检测出延迟整流钾电流，并发现TDP-25通过改变延迟整流钾电流的激活性质，抑制了延迟整流钾通道的活性，减小电流密度，延长动作电位的复极化时程，增大了细胞的放电频率，从而引起神经元兴奋性增高，对神经元产生兴奋毒性作用，据此推测TDP-25对钾电流的抑制产生的细胞兴奋性升高可能是其引起运动神经元变性的可能的机制之一。双甲氧姜黄素（DMC）具有促进延迟整流钾通道开放的作用，改变其激活特性，并可能因此增加延迟整流钾电流的幅度降低神经元兴奋性，从而对神经元起到保护作用。
余方[10]（2011）在《KCNQ2钾通道的温度调控机制研究》文中指出目的：电压依赖型钾离子通道KCNQ2（Kv7.2）在调节神经系统兴奋性方面发挥重要作用。KCNQ2/KCNQ3通道的突变已经被证实是良性家族性新生儿惊厥（benign familial neonatal epilepsy, BFNC）的分子发病基础,KCNQ通道的激活可以减少或降低未成熟大脑的神经元兴奋性的发放和传递。多种因素如神经递质、激素及细胞外离子等通过不同的途径调节KCNQ通道产生的M电流,从而对神经元兴奋性的调节、神经递质的释放和突触的传递等产生影响。因此,研究KCNQ2钾离子通道的调节机制,对了解多种疾病的发病机理和发现新的治疗途径均具有重要的意义。温度对于KCNQ2离子通道的作用尚不清楚,本研究的目的是检测温度对KCNQ2通道的影响,并探讨KCNQ2通道特异性的激活剂氟吡汀对反复热性惊厥（repetitive febrile seizure, RFS）大鼠模型的治疗作用。方法：1)采用PCR方法扩增目的基因,构建携带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）标签的野生型pEGFP-C1-KCNQ2。在融合表达载体构建成功的基础上,在通道上的这两个区域选择了与BFNC相关的位点进行了定点突变。第一个选择的位点S4区段电压敏感区第214位精氨酸突变为色氨酸（R214W, R→W）,第二个位点位于p-loop区段第284位酪氨酸突变为半胱氨酸（Y284C, Y→C）。最后利用重叠延伸（overlap extension） PCR的方法构建R214W、Y284C突变型和孔区截短突变型真核表达载体；2)用构建成功的野生型和突变型KCNQ2的真核表达载体并分别转染小鼠神经瘤细胞（mouse neuroblastoma cells, N2a）和人胚肾293T细胞（human embryonic kindey, HEK293T cell）,荧光共聚焦显微镜（confocal）和Western-blotting检测野生及突变型KCNQ2蛋白在不同温度下的表达情况；将内质网定位质粒pDsRed-ER质粒和野生及突变型KCNQ2的真核表达载体共转染后,Confocal观察野生及突变型KCNQ2蛋白在细胞内的分布及定位情况；3)全细胞膜片钳记录不同温度下HEK293T细胞上的野生及突变型KCNQ2钾通道的电生理特性；4)对SPF级10日龄雄性SD大鼠采用45℃热水浴方法制备反复热性惊厥模型,并给以氟吡汀或者苯巴比妥治疗,观察各组大鼠热性惊厥的发作情况。大鼠28日龄时再次诱发热性惊厥,观察不同组大鼠再次惊厥发作的易感性变化。大鼠30日龄时通过水迷宫方法观察大鼠学习记忆能力的变化。结果：1)经DNA测序分析证实野生及突变型重组载体构建正确。全细胞膜片钳结果提示野生型pEGFP-C1-KCNQ2表达的电流呈外向、电压依赖性、慢激活特征,达最大稳态电流后表现非失活特征；2)温度从37℃升高到40℃后,荧光显微镜结果显示转染野生KCNQ2及突变型R214W和Y284C的细胞荧光强度明显增强（p<0.001）,同时共定位结果分析提示野生及突变型KCNQ2通道蛋白在细胞内滞留,但是孔区截短型通道的表达在温度升高后没有增加；Western-blotting结果表明温度升高后,野生型和突变型KCNQ2通道总蛋白的表达都显着增加（p<0.05）,但是膜表面表达没有明显变化；3)电生理结果表明温度升高可导致KCNQ2通道的激活曲线明显左移,提示高温情况下KCNQ2通道电压依赖性激活的阈值显着性降低；4)氟吡汀和苯巴比妥这两种药物都能显着地延长热性惊厥的潜伏期、降低惊厥的发作等级,并使再次惊厥的易感性下降。水迷宫实验结果表明氟吡汀组在学习和记忆方面损伤较非药物处理组小。结论：温度升高增加了KCNQ2通道在细胞内的表达并且降低了KCNQ2通道的激活阈值,孔区可能是KCNQ2通道转运过程中的重要影响因素。同时,氟吡汀可治疗反复热性惊厥的发作,KCNQ通道作为治疗儿童反复热性惊厥的新靶点值得进一步研究。
二、电压依赖性钾通道抗体与获得性神经性肌强直（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、电压依赖性钾通道抗体与获得性神经性肌强直（论文提纲范文）
（1）Nav1.2小分子抑制剂的发现及其抗癫痫活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 电压门控钠离子通道 |
| 1.1.1 电压门控钠离子通道的结构 |
| 1.1.2 电压门控钠离子通道的表达和生理功能 |
| 1.1.3 电压门控钠离子通道作为药物靶点 |
| 1.2 Nav1.2 和癫痫 |
| 1.2.1 癫痫概述 |
| 1.2.2 Nav1.2 通道相关的癫痫表型 |
| 1.2.3 Nav1.2 相关癫痫的基因型-表型关联 |
| 1.2.4 Nav1.2 相关的癫痫动物模型 |
| 1.3 靶向钠通道的抗癫痫药物研发进展 |
| 1.4 立题依据 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 试剂与材料 |
| 2.1.4 溶液和缓冲液 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 点突变质粒的构建 |
| 2.2.2 细胞培养及转染 |
| 2.2.3 原代海马神经元的分离和培养 |
| 2.2.4 手动膜片钳实验 |
| 2.2.5 Ion Works Barracuda高通量筛选 |
| 2.2.6 癫痫动物模型的构建 |
| 2.2.7 数据处理和统计 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 Nav1.2 通道小分子抑制剂的发现 |
| 3.1.1 Nav1.2 通道小分子抑制剂的高通量筛选 |
| 3.1.2 Nav1.2 小分子抑制剂活性和选择性评价 |
| 3.1.3 Nav1.2 小分子抑制剂的结构改造 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 Nav1.2 通道小分子抑制剂在癫痫动物模型中的抗癫痫活性评价 |
| 3.3 氯桂丁胺T3563 抗癫痫作用的机制研究 |
| 3.3.1 氯桂丁胺简介 |
| 3.3.2 氯桂丁胺对海马神经元兴奋性的影响 |
| 3.3.3 氯桂丁胺对中枢神经系统表达的钠通道亚型选择性 |
| 3.3.4 氯桂丁胺对Nav1.2 通道的抑制特征 |
| 3.3.5 氯桂丁胺抑制Nav1.2 通道的分子机制研究 |
| 3.3.6 氯桂丁胺对致癫痫的Nav1.2 突变电生理功能特征的影响 |
| 3.3.7 小结 |
| 3.4 长春西汀VC03 抗癫痫作用的机制研究 |
| 3.4.1 长春西汀简介 |
| 3.4.2 长春西汀对海马神经元兴奋性的影响 |
| 3.4.3 长春西汀对神经元钾通道的影响 |
| 3.4.4 长春西汀对钠通道的亚型选择性 |
| 3.4.5 长春西汀对Nav1.2 通道的抑制特征 |
| 3.4.6 长春西汀衍生物对Nav1.2 通道的抑制效应 |
| 3.4.7 小结 |
| 3.5 其他:TRPA1 通道新型激动剂的发现 |
| 3.5.1 TRPA1 通道简介 |
| 3.5.2 基于成药库的TRPA1 激动剂高通量筛选 |
| 3.5.3 手动膜片钳检测进行活性确证 |
| 3.5.4 TRPA1 激动剂的选择性评价 |
| 3.5.5 小结 |
| 第4章 研究总结和展望 |
| 4.1 研究总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 癫痫的病因学研究进展 |
| 2.1.1 癫痫相关的神经结构与功能 |
| 2.1.2 脑结构性病因与癫痫 |
| 2.1.3 感染性病因与癫痫 |
| 2.1.4 免疫性病因与癫痫 |
| 2.1.5 代谢性病因与癫痫 |
| 2.1.6 遗传性病因与癫痫 |
| 2.2 NMDA受体基因变异与癫痫的相关性研究进展 |
| 2.2.1 NMDA受体的结构及功能 |
| 2.2.2 NMDA受体的分布 |
| 2.2.3 NMDA受体基因变异与癫痫 |
| 2.2.4 NMDA受体基因变异的药物调节 |
| 第3章 研究内容 |
| 3.1 细胞水平评估突变的NMDA受体功能及干预药物筛选 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.2 GluN2A/GRIN2A-V685G转基因鼠制备 |
| 3.2.1 基因信息 |
| 3.2.2 蛋白信息 |
| 3.2.3 转基因载体构建及目的基因片段的获得 |
| 3.2.4 显微注射 |
| 3.2.5 小鼠出生与检测 |
| 3.2.6 交配扩繁 |
| 3.3 转基因鼠癫痫发病机制及精准干预药物研究 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变对 NMDA 受体功能的影响 |
| 4.2 GluN2A/GRIN2A-V685G突变特异性功能增强剂的筛选 |
| 4.3 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠行为学改变 |
| 4.3.1 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠癫痫发作的特点 |
| 4.3.2 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠认知功能变化 |
| 4.3.3 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠抑郁行为的表现 |
| 4.4 通过在体及离体电生理学检测探讨 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变小鼠癫痫发病的机制 |
| 4.5 依法韦仑(EVF)对 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变小鼠行为学、电生理的影响及应用前景 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）西藏玛氏琵蝎四种钾毒素的克隆、表达、纯化与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTARCT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蝎毒液的组成和结构分类研究 |
| 1.1.1 蝎毒液的组成与分类 |
| 1.1.2 蝎毒素的种类与结构简介 |
| 1.1.3 蝎毒素多肽的获取 |
| 1.2 离子通道与钾离子通道简介 |
| 1.2.1 离子通道简介 |
| 1.2.2 钾离子通道简介 |
| 1.3 蝎毒肽与钾离子通道的相互作用研究 |
| 1.4 本论文工作的出发点 |
| 第二章 西藏玛氏琵蝎序列分析及重组表达载体构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 玛氏琵蝎毒腺转录组RNA的提取 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 PCR扩增和PCR产物纯化 |
| 2.2.4 载体质粒pGEX-4T-1的制备 |
| 2.2.5 载体质粒与PCR产物双酶切 |
| 2.2.6 双酶切产物的纯化 |
| 2.2.7 双酶切产物的连接与转化 |
| 2.2.8 阳性克隆子的鉴定及测序 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 玛氏琵蝎毒素多肽KTX-SM4、KTX-SM6 表达载体的构建 |
| 2.3.2 玛氏琵蝎毒素多肽KTX-SM7、KTX-SM9 重组质粒的构建 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 西藏玛氏琵蝎毒素多肽的表达纯化与鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 重组表达质粒的提取 |
| 3.2.2 蝎毒肽的表达与分离纯化 |
| 3.2.3 蝎毒肽的高效液相分离与制备 |
| 3.2.4 蝎毒肽的冻干、定量与分子量鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 蝎毒素多肽KTX-SM4、KTX-SM6 的表达纯化与分子量鉴定 |
| 3.3.2 蝎毒素多肽KTX-SM7、KTX-SM9 的表达纯化与分子量鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 西藏玛氏琵蝎毒素多肽的功能鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 西藏玛氏琵蝎毒素多肽电生理功能的初步鉴定 |
| 4.2.1 实验材料与方法 |
| 4.3 西藏玛氏琵蝎毒素多肽KTX-SM6功能的系统鉴定 |
| 4.3.1 实验材料与方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 KTX-SM4的电生理活性鉴定 |
| 4.4.2 KTX-SM7的电生理活性鉴定 |
| 4.4.3 KTX-SM9的电生理活性鉴定 |
| 4.4.4 KTX-SM6对Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3 通道的电生理活性 |
| 4.4.5 KTX-SM6对Jurkat T细胞上内源性Kv1.3 通道的电生理活性 |
| 4.4.6 KTX-SM6对Jurkat T细胞内Ca2+信号的影响 |
| 4.4.7 KTX-SM6对Jurkat T细胞释放炎性因子IL-2 的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 攻读学位期间科研成果 |
（4）化合物QO-83对KCNQ通道开放作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 结果 |
| 1. 化合物QO-83对Kv7通道不同亚型的选择性 |
| 2. 化合物QO-83开放Kv7通道的浓度依赖性 |
| 3. 化合物QO-83对Kv7通道电压依赖特征的影响 |
| 4. 化合物QO-83对Kv7通道的动力学过程影响 |
| 5. QO-83对Kv7突变体的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 KCNQ通道相关疾病与药物治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）结节性硬化症及轴索型腓骨肌萎缩症的基因诊断及表型相关性研究（论文提纲范文）
| 附录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 结节性硬化症基因诊断及基因型表型相关性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 轴索型腓骨肌萎缩症临床特点及基因分型研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 综述 |
| 参考文献 |
| 第二部分 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）基于龙血素B结构的新化合物的设计、合成与活性测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 龙血竭概况 |
| 1.2 龙血素B对钠、钾及钙离子通道作用 |
| 1.2.1 钠离子通道 |
| 1.2.2 钾离子通道 |
| 1.2.3 钙离子通道 |
| 1.3 钙离子成像系统 |
| 1.3.1 钙离子指示剂 |
| 1.3.2 钙指示剂标记 |
| 1.3.3 常见的钙成像设备 |
| 1.4 膜片钳实验技术 |
| 1.4.1 单通道膜片钳 |
| 1.4.2 全细胞膜片钳 |
| 1.4.3 膜内面向外和膜外面向外记录模式 |
| 1.5 本论文的初步设想 |
| 第二章 新型化合物的合成 |
| 2.1 目标小分子的设计思想 |
| 2.2 目标化合物的合成 |
| 2.2.1 合成步骤设计 |
| 2.2.2 实验试剂及仪器 |
| 2.2.3 实验部分 |
| 第三章 目标药物对钙通道的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 实验药物及试剂的配制 |
| 3.2.2 DRG细胞的分离与培养 |
| 3.2.3 功能性多神经元钙成像实验 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 目标产物对TRPV1 通道的作用测定 |
| 3.3.2 目标产物对TRPA1 通道的作用测定 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 目标药物对钾通道的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 细胞的培养及转染 |
| 4.2.3膜片钳实验 |
| 4.3 实验结果和分析 |
| 4.3.1 目标药物对Kv1.3 通道的作用 |
| 4.3.2 目标药物对其他类型钾通道的作用 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 目标药物对钠通道的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 目标药物对DRG钠电流影响 |
| 5.3.2 目标药物对Nav1.7 钠电流影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 目标药物的小鼠行为学实验研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料和方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果和分析 |
| 6.4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 攻读学位期间发表的学术论文及获奖情况 |
（7）作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 多肽毒素与疼痛相关钠通道相互作用的研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 蜘蛛毒液的主要组成与多肽类毒素的研究进展 |
| 1.2.1 蜘蛛概述 |
| 1.2.2 蜘蛛毒液的组成 |
| 1.3 蛇毒毒液的主要组成与多肽类毒素的研究进展 |
| 1.3.1 蛇概述 |
| 1.3.2 蛇毒毒液的主要组成 |
| 1.3.3 蛇毒中肽类毒素的研究进展 |
| 1.4 疼痛相关钠通道的研究进展 |
| 1.4.1 电压门控钠离子通道概述 |
| 1.4.2 电压门控钠离子通道的分布与分类 |
| 1.4.3 钠通道与疾病 |
| 1.4.4 钠通道毒素与作用位点 |
| 1.4.5 疼痛相关钠通道研究进展 |
| 第二章 中华眼镜蛇毒液多肽 μ-EPTX-Na1a阻断电压门控钠通道Nav1.8 抑制炎症性和神经病理性疼痛 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 Na1a多肽的分离纯化 |
| 2.2.2 大鼠背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）细胞的急性分离 |
| 2.2.3 SD新生大鼠心肌细胞和小鼠海马神经元的急性分离 |
| 2.2.4 人胚胎肾细胞（HEK293T）的培养与质粒转染 |
| 2.2.5 中华眼镜蛇毒腺RNA的提取，反转录和 3’RACE扩增Na1a家族多肽的基因序列 |
| 2.2.6 谷氨酸内切酶酶解Na1a与Edman降解测序 |
| 2.2.7 炎症性和神经病理性疼痛模型的制备 |
| 2.2.8 酿酒酵母表达Na1a多肽 |
| 2.2.9 Na1a的细胞毒性测定 |
| 2.2.10 Na1a的溶血活性测定 |
| 2.2.11 Na1a对hERG通道影响的测定 |
| 2.2.12 Na1a对小鼠游泳运动影响的测定 |
| 2.2.13 膜片钳活性分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Na1a多肽的分离纯化与对DRG上钠通道的影响 |
| 2.3.2 Na1a家族多肽的 3’RACE基因扩增 |
| 2.3.3 Na1a的谷氨酸内切酶酶解与Edman降解测序 |
| 2.3.4 Na1a多肽与DRG上钠通道的相互作用 |
| 2.3.5 Na1a对钠通道亚型的选择性 |
| 2.3.6 Na1a对炎症性和神经病理性疼痛的镇痛活性 |
| 2.3.7 Na1a的副作用分析：心肌Nav1.5， hERG， 游泳运动，细胞毒性，溶血活性 |
| 2.3.8 Na1a的酿酒酵母表达 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.4.1 Na1a是选择性作用于钠通道的蛇毒多肽 |
| 2.4.2 Na1a能够抑制炎症性疼痛和慢性神经病理性痛 |
| 2.4.3 Na1a具有较好的药物安全性 |
| 2.4.4 Na1a可以作为分子探针探究Nav1.8 参与疼痛调节 |
| 第三章 海南捕鸟蛛毒液多肽 δ-TRTX-Hhn1a专一性延缓电压门控钠通道Nav1.8 的失活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 Hhn1a的分离纯化与Edman降解测序 |
| 3.2.2 大鼠背根神经元细胞的分离 |
| 3.2.3 人胚胎肾细胞（HEK293T）的培养与质粒转染 |
| 3.2.4 膜片钳活性分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hhn1a的纯化与序列测定 |
| 3.3.2 Hhn1a延缓DRG细胞上Nav1.8 通道的失活 |
| 3.3.3 Hhn1a延缓异源表达的Nav1.8 通道的失活 |
| 3.3.4 Hhn1a抑制DRG上TTX-S钠通道电流 |
| 3.3.5 Hhn1a与钠通道亚型的相互作用 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.4.1. Hhn1a是Nav1.8 通道的专一性延缓失活剂 |
| 3.4.2 Hhn1a可用于探究Nav1.8 参与疼痛调节的分子机制。 |
| 第四章 HNTX-III家族多肽的天然突变改变及其对电压门控钠通道的亲和性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 HNTX-III及其天然突变体的化学合成与复性 |
| 4.2.2 大鼠背根神经节细胞的急性分离 |
| 4.2.3 人胚胎肾细胞（HEK293T）的培养与质粒转染 |
| 4.2.4 膜片钳活性分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 HNTX-III及突变体的合成 |
| 4.3.2 HNTX-III及其天然突变体与DRG上钠通道的相互作用 |
| 4.3.3 HNTX-III及其天然突变体与钠通道亚型的相互作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 主要研究结论和进一步研究设想 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 缩写表 |
| 攻读博士学位期间论文发表目录 |
| 致谢 |
（8）钾离子通道在鲈鱼巨噬细胞中非特异性免疫功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据和意义 |
| 1.2 鱼类免疫系统组成 |
| 1.2.1 鱼类免疫组织和器官 |
| 1.2.2 鱼类免疫细胞的种类 |
| 1.3 鱼类免疫机制研究进展 |
| 1.3.1 鱼类先天性免疫防御机制 |
| 1.3.2 细胞因子 |
| 1.3.3 呼吸爆发(respiratory burst) |
| 1.3.4 巨噬细胞增殖 |
| 1.4 离子通道概述 |
| 1.4.1 离子通道的分类 |
| 1.4.2 钾离子通道 |
| 1.5 花鲈(Lateolabrax japonicus) |
| 2 鲈鱼不同类型钾离子通道基因的克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 电压门控型钾离子通道(Kv)基因PCR引物设计 |
| 2.1.4 总RNA的提取 |
| 2.1.5 逆转录合成cDNA |
| 2.1.6 PCR反应预实验 |
| 2.1.7 PCR扩增鲈鱼Kv基因的cDNA序列 |
| 2.1.8 试剂盒回收PCR扩增片段 |
| 2.1.9 PCR扩增片段T-A克隆入载体和序列测定 |
| 2.1.10 用CaCl2制备感受态细胞 |
| 2.1.11 感受态细胞的转化 |
| 2.1.12 PCR检测含阳性克隆的转化菌落 |
| 2.1.13 鲈鱼Kv基因的RACE |
| 2.1.14 测序结果验证 |
| 2.1.15 系统进化树和进化距离 |
| 2.1.16 生物信息学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 鲈鱼不同类型Kv序列全长 |
| 2.2.2 鲈鱼Kv的系统进化树及同源相似性分析 |
| 2.2.3 鲈鱼Kv的结构预测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 不同类型的钾离子通道在鲈鱼各组织的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂和仪器 |
| 3.1.3 RT-PCR和Real-Time PCR引物的设计 |
| 3.1.4 鲈鱼样本的处理及总RNA的提取 |
| 3.1.5 不同组织中spKv1.1、spKv3.1、spKv1.5、spKv1.2基因的扩增和半定量 |
| 3.1.6 Real-time PCR反应条件及反应体系的优化 |
| 3.1.7 Real-time PCR重复性和特异性实验 |
| 3.1.8 Real-time PCR扩增效率比对实验 |
| 3.1.9 实验数据的输出与分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 定量引物设计结果 |
| 3.2.2 不同组织中spKv1.1、spKv3.1、spKv1.5、spKv1.2基因的扩增和半定量 |
| 3.2.3 Real-time PCR重复性和特异性实验 |
| 3.2.4 扩增效率比对 |
| 3.2.5 受感染鲈鱼不同组织spKv1.1、spKv3.1、spKv1.5、spKv1.2 mRNA的相对表达量 |
| 3.3 讨论 |
| 4 不同类型钾离子通道基因在鲈鱼巨噬细胞中的表达分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 鲈鱼巨噬细胞分离和培养 |
| 4.1.4 电压门控型钾离子通道(Kv)基因表达引物设计 |
| 4.1.5 鲈鱼巨噬细胞RNA的提取 |
| 4.1.6 鲈鱼巨噬细胞的收集 |
| 4.1.7 Real-time PCR检测鲈鱼Kv的表达 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 鲈鱼巨噬细胞培养 |
| 4.2.2 PCR反应预实验 |
| 4.2.3 Real-time PCR扩增鲈鱼Kv基因 |
| 4.2.4 鲈鱼巨噬细胞Kv基因的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 钾离子通道阻断剂对鲈鱼巨噬细胞免疫功能的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 |
| 5.1.3 鲈鱼巨噬细胞的收集 |
| 5.1.4 Real-time PCR分析鲈鱼巨噬细胞因子基因的表达 |
| 5.1.5 鲈鱼巨噬细胞增殖测定 |
| 5.1.6 鲈鱼巨噬细胞呼吸爆发活性的测定 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 Real-time PCR扩增鲈鱼细胞因子基因 |
| 5.2.2 钾离子通道阻断剂对鲈鱼巨噬细胞中细胞因子基因的表达的影响 |
| 5.2.3 钾离子通道阻断剂对鲈鱼巨噬细胞增殖的影响 |
| 5.2.4 钾离子通道阻断剂对鲈鱼巨噬细胞呼吸爆发活性的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 本论文的创新点 |
| 7 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文 |
（9）TDP-25对运动神经元延迟整流钾电流电生理特性的影响及双甲氧姜黄素的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 电压门控钾通道生物、药理学特性及其相关神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）KCNQ2钾通道的温度调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章温度对KCNQ2通道调控的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章KCNQ2通道的特异性激活剂对反复热性惊厥大鼠的治疗作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究工作总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士研究生阶段已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
四、电压依赖性钾通道抗体与获得性神经性肌强直（论文参考文献）
- [1]Nav1.2小分子抑制剂的发现及其抗癫痫活性研究[D]. 张献. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [2]NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究[D]. 赵腾. 吉林大学, 2021(01)
- [3]西藏玛氏琵蝎四种钾毒素的克隆、表达、纯化与功能鉴定[D]. 柯才华. 中南民族大学, 2020(07)
- [4]化合物QO-83对KCNQ通道开放作用研究[D]. 李倩. 河北医科大学, 2020(02)
- [5]结节性硬化症及轴索型腓骨肌萎缩症的基因诊断及表型相关性研究[D]. 林珊. 福建医科大学, 2019(07)
- [6]基于龙血素B结构的新化合物的设计、合成与活性测定[D]. 骆滨. 中南民族大学, 2019(08)
- [7]作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究[D]. 张凡. 湖南师范大学, 2015(05)
- [8]钾离子通道在鲈鱼巨噬细胞中非特异性免疫功能研究[D]. 丛柏林. 中国海洋大学, 2014(05)
- [9]TDP-25对运动神经元延迟整流钾电流电生理特性的影响及双甲氧姜黄素的保护作用[D]. 白素格. 河北医科大学, 2014(09)
- [10]KCNQ2钾通道的温度调控机制研究[D]. 余方. 武汉大学, 2011(04)