一、Selective induction of apoptosis in K562 cells by a BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor, STI571（论文文献综述）
黄婷婷[1]（2021）在《基于药效团模型的新型BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂筛选及其分子机制探究》文中研究说明慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤,其发病机制是9号染色体上C-abl原癌基因易位至22号染色体的断裂点集中区（bcr）,其特点是形成费城染色体（Ph）,Ph染色体上的BCRABL融合基因被认为是引发CML的主要原因。研究表明,超过90-95%的CML患者都呈现BCR-ABL融合蛋白表达阳性。BCR-ABL蛋白具有酪氨酸激酶活性,在与ATP进行结合后可持续激活下游信号传导通路如JAK/STAT等途径促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,导致CML发生。因此,BCR-ABL被公认为是治疗CML的重要靶点。可通过直接抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活性,阻止癌细胞增殖,促进细胞凋亡,从而达到缓解或者治疗CML的目的。虽然已有的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂药物如imatinib、dasatinib和ponatinib等可以延长病人的生存期,但其临床使用受到耐药性和严重不良反应的限制。论文第一章介绍了慢性髓系白血病,包括疾病产生的机制及其与BCR-ABL酪氨酸激酶的关系,BCR-ABL酪氨酸激酶的结构与功能,BCR-ABL抑制剂及其治疗过程中产生耐药性的原因。论文第二章介绍了BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂定量药效团模型（Hypogen）和定性药效团模型（Hiphop）的构建,把药效团模型作为3D检索条件去筛选ZINC数据库中潜在的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂,命中的化合物通过类药性五原则、ADMET和分子对接进一步筛选。论文第三章介绍了对上一章筛选出活性较好的化合物进行相似度搜索,并对搜索的化合物进行虚拟筛选以及通过生物实验对筛选的化合物进行活性评价,主要包括细胞毒性实验,流式细胞实验和Western Blot实验,得到活性最好的化合物ZINC21710815,作为BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂的先导化合物。论文第四章应用分子动力学模拟（molecular dynamics,MD）方法研究了野生型BCR-ABL和突变型BCR-ABL/T315I与小分子ZINC21710815结合模式。采用体系平衡分析、氢键分析、结合自由能和自由能分解分析方法以及结合实验结果对体系进行研究分析。模拟结果表明,与imatinib不同,ZINC21710815不管是与野生型还是突变型（T315I）结合,都能将蛋白稳定在DFG-out构象。本论文主要是利用药效团模型和分子对接对化合物数据库进行虚拟筛选,并结合生物实验对其进行活性验证,发现了活性较好且具有选择性的先导化合物ZINC21710815,这一系列的发现为将来设计和开发新的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂提供了一定的科学依据。
陈婷[2]（2020）在《ZSTK474联合Imatinib抗慢性粒细胞白血病活性研究》文中研究说明目的:本课题选取人慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02和K562/G01为研究模型,探讨PI3K抑制剂ZSTK474联合酪氨酸激酶抑制剂Imatinib在慢性粒细胞白血病中的抗白血病作用和分子机制,为白血病的治疗提供新的研究思路,也为ZSTK474应用于抗白血病研究提供实验依据。方法:1.Chou-Talalay法结合Calcu Syn软件分析K562、K562/A02、K562/G01细胞中ZSTK474联合Imatinb的联合效应,确定最佳联合用药比例;2.利用MTT、软琼脂克隆实验检测ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01及PBMCs细胞活力及增殖的影响;3.通过流式细胞术检测ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01细胞周期和凋亡的影响;4.通过MDC和m-RFP-GFP-LC3自噬流镜下观察ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01细胞自噬的影响;5.利用MTT法检测ZSTK474联合Imatinb对K562/A02、K562/G01的化疗增敏活性;采用流式细胞术检测联合用药对多药耐药蛋白泵药活性的影响;6.利用q RT-PCR实验研究ZSTK474联合Imatinb对细胞周期、自噬、凋亡、耐药相关蛋白m RNA表达水平的影响;7.Western-blot法检测ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01细胞周期G0/G1期相关蛋白（cyclin D1、p27、p-p Rb）、凋亡相关蛋白（caspase9、caspase3、PARP裂解片段）、自噬相关蛋白（p62、LC3B）、耐药相关蛋白（P-gp、MRP1）表达水平或磷酸化水平的影响,以及BCR-ABL/PI3K/Akt通路及下游分子表达水平及磷酸化水平的影响;结果:1.在K562、K562/A02、K562/G01细胞中筛选了IC 25 ZSTK474?IC50 Imatinib,IC 50 ZSTK474?IC 50 Imatinib,IC 50 ZSTK474?IC 25 Imatinib三个联合比例浓度,结果发现K562中的IC 50 ZSTK474?IC 50 Imatinib、K562/A02中的IC 50ZSTK474?IC 50 Imatinib、K562/G01中的IC 25 ZSTK474?IC 50 Imatinib的联合用药比例协同效果最好,因此选择以上联合比例浓度进一步开展药物协同机制研究。2.MTT结果表明ZSTK474联合Imatinb能够抑制K562、K562/A02、K562/G01细胞增殖,且药物联用的增殖抑制活性显着大于药物单用,此外实验选取的三组ZSTK474与Imatinb联合用药比例均对PBMC细胞表现出较低的细胞毒性。软琼脂克隆实验显示ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01表现出更显着地增殖抑制作用。3.流式细胞术结果显示,K562、K562/A02、K562/G01细胞中ZSTK474联合Imatinb能阻滞细胞周期G0/G1期、诱导细胞发生凋亡,且联合用药组的周期阻滞作用和诱导凋亡作用显着大于药物单用组;Western blot结果显示,联合用药能上调周期相关蛋白p27的表达水平,下调cyclin D1、p-p Rb的水平,促进凋亡相关蛋白caspase9、caspase3、PARP发生裂解。4.MDC和m-RFP-GFP-LC3自噬流实验发现ZSTK474联合Imatinb能够诱导K562、K562/A02、K562/G01细胞发生自噬,且联合用药的诱导自噬活性大于药物单用组;Western blot结果显示,联合给药使自噬蛋白LC3BII/LC3BI表达显着升高,p62的表达显着降低。5.Western-blot检测可能的信号传导通路,结果显示ZSTK474与IM联合用药能下调K562、K562/A02、K562/G01细胞中Bcr-Abl、PDK1、Akt、m TOR、G3K-3β磷酸化水平,表明联合用药可能是通过抑制BCR-ABL/PI3K/Akt通路发挥抗CML作用。6.q RT-PCR结果显示ZSTK474与IM联合用药能够下调K562、K562/A02、K562/G01细胞p62、Bcl-2的m RNA水平,上调p27、Bax的m RNA水平,且联合用药优于药物单用。7.MTT检测K562/A02和K562/G01细胞化疗增敏结果显示ZSTK474联合Imatinb能够增强K562/A02细胞对ADR的敏感性,但对K562/G01细胞增敏较弱。底物蓄积实验显示联合用药引起耐药细胞中Rh123、5-CFDA的蓄积;此外,联合用药抑制了耐药细胞中MDR1、MRP1的表达。结论:1.ZSTK474联合Imatinb在IC50 ZSTK474?IC50 Imatinib（K562细胞）、IC50ZSTK474?IC50 Imatinib（K562/A02细胞）、IC25ZSTK474?IC50 Imatinib（K562/G01细胞）的比例下显示出较强的药物协同作用。2.ZSTK474联合Imatinib对K562、K562/A02、K562/G01细胞具有抑制增殖、阻滞周期G0/G1期、诱导凋亡和自噬的活性,且药物联合优于药物单用;ZSTK474联合Imatinib抗CML的分子机制可能是协同抑制BCR-ABL/PI3K/Akt通路。3.ZSTK474联合Imatinb可能是通过降低K562/A02、K562/G01细胞中多药耐药蛋白MDR1、MRP1的表达水平和泵药活性发挥增敏作用。
李军[3]（2020）在《具有抗耐药性的新型酪氨酸激酶抑制剂的设计、合成及活性研究》文中研究表明Imatinib 2001年被FDA批准作为慢性粒细胞白血病（CML）患者的主要治疗药物开起了分子靶向治疗的新篇章。然而,随着Imatinib的广泛应用,越来越多的病例出现对Imatinib耐药。尽管第二代Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂Nilotinib,Dasatinib和Bosutinib可抑制大多数对Imatinib耐药的Bcr-Abl突变体,但对Bcr-Abl T315I突变体无效。因此,开发具有抗耐药性的新型酪氨酸激酶抑制剂具有重要意义。通过查阅文献以及对Type II型酪氨酸激酶抑制剂和Bcr-Abl激酶蛋白共晶结构分析,以苯基五元杂环（吡咯,恶唑,噻吩,呋喃）为母核,结合计算机辅助药物设计,运用拼合原理、电子等排原理在结构中引入咪唑并[1,2-b]哒嗪,1H吡唑并[3,4-b]吡啶等结构单元,并以多种取代基进行结构修饰与优化,设计并合成了43个未经文献报道的新型取代苯甲酰胺类化合物,所有目标化合物的结构经MS、1H NMR得到确证。采用MTT比色法,以人慢性髓系白血病细胞K562、人慢性髓系白血病耐药细胞K562/G01、人胃肠道间质瘤细胞GIST-882、人胃肠道间质瘤耐药细胞GIST-1210为测试细胞株,以Imatinib和Ponatinib为阳性对照药,对所合成的化合物进行体外抗肿瘤活性筛选。结果表明:大多数目标化合物对所测试的4个细胞株均表现出中等至显着的细胞毒活性,对人慢性髓系白血病细胞（K562）及耐药细胞（K562/G01）,有31个化合物的活性优于Imatinib,化合物6m、6n、6p、6q和22f的活性优于Ponatinib或与其相当。对人胃肠道间质瘤细胞（GIST-882）及耐药细胞（GIST-1210）,有19个化合物的活性优于Imatinib;化合物17d和22f的活性优于Ponatinib;其中,化合物6m对所测试的四个细胞株均有较好的抑制活性,IC50值分别为0.002±0.007（K562）,0.008±0.006（K562/G01）,1.67±0.01（GIST-882）和1.41±0.06μM（GIST-1210）。以6m为优选目标的化合物进一步研究其作用机制,以K562/G01为测试细胞株,应用AO-EB双染色试验从形态学上判断其诱导细胞凋亡情况,结果表明化合物6m成浓度依赖性诱导细胞凋亡。通过FCM法检测给药后细胞周期动力学的变化,结果表明化合物6m呈浓度依赖性诱导细胞周期在G0/G1期阻滞,流式细胞术检测细胞凋亡结果表明化合物6m呈浓度依赖性诱导细胞凋亡,且诱导效应强于Imatinib。运用计算机辅助药物设计软件SYBYL进行分子模拟对接考察化合物6m与Bcr-Abl T315I蛋白（PDB ID code:3IK3）的对接方式,结果显示化合物6m能与靶蛋白的MET318,ASP381,GLU286形成4个氢键作用。以上所有实验结果表明该类结构的化合物具有进一步的研究价值,为新型酪氨酸激酶抑制剂的深入研究奠定了基础。
黄涛[4]（2019）在《miR-96和miR-374a在慢性髓细胞白血病中作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分miR-96通过靶向BCR-ABL1融合基因抑制CML进展及其机制研究目的:慢性髓细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆性骨髓增生性疾病。其特征性的表现为t（9;22）易位形成BCR-ABL1融合基因,编码的BCR-ABL1融合蛋白在CML发病中起重要作用,BCR-ABL1融合蛋白具有酪氨酸激酶活性,酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）伊马替尼等通过靶向抑制BCR-ABL1蛋白的酪氨酸激酶活性,抑制CML细胞增殖,成为CML患者的一线治疗。但TKIs主要对慢性期的CML患者效果较好,对加速期和急变期患者疗效不显着。而且BCR-ABL1基因可发生突变从而对TKIs治疗产生耐药性,导致TKIs不能完全阻止CML的进展。因此,研究BCR-ABL1基因表达调控机制、通过调控BCR-ABL1基因表达阻断CML进展具有重要意义。MicroRNA（miRNA）是长度18～25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA,miRNA可通过降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译在转录后水平对基因表达起调控作用。研究表明miRNA在包括CML在内的许多恶性肿瘤中参与细胞增殖、分化、侵袭、转移和恶性转化等生物学过程。BCR-ABL1融合基因是CML发生的分子基础,在驱动CML疾病进展中也发挥重要作用。miRNA可否调控BCR-ABL1的表达进而阻断或逆转CML进展的相关研究少见。本研究发现CML急变患者骨髓标本中miR-96较慢性期表达明显减低,通过CML细胞水平研究发现miR-96对BCR-ABL1具有调控作用,进一步影响到CML细胞增殖、分化,在CML进展中的发挥作用,干预miR-96从转录层面调控BCR-ABL1,对慢粒急变具有潜在治疗作用。材料与方法:1.RT-PCR法检测CML患者骨髓细胞中miR-96的表达。收集 CML 慢性期（chronic phase,CML-CP）、急变期（blast crisis,CML-BC）患者及缺铁性贫血（iron-deficiency anemia,IDA）患者或健康个体骨髓样本,分离骨髓单个核细胞,提取总RNA,采用RT-PCR法检测miR-96表达水平。2.以CML急变细胞系K562和MEG01为研究对象,分别转染mi R-96模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）,用 RT-PCR、Western Blot、细胞转染、流式细胞术、荧光素酶检测和DNA甲基化分析等方法研究miR-96通过靶向BCR-ABL1融合基因抑制CML进展的作用和机制。（1）分别将 miR-96 mimics 和 inhibitor 同野生型/突变型 BCR-ABL1 3’ UTR报告质粒转染K562和MEG01细胞,通过荧光素酶活性检测miR-96是否可以与BCR-ABL1的3’ UTR结合,Western Blot法检测BCR-ABL1融合蛋白的表达,探讨miR-96对BCR-ABL1的调控和作用机制。（2）通过EdU法测定分别转染miR-96 mimics和inhibitor后,观察K562和MEG01细胞增殖情况,探讨miR-96对CML细胞K562和MEG01增殖的影响。（3）分别用PMA诱导K562和MEG01细胞向巨核细胞方向分化,hemin诱导K562细胞向红细胞方向分化,RT-PCR法检测miR-96表达,流式细胞术检测分化表面标志CD61和CD71表达,探讨miR-96在CML细胞分化中的作用。（4）分别使用不同浓度西达本胺或地西他滨处理K562和MEG01细胞,RT-PCR法检测miR-96的表达,探讨CML中组蛋白乙酰化与DNA甲基化状态改变对miR-96表达的影响。（5）使用不同浓度伊马替尼处理转染miR-96 mimics的K562和MEG01细胞,用CCK8法检测并计算活细胞比例。探讨上调miR-96表达对伊马替尼杀伤K562和MEG01细胞的协同作用。结果:1.miR-96在CML急变中下调。检测38例CML-CP患者、12例CML-BC患者和22例IDA患者或健康个体骨髓样本中miR-96的表达。结果表明,与对照组相比,CML-CP中miR-96的表达降低（P<0.05）;与CML-CP相比,miR-96在CML-BC中的表达水平进一步降低（P<0.05）。此外,CML-BC细胞株中miR-96表达也较CML-CP患者标本下调（P<0.001）。这些结果表明miR-96参与CML疾病进展。2.miR-96通过靶向3’ UTR区域抑制BCR-ABL1的翻译。TargetScan显示miR-96可以不完全互补地结合到BCR-ABL1的3’ UTR区域。将miR-96 mimics转染K562和MEG01细胞后,双荧光素酶检测显示野生型BCR-ABL1 3’UTR荧光素酶活性随miR-96表达的增加而降低,但对BCR-ABL1 3’UTR突变质粒无影响。同样,抑制miR-96导致野生型BCR-ABL1 3’UTR报告质粒的双荧光素酶活性增加,而突变质粒的双荧光素酶活性没有增加。这些结果表明miR-96可以与BCR-ABL1的3’UTR结合。同时,研究结果显示,miR-96在不调控BCR-ABL1 mRNA表达的情况下,抑制了 BCR-ABL1蛋白表达、自磷酸化（pTyr）以及下游STAT5和MEK/ERK信号通路活性。这些结果表明,miR-96通过抑制BCR-ABL1翻译来调控BCR-ABL1的表达和功能。3.miR-96低表达促进了 CML细胞的增殖。将mmiR-96的mimics转染到CML-BC细胞株K562和MEG01中,用EdU法测定细胞增殖,发现过表达miR-96可以显着降低CML细胞增殖（P<0.01）;将miR-96 inhibitor转染到K562和MEG01细胞中,EdU检测结果显示,K562和MEG01细胞的增殖能力明显升高（P<0.01）。这些表明miR-96低表达促进了 CML-BC细胞的增殖。4.miR-96参与了 CML-BC细胞分化阻滞。在体外分化诱导模型中发现CML-BC细胞在向红细胞方向分化后miR-96表达升高,表明miR-96可能参与CML-BC细胞分化,在CML从慢性期向急变期的转变过程发挥作用。5.西达本胺和地西他滨介导CML-BC细胞中mmiR-96表达的恢复。组蛋白乙酰化修饰及DNA甲基化在miRNA的表达调控中发挥重要作用。我们的研究发现经组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺处理的K562和MEG01细胞中,miR-96表达呈浓度依赖性上调,BCR-ABL1表达下调,提示miR-96在CML-BC中的表达降低至少部分可被西达本胺恢复。此外,我们比较了 5例CML患者骨髓CD34+细胞与5例正常供体CD34+细胞的全基因组甲基化微阵列数据,发现miR-96启动子的两个甲基化位点存在异常高甲基化,用地西他滨处理CML-BC细胞后,miR-96的表达水平上调,表明CML-BC中miR-96的低表达同时受DNA异常高甲基化调控。6.上调miR-96表达增加了 CML-BC细胞对伊马替尼的敏感性。将不同浓度的伊马替尼加入转染miR-96 mimics的K562和MEG01细胞,用CCK8法检测并计算活细胞比例。我们发现,上调miR-96水平可以以浓度依赖的方式增加伊马替尼对CML-BC细胞的杀伤作用。结论:1.miR-96在CML急变中下调。2.miR-96直接与BCR-ABL1的3’ UTR结合,抑制其蛋白翻译、自磷酸化以及下游STAT5和MEK/ERK信号通路活性。3.miR-96低表达可促进CML-BC细胞增殖,参与细胞分化。4.CML患者miR-96启动子区存在CpG岛,且存在两个异常的高甲基化位点。西达本胺和地西他滨可能通过表观遗传机制恢复CML-BC中miR-96的低表达。5.上调miR-96的表达增强了伊马替尼对CML-BC细胞的杀伤作用。miR-96可能是干预CML急变的新靶点,基于miRNA的联合治疗为CML-BC的治疗提供了新的策略。第二部分miR-374a通过靶向c-MYC增加CML细胞对HHT的敏感性研究目的:慢性髓细胞白血病包含恶性程度递增的慢性期、加速期和急变期。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）靶向抑制BCR-ABL的酪氨酸激酶活性,但TKIs主要对慢性期的CML患者效果较好,对加速期和急变期患者疗效不显着,而部分慢性期患者在用药后还会出现耐药和复发,最终进入疾病的终末期-急变期,此时TKIs疗效不佳,预后极差。因此,寻找新的治疗方法十分迫切。高三尖杉酯碱（Homoharringtonine,HHT）是从我国三尖杉属植物中分离出的抗肿瘤生物碱之一,属细胞周期特异性药物,主要通过抑制真核细胞的蛋白质合成,促进肿瘤细胞分化及凋亡发挥其抗肿瘤作用。研究发现当TKIs治疗的CML患者,出现包括T315I突变等耐药性突变时,HHT有显着的疗效,因此,CML诊治中国指南以及NCCN指南均推荐HHT做为TKIs耐药患者的治疗选择。然而,HHT在治疗CML中的确切机制尚未完全明了,而且其作为一种化疗药物,有心脏及骨髓抑制等毒副作用,限制了其广泛应用,因此寻找HHT的增敏剂、增加HHT的药物敏感性从而降低HHT的使用剂量,具有重要的临床意义。研究发现miRNA表达异常参与CML细胞对化疗药物的敏感性,比如,miR-124-3p通过miR-124-3p/B4GALT1轴增加CML细胞对化疗的敏感性;上调miR-424可抑制CML细胞的BCR-ABL活性和增加对伊马替尼的敏感性;miR-486调节CML祖细胞的药物敏感性。c-MYC是一个重要的原癌基因,在近一半的人类肿瘤中表达失调,并和细胞恶性转化和肿瘤进展密切相关,研究发现c-MYC异常高表达在CML细胞TKI耐药及急变中发挥很重要的作用。而miRNA调控c-MYC在多种疾病进程中发挥重要作用,例如扩张性心肌病,乳腺癌,前列腺癌,肝癌等。于是,我们将研究聚焦在可否通过miRNA调控c-MYC的通路增加CML细胞对HHT治疗的敏感性中。本课题通过研究发现CML患者骨髓标本中miR-374a低表达,尤其在急变期降低更为明显,在CML细胞系中miR-374a可调控c-MYC的表达影响到CML细胞增殖与凋亡,并且增加CML细胞对HHT的敏感性,另外,HHT能够以时间和剂量梯度依赖的方式上调miR-374a表达,miR-374a的重新表达能够增强CML细胞对HHT的敏感性,促进CML细胞凋亡,从而形成miR-374a-c-MYC-HHT环路发挥抗肿瘤作用。材料与方法:1.RT-PCR法检测CML患者骨髓标本单个核细胞中miR-374a的表达。收集CML慢性期和急变期患者及对照组的骨髓标本,分离骨髓单个核细胞,提取总RNA,采用RT-PCR法检测miR-374a表达水平。2.以CML细胞系K562为研究对象,分别转染miR-374a mimics和inhibitor,用RT-PCR、Western Blot、细胞转染、流式细胞术等方法研究miR-374a通过靶向c-MYC基因增加CML细胞对HHT的敏感性作用和机制。（1）流式细胞术检测转染miR-374a mimics,添加HHT后K562细胞凋亡情况,检测miR-374a协同HHT诱导K562细胞凋亡情况。（2）流式细胞术检测分别转染miR-374a mimics和inhibitor后K562细胞凋亡情况,探讨miR-374a对K562细胞凋亡的影响;同时转染miR-374a inhibitor 和 c-MYC 过表达质粒,同时转染 miR-374a mimics 和 c-MYC siRNA 后K562细胞凋亡情况,探讨miR-374a是通过调控c-MYC来影响K562细胞凋亡。（3）分别按照浓度梯度和时间梯度用HHT处理K562细胞,RT-PCR法检测miR-374a和c-MYC的表达,Western Blot法检测c-MYC蛋白的表达,流式细胞术检测K562细胞凋亡情况,探讨CML中HHT对miR-374a和c-MYC表达的影响,以及HHT、miR-374a、c-MYC三者在K562细胞凋亡中的作用关联。结果:1.CML患者骨髓标本单个核细胞中miR-374a的表达下调,尤其在急变期降低更为明显。2.上调miR-374a表达增强K562细胞对HHT的敏感性。与对照组相比,单独转染miR-374a mimics能诱导K562细胞凋亡;与单独转染miR-374a mimics相比,转染miR-374a mimics加HHT诱导K562细胞凋亡更明显（P<0.05）,表明miR-374a mimics能够增强HHT诱导的细胞凋亡（P<0.05）,即上调miR-374a表达增强了 K562细胞对HHT的敏感性。与单纯转染miR-374a mimics组相比,转染miR-374amimics加HTT后miR-374a的表达更高（P<0.01）,表明HTT也对K562细胞miR-374a的表达产生影响。3.c-MYC表达下调是miR-374a表达上调增加K562细胞对HHT的敏感性的原因之一。生物信息学技术分析表明miR-374a可能直接与CML发生发展过程中重要的癌基因c-MYC的3’ UTR结合,c-MYC可能是miR-374a发挥抗白血病作用的靶点之一。和对照组相比,转染miR-374a mimics后,miR-374a表达上调（P<0.01）,c-MYC mRNA水平和蛋白水平均表达下调（P<0.05）,和单纯转染miR-374a mimics组对比,转染miR-374a mimics加HHT组c-MYC表达下调更加明显（P<0.05）。反之,和对照组相比,转染miR-374a inhibitor后,miR-374a表达下调（P<0.01）,c-MYC mRNA水平和蛋白水平均表达上调（P<0.05）。分别将miR-374a inhibitor和c-MYC siRNA转染至K562细胞,发现上调miR-374a表达和下调c-MYC表达均能诱导细胞凋亡（P<0.05）。与之相反,分别将miR-374a inhibitor和c-MYC过表达质粒转染至K562细胞,细胞凋亡被抑制（P<0.05;P<0.05）。回复实验显示c-MYC过表达后miR-374a mimics诱导的凋亡被部分逆转。4.HHT介导CML中miR-374a表达的恢复将K562按照HHT浓度梯度和作用时间梯度分别孵育72h和96h,结果显示miR-374a表达呈现HHT剂量和时间依赖性增加（P<0.01）,c-MYC mRNA和蛋白质表达呈现HHT剂量和时间依赖性下调（P<0.01）。这些结果证明HHT能够介导K562细胞中miR-374a表达的恢复。结论:1.CML-CP患者中mi R-374a的表达明显低于对照组,在CML-BC患者中miR-374a的表达低于CML-CP,上调miR-374a表达可促进K562细胞凋亡。上调miR-374a联合HHT增加K562细胞凋亡,增加了 K562细胞对HHT的敏感性。2.miR-374a可能通过c-MYC的介导增加了 K562细胞对HHT的敏感性。即通过miR-374a-c-MYC途径发挥抗白血病作用。3.HHT能够以时间和剂量梯度依赖的方式上调miR-374a表达,miR-374a的重新表达能够增强K562细胞对HHT的敏感性,促进K562细胞凋亡,从而形成miR-374a-c-MYC-HHT环路发挥抗肿瘤作用。miRNA和HHT联合应用可能成为干预CML的新策略。
黄睿[5]（2015）在《EPS8参与髓系白血病生物学过程及其机制的研究》文中研究指明髓系白血病是成人常见的白血病类型,包括急性髓系白血病（AML）和慢性粒细胞白血病（CML）。AML是一个异质性疾病,原癌基因的突变、染色体异常发生率高。AML的治疗主要分为两个阶段,第一阶段为诱导治疗,常用阿糖胞苷联合蒽环类抗生素。第二阶段为缓解后治疗,采用联合化疗或造血干细胞移植。过去的三十年,65岁以下的年轻AML的生存率得到一定的改善,主要源于支持治疗的改善,使得患者能耐受联合化疗以及移植,从而获得长期生存,但是超过三分之一的患者会出现复发。老年白血病患者由于难以耐受化疗及移植,治疗效果欠佳,在过去的几十年中长期生存无明显改善,5年的总生存不到10%。难治复发及老年患者是AML的治疗难点,需要探讨新的治疗。分子靶向治疗由于其特异性,具有高效低毒的特点,成为近年来肿瘤治疗研究的热点。突变的FLT3抑制剂、ABT-199、IDH抑制剂等正在进行临床试验,初步显示其抗白血病的优势。虽然在AML靶向治疗方面,已经有了一些研究进展,但由于AML的患者具有较大的异质性,需要寻找更多的靶点,对AML患者进行个体化治疗。而对于CML的治疗,靶向药物伊马替尼及其二代、三代酪氨酸酶抑制剂（TKI）已经取得巨大的成功,但是仍然有20-51%的CML患者对TKI耐药。TKI耐药的原因众多,包括Abl酪氨酸激酶区域的点突变、BCR/ABL基因扩增或过表达、ATP药泵表达增高、SRC家族激酶活性异常增高、干细胞耐药、骨髓微环境介导耐药、表观遗传学介导的耐药等。TKI耐药是CML治疗的难题,探讨TKI以外的其他治疗有助于克服TKI耐药。表皮生长因子底物8（EPS8）是一个表达在细胞浆的接头蛋白。EPS8是EGFR等受体型和非受体型酪氨酸激酶的底物,其结构从N端到C端分别包括磷酸化酪氨酸结合蛋白域、SH3以及SAM-PNT域,可以与其他蛋白组成复合物,传递信号。研究表明 EPS8 可分别与 Abil、RN-tre、Shc、Shb、Dvl-1、IRSp53 等蛋白结合,组成复合物传递信号,参与细胞骨架的重塑、增殖、凋亡、粘附、迁移、受体内化等生理过程。近年来的研究发现EPS8还参与恶性肿瘤的发展、侵袭转移。多项研究表明EPS8在鳞癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤中高表达,并与侵袭、预后相关,被认为是一个原癌基因。然而,EPS8在血液肿瘤的研究较少,EPS8是否参与白血病的生物学过程尚不清楚。我们前期研究发现AML患者骨髓EPS8 mRNA较正常人骨髓表达增高,与对化疗的反应相关,但其参与白血病生物学过程的机制尚不清楚。本研究分三个部分探讨了 EPS8在髓系白血病生物学过程中的作用及其机制:Bcr-abl+细胞系及CML患者EPS8表达情况;过表达EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的影响;沉默EPS8对髓系白血病生物学功能的影响。结果发现在初发CML患者骨髓EPS8 mRNA表达高于正常对照,治疗后缓解的CML患者骨髓EPS8 mRNA水平低于初发CML患者。过表达EPS8使髓系白血病细胞增殖加快、凋亡减少、粘附迁移能力增加、对药物敏感性下降,PI3K/AKT、RAS/ERK、JAK2/STAT5信号通路激活,而沉默EPS8有相反的作用。本研究证实了 EPS8参与髓系白血病生物学过程,提示EPS8可作为髓系白血病治疗的靶点之一。第一章Bcr-abl+细胞系及CML患者EPS8表达情况目的探讨EPS8在Bcr-abl+细胞系及CML患者骨髓单个核细胞的表达方法:采用Q-RT-PCR方法对2013-2015年南方医科大学珠江医院血液科CML患者骨髓标本及广州金域医学检验中心CML RNA标本共98例及非白血病骨髓标本11例进行检测EPS8基因mRNA表达。98例CML患者中,慢性期58例,加速期11例,急变期21例,治疗后血液学缓解8例。EPS8与内参比值以2-ΔΔCt表示。采用western blot方法对CML细胞株KBM5、MEG01、K562、小鼠abl+温度敏感B淋巴细胞株S4C2-1、S9、小鼠32D-p210-野生型、32D-p210-T315I细胞株检测EPS8蛋白的表达。结果:1.CML不同分期EPS8与内参比值中位数分别为慢性期4.12（0.76-13.2）,加速期 3.25（1.77-9.01）,急变期 4.12（2.11-9.41）,治疗后血液学缓解 1.46（0.39-1.79）,正常对照 1.00（0.90-1.24）。采用非参数分析的多样本秩和检验进行统计学分析。慢性期、加速期、急变期、治疗后血液学缓解及正常对照的平均秩次分别为58.16、64.14、63.48、32.62、29.32,总体有统计学差异（P=0.006）。慢性期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异（P值分别为0.047及0.029）,加速期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异（P值分别为0.010及0.001）,急变期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异（P值分别为0.005及0.000）。2.对三株人CML细胞株KBM5、MEG01、K562分析EPS8蛋白表达,发现MEG01表达低,KMB5及K562表达高。发生恶性转化的稳定转染小鼠温度敏感Abl病毒的B淋巴细胞株S4C2-1的EPS8蛋白水平高于亲代未恶性转化细胞S9。转染了突变型BCR/ABL-T315I的TKI耐药小鼠髓系细胞株32D-p210-T315I 的 EPS8 表达高于野生型 32D-p210-wt。结论:初发CML患者骨髓EPS8 mRNA高于正常对照,治疗后骨髓缓解的CML患者EPS8表达水平下降。恶性转化细胞S4的EPS8蛋白水平高于亲代未转化细胞SP9,TKI耐药的32D-p210-T315I细胞EPS8蛋白水平高于32D-p210-wt,提示EPS8参与CML的生物学过程。第二章过表达Eps8对髓系白血病细胞生物功能的作用及其机制研究目的:探讨过表达Eps8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制。方法:构建pLVX-hEPS8-Puro及pLVX-AcGFP1-N1慢病毒载体,转染到293T细胞包装表达hEPS8及GFP的慢病毒,感染HL60细胞并用嘌呤霉素筛选,建立稳定转染EPS8的HL60细胞株HL60-EPS8及其对照细胞株HL60-GFP。采用CCK8检测HL60-EPS8细胞株及对照细胞、亲代细胞的增殖。用Annexin-APC/7-AAD染色后流式细胞仪检测细胞的凋亡。用PI对细胞染色后流式检测细胞周期。将细胞铺在包被了 fibronectin的培养板上,1.5小时后光学显微镜下观察粘附板底的细胞,并用CCK8检测粘附细胞的OD值。用Transwell小室检测细胞的迁移能力。用荧光标记的鬼笔环肽检测细胞的F-actin。将柔红霉素、阿糖胞苷在不同浓度、不同时间处理细胞,CCK8检测细胞的存活率。采用 western blot 检测细胞信号通路的蛋白 p-AKT、p-ERK、p-STAT5、p-PP2Ac。结果:1.成功构建过表达EPS8的HL60-EPS8细胞株,mRNA水平EPS8表达为对照细胞HL60-GFP细胞株的52.09倍,蛋白水平EPS8表达为对照细胞HL60-GFP细胞株的10.62倍。2.24 小时 HL-60 OD 值为 0.44±0,HL60-GFP 为 0.44±0.01,HL60-EPS8 为0.47±0,不同组间有差异（F=31.864,P=0.001）。HL60-EPS8 与 HL60 及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显着性意义。（P均<0.01）。第48 小时 HL-60 OD 值为 0.62±0.01,HL60-GFP 为 0.62±0.01,HL60-EPS8 为0.67±0.01。不同组间有差异（F=18.827,P=0.003）,HL60-EPS8 与 HL60 及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显着性意义（P均<0.01）。72小时 HL-60 OD 值为 0.86±0.01,HL60-GFP 为 0.87±0.01,HL60-EPS8 为1.01±0.03。不同组间有差异（welch=28.388,P=0.008）。HL60-EPS8 与 HL60及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显着性意义（P均<0.05）。3.细胞在包被fibronetin的培养板上培养1.5小时,光学显微镜下观察到HL60-EPS8数量多于HL60-GFP及HL60。CCK8计数显示HL60细胞粘附在 96 孔板细胞 OD 值为 0.43±0.05,HL60-GFP 为 0.51±0.06,HL60-EPS8为0.69±0.07。三组细胞粘附在fiberonectin的细胞OD值有显着性差异（F=28.432,P=0.000）。HL60-EPS8 组粘附细胞 OD 值与 HL60、HL60-GFP组相比,差异均有显着性意义（P均<0.001）。4.采用 annexin V/7-AAD 双染法检测凋亡,HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 的早期凋亡细胞比例分别为3.31±0.21%、3.7±0.2%、2.43±0.06%。三组细胞的早期凋亡比例有显着性差异（F=43.712,P=0.000）。HL60-EPS8早期凋亡比例与HL60、HL60-GFP组相比,差异均有显着性意义（P均<0.01）。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 的晚期凋亡细胞比例分别为 1.13±0.09%、1.04±0.13%、1.01±0.07%,三组细胞的晚期凋亡比例无显着性差异（F=1.098,P=0.392）。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞的总凋亡比例分别为4.44±0.28%、4.74±0.26%、3.44±0.03%。三组细胞的总凋亡比例有显着性差异（Welch=44.730,P=0.008）。HL60-EPS8 总凋亡比例与 HL60、HL60-GFP相比,差异均有显着性（P<0.05）。5.PI染色测定细胞周期,发现HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞S比例分别为 48.39±0.87%、55.44±0.25%、60.57±0.87%。三组细胞 S 期比例之间差异有显着性（F=213.519,P=0.000）。三组细胞多重组间比较,发现三组细胞S期比例差异均有显着性（P均<0.05）。6.Transwell小室检测迁移能力,在光学显微镜下观察到HL60-EPS8细胞从上室迁移到下室细胞明显多于HL60、HL60-GFP细胞。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 下室细胞的 OD 值分别为 0.99±0.01,0.96±0.02,1.23±0.02,三组迁徙细胞OD值差异有显着性（F=544.573,P=0.000）。HL60-EPS8组迁移细胞OD值与HL60、HL60-GFP相比,差异均有显着性（P均<0.001）。7.用荧光标记的鬼笔环肽对F-actin染色,在共聚焦显微镜下观察HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞F-actin分布情况,三组细胞无明显差异。8.用不同浓度柔红霉素分别处理HL60-GFP、HL60-EPS8细胞24小时、48小时、72小时。24小时,在15nM、30 nM、60nM、120 nM浓度的柔红霉素作用下HL60-EPS8存活率均高于HL60-GFP组,差异有显着性（t-7.120,P=0.002;t=-6.664,P=0.003;t=-34.689,P=0.000,t=-19.724,P=0.000）。48小时,在15nM、30 nM、60nM、120 nM浓度的柔红霉素作用下HL60-EPS8存活率均高于HL60-GFP组,差异有显着性。（t=-25.216,P=0.000;t=-69.148,P=0.000;t=-158.408,P=0.000,t=-16.612,P=0.000）。72 小时,在 15nM、30nM、60nM浓度HL60-EPS8细胞存活率均高于HL60-GFP,在各浓度均有统计学意义（t=-50.289,P=0.000;t=-38.240,P=0.000;t=8.316,P=0.001）。用阿糖胞苷分别处理HL60-GFP、HL60-EPS8细胞株,比较不同浓度（0、250nM、500nM、1000nM）,不同时间点（48小时及72小时）与不用药细胞相比的存活率。48小时在250nM、500nM、1000nM浓度细胞存活率进行分析,HL60-EPS8细胞存活率在各浓度均高于HL60-GFP,差异具有显着性（t=-8.268,P=0.000;t=-7.714,P=0.000,t=-7.408,P=0.000）。72 小时在 250nM、500nM、1000nM浓度细胞存活率进行分析,HL60-EPS8细胞存活率在各浓度均高于 HL60-GFP,差异具有显着性（t=-10.447,P=0.000;t=-11.632,P=0.000,t=-15.908,P=0.000）。9.信号通路蛋白分子检测提示HL60-EPS8细胞的p-ERK、p-AKT、p-STAT5高于HL60-GFP,而p-PP2Ac水平低于对照细胞。结论:过表达EPS8后HL60的增殖加快,凋亡减少,粘附能力增加,迁移能力增加,对化疗药物的敏感性下降,p-ERK、p-AKT、p-STAT5水平升高。EPS8可能通过调控RAS/ERK、PI3K/AKT、JAK2/STAT5信号通路调控细胞生物学功能。第三部分沉默EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制研究目的探讨沉默EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制研究方法构建4个shRNA-EPS8质粒载体,分别转染到293T细胞,包装沉默EPS8的慢病毒。将慢病毒感染K562,选择沉默EPS8效率最高的病毒继续用嘌呤霉素筛选,构建稳定沉默EPS8的K562细胞株K562-shRNA-EPS8及对照细胞株K562-GFP。采用MTT方法检测K562-shRNA-EPS8及对照细胞24小时、48小时及72小时增殖。采用Annexin V-APC/7-AAD染色,流式检测K562-shRNA-EPS8及对照细胞的凋亡。用PI对K562-shRNA-EPS8及对照细胞染色,流式检测细胞周期。提取K562-shRNA-EPS8及对照细胞总蛋白,采用western blot 方法检测 p-AKT、p-ERK、p-PP2Ac、p-STAT5、PTEN。结果1.设计4条沉默EPS8的序列,分别连接入慢病毒载体,进行PCR测序,测序结果提示连接在载体上的序列和目的序列一致。2.将慢病毒感染K562细胞,三天后在荧光显微镜下观察感染率在70%以上。细胞经扩增及嘌呤霉素筛选后,Q-RT-PCR检测抑制效率。4个慢病毒干扰EPS8 效率分别为 58.03%、14.6%、13.67%、74.93%,western blot 验证在蛋白水平序列4干扰EPS8最显着,选取序列4慢病毒感染的K562细胞为功能实验用的稳定转染株。3.MTT检测K562-shRNA-EPS8细胞在24小时、48小时、72小时的OD值。结果发现24小时K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞OD值分别为0.61±0.01、0.58±0.02、0.56±0.02,发现三组之间差异有显着性（F=5.328,P=0.030）。K562-shRNA-EPS8细胞与K562-GFP细胞相比,均值差异无显着性（P>0.05）。48 小时 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞 OD 值分别为 0.90±0.02、0.87±0.03、0.79±0.02。三组均数差异有显着性（F=23.073,P=0.000）,发现K562-shRNA-EPS8细胞与K562-GFP细胞相比,均值差异有显着性（P<0.05）。72 小时 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞 OD值分别为1.19±0.08、1.13±0.07、0.99±0.11。三组均值差异具有显着性（F=5.377,P=0.029）。K562-shRNA-EPS8 细胞与 K562-GFP 细胞相比,OD值差异有显着性（P<0.05）。4.用 Annexin V-APC 及 7-AAD 对 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞进行染色后,流式检测细胞凋亡。结果发现K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞早期凋亡分别为 2.66±0.14%,6.25±0.10%,14.27±0.06%;三组早期凋亡率差异有显着性（F=9506,P=0.000）。K562-shRNA-EPS8组和K562、K562-GFP组相比,差异均有显着性（P均<0.001）。K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞晚期凋亡率为1.19±0.06%、2.18±0.17%、6.45±0.08%,三组之间晚期凋亡率差异有显着性（F=1859,P=0.000）。K562-shRNA-EPS8 组和 K562、K562-GFP 组相比,晚期凋亡率差异均有显着性（P均<0.001）。K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞总凋亡率为3.85±0.20%、8.43±0.11%、20.72±0.13%。三组之间总凋亡率差异有显着性（F=9912,P=0.000）。K562-shRNA-EPS8 组和 K562、K562-GFP组相比,总凋亡率差异均有显着性（P均<0.001）。5.用PI对K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8细胞进行染色,流式检测细胞周期显示K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8细胞的G1期细胞比例为47.78±0.48%、48.04±0.66%、54.85±0.45%,三组均值差异有显着性（F=163.847,P=0.000）,K562-shRNA-EPS8 与 K562、K562-GFP 相比,差异均有显着性（P均<0.001）。6.将细胞加入包被fibronectin的96孔板,培养1.5小时,PBS洗2遍,光学显微镜下观察粘附板底的细胞,观察到粘附在fibronectin的K562-shRNA-EPS8细胞比K562、K562-GFP细胞数量减少。CCK8计数显示K562细胞粘附在96 孔板细胞OD值为 0.48±0.05,K562-GFP 为 0.46±0.29,K562-shRNA-EPS8为0.35±0.06。三组细胞粘附在fiberonectin的细胞OD值有显着性差异（F=12.060,P=0.001）。K562-shRNA-EPS8 组粘附细胞 OD 值与 K562、K562-GFP组相比,差异均有显着性意义（P均<0.01）。7.采用transwell小室法检测细胞的迁移能力,经过在显微镜下对K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8 组的下室细胞进行观察,发现K562-shRNA-EPS8下室细胞明显比其他两组对照细胞数量减少。CCK8法对下室细胞进行定量分析提示K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8下室细胞OD值分别为0.14±0.00,0.14±0.00,0.10±0.00。三组迁徙细胞OD值差异有显着性（F=208.245,P=0.000）。K562-shRNA-EPS8 组迁移细胞 OD 值与 K562、K562-GFP相比,差异均有显着性（P均<0.001）。8.用伊马替尼分别处理K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞株,结果发现48小时在1.2μM、1.6μM、2.0μM的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显着性（t=3.441,P=0.03;t=12.093,P=0.000;t=11.078,P=0.000）。72 小时在 0.8μM、1.2μM、1.6μM、2.0μM 的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显着性（t=17.079,P=0.000;t=5.204,P=0.029;t=34.692,P=0.000;t=23.603,P=0.000）。用柔红霉素分别处理K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞株,48 小时在 0.05μM、0.1μM、0.15μM的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显着性（t=17.802,P=0.000;t=15.563,P=0.000;t=5.665,P=0.001）。72 小时在0.025μM、0.05μM、0.075μM、0.1μM 的浓度,K562-shRNA-EPS8 细胞存活率低于 K562-GFP,差异均有显着性（t=6.736,P=0.001;t=7.857,P=0.000;t=8.617,P=0.000;t=4.638,P=0.004）。9.提取 K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8 细胞的蛋白,检测 p-ERK、p-AKT、p-STAT5、PTEN的表达变化,结果发现K562的EPS8沉默后导致p-ERK、p-AKT、p-STAT5 水平下降,而PTEN的水平升高。并且,BCR/ABL磷酸化水平下降,磷酸化PP2Ac水平升高。结论成功构建了干扰EPS8的K562-shRNA-EPS8稳定转染株及对照细胞株K562-GFP。K562-shRNA-EPS8细胞的增殖低于对照细胞,早期凋亡及晚期凋亡均较对照细胞增加,细胞周期阻滞在G1,p-ERK、p-AKT、p-STAT5水平下降,而PTEN的水平升高。沉默EPS8可能通过影响RAS/ERK、PI3K/AKT、JAK2/STAT5信号通路影响K562细胞的增殖、凋亡、细胞周期。EPS8有望成为克服CML耐药的靶点,为CML克服耐药的个体化治疗提供新思路。
夏德雨[6]（2014）在《P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-abl siRNA及STI571对慢性粒细胞白血病K562细胞的实验研究》文中认为慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia.CML）是一种起源于多能干细胞异常克隆的恶性增殖性疾病,约占白血病总发病率的15%,多见于老年人。绝大多数CML患者白血病细胞中具有费城染色体（Ph染色体）,它是有9号染色体长臂3区4带和22号染色体长臂1区1带相互易位融合而成,使位于9号染色体上的c-abl1原癌基因在第二外显子的5’端断裂,与22号染色体的M-Bcr基因第2或第3外显子的3’端结合,形成Bcr-abl融合基因,该基因编码P210蛋白,具有持续而强烈的酪氨酸激酶活性,可使粒细胞发生恶性增殖。基于Bcr-abl融合基因在慢性粒细胞性白血病中的重要病理意义,诺华制药公司于2001成功开发Bcr-abl特异性抑制剂--STI571用于CML的治疗,成为第一个靶向治疗药物。STI571的应用使原来CML的5年生存率由20%提升至90%,被称为是CML治疗史上的里程碑。然而,随后8年随访研究发现约16%的患者因药效降低停止服用STI571,有6%的患者由于不良反应而停止用药。随着STI571在CML治疗中的大量应用,其耐药性的问题已愈发明显,尤其是Bcr-abl基因突变位点的增多,出现了越来越多STI571治愈无效的CML患者。因此,寻找抑制效能更强或Bcr-abl以外的新靶点是当前cml治疗研究的一项前沿课题。最近的研究表明cml的治疗需在抑制bcr-abl的基础上,同时联合其它新发现或确认的靶点进行联合治疗,可显着提高cml的治愈率。p15ink4b是细胞周期蛋白激酶抑制剂ink4家族的一员,又被称作cdkn2b和mts2,它位于人类9号染色体,通常与p16ink4a和p14arf一起发生改变。p16ink4a和p15ink4b都可通过抑制cdk4/6,使细胞停滞于g1期。在血液病中,p16ink4a和p15ink4b表达降低通常是由于外界原因使基因发生甲基化所导致。而且,p15ink4b是唯一在mds和aml中发生甲基化的ink4家族成员,提示它在粒细胞疾病中的具有特异性。临床研究显示50-60%的骨髓异常增殖综合症患者和70-80%急性粒细胞性白血病患者都会发生p15ink4b的甲基化改变,提示我们p15ink4b可能参与了白血病的病理过程。p15ink4b的生物学活性研究表明它具有以下3方面的特性:1.p15ink4b在体内具有肿瘤抑制因子的作用,逆转录病毒引起的髓性单核粒细胞性白血病存在明显的p15ink4b基因5’cpg岛甲基化改变,而当p15ink4b缺失被重新构建时,粒细胞增殖情况得到显着抑制。2.p15ink4b显示可以促进造血干细胞向红细胞的分化,抑制其向粒细胞的分化。3.p15ink4b在促进树突细胞成熟中的作用,增强免疫监督作用。上述三种生物学活性均表明p15ink4b可能成为治疗cml的潜在靶点。基于上述理论基础,本研究旨在观察p15ink4b与bcr-abl抑制联合应用是否可提高cml的治疗效率。为了实现这一目的,我们首先构建了p15ink4b慢病毒表达载体,通过rt-pcr方法从人外周单个核细胞中扩增p15ink4b基因,经纯化回收后连接于pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp载体上构建p15ink4b慢病毒表达载体。然后对p15ink4b基因进行慢病毒包装,制备p15ink4b的病毒颗粒感染k562细胞,使其稳定表达p15ink4b基因。其次,构建bcr-ablsirna,采用荧光素酶基因（基因序号m15077,394414）作为非特异性对照,将bcr-ablsirna转染k562细胞抑制p210bcr-abl的表达。同时,结合对sti571的研究,通过排列组合的方式,观察sti571,p15ink4b慢病毒感染和bcr-ablsirna转染联合作用后对k562细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡等的影响,为指导cml的治疗提供新的理论基础。1.p15ink4b慢病毒载体构建及病毒滴度测定p15ink4b慢病毒表达载体经慢病毒包装后,经逐孔稀释法测定病毒的滴度为2×108u/ml。p15ink4b慢病毒感染可显着抑制k562细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡。2.bcr-abl特异性sirna可显着抑制k562细胞增殖,使细胞阻滞于g0/g1期,且具有明显的诱导凋亡的作用;本研究发现bcr-ablsirna转染可显着抑制k562细胞内p210bcr-abl蛋白的表达,转染48h时,抑制率约为85%。细胞增殖实验显示,bcr-ablsirna转染可在24-96h内显着抑制k562细胞的增殖,在48h时,可显着阻滞细胞周期,使处于g1期的细胞比例明显增加,并且可诱导细胞凋亡的出现。3.p15ink4b慢病毒感染联合bcr-balsirna或sti571对k562细胞增殖抑制作用明显加强细胞增殖实验表明,p15ink4b慢病毒感染,bcr-ablsirna转染或sti571单独应用均可显着抑制k562细胞的增殖率,且呈现明显的时间依赖性。p15ink4b慢病毒感染+bcr-abl抑制抑制效率显着高于两者单独应用;p15ink4b感染+sti571抑制效率显着高于两者单独应用,bcr-abl抑制+sti571抑制抑制效率显着高于两者单独应用,上述结果提示我们p15ink4b慢病毒感染联合bcr-abl抑制可显着提升对k562细胞增殖的抑制率。4.p15ink4b慢病毒感染联合bcr-balsirna或sti571对k562细胞周期的影响流式细胞术检测结果显示,p15ink4b慢病毒感染可显着提高g1期细胞比率,降低s期细胞比率,表明p15ink4b表达可延缓dna复制。p15ink4b表达与bcr-abl抑制或sti571联合应用可显着增加处于g1期的细胞比率,提示p15ink4b与bcr-abl抑制或sti571联合应用可显着抑制dna的复制,降低细胞增殖速率。机制分析显示与单独治疗组相比,联合治疗组可显着抑制cyclind1和cdk4的表达,上述结果提示我们,联合治疗可显着抑制细胞周期依赖蛋白或激酶的表达,从而发挥阻滞细胞周期的作用。5.p15ink4b联合bcr-balsirna或sti571对k562凋亡的影响流式细胞术检测结果显示,与空载体组相比,p15ink4b慢病毒感染可显着提高细胞凋亡率,表现为annexin-v阳性细胞比率的增加。bcr-ablsirna转染和sti571亦有相似的作用。P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显着增加细胞凋亡率,提示P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显着促进K562细胞凋亡。机制分析显示,联合治疗组可显着提升Bax/Bcl-2的比值。结论:酪氨酸激酶抑制剂在CML的治疗中发挥了重要的作用,尤其是STI571的问世,大大提高了CML患者的生存时间和生存率。但是,随着STI571的大规模使用,STI571耐药性的问题凸显,这就要求我们在抑制Bcr-abl的同时,探寻新的治疗靶点以提高CML的治疗效果。P15INK4b作为经典的肿瘤抑制因子,具有抑制细胞周期蛋白激酶的功效。我们的研究显示,与单独应用Bcr-abl siRNA转染、STI571治疗或P15INK4b慢病毒转染相比,联合应用P15INK4b慢病毒转染与Bcr-abl及STI571可显着抑制K562细胞的增殖,增加细胞凋亡率,提示我们联合应用P15INK4b慢病毒感染与Bcr-abl siRNA及STI571可能具有提高CML治愈率的潜能,P15INK4b具有成为Bcr-abl以外治疗CML的潜在靶点的可能性。
许晓华[7]（2012）在《钙调素拮抗剂枸橼酸汉防已甲素抗慢性粒细胞白血病作用及其机制研究》文中研究指明研究背景：慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）是一种造血干细胞的克隆性疾病,约占成人白血病的15%-20%,是严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤。CML患者存在Ph染色体,即9号染色体c-ab1癌基因易位到22号染色体bcr基因处,形成bcr-abl融合基因,bcr-abl融合基因编码BCR-ABL融合蛋白,该蛋白具有酪氨酸激酶活性,促进细胞异常增殖,导致CML的发生和发展。伊马替尼（Imatinib）是一种酪氨酸激酶抑制剂,对CML患者具有良好的疗效,并于2001年获美国FDA批准成为治疗CML的一线药物。然而,已有越来越多的临床和实验研究资料显示,伊马替尼虽然对CML慢性期患者有较好的疗效,却对急变期CML疗效较差,而且随着伊马替尼的广泛应用,发现有相当一部分患者出现耐药。研究认为分子靶向药物对急变期CML无效主要与其致病基因bcr-abl发生突变有关,如T315I突变。T315I突变患者不仅对第一代酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼耐药,对第二代酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（Dasatinib）和尼洛替尼（Nilotinib）也耐药。近年来,随着对白血病细胞生物学和分子生物学特性研究的深入,发现白血病干细胞（leukemia stem cell, LSC）不仅是CML对分子靶向药物耐药的关键因素,而且在白血病起始和复发中也起着重要的作用,LSC是CML长期缓解和治愈的主要障碍之一。CML患者要获得长期缓解和治愈,必需清除这些白血病干细胞。因此,筛选和鉴定白血病干细胞治疗性药物靶标,阐明其作用分子机制,以及研发相应药物是目前迫切需要解决的问题之一。目前抗肿瘤药物大多存在毒副反应大,价格昂贵等不足,因此寻找高效低毒价廉的抗肿瘤药物和方法,提高患者生存质量已成为医学研究的热点。汉防己甲素（tetrandrine,TTD）又名粉防己碱,是从防已科千金藤属植物粉防己（Stephamia tetrandra S. Moore）块根中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱,是一种钙调素拮抗剂,对多种肿瘤细胞株具有明显的增殖抑制作用。有文献报道钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱγ（CaMKⅡ γ）在很多肿瘤细胞中呈异常表达,研究发现CaMKⅡγ在髓系白血病细胞中呈异常激活状态并调节白血病细胞的增殖。汉防己甲素对慢性粒细胞白血病急性变白血病细胞株K562细胞和多药耐药株K562/ADM细胞体内外均有较好的抗增殖和逆转多药耐药的作用,但其作用机制尚缺乏深入的研究。因此,本文以K562细胞及伊马替尼耐药的K562R细胞和慢性粒细胞白血病患者原代细胞为研究对象,探讨钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素（Tetrandrine citrate, TTDC）体内外抗慢性粒细胞白血病作用及其可能的机制。第一部分：枸橼酸汉防己甲素抑制人慢性粒细胞白血病细胞增殖的体外研究目的：检测枸橼酸汉防己甲素对人慢性粒细胞白血病细胞增殖抑制作用。方法：用TTDC处理慢性粒细胞白血病细胞株（K562细胞和K562R细胞）和慢性粒细胞白血病患者原代细胞,采用MTT检测处理前后对白血病细胞的增殖抑制作用,Wright-Giemsa染色观察细胞的形态的变化；流式细胞仪分析细胞DNA含量及细胞凋亡；甲基纤维素克隆形成试验检测TTDC对白血病细胞克隆的增殖抑制作用；运用Western Blot技术检测BCR-ABL蛋白及其磷酸化蛋白表达。结果：不同浓度（0～16μg/m1）的TTDC分别作用于K562细胞和K562R细胞24h、48h、72h能显着抑制K562细胞和K562R细胞的增殖,其作用具有浓度-时间依赖性,TTDC对K562细胞和K562R细胞在48h IC50分别是2.78μg/ml和3.51μg/ml,同样TTDC对慢性粒细胞白血病患者原代细胞也具有增殖抑制作用而对正常造血细胞没有明显抑制作用。TTDC处理K562R细胞出现凋亡细胞形态学的改变和凋亡细胞比例的增加,K562R细胞经1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml和8.0μg/mlTTDC分别处理48h后,早期凋亡细胞比例分别为3.1%,7.3%,50%和76%,呈明显递增趋势,甲基纤维素克隆形成试验结果显示TTDC能抑制CML细胞克隆形成,同时观察到经TTDC作用后P210BCR-ABL蛋白表达量明显下降。结论：TTDC能够抑制K562细胞和K562R细胞的增殖,其作用具有浓度-时间依赖性,对慢性粒细胞白血病患者原代白血病细胞增殖和克隆形成具有抑制作用而对正常外周血单个核细胞抑制作用不明显;TTDC对白血病细胞增殖抑制作用与诱导细胞凋亡和抑制CML关键性分子P2108CR-ABL蛋白的表达有关。第二部分枸橼酸汉防己甲素抑制伊马替尼耐药的K562R细胞增殖的体内研究目的：观察枸橼酸汉防己甲素抑制伊马替尼耐药的K562R细胞移植瘤的生长及其安全性。方法：用BALB/C nu/nu裸鼠建立伊马替尼耐药的K562R细胞的异种移植瘤模型,皮下接种K562R细胞浓度为2×107/0.2ml,待肿瘤体积为50-100mm3时分成对照组和给药组,给药组伊马替尼和TTDC均口服给药剂量为100mg/kg,每日三次连续给药10天,饲养至35天。对照组给予等体积生理盐水。分别观察伊马替尼、TTDC治疗组和对照组荷瘤裸鼠的抑瘤效果及其副作用。结果：裸鼠在接种K562R细胞后第3-5天,腋下就能摸到米粒大小的瘤块,提示荷瘤裸鼠建模成功,本研究分两批进行,实验动物共25只,成瘤率为100%,伊马替尼给药组存活率7/7（100%）,其中3只荷瘤裸鼠的肿块消失,无瘤生存率为3/7（42.9%）；而对照组3只裸鼠因肿瘤负荷过大死亡,存活率3/6（50%）。至给药后35天,对照组和伊马替尼给药组存活裸鼠平均肿瘤重量分别为2.24±0.25g和1.02±1.23g,对照组大于伊马替尼组。TTDC给药组6只荷瘤裸鼠的肿瘤生长均得到抑制,其中5只肿瘤消退,1只明显缩小,存活率6/6（100%）,无瘤生存率达5/6（83.33%）,抑瘤率为91.60%；而对照组6只裸鼠的肿瘤均继续生长,其中一只裸鼠因肿瘤负荷过大死亡,存活率5/6（83.33%）,至给药后35天,对照组和TTDC组存活的荷瘤裸鼠平均肿瘤重量分别是2.20±0.77g和0.135±0.32g,两组间差异具有统计学意义（p值<0.05）。在TTDC给药期间,裸鼠一度体重低于对照组,但后又缓慢增长,裸鼠无脱发,食欲、活动能力、精神状态良好,提示TTDC对BALB/c-nu/nu裸鼠没有明显的毒副反应。结论：TTDC在裸鼠体内对伊马替尼耐药的K562R细胞的异种移植瘤具有良好的抑瘤作用,在实验期间裸鼠没有出现明显的毒副反应。第三部分枸橼酸汉防己甲素抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖机制的研究目的：研究枸橼酸汉防己甲素抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖的可能的机制。方法：采用Western blot技术检测CaMKⅡγ、pCaMKII γ和β-catenin蛋白的表达用流式细胞分选仪分选CD34+CD38细胞,应用基因转染技术建立CaMKⅡ γ高表达稳转细胞（转染pcDNA3.1-CaMKII y-EGFP质粒的K562细胞）,运用激光共聚焦显微镜观察CaMKⅡ γ的亚细胞定位,并用流式细胞仪检测CaMKⅡ γ在细胞周期中的表达。结果：pCaMKⅡ γ激酶在5例CML急变期患者的细胞中呈高表达,同时伴有β-catenin表达水平的增高,而在6例慢性期患者的细胞中两者表达水平均较低,甚至不表达。CaMKⅡ γ激酶在CD34+CD38-的CML细胞群中呈异常激活和高表达状态,而在CD34-的CML细胞群和正常脐血CD34+CD38-细胞群中呈低表达。在高表达CaMKⅡγ的K562细胞中CaMKⅡ γ荧光信号在S/G2期达到最高,细胞周期的检测中也发现转染pcDNA3.1-CaMKII y-EGFP质粒的K562细胞在G2/M期的比例明显高于对照。经0-4μg/mlTTDC处理K562R细胞48小时后发现随着TTDC药物浓度的增加pCaMKⅡ γ蛋白表达水平显着下降,并呈现与(3-catenin蛋白表达量下降同步,而CaMKⅡ γ表达水平无明显变化。结论pCaMKⅡ γ激酶在CML急变期患者的原代细胞和CD34+CD38-的CML细胞群中呈异常高表达,并与β-catenin呈同步表达；根据CaMKⅡ γ激酶的亚细胞定位和不同细胞周期的表达量,推测其与CML细胞增殖相关；TTDC可以通过抑制磷酸化的CaMKⅡ γ激酶活性并同步下调β-catenin蛋白发挥抗白血病作用；推测CaMKⅡ γ激酶与wnt/β-catenin信号通路间可能存在相互联系。
黄庆[8]（2011）在《抑癌基因SARI在慢性髓细胞白血病中异常调控分子机制及作用的研究》文中认为目的SARI基因是近年来发现的一种新型抑癌基因,它在多种正常组织细胞中均有表达,而在许多实体肿瘤中表达水平明显下降。然而其表达异常机制尚不清楚。本课题通过检测慢性髓细胞白血病患者与正常人中SARI基因中的表达水平,以慢性髓细胞白血病细胞系K562为模型,探讨SARI基因在慢性髓细胞白血病中的作用及其表达调节可能的分子机制,为慢性髓细胞白血病基因治疗的研究提供新线索。方法（1）初发慢性髓细胞白血病患者中SARI表达水平的研究：46名初发慢性髓细胞白血病患者作为实验组,40名健康受试者作为正常对照组。采集每位患者和健康受试者的外周血,分离单个核细胞,使用实时定量PCR技术检测两组人群中SARI基因的相对表达水平。（2） SARI基因在慢性髓细胞白血病中表达异常分子机制的研究：以慢性髓细胞白血病细胞系K562为研究模型,使用Bcr-Abl抑制剂STI571处理K562细胞,做时间梯度实验和浓度梯度实验。设置浓度梯度：0,0.5,1.5,2.5μM及时间梯度：6,12,24小时。收集各组细胞,用实时定量PCR技术检测各组SARI基因表达情况。使用P13K抑制剂LY294002 （20μM）, MEK抑制剂PD98059 （50μM）, JAK抑制剂Ag490（501μM）处理K562细胞24小时后收集各组细胞,以未处理K562细胞作为对照组,用实时定量PCR技术检测各组SARI基因表达情况。（3）SARI基因在慢性髓细胞白血病中作用的研究：使用SARI特异性siRNA转染K562细胞：siRNA+转染液+K562细胞为实验组,转染液+K562细胞为Mock对照组,未转染K562细胞为空白对照组。使用750ng SARI特异性siRNA转染K562细胞72小时,用实时定量PCR技术检测K562细胞中SARI基因表达水平,确定其干扰效率。用STI571（2.5μM）分别处理实验组和Mock对照组K562细胞24小时,用流式细胞术检测两组K562细胞凋亡率及STI571处理后两组K562细胞的凋亡率。结果1.初发慢性髓细胞白血病患者中SARI表达水平的研究与正常对照组（n=40）相比,实验组（n=46） SARI基因表达在mRNA水平明显降低,三次实验结果所得数据经过Student’s unpaired t-test分析,p<0.001,两组间具有明显的统计学差异。2. SARI基因在慢性髓细胞白血病中表达异常分子机制的研究2.1 STI571对SARI基因表达的影响使用STI571（1.5μM）处理K562细胞12小时后SARI基因mRNA表达水平开始增高。在浓度梯度实验中,各组SARI基因表达未显示明显的浓度依赖关系；在时间梯度实验中,各组SARI基因表达显示较明显的时间依赖性,随着处理时间的延长,SARI基因表达逐渐升高。2.2信号通路抑制剂对SARI基因表达的影响用MEK抑制剂PD98059处理24小时后,K562细胞中SARI基因1mRNA表达水平高于对照组（p<0.05）；与之相似,用JAK抑制剂Ag490处理24小时后,K562细胞中SARI基因mRNA表达水平高于对照组（p<0.05）；而PI3K抑制剂处理24小时后,K562细胞中SARI基因mRNA表达水平下降。3. SARI基因在慢性髓细胞白血病中作用的研究3.1 SARI特异性siRNA干扰效应与Mock对照组相比,使用SARI特异性siRNA（750ng）转染K562细胞72小时后,SARI基因mRNA表达水平降低了72%（p<0.001）；而空白对照组和Mock对照组SARI基因mRNA表达水平无明显差异（p>0.05）。3.2 SARI干扰对K562细胞凋亡的影响使用流式细胞术检测各组凋亡率,与Mock对照组相比,实验组K562细胞凋亡率增加了（1.74±0.30）%,p=0.05)。3.3 SARI干扰对STI571诱导细胞凋亡的影响实验组与Mock对照组经过STI571（2.5μM）处理24小时后,使用流式细胞术检测两组凋亡率,与Mock对照组相比,实验组K562细胞凋亡率减少了（（7.61±0.16）%,p<0.001）。结论慢性髓细胞白血病患者外周血SARI mRNA表达水平降低可能与该疾病的发生发展过程相关联。在慢性髓细胞白血病细胞系K562中,SARI基因表达下调与Bcr-Abl抑制作用有关,而Bcr-Abl下调SARI基因表达可能是通过其下游MEK和JAK信号通路实现的。干扰SARI基因在K562细胞中表达部分降低了STI571诱导的凋亡作用,SARI基因可能参与了STI571诱导细胞凋亡作用。
黄先豹[9]（2010）在《尼洛替尼、三氧化二砷对耐伊马替尼K562细胞株增殖、凋亡和BCR-ABL基因表达的影响》文中进行了进一步梳理目的:观察不同浓度的尼洛替尼（AMN107）、三氧化二砷（ATO）、伊马替尼（STI571）及两两者联合对耐伊马替尼K562（K562G）细胞株生长、凋亡和BCR/ABL基因表达的影响,为临床耐伊马替尼慢性粒细胞白血病（CML）治疗提供实验依据。方法:在体外以人耐伊马替尼K562细胞为研究对象,分成对照组和实验组进行细胞培养,对照组不加任何药物,实验组共分6组分别加入不同浓度STI571、ATO、AMN107以及联合用药STI571+ATO、AMN107+ATO、STI571+AMN107。MTT比色法测定药物对K562G细胞生长抑制率的影响,PI单染色法流式细胞仪检测K562G细胞凋亡率,荧光定量PCR检测K562G细胞BCR/ABL融合基因的表达水平。结果: 1.MTT检测实验结果示:（1）耐药浓度范围内STI571对K562G细胞生长无明显抑制作用。（2） ATO对K562G细胞生长有抑制作用,呈剂量依赖性。（3） AMN107对K562G细胞生长有抑制作用,呈剂量依赖性。（4）联合用药STI571+ATO组对K562G细胞生长有抑制作用,呈剂量依赖性,比单用ATO组（除1.0μmol/L外）有显着性差异（P<0.05）。（5）联合用药AMN107+ATO组对K562G细胞生长有明显抑制作用,呈剂量依赖性,各浓度比单用AMN107组或单用ATO组有显着性差异（P<0.05）。（6）联合用药STI571+AMN107组对K562G细胞生长有明显抑制作用,呈剂量依赖性,各浓度组比单用AMN107组有显着性差异（P<0.05）。2.流式细胞术分析各组K562G细胞凋亡率结果显示:对照组细胞凋亡率为:9.86±1.02。（1） STI571（0.25、2.5、10.0μmol/L）组细胞凋亡率为:10.54±1.21、10.62±1.40、11.20±1.81,均无明显细胞凋亡作用。（2） ATO（1.0、5.0、10.0μmol/L）组细胞凋亡率为:19.12±1.10、60.98±2.28、52.28±1.21,其中以5.0μmol/L时细胞凋亡率最高。（3） AMN107（0.25、2.5μ、5.0μmol/L）组细胞凋亡率为:17.54±2.21、30.41±2.22、60.98±2.64,呈剂量依赖性。（4） STI571+ATO[（0.25+1.0）、（2.5+5.0）、（10.0+10.0）μmol/L]组细胞凋亡率为:31.2±1.10、70.98±2.28、62.98±1.21,其中以（5.0+2.5）μmol/L浓度时细胞凋亡率最高,各浓度比单用ATO组有显着性差异（P<0.05）。（5） AMN107+ATO[ （0.25+1.0）、（2.5+5.0）、（5.0+10.0）μmol/L]组细胞凋亡率为:29.5±1.10、86.65±2.28、71.65±1.21,其中以（2.5+5.0）μmol/L浓度时细胞凋亡率最高,各浓度比单用AMN107组或单用ATO组有显着性差异（P<0.05）。（6） AMN107+STI571[（0.25+0.25）、（2.5+2.5）、（5.0+10.0）]μmol/L组细胞凋亡率为:28.37±1.10、59.64±2.28、71.19±1.21,呈剂量依赖性,各浓度比单用AMN107有显着性差异（P<0.05）。3.荧光定量PCR检测K562G细胞BCR/ABL融合基因的表达水平:（1） ATO（1.0、5.0、10.0μmol/L）组BCR/ABL基因表达水平分别为1.18×106拷贝/ml、3.28×104拷贝/ml、5.23×104拷贝/ml。（2） AMN107（0.25、2.5、5.0μmol/L）组BCR/ABL基因表达水平分别为8.13×104拷贝/ml、1.58×103拷贝/ml、阴性。（3） ATO+STI571 [（1.0+0.25）、（5.0+2.5）、（10.0+10.0）μmol/L]组BCR/ABL基因表达水平分别为1.10×105拷贝/ml、5.06×103拷贝/ml、6.43×103拷贝/ml。（4） ATO+AMN107[（1.0+0.25）、（5.0+2.5）、（10.0+10.0）μmol/L]组BCR/ABL基因表达水平分别为2.54×104拷贝/ml、阴性、阴性。（5） AMN107+STI571[ （0.25+0.25）、（2.5+2.5）、（5.0+10.0）μmol/L ]组BCR/ABL基因表达水平分别为3.13×103拷贝/ml、阴性、阴性。结论:1. K562G细胞对10μmol/L及10μmol/L以下的STI571耐药2. ATO能抑制K562G细胞生长,诱导K562G细胞凋亡,细胞抑制率呈剂量依赖性,细胞凋亡以中浓度（5.0μmol/L）时最明显。3. AMN107作能抑制K562G细胞生长,诱导K562G细胞凋亡,细胞抑制率和细胞凋亡率均呈剂量依赖性。4.STI571与ATO联合用药作用于K562G细胞时,细胞抑制率和细胞凋亡率比单用ATO效果好。5. AMN107与ATO联合用药作用于K562G细胞时,细胞抑制率和细胞凋亡率比单用AMN107或ATO效果好,具有协同作用。6.AMN107与STI571联合用药作用于K562G细胞,细胞抑制率和细胞凋亡率比单用AMN107或STI571效果好,具有协同作用。7. AMN107、ATO及联合用药组均能使K562G细胞BCR/ABL基因表达水平下降。
吴振华[10]（2009）在《XIAP抑制物Embelin和STI-571协同诱导K562细胞生长抑制和凋亡》文中研究说明STI-571（imatininb mesylate,商品名Gleevec,中文名伊马替尼）是2001年FDA批准上市的治疗慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）的新一代肿瘤靶向治疗药物。STI-571为酪氨酸激酶抑制剂,能有效抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的活性,从而诱导白血病细胞凋亡,达到治疗肿瘤的目的。然而,由于BCR-ABL癌基因发生突变和扩增等原因,STI-571耐药问题越来越突出,另一方面,STI-571对CML加速期和急变期患者的治疗效果并不明显,这些因素使得有必要对CML的治疗策略进行改进。解决这一问题的一个可行方法就是提高CML细胞对STI-571的敏感性。本研究以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,探讨提高K562细胞对STI-571敏感性的方法。我们的工作发现,细胞凋亡抑制蛋白XIAP的小分子抑制物Embelin或转染ARF肿瘤抑制基因都可增加K562细胞对STI-571的敏感性。STI-571和Embelin对K562细胞的生长抑制作用呈浓度依赖性。与药物单独作用相比,STI-571和Embelin二者联合作用能显着抑制K562细胞的生长及体外的克隆形成能力。经Calcusyn软件分析,STI-571和Embelin两药物之间在抑制K562细胞生长方面发挥着协同的作用。低浓度的STI-571（50nM）和Embelin（20μM）联用显着诱导了K562细胞的凋亡,此时在K562细胞中可检测到线粒体外膜的变化和促细胞凋亡因子（如细胞色素C）的释放及随后的caspase3的活化。细胞周期检测发现,STI-571和Embelin联合作用K562细胞24h后,可诱导细胞周期阻滞在G1期,并且细胞周期调控蛋白p21的表达也相应增加,而p27的表达没有变化。STI-571和Embelin诱导的K562细胞凋亡伴随着相关信号蛋白、凋亡调控蛋白表达的变化。两药联合作用可以显着下调抗凋亡蛋白XIAP和Mcl-1的表达,而Phospho-Akt却受到上调。STI-571能降低Embelin诱导的Bcl-2表达的上调,但对Embelin诱导的Bcl-XL表达增加却无影响。STI-571和Embelin单独作用K562细胞都能诱导促凋亡蛋白Bim的表达,两药联合作用后,更进一步增强了Bim的表达。为了进一步研究Bim在STI-571和Embelin联合诱导的K562细胞凋亡中的作用,我们通过病毒介导的RNA干扰技术,筛选到了Bim表达水平明显下调的K562亚系（命名为K562/ShBim）。与亲本细胞相比,K562/ShBim细胞对STI-571和Embelin的联合作用表现出了明显的耐受性,提示Bim蛋白在STI-571和Embelin联合诱导的K562细胞凋亡和增殖抑制中发挥了关键的作用。我们通过逐渐增加STI-571浓度的方法,体外筛选出了一株耐STI-571作用的K562细胞系（K562/R）。有趣的是,我们发现Embelin可以增加K562/R对STI-571的敏感性。与药物单用相比,STI-571、Embelin联合作用显着促进了K562/R细胞的生长抑制和凋亡发生。同时我们发现,在K562细胞中转染ARF肿瘤抑制基因后,ARF的表达可促进STI-571对K562细胞的生长抑制和凋亡诱导。我们的结果表明,Embelin或肿瘤抑制基因ARF的表达均可增强STI-571诱导的K562细胞凋亡和生长抑制,这对于临床上CML治疗策略的改进提供了相应的理论基础。并且,STI-571和Embelin联合用药对于临床上出现的STI-571耐药现象的克服也可能是一种潜在的有效策略。目前,对肿瘤细胞中不同通路信号蛋白的协同抑制,正成为国际上治疗各种不同类型肿瘤的一种新兴起的方法。我们利用STI-571和Embelin对K562白血病细胞凋亡的诱导及相关信号通路的研究,是在分子水平上对慢性粒细胞白血病靶向治疗和协同治疗的一种有益尝试。
二、Selective induction of apoptosis in K562 cells by a BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor, STI571（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Selective induction of apoptosis in K562 cells by a BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor, STI571（论文提纲范文）
（1）基于药效团模型的新型BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂筛选及其分子机制探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 慢性髓系白血病 |
| 1.1.1 慢性髓系白血病的临床监测 |
| 1.1.2 CML患者治疗方法的演变 |
| 1.1.3 慢性髓系白血病与BCR-ABL酪氨酸激酶 |
| 1.2 BCR-ABL酪氨酸激酶 |
| 1.2.1 BCR-ABL酪氨酸激酶的结构 |
| 1.2.2 BCR-ABL酪氨酸激酶的对机体的影响 |
| 1.2.3 BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂 |
| 1.2.4 BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂相关的耐药机制 |
| 1.3 抗imatinib耐药的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂 |
| 第二章 基于BCR-ABL酪氨酸抑制剂药效团模型的虚拟筛选 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 Hypogen模型训练集的选择及其验证 |
| 2.2.2 Hiphop模型训练集的选择及其验证 |
| 2.2.3 基于药效团模型的虚拟筛选 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Hypogen模型 |
| 2.3.2 Hiphop模型 |
| 2.3.3 基于Hypogen与Hiphop模型的虚拟筛选 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 BCR-ABL酪氨酸激酶命中化合物的活性验证 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 细胞增殖实验 |
| 3.2.4 结构优化实验 |
| 3.2.5 流式实验 |
| 3.2.6 Western Blot实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 细胞增殖实验结果与讨论 |
| 3.3.2 相似度搜索结果与讨论 |
| 3.3.3 ZINC21710815抑制CML细胞周期的结果与讨论 |
| 3.3.4 ZINC21710815诱导CML细胞凋亡的结果与讨论 |
| 3.3.5 ZINC21710815诱导CML细胞自噬的结果与讨论 |
| 3.3.6 ZINC21710815抑制BCR-ABL靶蛋白及其下游通路蛋白的结果与讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 BCR-ABL酪氨酸激酶与ZINC21710815的分子动力学模拟研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 模型构建 |
| 4.2.2 分子动力学模拟 |
| 4.2.3 结合自由能计算 |
| 4.2.4 结合自由能分解计算 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 分子对接结果 |
| 4.3.2 体系的平衡和结构柔性的分析 |
| 4.3.3 结合模式分析 |
| 4.3.4 能量分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）ZSTK474联合Imatinib抗慢性粒细胞白血病活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、ZSTK474与Imatinib对 CML细胞的联合用药分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 主要试剂和药品 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 K562、K562/A02、K562/G01细胞培养 |
| 1.2.2 K562/A02、K562/G01细胞的耐药培养 |
| 1.2.3 细胞的耐药倍数测定实验 |
| 1.2.4 细胞增殖抑制实验 |
| 1.2.5 药物联合用药分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 K562/A02、K562/G01细胞耐药性的评价 |
| 1.3.2 ZSTK474、Imatinib对 CML细胞活力的影响 |
| 1.3.3 ZSTK474与Imatinib对 CML细胞的联合用药分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 二、ZSTK474与Imatinib联合应用抗CML活性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂和药品 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PBMC的分离制备 |
| 2.2.2 药物对PBMC增殖影响 |
| 2.2.3 软琼脂克隆实验 |
| 2.2.4 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.5 Hoechst染色 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 MDC染色实验 |
| 2.2.8 自噬流 |
| 2.2.9 Western Blot |
| 2.2.10 Real-time定量PCR |
| 2.2.11 统计学分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ZSTK474与Imatinib联合用药对PBMC细胞活力的影响 |
| 2.3.2 ZSTK474与Imatinib联合用药抑制CML细胞的致瘤性 |
| 2.3.3 ZSTK474与Imatinib联合用药对CML细胞周期的影响 |
| 2.3.4 ZSTK474与Imatinib联合用药对CML细胞凋亡的影响 |
| 2.3.5 ZSTK474与Imatinib联合用药对CML细胞自噬的影响 |
| 2.3.6 ZSTK474 联合Imatinib对 CML细胞中Bcr-Abl/PI3K/Akt通路及下游信号分子的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 三、ZSTK474与Imatinib联合应用逆转CML细胞多药耐药活性的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂和药品 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 逆转指数的测定 |
| 3.2.2 Rh123、5-CFDA泵出实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ZSTK474 联合Imatinib增强CML多药耐药细胞对化疗药物的敏感性 |
| 3.3.2 ZSTK474 联合Imatinib对 CML多药耐药细胞中MDR相关蛋白的影响 |
| 3.3.3 ZSTK474 联合Imatinib抑制CML多药耐药细胞对化疗药物的外排功能 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 小分子抑制剂靶向治疗慢性粒细胞白血病研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）具有抗耐药性的新型酪氨酸激酶抑制剂的设计、合成及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 0.1 蛋白酪氨酸激酶及其抑制剂 |
| 0.1.1 蛋白酪氨酸激酶 |
| 0.1.2 小分子酪氨酸激酶抑制剂研究概况 |
| 0.2 慢性粒细胞性白血病(CML)发病机制 |
| 0.2.1 Bcr-Abl基因介导的信号传导途径 |
| 0.2.2 Bcr-Abl融合基因与慢性粒细胞性白血病 |
| 0.3 慢性粒细胞性白血病(CML)的靶向治疗 |
| 0.3.1 慢性粒细胞性白血病(CML)介绍 |
| 0.3.2 Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂研究进展 |
| 0.4 选题意义与目的 |
| 第1章 目标化合物的设计与合成 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 目标化合物的设计 |
| 1.3 目标化合物的合成 |
| 1.3.1 目标化合物6a-r的合成 |
| 1.3.2 目标化合物12a-j的合成 |
| 1.3.3 目标化合物17a-h的合成 |
| 1.3.4 目标化合物22a-h的合成 |
| 第2章 目标化合物的体外抗肿瘤活性及构效关系分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 目标化合物体外抗肿瘤实验结果 |
| 2.3 构效关系总结 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 目标化合物作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 AO-EB双染色检测细胞凋亡形态变化 |
| 3.3 流式细胞术检测药物对细胞周期作用机制 |
| 3.4 流式细胞术检测药物诱导细胞凋亡作用机制 |
| 3.5 化合物6m分子对接结果及分析 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 实验部分 |
| 4.1 药化部分 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 目标化合物6a-r的合成 |
| 4.1.4 目标化合物12a-j的合成 |
| 4.1.5 目标化合物17a-h的合成 |
| 4.1.6 目标化合物22a-h的合成 |
| 4.2 药理部分 |
| 4.2.0 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 体外抗肿瘤实验 |
| 4.2.2 AO-EB双染色检测细胞凋亡形态变化 |
| 4.2.3 流式细胞术检测药物对细胞周期作用机制 |
| 4.2.4 流式细胞术检测药物诱导细胞凋亡作用机制 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况 |
（4）miR-96和miR-374a在慢性髓细胞白血病中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 miR-96通过靶向BCR-ABL1融合基因抑制CML进展及其机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-374a通过靶向c-MYC增加CML细胞对HHT的敏感性 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文(一) |
| 外文论文(二) |
（5）EPS8参与髓系白血病生物学过程及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 EPS8在慢性粒系白血病患者及BCR/ABL~+细胞株中的表达及意义 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第二章 过表达EPS8对髓系白血病细胞生物功能的作用及其机制研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第三章 沉默EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（6）P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-abl siRNA及STI571对慢性粒细胞白血病K562细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 P15INK4b慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 实验二 P15INK4b基因慢病毒包装 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.慢病毒滴度测定 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 实验三 P15INK4b慢病毒感染K562细胞 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 实验四 Bcr-abl siRNA的合成及效能鉴定 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 实验五 P15INK4b与Bcr-abl siRNA/STI571联合治疗对K562细胞的影响 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）钙调素拮抗剂枸橼酸汉防已甲素抗慢性粒细胞白血病作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 插图和附表清单 |
| 目录 |
| 1 绪论 |
| 2 枸橼酸汉防已甲素抑制人慢性粒细胞白血病细胞增殖的体外研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 细胞株 |
| 2.2.1.2 主要实验设备 |
| 2.2.1.3 主要试剂和配方 |
| 2.2.1.3.1 主要试剂 |
| 2.2.1.3.2 主要溶液配制方法 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2.2 原代骨髓或外周血标本单个核细胞分离 |
| 2.2.2.3 MTT法检测细胞增殖 |
| 2.2.2.4 Wright-Giemsa染色 |
| 2.2.2.5 Annexin V/PI荧光双染-流式细胞仪测定细胞凋亡率 |
| 2.2.2.6 PI标记-流式细胞仪检测细胞DNA含量 |
| 2.2.2.7 甲基纤维素克隆形成试验 |
| 2.2.2.8 Western Blot相应蛋白检测 |
| 2.2.2.8.1 细胞总蛋白提取方法 |
| 2.2.2.8.2 BCA法蛋白定量 |
| 2.2.2.8.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、杂交、成像 |
| 2.2.3 统计分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 TTDC抑制K562细胞增殖 |
| 2.3.2 TTDC抑制K562R细胞增殖 |
| 2.3.3 TTDC对慢性粒细胞白血病患者原代细胞的增殖抑制作用 |
| 2.3.4 TTDC对正常人外周血单个核细胞生长抑制作用 |
| 2.3.5 Wright-Giemsa染色观察TTDC诱导K562R细胞凋亡 |
| 2.3.6 流式细胞仪检测TTDC诱导K562R细胞凋亡 |
| 2.3.7 TTDC对细胞DNA含量的影响 |
| 2.3.8 TTDC对细胞周期的影响 |
| 2.3.9 TTDC抑制白血病细胞克隆的形成 |
| 2.3.10 TTDC对BCR-ABL蛋白的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 枸橼酸汉防已甲素抑制伊马替尼耐药的K562R细胞增殖的体内研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 细胞株 |
| 3.2.1.2 实验动物 |
| 3.2.1.3 主要试剂与药品 |
| 3.2.1.4 主要实验设备 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2.2 动物实验条件 |
| 3.2.2.3 实验药物配制 |
| 3.2.2.4 荷人白血病细胞裸鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.2.2.5 实验分组、给药方法、剂量和给药时间 |
| 3.2.2.6 观察指标 |
| 3.2.2.7 动物处死 |
| 3.2.2.8 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 荷瘤裸鼠的建立 |
| 3.3.2 伊马替尼对裸鼠体内K562R细胞异种移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.3.3 TTDC对裸鼠体内K562R细胞异种移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 枸橼酸汉防已甲素抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖机制的初步研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要材料 |
| 4.2.1.1 细胞株 |
| 4.2.1.2 主要试剂与药品 |
| 4.2.1.3 主要实验设备 |
| 4.2.1.4 常用缓冲液 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2.2 CML患者骨髓及正常脐血标本单个核细胞分离 |
| 4.2.2.3 流式细胞分选技术分选CD34~+CD38~-细胞 |
| 4.2.2.4 细胞总蛋白提取方法 |
| 4.2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、杂交、成像 |
| 4.2.2.6 细胞转染 |
| 4.2.2.7 观察转染pcDNA3.1-CaMKⅡγ-EGFP质粒的K562细胞内CaMKⅡγ的亚细胞定位 |
| 4.2.2.8 PI标记-流式细胞仪检测细胞周期 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 CaMKⅡγ激酶和β-catenin在慢性粒细胞白血病细胞中的表达 |
| 4.3.2 CaMKⅡγ激酶在CD34~+CD38~-白血病细胞中的表达 |
| 4.3.3 CaMKⅡγ在转染pcDNA3.1-CaMKⅡγ-EGFP质粒的K562细胞中的亚细胞定位 |
| 4.3.4 CaMKⅡγ对转染pcDNA3.1-CaMKⅡγ-EGFP质粒的K562细胞的细胞周期的影响 |
| 4.3.5 TTDC作用K562R细胞后磷酸化CaMKⅡγ(pCaMKⅡγ)的表达水平 |
| 4.3.6 TTDC作用K562R细胞后β-catenin蛋白表达量变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（8）抑癌基因SARI在慢性髓细胞白血病中异常调控分子机制及作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 初发慢性髓细胞白血病患者SARI表达水平的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SARI基因在慢性髓细胞白血病中表达异常的分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SARI基因在慢性髓细胞白血病中作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）尼洛替尼、三氧化二砷对耐伊马替尼K562细胞株增殖、凋亡和BCR-ABL基因表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 试剂准备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 实验分组 |
| 2.3.4 MTT 法检测药物对 K562G 细胞生长抑制的影响 |
| 2.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.6 荧光定量 PCR 检测 K562G 细胞 BCR/ABL 融合基因的表达水平 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 MTT 检测不同浓度药物对 K562G 细胞生长抑制的影响 |
| 3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 3.3 荧光定量 PCR 检测 BCR/ABL 融合基因的表达水平 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附带综述 |
（10）XIAP抑制物Embelin和STI-571协同诱导K562细胞生长抑制和凋亡（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 BCR-ABL与慢性粒细胞白血病的发生 |
| 1.2 BCR-ABL引起的下游信号转导通路 |
| 1.3 STI-571与慢性粒细胞白血病的治疗 |
| 1.4 Embelin的结构及生物活性 |
| 1.5 ARF肿瘤抑制基因概况 |
| 1.6 本文研究的目标、内容和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Embelin与STI-571协同抑制K562细胞生长 |
| 3.2 Embelin与STI-571联合作用对K562细胞凋亡的影响 |
| 3.3 STI-571促进Embelin诱导的K562细胞周期阻滞 |
| 3.4 Embelin和STI-571对K562细胞凋亡调节蛋白表达的调控 |
| 3.5 Embelin与STI-571相互作用机制的探讨 |
| 3.6 STI-571和Embelin对K562耐药细胞系的作用分析 |
| 3.7 转染ARF肿瘤抑制基因增强K562细胞对STI-571的敏感性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 6 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、Selective induction of apoptosis in K562 cells by a BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor, STI571（论文参考文献）
- [1]基于药效团模型的新型BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂筛选及其分子机制探究[D]. 黄婷婷. 兰州大学, 2021(09)
- [2]ZSTK474联合Imatinib抗慢性粒细胞白血病活性研究[D]. 陈婷. 天津医科大学, 2020(06)
- [3]具有抗耐药性的新型酪氨酸激酶抑制剂的设计、合成及活性研究[D]. 李军. 辽宁大学, 2020(02)
- [4]miR-96和miR-374a在慢性髓细胞白血病中作用及机制研究[D]. 黄涛. 山东大学, 2019(03)
- [5]EPS8参与髓系白血病生物学过程及其机制的研究[D]. 黄睿. 南方医科大学, 2015
- [6]P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-abl siRNA及STI571对慢性粒细胞白血病K562细胞的实验研究[D]. 夏德雨. 第四军医大学, 2014(08)
- [7]钙调素拮抗剂枸橼酸汉防已甲素抗慢性粒细胞白血病作用及其机制研究[D]. 许晓华. 浙江大学, 2012(10)
- [8]抑癌基因SARI在慢性髓细胞白血病中异常调控分子机制及作用的研究[D]. 黄庆. 华中科技大学, 2011(09)
- [9]尼洛替尼、三氧化二砷对耐伊马替尼K562细胞株增殖、凋亡和BCR-ABL基因表达的影响[D]. 黄先豹. 南昌大学, 2010(05)
- [10]XIAP抑制物Embelin和STI-571协同诱导K562细胞生长抑制和凋亡[D]. 吴振华. 厦门大学, 2009(12)
标签：细胞凋亡论文; 酪氨酸激酶论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 慢性粒细胞白血病论文; 急性髓性白血病论文;