一、植物抗病基因类似序列研究进展及展望（论文文献综述）
蒲小剑[1]（2021）在《红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化》文中认为红三叶（Trifolium pratense L.）是营养价值和草产量仅次于苜蓿（Medicago Sativa L.）的多年生豆科牧草之一。该牧草用途广泛,具有广阔的开发应用前景。白粉菌（Erysiphales）作为一类普遍而重要的专性生物营养型病原菌,可严重降低红三叶草产量与品质,限制其在草牧业中的应用与发展。为阐明白粉菌对红三叶生理生化、内源激素和细胞结构的影响并验证抗白粉病TpGDSL基因的功能,本研究首先对感白粉病品种（岷山红三叶）和×抗白粉病品种（“甘农RPM1”红三叶）的杂交F2代进行抗病性评价,并建立白粉病抗性分离群体,采用人工接菌的方法,测定白粉菌侵染后不同抗性群体的生理生化变化、内源激素含量和细胞结构变化;利用F2代群体的抗病单株和感病单株作为试验材料,进行转录组分析;克隆由转录组分析得到的红三叶抗白粉病相关候选基因TpGDSL,同时构建p HB-GDSL过表达载体,并遗传转化拟南芥。取得的主要结果如下:1.白粉病病原菌为三叶草白粉菌（Erysiphe trifoliorum）;人工接菌后抗病材料的电导率（EC）先升高后降低、感病材料持续升高,接菌15 d时感病材料EC较接菌前增加3.57倍。抗病材料的相对含水量（RWC）先降后升,感病材料持续降低,接菌15d时感病材料的RWC含量较接菌前减少了31.85%。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性与过氧化氢酶（CAT）活性和可溶性糖（WSC）含量分别在接菌后第7 d和11 d升高,随后降低,其最高值分别为534.43±10.07 U·g-1·min-1 FW、411.73±4.08 U·g-1·min-1 FW、136.53±1.00 U·g-1·min-1 FW和32.02±0.57 mg·g-1。接菌第15 d的丙二醛（MDA）与游离脯氨酸（Pro）含量分别是接菌前的4.84和5.38倍。接白粉菌后第1和7 d,抗病材料的玉米素（ZR）、茉莉酸（JA）与水杨酸（SA）含量出现两个峰值,感病材料接菌第1d后增加,之后持续降低。抗病材料的ABA含量先升后降,感病材料的变化趋势相反。抗病材料的ZR、JA、SA与ABA含量的分别在接菌第7 d、1 d、7 d和1 d时最大,其值分别为12.23±1.27 ng·g-1、15.55±0.30 ng·g-1、124.82±1.68 ng·g-1、483.50±125.50 ng·g-1,分别较接菌前增加3.52、0.93、1.60和1.04倍。接菌后红三叶抗病材料内源激素变化幅度大于感病材料,表明抗病材料中白粉菌对红三叶体内内源激素的效应更明显。2.抗病红三叶单株叶片的上表皮细胞宽,叶片厚度、栅栏组织厚度及蜡质含量均极显着高于感病材料（P<0.01）,分别高16.13%、22.29%、29.99%与85.90%;抗病材料的上表皮细胞宽度增大、栅栏组织加厚、栅栏组织细胞排列更紧密有序,感病材料的海绵组织厚度显着增加、海绵细胞排列松散混乱。白粉菌侵染增加了细胞壁的半纤维素、纤维素和木质素含量,降低了可溶性果胶的含量,其中抗病材料纤维素、半纤维素、木质素和羟脯氨酸糖蛋白含量略高于感病材料。3.白粉菌侵染后抗性差异红三叶代谢中DEGs分别富集在苯丙烷途径、甲醛戊酸途径、木质素和木酚素途径与硫代葡萄糖苷等代谢途径。CHRs、C2H2、HAD、MYB、b ZIP和MADS等转录因子家族基因参与红三叶白粉病防御反应。SA与IAA通路中相关基因AXR1、CYP、CAND1和PPR-like可能在红三叶白粉病防御反应中具有积极作用。细胞色素P450、氧化酶类、磷酸酶、腈水解酶及GDSL脂肪酶等家族中DEGs分别富集23、20、18、14与2条。木质素代谢途径中PAL、C4H、4CL和BGL、ABA调控路径中NAD（P）-binding Rossmann-fold、赤霉素代谢途径中2-氧戊二酸/铁（II）依赖双加氧酶及JA合成前体12-Oxo-PDA等基因均参与调控红三叶的防御过程。转录组分析显示红三叶GDSL同源基因有较高的本底表达和差异表达倍数,Log2（FC）为10.62,本研究选择GDSL基因进行研究。4.克隆得到编码366个氨基酸,全长1101bp的TpGDSL基因。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）GDSL基因与该基因氨基酸序列相似性高达86.47%。TpGDSL基因编码蛋白分子式为C1776H2704N470O561S15,相对分子量为40.9672kD,理论等电点（p I）为4.39,正、负电荷残基为20和35,不稳定系数为31.38,为不稳定蛋白,脂肪系数为81.01。TpGDSL编码蛋白可能存在于细胞外基质（Extracell）。TpGDSL蛋白主要包括36.34%α螺旋（Alpha helix,Hh）、4.10%β转角（Beta turn,Tt）、17.49%延伸链（Extended strand,Ee）、及42.08%无规则卷曲（Random coil,Cc）。该基因翻译的蛋白均由二级结构和三维结构覆盖,覆盖率和可信度分别达82%和100%。本试验采用农杆菌介导的花序浸染法将重组过表达载体p HB-GDSL转入模式植物野生型拟南芥中,得到16 lines T1代阳性转基因种子,为TpGDSL基因的功能分析奠定了基础。
费莉玢[2]（2020）在《Botryosphaeria dothidea侵染后山核桃酚类物质合成相关酶活及关键基因的表达特性》文中进行了进一步梳理茶藨子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）是引起山核桃干腐病的病原菌,易侵染枝干部位,造成全株死亡,导致严重经济损失。抗病品种的培育过程中发现分别以湖南山核桃和美国山核桃为砧木、浙江山核桃为接穗的嫁接苗抗性好、产果率高,目前已广泛种植,但关于其抗病机理还缺乏研究。前期研究发现发病严重的山核桃体内酚类物质以及相关酶——苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）、过氧化物酶（Peroxidase,POD）和多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）都比抗病山核桃品种中含量低,这些指标对抗病性的鉴定起重要作用,因此还需要对山核桃受B.dothidea侵染后抗性反应中酚类物质的合成开展进一步的研究。本研究以湖南嫁接山核桃（HG）、美国嫁接山核桃（AG）和浙江山核桃（ZJ）为材料,对接种B.dothidea后不同品种山核桃的感病情况和侵染状况做分析;测定了不同品种中总酚、总黄酮的含量,并对与防御相关的酶活（PAL、PPO、POD、肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）、细胞壁水解酶）进行了分析;同时对山核桃防御途径中苯丙烷代谢途径的几个关键基因:苯丙氨酸解氨酶基因（PAL基因）、肉桂酸-4-羟基化酶基因（C4H基因）、4-香豆酸辅酶A连接酶基因（4CL基因）4CL和查尔酮合成酶（CHS基因）进行了克隆与序列分析,对不同侵染时期基因的表达动态进行了研究。主要结果如下:1.人工接种B.dothidea后浙江山核桃最易感病,湖南嫁接山核桃最抗病。山核桃的感病程度依次为:ZJ>AG>HG。扫描电镜观察到,B.dothidea菌丝在寄主表面的伤口发生侵染,前期菌丝附着在寄主表面;中期时菌丝侵入表皮结构,在表皮层中逐渐扩展形成网状;后期菌丝进入到组织结构内,包裹组织结构,破坏组织形态。同一时期感病品种受侵染情况比抗病品种严重。2.B.dothidea侵染后,HG的总酚、总黄酮含量显着高于ZJ,AG的含量则略低于HG。苯丙烷代谢途径的关键酶PAL在三个品种中都出现先上升后下降的趋势,但抗病品种接种后酶活性快速积累,显着高于感病品种。HG在接种后POD和PPO活性都表现出升高,而ZJ品种无明显的波动变化。HG和AG中β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）受到诱导后呈上升趋势,相反ZJ表现出下降的反应。接种后所有品种的几丁质酶都呈波动的变化,品种间活性相差不大,诱导抗性的行为不明显。3.通过PCR技术和RACE实验获得了山核桃PAL、C4H、4CL和CHS基因的全序列,结果显示:山核桃PAL基因的开放阅读框为2160 bp,可编码720个氨基酸;C4H基因含有长1521 bp的ORF,编码507个氨基酸;4CL基因含有1个长1638 bp的ORF,能编码545个氨基酸;CHS基因序列,包含了长1170 bp的开放阅读框,可编码389个氨基酸。同源性比对分析结果显示,这四个基因的核苷酸序列在三个品种中的相似度高达97%以上,均与来自胡桃科核桃属植物的序列同源性较高,在90%左右,与其他科属植物同源性在70%-85%之间。系统发育树分析发现山核桃基因序列与胡桃科聚为一支,其他为同一科的聚在一起,木本植物与草本植物的基因进化存在一定距离。4.通过实时荧光定量PCR实验测定了B.dothidea侵染后不同品种山核桃苯丙烷代谢途径关键基因（PAL、C4H、4CL和CHS）的表达动态。PAL基因在接种前期均呈现上调表达,并且山核桃的抗性越强,PAL基因表达量越大且表达时间越早。在病原菌的胁迫下,C4H基因的表达量迅速上调,嫁接品种AG和HG均在第3 d达到峰值,分别是ZJ的9.3倍和9倍。接种后4CL基因表达量存在一定差异,ZJ的相对表达量较低。山核桃抗性越好,4CL基因的表达量越高,并且接种5 d后该基因表达量也能维持在较高水平。CHS基因是类黄酮合成的关键基因,3个品种中湖南嫁接山核桃的表达显着高于其他两个品种。实验结果与山核桃不同品种酮类物质的积累以及发病情况相一致。
施云龙[3]（2020）在《茶树抗炭疽病和抗冻机制及评价研究》文中指出真菌病害和低温是茶树生长发育过程中主要的生物胁迫和非生物胁迫因素,对茶叶品质和产量有重要影响,备受关注。本研究以茶树炭疽病和冻害为研究对象,探索茶树抵御这两种胁迫的分子机制及调控网络,寻找可供分子标记辅助选择（MAS）育种利用的抗性相关分子标记,以期加快茶树的抗性育种进程,实现多基因有效聚合,促进茶树高抗多抗育种,为茶树高质量生产提供基础。本文以‘龙井43’为主的多个茶树品种为试验对象,采用高通量测序、转录组、双重转录组、基因克隆、高效液相色谱（HPLC）、实时荧光定量（qRT-PCR）、平行反应监测（PRM）、色差分析和叶绿体荧光参数（Fv/Fm）测定等技术,研究茶树炭疽病感病叶的真菌多样性,揭示病原菌种类及致病活力,为活体或者离体实验提供致病菌;建立茶树炭疽菌有伤接种和快速感染的方法,开发茶树炭疽病抗性基因及其分子标记,了解关键基因、蛋白和植物激素的作用,明确茶树和炭疽菌的互作机制;开发茶树多品种抗冻性快速评价体系和相关分子标记,为抗寒育种提供科学依据。主要结果如下:（1）真菌多样性结果显示,茶树健康叶中枝孢属Cladosporium、柱隔孢属Ramularia丰度较高,炭疽病发病叶前中期炭疽病菌属Colletotrichum的菌群比例显着上升,发病中后期炭疽病菌属的菌群比例稍有下降,而假拟盘多毛孢属Pseudopestalotiopsis显着增加。炭疽菌属是茶树炭疽病的主要致病菌属,假拟盘多毛孢属菌群在中后期显着增加,与前者共同作用,扩大病斑和形成其它病症。（2）病原菌的分离和纯化结果表明,初代分离菌回接后,对新感染病斑再进行组织分离的方法,相比单一使用组织分离法或者稀释法,杂菌较少,效果最好。本研究分离的9株菌株中有6株是炭疽病菌,分离率67%。分子鉴定结果显示,涉及45种纯化菌株的种类,主要优势致病菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides或其复合种。（3）两个易感病品种（‘龙井43’和‘浙农139’）健康叶和感病叶的转录组分析表明,‘龙井43’叶片检出差异表达基因1621个,‘浙农139’则达到3089个,差异表达基因主要富集在植物激素信号传导和植物-病原体相互作用这两条重要的KEGG代谢通路中,同时涉及氧化还原反应、催化活性、细胞壁变化等GO通路。对ALD1、NPR1和PR1等多个关键基因进行克隆,明确其核苷酸序列,并对其氨基酸序列在线分析,预测其蛋白理化性质和结构模型。HPLC结果显示茶树感染炭疽病后内源性水杨酸含量显着提高,qRT-PCR结果表明感病叶中的ALD1、NPR1和PR1等基因表达显着上调。在茶树上第一次证实PR1蛋白和内源性水杨酸是炭疽病感染过程的关键化合物,它们对茶叶抗炭疽病的免疫激活反应起关键作用,可用于分子标记辅助育种。（4）建立改良的有伤接种和计算机图像识别技术相结合的茶树抗病性判断方法,检测表明:‘LCS’、‘4-52’和‘4-147’属于抗病品种,WM1、WM3和‘FZ-0’属于易感病品种。番红固绿染色法结果表明:茶树品种的抗病性差异可能源于细胞壁变化的快慢和木质素含量的增加量。建立2个茶树品种（‘LCS’和‘WM3’）和5个时间点（0 h、12 h、30 h、72 h和120 h）和炭疽菌TJB44的具有时间分辨的双重转录组数据库,结果表明:共有7425 DEGs参与茶树抵御炭疽病的过程,主要集中在细胞壁相关、次级代谢产物、酶类、植物激素、过氧化物、信号传递、转录因子、PR蛋白等过程,抗病性强的品种可能在感染初期能快速响应炭疽菌入侵信号,通过细胞壁的变化和植保素的产生等对炭疽菌的定植有减缓和阻止作用;共有3697个DEGs参与炭疽菌入侵过程,发现炭疽菌的致病能力与植物毒素（Cerato-ulmin、Cerato-platanin）、果胶裂解酶等破坏茶树细胞壁的酶类、伏鲁宁小体、CAP20蛋白和CFEM效应子等显着相关。PRM蛋白质定量验证结果表明:茶树几丁质酶（CHIT）、类甜蛋白（TLP）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）在72h处理组显着上调,这些酶降解炭疽菌细胞壁成分,与转录组结果一致;‘LCS’健康叶PR1蛋白含量显着高于‘WM3’;处理组该蛋白含量减少,而PR1基因显着上调,可能是PR1蛋白由于在抗病过程中发挥作用而被消耗,消耗量大于合成量。双重数据库揭示了炭疽菌入侵和茶树防御的相关基因及其编码产物,为深入研究茶树和炭疽菌互作分子机制提供基础。（5）使用田间观测法测定47个茶树品种的冻害系数（H）,有效判断不同茶树品种的抗冻性差异。茶树枝条在-15℃冷冻2 h后置于室温5 h,其Fv/Fm、psbA基因的表达水平、色差中的绿红（a）指标与不同茶树品种的抗冻性差异相关。研究发现,a指标冷冻前后的比值Ra和Fv/Fm冷冻前后的比值RFv/Fm与H呈现相关性,线性回归方程分别为:H=30.03-10.82Ra（n=47,P值<0.01）和H=60.31-50.09RFv/Fm（n=47,P值<0.01）。qRT-PCR结果显示抗冻性强的茶树品种在冷冻胁迫后仍能保持较高的psbA基因表达水平,有利于D1蛋白的从头合成和维持光系统2（PSII）活力。这些指标能快速评价茶树品种抗冻性,有利于加速茶树抗冻能力筛选进程。
张琰锋[4]（2019）在《杨生褐盘二孢菌专化寄生特性及效应分子研究》文中研究指明杨树黑斑病是杨树的主要病害之一。在我国,其最主要的病原菌为杨生褐盘二孢菌（Marssonina brunnea）,该菌能够侵染青杨派、黑杨派、白杨派的很多种类和品种,对杨树人工林的危害尤为严重。杨生褐盘二孢菌有两个专化型,即单芽管专化型（M.brunnea f.sp.monogermtubi）和多芽管专化型（M brunnea f.sp.multigermtubi）。在自然条件下,它们分别侵染不同派系的杨树寄主,非亲和派系杨树对专化型具有稳定的抗病性,因此成为杨树抗病育种研究的重要体系。然而,目前有关两个专化型的详细侵染过程和寄生特性等尚不明确,这直接阻碍了研究工作的深入开展。同时,效应分子作为病原菌的关键致病因子,是抗病寄主识别病原菌的重要靶标,揭示效应分子的生物学功能是研究病害互作机制的重要内容。因此,本论文应用微卫星分子标记技术,进一步明确了两个专化型的区别;采用多种显微技术详细观察了杨生褐盘二孢菌的附着、定殖和扩展等侵入过程;运用mRNA-Seq技术对两个专化型与亲和寄主互作过程中基因的转录表达进行分析;采用瞬时表达和酵母双杂等技术对专性效应分子做了研究,旨在明确杨生褐盘二孢菌的侵染、寄生特性,了解两个专化型与寄主杨树的互作机制,为抗病育种工作提供有价值的信息。主要研究结果及结论如下:1.开发了杨生褐盘二孢菌的微卫星分子标记,明确了两个专化型在遗传结构上的区别。通过分析杨生褐盘二孢菌的基因组发现该菌含有丰富的微卫星位点,继而经过引物设计和筛选获得了 24对微卫星引物并证实它们能够用于杨生褐盘二孢菌遗传多样性的研究。使用这些引物研究该菌的遗传多样性发现:两个专化型群体遗传结构的差异明显;同时,单芽管专化型比多芽管专化型具有更丰富的遗传多样性。研究结果进一步证实两个专化型的客观存在,并说明多芽管专化型可能由单芽管专化型进化而来。2.揭示了杨生褐盘二孢菌对杨树的组织病理侵入过程,阐明了其半活养的寄生特性。杨生褐盘二孢菌在寄主叶片表面形成侵染芽管,可直接从角质层侵入寄主。在侵染前期,该病菌主要以侵染泡囊和初生菌丝进行扩展,这些结构可突破寄主细胞壁,但不能穿过细胞膜,寄主细胞不发生死亡。在侵染后4 d,细长的次生菌丝大量出现,很多寄主细胞已经死亡,这些结果表明该菌是半活养型病原真菌,其寄生过程包含活养和死养两个阶段。此外,通过对侵染结构细节特征的观察发现,侵染芽管、侵染泡囊和次生菌丝等结构与寄主发生了明显的相互作用。3.发现两个派系杨树品种对杨生褐盘二孢菌侵染具有不同的响应方式。在杨树黑斑病的发生过程中,黑杨派和白杨派寄主分别有3301和4382个基因发生差异表达,这些基因涉及寄主的抗病蛋白、转录因子、信号转导、初生代谢和次生代谢等过程。维恩图分析和基因共表达趋势分析等表明,两个派系杨树品种在响应黑斑病菌侵染时表现出较大差异。黑杨派杨树在侵染初期（接种后6 h）有1543个基因发生上调表达,包括与细胞壁代谢、植物激素信号通路等生物过程相关的很多基因,说明其发生了较强的防御反应。与之不同,白杨派寄主在侵染初期反应较弱,只有526个基因发生上调表达;但在侵染后96 h该寄主响应强烈,有4093个基因发生了差异表达,其中有1773个基因发生下调表达,包括碳水化合物代谢、光合作用等生物过程相关的很多基因。此外,两个专化型可能通过影响亲和寄主不同生理过程完成寄生方式的转变。黑杨派寄主的类黄酮合成通路和苯丙素合成通路可能参与了多芽管专化型寄生方式的转变;而单芽管专化型可能通过引发白杨派寄主的过敏性细胞死亡实现寄生方式的转变。4.筛选到多芽管专化型的4个潜在专性效应分子。通过比对分析和软件预测获得156个杨生褐盘二孢菌的效应分子。其中,多芽管专化型菌株可能具有4个专性效应分子,分别为 MBM02130、MBM03364、MBM02980 和 MBM06785,它们在多芽管专化型的侵染过程中均发生显着上调表达;同时,这4个效应分子的表达均不能引发烟草的免疫反应,属于毒性效应分子。其中,MBM02980和MBM06785在死养阶段的表达量显着提高,说明它们可能在多芽管专化型杀死寄主组织的过程中起着重要的作用。此外,酵母双杂交试验结果表明MBM06785可以同杨树的类S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因发生互作。
蒋时姣[5]（2019）在《核桃黑斑病抗性评价及抗病机理研究》文中提出核桃黑斑病是由核桃黄单胞杆菌（Xanthomonas arbicola pv.juglandis）引起的细菌性病害,是世界各大核桃种植区最主要的叶部和果部病害。发病时可以侵染核桃的各个器官,包括雄花、雌花、果、嫩枝、芽和叶,影响树势生长发育,且严重导致核桃产量及品质的下降。目前,核桃黑斑病主要采用含铜类农药进行防御和控制,但易导致病菌耐药性的增加及环境的污染。提高核桃品种的抗病性是解决这一问题最经济、最有效的方法,而抗病育种的前提是对不同核桃品种的抗病性进行良好评估,此外,对核桃响应黑斑病病菌侵染的机制的研究对抗病育种具有指导意义。由于当前核桃抗病材料及其遗传信息的匮乏,有关核桃与核桃黄单胞杆菌互作机制的研究,尤其是关于病原菌致病力的研究以及植物抗病机理的研究较少,抗病品种的培育进展缓慢。本研究利用田间调查及人工接种（离体叶片接种和植株叶片接种）的方法,对18个核桃不同品种（无性系）的黑斑病抗性进行了评价。此外,通过选取10个不同黑斑病抗性的品种（无性系）,分析其在黑斑病病原菌侵染过程中各生理生化指标的响应规律。最后,利用转录组测序技术,分析黑斑病易感品种和抗病无性系健康叶片及发病叶片中基因的表达水平的变化,分析抗病相关基因间的差异,筛选主要的抗病相关基因,以期揭示核桃黑斑病抗病机理,为核桃黑斑病抗病育种提供一定的指导和理论依据。研究结果如下:1、通过田间调查评价,确定了18个核桃品种（无性系）的黑斑病抗性强弱分别为:JS 91（JS 92、JS 86、清香、JS 71、JS 64）>JS 199（JS 200、硕星）>攀核一号（盐源早）>川早一号（川早二号、辽核、JS 100）>蜀江一号（JS 65、香玲）。采用离体叶片接种和植株叶片接种的方法进行人工评价,评价结果与田间调查结果比较发现,人工接种评价结果与田间调查结果均显着相关（P≤0.05）,其中,植株叶片接种评价的结果与田间调查结果相关性最大（r=0.789）,即植株叶片接种评价比离体叶片接种评价更接近田间调查评价。因此,植株叶片接种评价可以作为田间调查评价的补充,为核桃黑斑病抗性材料的筛选提供依据。2、选取10个黑斑病抗病性不同的核桃品种（无性系）,采用植株叶片接种方法,分别观察其在接种核桃黄单胞杆菌0 d、3 d、7 d、14 d、28 d后叶氧化还原相关酶活性、酚类化合物含量及酚类合成相关酶活性以及膜脂过氧化的变化情况。结果表明,超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量在侵染后活性显着升高,但其变化大小与品种（无性系）抗病性大小无关;过氧化氢酶侵染后活性变化无明显规律;过氧化物酶活性、总酚类物质含量、多酚氧化酶与苯丙氨酸转化酶活性在侵染后均显着升高,且在早期的变化均与抗病性强弱显着正相关（P≤0.05）。总酚类含量以及酚类相关酶活性在接种后被诱导且其变化与抗病性强弱呈正相关关系,说明酚类物质代谢在核桃黑斑病的早期防御中发挥重要作用。3、以核桃黑斑病抗病无性系JS 91和感病品种香玲的健康及发病叶片为材料进行转录组测序,通过基因注释、代谢通路注释以及健康及发病叶片中差异基因表达的变化,构建了核桃响应黑斑病病原菌侵染的转录组表达谱,分析核桃对黑斑病病原菌的响应以及抗病相关基因在此响应上的差异。本研究对8个核桃样本进行转录组测序,共获得77325条注释的Unigene,该注释结果为核桃其他相关研究的基因注释提供了重要的参考。通过抗病相关基因的差异表达分析,获得以下结果:第一,在病原体识别方面,抗病无性系通过FLS2和XA21识别病原体建立了病原体触发的免疫（PTI）以抵御病原体的攻击;而感病品种中抑制FLS2以及XA21的相关基因（RING/U-box和E3泛素连接酶;环指泛素连接酶、质膜ATP酶以及蛋白磷酸酶2C）被诱导,该防御途径受到抑制。第二,在细胞壁重建方面,抗病和感病品种（无性系）同时通过抑制木葡聚糖水解酶相关基因以抑制细胞壁水解,抗病无性系诱导果胶酯酶、转录因子MYB、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶类酶、愈伤组织合成酶和大量转录因子bHLH及壁相关激酶参与细胞壁重建,从而阻碍病原菌的继续扩散;感病品种诱导促进细胞壁降解的木葡聚糖内切葡聚糖酶以及纤维素酶,且MYB转录因子被诱导而bHLH没有显着变化,同时感病基因MLO被特异性诱导,其细胞壁重建受阻,组成型防御被病原体克服。第三,在ROS清除方面,抗病无性系过氧化物酶相关基因被诱导,感病品种超氧化物歧化酶相关基因被诱导,其余活性氧清除酶（谷胱甘肽转移酶、过氧化氢酶等）相关基因则被抑制或没有显着变化。此外,感病品种中多酚氧化酶被诱导而苯丙氨酸转移酶被抑制,其苯丙烷类途径受到抑制。第四,在信号传导方面,抗病无性系中大量钙离子相关基因被诱导,其主要通过钙离子信号传导途径传递抗病防御信号;而与乙烯信号传导相关基因则仅在感病品种中被诱导或抑制,其主要通过乙烯信号传导途径传递抗病防御信号,抗病信号传导途径上的差异可能与品种（无性系）抗病性差异有关。本研究对18个核桃品种（无性系）进行了黑斑病抗性评价,并明确了植株接种评价方法可以作为田间调查评价方法的补充。生理生化指标的测定发现,总酚含量以及与酚类相关的过氧化物酶、多酚氧化酶及苯丙氨酸转化酶活性在病原菌侵染后被诱导,且其变化与核桃黑斑病抗性大小有关,可以作为检测抗病性的候选参考指标。此外,转录组测序结果有助于理解核桃黑斑病抗病防御,抗病无性系与感病品种在抗病相关途径上的差异有助于揭示其抗性差异的原因,得到的相关基因为后续的核桃黑斑病抗病机理研究以及抗病育种提供了一定的理论依据。
刘泽慈[6]（2019）在《甘蓝染色体片段替换系的构建和黑腐病抗性QTL定位及候选基因分析》文中提出结球甘蓝（Brassica oleracea var.capitata）是一种在世界范围内广泛种植的叶菜类蔬菜。近年来,由于复种指数的提高、不合理栽培方式与大量引种,黑腐病在我国甘蓝产区普遍发生且逐年加重,严重影响了甘蓝的品质和产量,造成巨大的经济损失。了解甘蓝黑腐病遗传机理、选育抗病品种是防治黑腐病最经济有效的办法。本研究以野生抗黑腐病甘蓝自交系R4-P1与感病骨干自交系R2-P2为杂交组合构建的重组自交系绘制了甘蓝遗传图谱;通过连续多代回交与自交策略,结合遗传图谱上均匀分布的分子标记进行辅助选择的方法构建了一套以R2-P2为背景、R4-P1为供体的甘蓝染色体片段替换系;利用构建的染色体片段替换系与绘制图谱所用的重组自交系,进行了甘蓝黑腐病抗性QTL定位,对主效定位区段内的9个候选基因进行测序比对与接病后不同时间段表达量与瞬时表达分析;并对甘蓝全基因组NBS-LRR类型抗病基因进行了鉴定与基因分析,为甘蓝抗黑腐病品种的分子选育提供帮助。主要研究结果如下:1.选用野生甘蓝高代纯合自交系R4-P1和结球甘蓝骨干自交系R2-P2构建的重组自交系,构建了一张包含303对SSR与In Del标记,覆盖基因组总长度为767.2 c M,标记间平均遗传距离和物理距离分别为2.53 c M和2.07 Mb的结球甘蓝遗传连锁图谱。2.利用均匀分布在图谱9条染色体的181个标记,通过对不同世代的单株进行分子标记筛选,构建了一套包含160个株系,以结球甘蓝自交系R2-P2为遗传背景的甘蓝染色体片段替换系,导入的供体R4-P1染色体片段对受体R2-P2基因组的覆盖率为100%,受体亲本基因型的回复率平均达到97.21%。3.通过苗期喷雾法接种黑腐病3号生理小种,在重组自交系与染色体片段替换系两个群体中共定位出分布在甘蓝1、2、7和8号染色体上的11个抗黑腐病QTL,其中位于7号染色体上的q BR-7-1与q BR-7-3与位于8号染色体的q BR-8-2的LOD值均大于3,为主效抗黑腐病位点。位于1号染色体上的q BR-1-2与q BR-1-4,7号染色体的q BR-7-1与q BR-7-3及8号染色体的q BR-8-1与q BR-8-2均存在部分定位区域重叠,说明这三个重叠区域可能为稳定抗黑腐病区间。其中位于7号染色体,最高可解释16.72%表型变异的q BR-7-3在两个群体中均被定位到且LOD最高,为稳定主效抗病区域。4.根据稳定主效抗病q BR-7-3区域内的基因注释,共鉴定出9个（5个NBS-LRR、3个STK及1个抗病相关）黑腐病抗病候选基因。候选基因测序结果表明NBS-LRR类型基因Bo7g111290在两亲本间存在多处SNP和In Del差异,导致两亲本间编码的部分氨基酸存在差异;9个候选基因在喷雾接种黑腐病3号生理小种后在0-48小时内的表达量存在显着差异。与其它8个候选基因不同,Bo7g111290在接病后各时间段内在抗病亲本R4-P1中的相对表达量均高于感病亲本R2-P2;瞬时表达表明Bo7g111290可能参与了甘蓝黑腐病的抗性,R4-P1与R2-P2中Bo7g111290基因表达量的不同可能是导致两亲本对黑腐病3号生理小种抗性存在巨大差异的原因之一。5.在甘蓝基因组上共鉴定出包括Bo7g111290在内的广泛分布于甘蓝9条染色体上的176个NBS-LRR基因,其中88个NBS-LRR基因以基因簇的形式存在,约占全部基因NBS-LRR总数的51.5%,抗黑腐病候选基因Bo7g111290单独存在于甘蓝7号染色体,这些基因簇的分布可能与甘蓝NBS-LRR基因进化有关;甘蓝TNL类型基因的平均序列长度、CDS长度及编码的氨基酸均大于CNL与NL类型。同时,TNL基因的平均外显子数量也高于CNL与NL类型,表明甘蓝NBS-LRR基因的大小与结构域及基因类型密切相关。同时在这176个NBS-LRR蛋白中均检测到P-loop、RNBS和kinase-2基序,而且这三个基序在三种类型的NBS-LRR蛋白质中具有高度的相似性,说明甘蓝NBS-LRR基因家族的蛋白具有很强的保守性;基因进化分析表明TNL亚家族的扩展程度更大,表明TNL亚家族比CNL和NL亚家族更古老。
肖梅[7]（2019）在《甘薯SPW5基因克隆、表达载体构建及遗传转化探索》文中指出近年来,由于生产水平的提高和农业产业结构的优化,以及人们膳食结构的调整,甘薯（Ipomoea batatas L.）作为重要的粮食、饲料、工业原料及新能源,种植的面积日益加大,人们对甘薯的需求也日益增高。甘薯是一种无性繁殖作物,极易在代代繁殖中累积病毒,从而导致产量大减,品质变差。深入研究甘薯抗病机制,可以为甘薯的优质育种提供依据。本实验室前期通过转录组数据分析,筛选出一些与甘薯抗病毒病相关的基因,其中包括SPW5基因。本研究从甘薯品种徐薯22中克隆出了SPW5基因,并对其核苷酸序列进行了分析,证明SPW5属于WRKY转录因子,成功构建了该基因过表达载体SPW5-p101-GV3101。对甘薯的再生体系进行了探索:以无菌试管苗为材料,分别将4个甘薯品种的茎尖、叶片、叶柄、侧芽作为外植体建立再生体系,并对离体再生培养基进行了优化,成功诱导出愈伤组织,并进行悬浮培养,成功诱导出体细胞胚。并且对农杆菌介导的SPW5基因表达载体遗传转化体系进行了探索。主要研究结果如下:1.基因克隆及载体构建:根据转录组测序得到的序列设计SPW5基因引物,从甘薯品种徐薯22中克隆了SPW5基因CDS序列。然后利用载体pEarleyGate101成功构建了超表达载体SPW5-p101-GV3101。2.生物信息学分析:利用生物信息学技术对SPW5基因进行预测分析,编码区1182bp,编码了393个氨基酸,该基因编码的蛋白是一个位于细胞核的非膜蛋白,蛋白质分子量为43301.21 Da,等电点pI为6.36,通过NCBI网站预测发现编码的蛋白具有WRKY家族所有的WRKY区域,且具有高度的保守性,推断甘薯SPW5基因编码WRKY家族基因的成员。3.甘薯再生体系的试验结果表明:（1）甘薯诱导愈伤组织时最佳的外植体是叶片;（2）在甘薯愈伤组织培养中,MS+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖的效果最好;（3）悬浮培养的最佳条件是:初始接种密度在1.0-4.0:25mL范围内时,随着接种密度增大,悬浮细胞的增值速率逐渐变小,因此最佳的接种密度为1.0:25ml。初始接种量在0.5-2.0mL范围内时,随着接种量的增加,悬浮细胞的增值速率呈下降趋势,综合考虑绝对增值量,最佳的接种量为1.5mL。当摇床转速为低于100r/min时,胚性悬浮细胞的增值速率随着转速的增加而加大,反之,当转速高于100r/min时则相反,因此最佳的摇床转速为100r/min。4.对甘薯遗传转化体系进行了探索,结果表明,用甘薯品种徐薯22作为遗传转化的外植体时,（1）非转基因阳性植株在50mg/L卡那霉素（Kan）的条件下依然能正常生长发育,因此在遗传转化过程中需提高抗性筛选浓度。（2）不带侧芽的茎段并不能分化出不定芽,而带有侧芽的茎段一共分化出45株拟转基因植株,PCR结果表明,45个植株中,并未出现阳性植株。
丁玉梅[8]（2019）在《黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的应答机制及NBS类抗病基因筛选》文中指出黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia Bouche）是南瓜属一年或多年生瓜类作物,对瓜类枯萎病有较强抗性,已作为嫁接砧木有效控制了瓜类枯萎病的发生和危害。中国是全球瓜类生产大国,枯萎病是影响瓜类产量和品质的重要病害之一,为镰孢属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）寄生引起的一种真菌土传病害,在世界范围内的瓜类种植区普遍发生,一般使瓜类减产20%60%,而培育抗病品种是防控该病最经济、最有效和环境友好的途径。有关瓜类对枯萎病菌侵染的免疫应答机制及瓜类-枯萎病菌互作的分子机制至今未完全阐明。利用高通量的测序技术,从转录组学和蛋白组学水平上研究黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的分子机制。一方面,可以较系统分析抗性基因和抗性蛋白的差异表达特性,有助于从整体水平上揭示黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的代谢通路、信号传导和分子调控网络,深入解析黑籽南瓜-枯萎病菌互作的分子机制,为阐明瓜类寄主响应枯萎病菌胁迫的抗性机制提供分子生物学基础信息。另一方面,可获得差异基因和差异蛋白表达谱的全景图,有利于筛选和鉴定起关键作用的抗病基因,为瓜类抗枯萎病基因工程育种提供可利用的基因资源。基于此,本研究从黑籽南瓜基因组中克隆NBS类抗病基因同源序列（RGAs）,并分析不同抗性品种中NBS同源片段的表达差异,结合枯萎病症状的表现确定抗性基因表达丰度较高的取样时间。在此基础上,选取抗病材料,利用高通量RNA-Seq技术和iTRAQ技术,通过多点时序比较,构建黑籽南瓜应答枯萎病菌胁迫的差异基因和差异蛋白表达谱,分析黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的代谢通路和分子调控网络;锁定和鉴别黑籽南瓜NBS类关键抗病基因,构建NBS类基因的VIGS沉默载体进行基因功能的初步验证。获得的主要研究结果如下:1.设计NBS类抗病基因保守结构域的简并引物,从黑籽南瓜基因组中分离了8条RGAs,其中HQRGA2（GenBank ID:MG946756）包含NBS类抗病基因的4个保守模块:P-loop、Kinase-2、Kinase-3a和GLPL区,且具有NB-ARC（nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4）结构,为CC-NBS-LRR类抗病基因序列。HQRGA2与部分抗病基因序列的核苷酸相似性达到87%99%,与中国南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13的氨基酸同源性较高,达到96.6%,与其余抗病基因同源性在16.6%43.8%之间。Q-PCR分析显示3个黑籽南瓜品种中HQRGA2的表达均受枯萎病菌胁迫（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）的诱导,其中感病白皮品种呈多个升-降的表达趋势,中抗花皮品种呈多个降-升的趋势,抗病绿皮品种HQRGA2的表达水平增加迅速且持续能力强,呈增加-降低的表达特点。结合接种后枯萎病出现和发展特征,确定转录组和蛋白组测序取样时间为接种枯萎病菌后48h（无肉眼可见症状的潜伏期）和96h（病症扩展期）。2.以抗病绿皮品种为材料,采用伤根法加灌根法接种枯萎病菌,对接种后48h、96h和对照（伤根加无菌水灌根后48h）的黑籽南瓜叶片进行RNA-Seq高通量测序,用Trinity软件对Clean reads进行组装,组装获得的Unigene在NR、SWISSPROT、KOG、GO、KEGG数据库中比对得到注释结果,FPKM法计算Unigene表达量筛选差异表达基因并进行GO功能和Pathway富集分析,研究黑籽南瓜响应枯萎病病原菌侵染过程中同一时间点及不同时间点的差异基因表达变化,构建了黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的转录组表达谱。主要结果如下:（1）黑籽南瓜转录组测序经组装后共获得62,169条Unigene,N50为1,640bp,最长Unigene为15,877bp,最短Unigene为301bp,平均长度为1,160bp。将Unigene和NR、SWISSPROT、KOG、GO和KEGG数据库进行比对,共获得47,521条Unigene（76.44%）的生物信息学注释结果,其中11,676条Unigene（29.40%）能与甜瓜基因组比对上,11,674条Unigene（29.39%）能与黄瓜基因组比对上。另有14,648条Unigene（23.56%）未被注释到,推测该部分序列可能是新转录本,或者是黑籽南瓜区别于其他瓜类作物的特有基因。本研究构建的转录组数据库可为研究其他瓜类抗病机制的基因注释提供参考。（2）通过接种后不同时间点的基因表达量和差异表达基因分析,对差异基因进行功能注释和代谢通路富集,Q-PCR验证转录组测序结果较为可靠。结果显示:（1）受枯萎病菌侵染后,不同时间点被诱导的大多数Unigene的功能都是常见的,几乎涵盖了植物生长发育的各个方面。共有25,020条Unigene被富集到25个分子功能家族,其中4,437条Unigene被富集到仅一般功能预测（General function prediction only）,是富集基因数最多的一类,其次2,744条Unigene富集到翻译后修饰（Posttranslational modification）、蛋白质周转（Protein turnover）和分子伴侣（Chaperones）,2,368条Unigene富集到信号转导机制（Signal transduction mechanisms）,而富集到次生代谢物的合成、运输及分解（Secondary metabolites biosynthesis,Transport and catabolism）与防御机制（Defense mechanisms）上的基因数分别是837条和228条。（2）枯萎病菌激活的黑籽南瓜差异表达基因随侵染时间的延长而增多。接种后48h和96h的差异表达基因分别为939和2,021个,且下调基因的数量大于上调基因,其中有大量转录因子和抗病R基因发生了上调或下调表达。并集分析显示有721个差异表达基因在2个时间点中共同差异表达,355个基因上调表达,366个基因下调表达;具有相同的表达趋势的有444个,238个持续上调表达,206个持续下调表达。（3）Pathway富集分析显示,接种后48h时差异表达基因参与了细胞程序性死亡（Necroptosis）、过氧化物酶体（Peroxisome）、硫胺素代谢（Thiamine metabolism）、淀粉和糖代谢（Starch and sucrose metabolism）、细胞凋亡（Apoptosis）、糖酵解/糖异生（Glycolysis/gluconeogenesis）、溶菌酶（Lysosome）、细胞色素P450代谢（Cytochrome P450 metabolism）、丙酮酸盐代谢（Pyruvate metabolism）、谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）、抗坏血酸和醛酸盐代谢（Ascorbate and aldarate metabolism）、植物激素信号转导途径（Plant hormone signal transduction）等抗病相关代谢途径。接种后96h,除上述代谢途径外,还激活了P53信号、VEGF信号和TNF信号等抗病相关信号途径,枯萎病菌激发了黑籽南瓜体内多种抗病途径、差异表达基因涉及防御反应及信号转导等,显示黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的分子机制受到多基因网络系统的调控。3.在转录组学研究的基础上,以相同处理的材料,利用iTRAQ技术研究黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的差异蛋白表达谱。结果表明:（1）总共鉴定到的可信蛋白数量为1,907个,差异表达蛋白总数为567个,CK-VS-48h处理组的差异表达蛋白有113个,其中60个差异蛋白通过KEGG富集到55个代谢通路;CK-VS-96h处理组有329个,198个富集在82条通路;48h-VS-96h有125个。发现在差异表达蛋白中有4个未知功能蛋白,其中的1个上调蛋白CL11145contig1是gpi锚定的非特异性脂质转移蛋白,对于抵抗非生物胁迫具有重要作用。另一个上调蛋白CL9717contig1为未知蛋白。2个下调的未知蛋白CL29643contig1和CL4168contig1均为假定的Csa蛋白,功能有待研究。（2）对差异表达蛋白进行并集分析找到3个处理组中有13个共性差异蛋白,其中与抗性相关的是S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAM1和SAM2）,推测SAM合成相关基因也在抗病过程中发挥了重要作用。差异基因和差异蛋白与KEGG通路之间的互作分析表明,接种后48h的基因和蛋白间的相互作用差异比96h大,上调表达的互作基因和蛋白数量比96h多。（3）差异表达基因与差异表达蛋白关联性分析表明,接种后48h和96h与转录组差异基因关联表达的差异蛋白分别有11个和39个;KEGG富集分析表明差异基因、差异蛋白和相关调节基因富集到20个代谢途径,主要参与了核糖体、苯丙素类生物合成、光合生物的碳固定、过氧化物酶体、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢和糖酵解/糖异生、半乳糖代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及植物激素信号传导等途径。研究结果为确定需深入研究的代谢通路及鉴定关键抗性蛋白提供依据。4.综合黑籽南瓜接种枯萎病菌后的转录组和蛋白组学中的pathway富集分析数据,提出了黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的抗病信号转导网络,初步明确了黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的分子调控和信号传导途径,为黑籽南瓜抗病基因的进一步挖掘奠定了基础。（1）受枯萎病菌侵染后,黑籽南瓜通过膜锚定的枯萎病菌受体蛋白识别真菌诱导子/PAMPs（病原体相关分子模式）,诱导下游信号传导。（2）钙通道的激活和胞质钙的增加触发NADPH氧化酶的激活,导致H2O2的产生和活性氧（ROS）爆发。（3）黑籽南瓜去除根尖后,枯萎病菌快速入侵,病菌的效应因子/无毒基因（AVR）使黑籽南瓜相关基因作出误判,从而导致木质素合成降低、细胞间隙扩大、细胞壁降解、光合速率下降、蜡质合成下降等过程,植株的物理抗性并未发挥作用。（4）随着病原菌的增多,黑籽南瓜通过特定的病原体受体（PRRS）和NBS类抗病蛋白识别病菌效应因子,从而激活MAPK信号转导途径。（5）ABA途径在MYB和NAC等转录因子的参与下,通过提高丙酮酸盐、介导气孔关闭、减少蒸腾作用及细胞程序性死亡来防御病菌。（6）茉莉酸（JA）途径主要是通过茉莉酸甲酯的增加来促进相关转录因子或基因的表达,但其中的基因有上调或下调,预测细胞色素P450和细胞程序性死亡参与了后期的防御;（7）水杨酸（SA）途径作为主要的抗病信号转导途径,通过WRKY和BZIP转录因子激发了PR1蛋白的表达,从而开启系统性防御过程（SAR）,调动硫胺素、溶菌酶、细胞程序性死亡,细胞凋亡、吞噬体等过程来清除病菌;（8）产生的ROS通过抗坏血酸-谷胱苷肽循环（ASA-GSH）循环来清除。（9）过氧化物酶体在抗病过程中通过CAT来调节和平衡ROS的产生。5.针对NBS-LRR类基因在黑籽南瓜抗病信号转导中的重要作用,本研究采用二代转录组Unigene和全长转录组Unigene结合方法对NBS类基因进行了鉴别和筛选。（1）以NB-ARC作为参考氨基酸序列,从黑籽南瓜CDS中鉴定了43条CfNBS（NBS-type gene from C.ficifolia）类基因序列,分属于TNL、CNL、TN、RPW8-N和N类六个亚基因家族,典型的TNL和CNL类分别有2个和13个。进化树分析表明,CfNBS类基因可以分为4大类群,黑籽南瓜的NBS类抗病基因数量较少但其基因分化比其它瓜类物种丰富。（2）与二代转录组进行比对,筛选获得11个差异表达的CfNBS类关键基因,显着富集在防卫反应、谷胱苷肽转运、受体丝氨酸/苏氨酸激酶结合等生物学过程和分子功能,富集通路最多的是与TMV抗性蛋白同源的2个基因（CL19588contig1和CL21402contig1）,表明这2个基因在抗病过程中起到了重要的作用。接种枯萎病菌后的Q-PCR验证表明,有10个基因表达趋势同转录组数据变化趋势基本一致。组织表达特异性分析表明,在根、茎和果皮中表达量最高的基因分别是CL34065Contig1、CL52011Contig1和CL19588Contig1。6.从黑籽南瓜转录组数据库中获得了HQRGA2片段的全长基因,其Unigene编码为CL7398Contig1,经实体克隆测序该基因全长4,303bp,命名为CfRFN2（Gene Bank ID:MK618462）,ORFfinder分析发现其有一个完整的编码框,长度4,092bp,编码1,363个氨基酸。（1）CfRFN2注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录突变体X1同源基因。CfRFN2与其他瓜类抗病基因核苷相似性在87%98%之间,保守结构域分析该基因含有1个NB-ARC和2个LRR结构域;推导该基因的信号肽序列在1920个氨基酸之间且不属于分泌蛋白;CfRFN2蛋白与美洲南瓜和中国南瓜的RPS2蛋白同源性亲缘关系最近。（2）从克隆载体pEASY-CfRFN2片段3中扩增415bp的CfRFN2基因片段,连接入VIGS载体pTRV2,构建完成VIGS沉默载体pTRV2-CfRFN2。以含有沉默载体和共转化载体pTRV1的农杆菌同时侵染黑籽南瓜幼苗,28d后以共侵染的植株接种枯萎病菌为处理,以野生型植株接种枯萎病菌为对照,接种7d后,处理植株较对照发病严重,Q-PCR分析显示处理植株中CfRFN2的相对表达量在接种后48h和96h比对照分别减低34.75%和98.27%,初步表明黑籽南瓜CfRFN2基因具有抗枯萎病的功能。
李德强[9]（2018）在《抗稻瘟病和稻曲病种质资源筛选与雅恢2115抗瘟基因鉴定及改造利用》文中研究说明稻瘟病和稻曲病是影响水稻高产、稳产及食品安全的主要病害。实践证明,选育和种植抗病品种是控制病害最经济、最环保、最有效的措施。抗病种质资源筛选及抗病基因发掘是抗病育种的基础。因此,本研究结合室内抗谱测定和田间病圃抗性鉴定,对29个抗稻瘟病单基因系的稻瘟病抗性及223份种质资源的稻瘟病、稻曲病抗性进行了系统的鉴定评价;利用抗病基因表达谱分析、转基因验证等技术,对高抗稻瘟病恢复系雅恢2115进行了抗稻瘟病基因鉴定和改造利用。主要研究结果如下:（1）有效抗稻瘟病基因筛选2013-2017年室内抗谱测定和田间病圃抗性鉴定结果表明,29个抗稻瘟病单基因系对四川稻瘟病菌群体的抗病频率分布在0.24%94.39%之间,叶瘟病情指数分布在0.1594.22之间,穗颈瘟病穗率分布在1.32%100.00%之间,材料间抗性水平差异显着;携带Pikh、Pikm、Pi9和Pi2的单基因系抗瘟性表现较好,其中携带Pi2和Pi9单基因系的抗病频率分别达到94.39%和90.38%,叶瘟病情指数分别为0.15和0.22,穗颈瘟病穗率分别为1.32%和1.82%,对四川稻瘟病菌群体抗谱宽,田间病圃稳定表现为抗稻瘟病。由此可见,抗稻瘟病瘟基因Pi2和Pi9对四川水稻抗稻瘟病育种有较高利用价值。（2）抗稻瘟病和稻曲病种质资源筛选2013-2017年田间抗性鉴定结果表明,223份种质资源中对稻瘟病、稻曲病均表现为抗或高抗的有雅恢2115、雅恢2918及成恢727等34份,其中对穗颈瘟和稻曲病均表现为高抗的有成恢3203、MR183-2及R650等13份,这些资源对四川水稻抗稻瘟病和稻曲病育种有较高利用价值。（3）稻瘟病抗源抗性遗传背景分析以在四川有利用价值的抗瘟基因Pikh、Pikm、Pi9、Pi2和最新克隆的广谱抗瘟基因Pigm的分子标记对37份抗源进行基因型检测,发现与携带Pigm、Pikh和Pikm对照带型一致的抗源分别有20份,与携带Pi2对照带型一致的有雅恢2115、华占和五山丝苗等14份,与携带Pi9对照带型一致的只有2份;在Piz位点和Pik位点均有与对照带型一致的有16份,占参试抗源的43.24%。由此可见,Piz位点和Pik位点抗瘟基因在抗源中分布较广,将这两个位点的有效抗瘟基因聚合,有利于四川抗稻瘟病新品种的选育。（4）雅恢2115抗瘟基因鉴定通过分析雅恢2115全基因组重测序数据,从中发现5个可能对稻瘟病抗性有作用NBS-LRR类基因。接种稻瘟病菌后利用qRT-PCR结果分析表明,只有LOCOs11g44960基因在雅恢2115中诱导上调表达且本底水平较高。利用转基因技术将LOCOs11g44960基因连入以35S为启动子的pCAMBIA1300载体中,在感病材料TP309中对LOCOs11g44960基因进行过表达,通过潮霉素鉴定、特异性引物PCR扩增鉴定和qRT-PCR分析获得16个阳性株系,对阳性株系接种稻瘟病菌发现,LOCOs11g4496基因在过表达株系中的表达水平高于野生型TP309,且受稻瘟病病菌诱导表达,叶片病斑面积也小于对照,可见该基因增强了水稻对稻瘟病菌的抗性,对雅恢2115的抗瘟性有贡献。（5）雅恢2115的改造与利用以雅恢2115为核心种质,采用“抗性精准鉴定、南北穿梭选育、中低世代配合力和米质测定”的技术路线,创制出了雅恢2116、雅恢2119和雅恢2275等10个新恢复系,并以其为核心亲本选育了出23个杂交稻新组合参加省级、国家级区试,其中雅优2116于2018年通过国家级审定,这些新亲本及新组合的育成对确保水稻优质高产稳产具有重要意义。
汪顺娥[10]（2018）在《蜡质芽胞杆菌AR156和植物蛋白酶AtMC1参与调控植物抗病的机理研究》文中研究说明蜡质芽胞杆菌（Bacillus cereus）AR156是从土壤中分离的一株根围促生菌,前期研究中发现AR156灌根处理能激发拟南芥产生对丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringaepv.tomato,Pst）以及灰霉病菌（Botrytis cinerea）的诱导性系统抗性（Induce systemic resistance,ISR）,而叶片注射AR156则能诱导拟南芥叶片产生对Pst的系统获得性抗性（Systemic acquire resistance,SAR）。在此基础上,本研究通过在拟南芥叶片上注射处理AR156,发现能增强对后续接种病原菌Pst的抗病能力,这与flg22诱导的抗病表型类似。为了深入解析AR156在植物诱导抗病中的机理,本研究对AR156和flg22在抗病反应上进行了 一系列的比较分析。拟南芥类半胱天冬蛋白酶（type Ⅰ metacaspase 1,AtMC1）正向调控植物细胞的程序性死亡。本研究发现拟南芥atmc1突变体接种Pst后,和野生型相比突变体更为抗病。免疫共沉淀和荧光素酶互补实验证明AtMC1与类Sm蛋白（Sm-likeprotein4,LSM4）互作,且LSM4和AtMC1均反向调控植物的抗病能力。LSM4参与植物信使RNA前体的可变性剪接,转录组测序发现AtMC1同样影响植物信使RNA前体的可变性剪切,其中包括参与调控植物的抗病的部分基因。同时,在本研究中还发现AtMC1能够和部分miRNAs的前体结合,进而影响植物体内miRNAs的表达水平。1.蜡质芽胞杆菌AR156诱导拟南芥产生抗病反应。在本研究中将浓度为5×107 CFU/mL的AR156注射到4周龄大小的拟南芥Col-0以及转基因植株PR1::GUS的叶片中,一天后取叶片观察,结果显示叶片中累积了大量的胼胝质,活性氧以及PR1蛋白。此外,本研究用浓度高达5×108 CFU/mL的AR156对在MS培养基上生长两周的拟南芥Col-0幼苗进行叶面喷雾处理,可以检测到MPK3/6蛋白的快速激活,以及PTI反应应答基因FRK1、WRKY22和WRKY29的诱导上调表达。为了验证AR156是否诱导拟南芥产生了对Pst的抗病性,本研究分别用5×107 CFU/mL的AR156和1μM的flg22注射4周龄大小的拟南芥叶片,一天后在注射过的叶片上接种5×105 CFU/mL的Pst,发现和对照组相比,AR156和flg22预处理均能有效降低病原菌在叶片内的增殖。2.蜡质芽胞杆菌AR156和flg22激发植物产生类似的PTI反应。本研究发现在jar1,sid2-2,etr1,ein2和npr1突变体中AR156预处理仍然能诱导拟南芥产生抗性,说明其诱导的抗性不受SA,ET和JA途径的影响。但在ago1-27和dcl1-9突变体植物中AR156预处理诱导的抗性受损,说明AGO1和DCL1参与调控AR156处理诱导的抗性,AGO1是miRNAs介导的沉默复合体的重要组成成分,而DCL1是miRNAs生物合成所必需的。AR156和flg22均能调控一些参与植物PTI反应的miRNAs在拟南芥体内的积累。高通量测序结果显示AR156和flg22处理引起的转录组变化具有较高的相关性。3.AtMC1与LSM4互作负向调控植物免疫反应。AtMC1正向调控细胞程序性死亡并负向调控植物的抗细菌免疫反应。为了研究AtMC1在植物抗病免疫中的分子机制,我们在拟南芥互作网站上筛选AtMC 1的互作蛋白,并发现LSM4有可能与AtMC 1存在互作。为了验证AtMC1 与LSM4之间的互作关系,本研究分别构建了35S::AtMC1-FLAG和35S::LSM4-HA表达载体并转入农杆菌进行烟草瞬时表达,通过免疫共沉淀（Co-IP）验证了 AtMC1确实与LSM4存在互作。同时构建了35S::cLUC-LSM4和35S::AtMC1-nLUC表达载体转入农杆菌在烟草中进行了荧光素酶互补实验,实验结果再次验证了 AtMC1与LSM4之间的互作关系。lsm4突变体生长矮小,无法进行致病性测定。为了探究LSM4在植物免疫中的功能,本研究构建了LSM4的过表达植株,致病性测定结果表明LSM4负调控拟南芥对病原细菌的抗病性。4.AtMC1参与调控植物的可变性剪切和miRNAs的表达。由于LSM4在mRNA前体可变性剪切中具有重要的的调控作用,推测AtMC1也可能参与调控植物的可变性剪切。通过高通量测序和生物信息学分析,筛选并鉴定了一些参与植物可变性剪切发生影响的基因。其中,At2G30350编码的HIGLE蛋白是miRNAs生物合成途径的加工因子,At1G48500编码的JASMONATE ZIM-DOMAIN 4（JAZ4）蛋白和At1G65060编码的4-香豆酸:CoA连接酶3（4CL3）参与调控植物免疫。经过Northern blot验证发现一些miRNAs在atmc1突变体植物中的积累受到了影响,如miR398b,miR399a,miR159a和miR165a。定量PCR和蛋白检测结果显示AtMC1不影响miRNAs生物合成途径加工因子的表达水平,如RNA聚合酶（Pol）Ⅱ、DCL1、HYL1、SERRATE、HEN1和AGO1。通过RNA免疫沉淀实验发现AtMC1与这些miRNAs的初始转录本相结合,表明AtMC1参与调控miRNAs在植物体内的积累。综上所诉,本研究首次发现根围促生菌蜡质芽胞杆菌AR156能诱导植物产生PTI反应,从而增强植物抗病能力,为AR156作为生防菌的产业化提供理论依据。但不足之处在于采用叶片注射的方式增强植物抗病能力在实际的农业生产应用上并没有什么优势。作为植物体内的类半胱天冬蛋白酶,AtMC1首次被发现参与植物的抗细菌免疫反应。AtMC1通过正向调控miRNAs在拟南芥体内的积累以及mRNA前体的可变性剪接负向调控植物抗细菌免疫反应。
二、植物抗病基因类似序列研究进展及展望（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、植物抗病基因类似序列研究进展及展望（论文提纲范文）
（1）红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 红三叶主要病虫害、作物白粉病及病原菌鉴定的研究进展 |
| 2.1 红三叶主要病虫害 |
| 2.2 白粉病研究进展 |
| 2.3 病原菌鉴定研究进展 |
| 3 寄主植物-病原菌互作的转录组学研究进展 |
| 3.1 转录组学 |
| 3.2 转录组学在寄主植物与病害研究中的进展 |
| 4 植物抗病机制与GDSL脂肪酶的研究进展 |
| 4.1 作物病害生理生化反应研究进展 |
| 4.2 植物结构抗性研究进展 |
| 4.3 植物内源激素抗病性响应研究进展 |
| 4.4 GDSL脂肪酶基因研究进展 |
| 5 选题依据与意义 |
| 5.1 选题依据 |
| 5.2 主要研究内容 |
| 5.3 主要技术路线 |
| 第二章 红三叶抗白粉病的生理响应机制 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶白粉菌分离、鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 病害症状观察 |
| 1.3 病原菌形态学观察 |
| 1.4 病原菌rDNA-ITS片段的PCR扩增和序列测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病害症状与病原菌形态特征观察 |
| 2.2 rDNA ITS片段的扩增与测序 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 红三叶抗白粉病生理基础 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.2 测定方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素处理间红三叶的生理生化差异 |
| 2.2 二因素交互作用间红三叶的生理生化差异 |
| 2.3 人工接菌×抗病性×接菌后时间交互作用间红三叶生理生化的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 白粉菌侵染后红三叶内源激素的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 测定项目与方法 |
| 1.3 色谱条件及流动相的选择 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 标准样品保留时间?回归方程和决定系数 |
| 2.2 单因素处理间各内源激素的差异 |
| 2.3 二因素交互作用间各内源激素的差异 |
| 2.4 人工接菌×抗病性×浸染时间交互作用间红三叶内源激素的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 红三叶响应白粉菌侵染的结构抗病性 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶抗白粉病的细胞结构变化规律 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 白粉病不同抗性红三叶叶片显微结构 |
| 2.2 不同红三叶抗性材料叶片组织结构特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 白粉菌侵染后红三叶叶片细胞壁成份变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素处理间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 2.2 二因素交互作用间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 2.3 人工接菌×抗病性×浸染时间交互作用间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 红三叶抗白粉病的分子机制及TpGDSL基因的克隆与遗传转化 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶抗白粉病的转录组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料与试验设计 |
| 1.2 测序样品准备和RNA提取 |
| 1.3 建库、测序及信息分析 |
| 1.4 测序数据质控与转录组组装 |
| 1.5 Unigene的注释 |
| 1.6 差异表达基因数字分析 |
| 1.7 基因功能注释及通路富集 |
| 1.8 差异表达基因的qRT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA-seq结果的实时定量PCR验证 |
| 2.2 转录组组装与注释 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)分析 |
| 2.4 接种白粉菌后DEGs的GO富集分析 |
| 2.5 接种白粉菌后DEGs的KEGG富集分析 |
| 2.6 白粉菌侵染红三叶叶片诱导的 DEGs的 Map Man分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 红三叶抗白粉病TpGDSL基因克隆与遗传转化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 红三叶TpGDSL基因克隆 |
| 1.2.2 构建表达载体 |
| 1.2.3 红三叶抗白粉病基因TpGDSL遗传转化拟南芥 |
| 1.2.4 拟南芥T_1代阳性植株鉴定 |
| 1.2.5 目的基因生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TpGDSL基因阳性克隆鉴定 |
| 2.2 TpGDSL基因的核苷酸序列分析 |
| 2.3 TpGDSL基因编码蛋白的一级结构分析 |
| 2.4 TpGDSL基因编码蛋白的二级结构分析 |
| 2.5 TpGDSL基因编码蛋白的三级结构分析 |
| 2.6 TpGDSL基因克隆与表达载体构建 |
| 2.7 转基因拟南芥T_1阳性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论与研究展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）Botryosphaeria dothidea侵染后山核桃酚类物质合成相关酶活及关键基因的表达特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 山核桃干腐病的研究现状 |
| 1.1.1 山核桃干腐病的发生和危害 |
| 1.1.2 葡萄座腔菌属的概述 |
| 1.2 嫁接山核桃的品种 |
| 1.3 植物抗病机制的研究现状 |
| 1.3.1 植物抗病性作用机制 |
| 1.3.2 山核桃抗病机制的研究 |
| 1.4 植物抗病过程中酚类化合物的研究进展 |
| 1.4.1 酚类物质的种类及生物合成 |
| 1.4.2 酚类化合物合成酶及防御酶活性研究 |
| 1.4.3 酚类物质合成关键基因的研究现状 |
| 1.5 研究的内容、目的和意义 |
| 1.5.1 研究的内容 |
| 1.5.2 研究的目的和意义 |
| 2 不同品种山核桃干腐病感病情况及侵染情况分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂与培养基 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.3.1 人工活体接种 |
| 2.1.3.2 病情指数测定 |
| 2.1.3.3 扫描电子显微镜观察 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 B.dothidea侵染后不同品种山核桃感病情况分析 |
| 2.2.2 病原菌丝体在山核桃寄主体内的定殖与扩展 |
| 2.3 讨论 |
| 3 B.dothidea侵染对山核桃酚类代谢相关酶的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验接种和取样 |
| 3.1.3 总酚、总黄酮含量的测定 |
| 3.1.4 木质素含量的测定 |
| 3.1.5 酶活性的测定 |
| 3.1.5.1 试验试剂和仪器 |
| 3.1.5.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定 |
| 3.1.5.3 多酚氧化酶(PPO)活性测定 |
| 3.1.5.4 过氧化物酶(POD)活性测定 |
| 3.1.5.5 肉桂醇脱氢酶(CAD)活性测定 |
| 3.1.5.6 β-1,3葡聚糖酶(β-1,3GA)活性测定 |
| 3.1.5.7 几丁质酶(Chitinase)活性测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 总酚含量分析 |
| 3.2.2 总黄酮含量分析 |
| 3.2.3 木质素含量分析 |
| 3.2.4 几种防御酶活性分析 |
| 3.2.4.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性分析 |
| 3.2.4.2 多酚氧化酶(PPO)活性分析 |
| 3.2.4.3 过氧化物酶(POD)活性分析 |
| 3.2.4.4 肉桂醇脱氢酶(CAD)活性分析 |
| 3.2.4.5 β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性分析 |
| 3.2.4.6 几丁质酶(Chitinase)活性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 总酚、总黄酮和木质素与抗病相关性 |
| 3.3.2 几种防御酶与抗病相关性 |
| 4 B.dothidea侵染对山核桃酚类物质合成关键基因的克隆分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株、载体 |
| 4.1.3 试验接种和取样 |
| 4.1.4 试验试剂及仪器 |
| 4.1.5 山核桃枝干总RNA的提取 |
| 4.1.6 总RNA完整性检测 |
| 4.1.7 cDNA第一链的合成 |
| 4.1.8 PAL、4CL、C4H及 CHS基因克隆 |
| 4.1.8.1 引物合成及PCR扩增 |
| 4.1.8.2 RACE-PCR扩增 |
| 4.1.8.3 PCR产物的回收 |
| 4.1.8.4 目的产物与载体连接 |
| 4.1.8.5 感受态细胞的制备 |
| 4.1.8.6 目的片段的转化和阳性克隆 |
| 4.1.9 生物信息学分析 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 山核桃枝干总RNA的提取质量 |
| 4.2.2 苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆和分析 |
| 4.2.3 肉桂酸-4-羟基化酶基因(C4H)克隆和分析 |
| 4.2.4 4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)克隆和分析 |
| 4.2.5 查耳酮合成酶基因(CHS)克隆和分析 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 4.3.1 山核桃PAL基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.2 山核桃C4H基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.3 山核桃4CL基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.4 山核桃CHS基因的克隆及生物信息学分析 |
| 5 B.dothidea侵染对山核桃中酚类合成关键基因的表达研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 植物材料和菌株 |
| 5.1.2 试验接种和取样 |
| 5.1.3 试验试剂和仪器 |
| 5.1.4 山核桃枝干总RNA的提取 |
| 5.1.5 cDNA第一链的合成 |
| 5.1.6 PAL、4CL、C4H及 CHS基因Real-Time PCR |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 PAL基因在B.dothidea侵染山核桃过程中的表达 |
| 5.2.2 C4H基因在B.dothidea侵染山核桃过程中的表达 |
| 5.2.3 4CL基因在B.dothidea侵染山核桃过程中的表达 |
| 5.2.4 CHS基因在B.dothidea侵染山核桃过程中的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 6 结果与展望 |
| 6.1 主要研究结论 |
| 6.2 研究创新点 |
| 6.3 存在的不足及研究展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（3）茶树抗炭疽病和抗冻机制及评价研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 茶树炭疽病的研究进展 |
| 1.2.1 危害和发生规律 |
| 1.2.2 炭疽病菌的鉴定和分类 |
| 1.2.3 分子机理研究 |
| 1.2.4 防治措施 |
| 1.3 炭疽病菌致病机理的研究进展 |
| 1.3.1 炭疽菌侵染过程 |
| 1.3.2 炭疽菌相关分子模式 |
| 1.3.3 效应子 |
| 1.4 植物对炭疽病防御机制的研究进展 |
| 1.4.1 细胞壁 |
| 1.4.2 植物超敏反应 |
| 1.4.3 R基因 |
| 1.4.4 PR蛋白 |
| 1.4.5 水杨酸 |
| 1.4.6 植保素 |
| 1.5 茶树抗冷指标的研究进展 |
| 1.5.1 生理生化指标 |
| 1.5.2 分子指标 |
| 1.6 本研究主要内容和目标 |
| 第2章 茶树病害叶片真菌多样性测序和分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料和处理 |
| 2.2.2 试剂与设备 |
| 2.2.3 真菌总DNA提取和检测 |
| 2.2.4 ITS序列片段PCR扩增和检测 |
| 2.2.5 测序文库制备和高通量测序 |
| 2.2.6 测序下游分析 |
| 2.2.7 数据处理和分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 总DNA提取和PCR扩增质量 |
| 2.3.2 测序质量和物种注释结果 |
| 2.3.3 物种组成结果 |
| 2.3.4 真菌多样性结果 |
| 2.3.5 物种差异结果和主要优势菌 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 茶树病原菌的分离、纯化和分子鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料和处理 |
| 3.2.2 试剂和设备 |
| 3.2.3 改良PDA培养基平板配制 |
| 3.2.4 病原菌的分离和纯化 |
| 3.2.5 病原菌致病力测试和菌株保藏 |
| 3.2.6 病原菌菌种分子鉴定 |
| 3.2.7 数据处理和分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 病原菌的分离和纯化 |
| 3.3.2 致病力测试结果 |
| 3.3.3 菌种分子鉴定结果 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 茶树炭疽病转录组分析和水杨酸相关基因克隆表达研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料和处理 |
| 4.2.2 试剂和设备 |
| 4.2.3 RNA提取和质量检测 |
| 4.2.4 cDNA文库建立和高通量测序 |
| 4.2.5 转录本组装,功能注释和下游分析 |
| 4.2.6 实时荧光定量qRT-PCR验证 |
| 4.2.7 水杨酸含量HPLC法测定 |
| 4.2.8 基因克隆和测序 |
| 4.2.9 数据处理和分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 茶树炭疽病感染症状 |
| 4.3.2 RNA提取质量 |
| 4.3.3 转录组测序结果 |
| 4.3.4 实时荧光定量结果 |
| 4.3.5 基因克隆和序列分析 |
| 4.3.6 水杨酸测定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 炭疽菌与茶树互作双重转录组的构建和相关蛋白研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料和处理 |
| 5.2.2 试剂和设备 |
| 5.2.3 接种叶片染色观察 |
| 5.2.4 互作双重转录组的构建和高通量测序 |
| 5.2.5 测序下游分析 |
| 5.2.6 茶树叶片总蛋白质的提取和含量测定 |
| 5.2.7 蛋白质前处理 |
| 5.2.8 目的蛋白PRM定量验证 |
| 5.2.9 数据处理和分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 叶片有伤接种的形态学观察结果 |
| 5.3.2 叶片有伤接种的染色观察结果 |
| 5.3.3 茶树叶片RNA和总蛋白提取质量 |
| 5.3.4 互作双重转录组测序质量评估和比对 |
| 5.3.5 茶树差异表达基因和富集分析 |
| 5.3.6 炭疽菌差异表达基因和富集分析 |
| 5.3.7 PRM蛋白定量验证结果 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 茶树抗冻评价体系的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料和处理 |
| 6.2.2 试剂和设备 |
| 6.2.3 冻害情况的田间调查和统计 |
| 6.2.4 冷冻处理 |
| 6.2.5 Fv/Fm参数测定 |
| 6.2.6 psbA和 psbD基因表达研究 |
| 6.2.7 色差测定 |
| 6.2.8 数据处理和分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 茶树冻害发生情况 |
| 6.3.2 不同茶树品种的抗冻性情况 |
| 6.3.3 不同茶树品种抗冻性对于Fv/Fm参数的影响 |
| 6.3.4 不同茶树品种抗冻性对于PSII相关基因表达情况的影响 |
| 6.3.5 不同茶树品种抗冻性对于叶色变化的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论和创新点 |
| 7.2 展望 |
| 附录 |
| 附表 |
| 附图 |
| 附录1 PRM验证蛋白序列 |
| 参考文献 |
（4）杨生褐盘二孢菌专化寄生特性及效应分子研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 杨树黑斑病的病害特征及主要病原菌 |
| 1.1.1 杨树黑斑病的危害 |
| 1.1.2 杨树黑斑病的侵染循环和传播途径 |
| 1.1.3 杨树黑斑病的主要病原菌及其寄主范围 |
| 1.2 杨生褐盘二孢菌的研究进展 |
| 1.2.1 杨生褐盘二孢菌的形态特征及分类地位 |
| 1.2.2 杨生褐盘二孢菌两个专化型的研究概况 |
| 1.2.3 杨生褐盘二孢菌的分子植物病理研究进展 |
| 1.3 微卫星分子标记技术的特点及应用 |
| 1.4 不同营养类型植物病原真菌的侵染、寄生特点 |
| 1.5 植物病原微生物的效应分子研究进展 |
| 1.5.1 效应分子的基本特征及分泌途径 |
| 1.5.2 不同植物病原微生物效应分子的特点 |
| 1.5.3 植物病原真菌效应分子的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 本研究的主要内容 |
| 1.8 本研究的技术路线 |
| 2 杨生褐盘二孢菌微卫星引物的开发及专化型区分 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 杨生褐盘二孢菌的分离、培养与保存 |
| 2.1.3 微卫星位点的分析 |
| 2.1.4 微卫星引物设计 |
| 2.1.5 杨生褐盘二孢菌DNA样品的提取 |
| 2.1.6 引物的筛选及验证 |
| 2.1.7 遗传统计及遗传结构分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 杨生褐盘二孢菌微卫星位点的分布特征 |
| 2.2.2 杨生褐盘二孢菌微卫星引物的开发 |
| 2.2.3 杨生褐盘二孢菌微卫星引物的验证 |
| 2.2.4 杨生褐盘二孢菌两个专化型的遗传结构分析 |
| 2.2.5 小结与讨论 |
| 3 杨生褐盘二孢菌侵染过程的组织病理观察 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 寄主材料和供试菌株 |
| 3.1.2 接种方法 |
| 3.1.3 光学显微镜 |
| 3.1.4 扫描电子显微镜 |
| 3.1.5 透射电子显微镜 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 两个专化型菌株和寄主杨树的性状观察结果 |
| 3.2.2 光学显微镜和扫描电镜的观察结果 |
| 3.2.3 透射电子显微镜的观察结果 |
| 3.2.4 杨生褐盘二孢菌两个专化型的比较分析结果 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 3.3.1 杨生褐盘二孢菌是半活养型病原真菌 |
| 3.3.2 侵染芽管、侵染泡囊和次生菌丝是互作机制研究的关键结构 |
| 3.3.3 两个专化型具有相似的组织病理侵入过程 |
| 4 杨树响应杨生褐盘二孢菌的转录组分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 寄主和病原菌 |
| 4.1.2 光学显微镜 |
| 4.1.3 接种方法及样品的保存 |
| 4.1.4 RNA的提取方法 |
| 4.1.5 RNA文库的构建和测序方法 |
| 4.1.6 序列比对方法 |
| 4.1.7 显着差异表达基因的分析和基因功能的注释 |
| 4.1.8 荧光定量PCR |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 互作体系的建立和测序样品的选择 |
| 4.2.2 测序数据的验证结果 |
| 4.2.3 RNA测序组装比对结果 |
| 4.2.4 显着性差异表达基因的分析结果 |
| 4.2.5 GO富集分析结果 |
| 4.2.6 生物胁迫信号通路的分析结果 |
| 4.2.7 共表达趋势分析结果 |
| 4.2.8 抗病基因、类受体蛋白激酶、几丁质酶和防卫素的分析结果 |
| 4.2.8.1 抗病基因 |
| 4.2.8.2 类受体蛋白激酶 |
| 4.2.8.3 几丁质酶和防卫素 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 4.3.1 杨树对杨生褐盘二孢菌侵入的响应反应 |
| 4.3.2 两种杨树响应杨生褐盘二孢菌侵入的具体方式存在差异 |
| 4.3.3 两个专化型营养方式的转变机制可能不同 |
| 5 杨生褐盘二孢菌效应分子的筛选和功能研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试菌株 |
| 5.1.2 杨生褐盘二孢菌、大肠杆菌、酵母细胞的培养 |
| 5.1.3 DNA和RNA的提取 |
| 5.1.4 效应分子的预测及结构分析 |
| 5.1.5 RNA的反转录及qRT-PCR |
| 5.1.6 AD/BD载体的构建 |
| 5.1.7 酵母感受态细胞的制备 |
| 5.1.8 酵母文库构建及酵母双杂 |
| 5.1.9 农杆菌介导的烟草瞬时表达 |
| 5.1.10 PEG介导的杨生褐盘二孢菌遗传转化 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 效应分子的预测和筛选结果 |
| 5.2.2 效应分子基因序列结构分析结果 |
| 5.2.3 专性效应分子的转录表达分析 |
| 5.2.4 专性效应分子的致病性分析结果 |
| 5.2.5 酵母文库的筛选和双杂验证结果 |
| 5.2.6 PEG介导遗传转化体系的建立 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 全文结论 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（5）核桃黑斑病抗性评价及抗病机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 核桃黑斑病的研究 |
| 1.1.1 核桃黑斑病的发生危害与防治 |
| 1.1.2 核桃黑斑病抗病育种研究进展 |
| 1.2 抗病育种研究 |
| 1.2.1 抗病评价方法 |
| 1.2.2 抗病生理机制 |
| 1.2.3 抗病分子机制 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 核桃不同品种(无性系)的黑斑病抗病性评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 田间调查 |
| 2.1.3 人工接种 |
| 2.1.4 统计分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 田间调查 |
| 2.2.2 人工接种 |
| 2.2.3 评价结果的比较 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 2.3.1 不同品种(无性系)核桃黑斑病抗性评价 |
| 2.3.2 不同评价方法的比较 |
| 2.3.3 核桃黑斑病抗病性评价方法的确定 |
| 2.3.4 小结 |
| 第三章 核桃品种(无性系)接种黑斑病病原菌后生理生化物质的变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 病原菌的接种 |
| 3.1.3 抗氧化酶的提取及活性测定 |
| 3.1.4 脂质过氧化的测定 |
| 3.1.5 总酚含量的测定 |
| 3.1.6 苯丙氨酸解氨酶活性的测定 |
| 3.1.7 多酚氧化酶活性的测定 |
| 3.1.8 数据分析方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 接种后叶片抗氧化酶活性 |
| 3.2.2 接种后叶片脂质过氧化 |
| 3.2.3 接种后总酚含量以及PPO和 PAL活性 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 抗氧化酶活性变化 |
| 3.3.2 总酚含量以及PPO和 PAL的活性 |
| 3.3.3 脂质过氧化反应 |
| 3.3.4 小结 |
| 第四章 核桃感染黑斑病后抗病相关基因的变化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 总RNA提取及测序 |
| 4.1.3 实时荧光定量验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RNA测序结果 |
| 4.2.2 组装结果统计 |
| 4.2.3 基因功能注释及CDS预测 |
| 4.2.4 基因表达水平分析 |
| 4.2.5 基因差异表达分析 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 4.3.1 病原相关分子模式的识别和防御信号传导 |
| 4.3.2 结构抗病防御反应 |
| 4.3.3 生物化学抗病防御反应 |
| 4.3.4 过敏反应与细胞死亡 |
| 4.3.5 系统获得性抗性(SAR) |
| 4.3.6 酚类物质在黑斑病抗病防御反应中的作用 |
| 4.3.7 抗病相关的基因的应用 |
| 4.3.8 小结 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点及展望 |
| 6.1 创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（6）甘蓝染色体片段替换系的构建和黑腐病抗性QTL定位及候选基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 甘蓝黑腐病研究进展 |
| 1.1.1 甘蓝黑腐病危害性与生理小种鉴定 |
| 1.1.2 甘蓝黑腐病菌致病因子研究 |
| 1.1.3 甘蓝黑腐病抗性鉴定及与防治 |
| 1.2 甘蓝黑腐病抗性研究现状 |
| 1.2.1 经典遗传学对数量性状的相关研究 |
| 1.2.2 QTL定位的相关研究 |
| 1.2.3 甘蓝黑腐病的遗传研究进展及存在问题 |
| 1.3 染色体片段代换系的构建及研究进展 |
| 1.3.1 染色体片段替换系的概念与构建 |
| 1.3.2 染色体片段替换系在QTL定位中的优点 |
| 1.3.3 染色体片段替换系在遗传和育种上的应用 |
| 1.4 植物抗病基因 |
| 1.4.1 植物抗病机理和进展 |
| 1.4.2 植物抗病基因的主要结构与类型 |
| 1.4.3 NBS-LRR基因研究进展 |
| 1.5 本研究目的意义与主要内容 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 研究的主要内容 |
| 1.5.3 技术路线图 |
| 第二章 结球甘蓝高密度遗传连锁图谱的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 亲本与RIL群体基因组DNA的提取与检测 |
| 2.1.3 标记来源 |
| 2.1.4 SSR与 InDel分子标记的检测 |
| 2.1.5 标记双亲筛选与群体检测 |
| 2.1.6 遗传分析与图谱构建 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 分子标记筛选 |
| 2.2.2 甘蓝高密度遗传图谱的构建 |
| 2.2.3 连锁群的染色体定位与标记分布 |
| 2.2.4 分子标记的偏分离分析 |
| 2.3 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 甘蓝染色体片段替换系的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 多态性标记的选择 |
| 3.2.2 甘蓝染色体片段替换系的构建 |
| 3.2.3 不同世代R4-P1 染色体替换片段的比较分析 |
| 3.2.4 R4-P1 染色体片段在R2-P2 基因组中的分布 |
| 3.2.5 R4-P1 CSSLs遗传组成 |
| 3.2.6 R4-P1 单片段染色体替换系SSSLs基因组分析 |
| 3.3 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 甘蓝抗黑腐病QTL定位 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验群体 |
| 4.1.2 黑腐病病菌 |
| 4.1.3 甘蓝黑腐病抗性鉴定 |
| 4.1.4 群体调查及抗病性划分标准 |
| 4.1.5 甘蓝黑腐病抗性QTL定位 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 病原菌分离与生理小种鉴定结果 |
| 4.2.2 甘蓝RILs与 CSSLs群体黑腐病抗性鉴定结果 |
| 4.2.3 主效稳定QTL qBR-7-3 抗性验证 |
| 4.3 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 甘蓝黑腐病病抗性候选基因的表达分析 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 抗黑腐病候选基因分析 |
| 5.2.2 候选基因的初步确定与测序验证 |
| 5.2.3 候选基因表达分析 |
| 5.2.4 候选基因瞬时表达验证 |
| 5.3 讨论 |
| 小结 |
| 第六章 甘蓝NBS-LRR抗病基因全基因组鉴定及进化分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 甘蓝NBS-LRR抗病基因的鉴定 |
| 6.1.2 NBS-LRR抗病基因定位 |
| 6.1.3 基因特征与结构 |
| 6.1.4 系统发育树的构建和保守的基序分析 |
| 6.1.5 基因复制与Ka/Ks比值分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 甘蓝NBS-LRR抗病基因的鉴定及其分类 |
| 6.2.2 甘蓝NBS-LRR基因的定位与分布 |
| 6.2.3 NBS-LRR抗病基因的基因大小 |
| 6.2.4 NBS-LRR抗病基因的顺式作用元件 |
| 6.2.5 NBS-LRR抗病基因的基因结构分析 |
| 6.2.6 NBS-LRR抗病基因理化性质分析 |
| 6.2.7 NBS-LRR抗病基因的系统发育关系分析 |
| 6.2.8 甘蓝 NBS-LRR 蛋白的序列特征与基序分布 |
| 6.2.9 NBS-LRR基因复制与进化分析 |
| 6.3 讨论 |
| 小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 本研究的创新点 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（7）甘薯SPW5基因克隆、表达载体构建及遗传转化探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 甘薯病害及其危害 |
| 1.2 甘薯病毒病研究进展 |
| 1.2.1 甘薯病毒病及危害 |
| 1.2.2 甘薯病毒病的表型 |
| 1.2.3 甘薯病毒病菌和病原菌生活史 |
| 1.2.4 甘薯病毒传播途径 |
| 1.2.5 甘薯病毒病鉴定方法 |
| 1.2.6 甘薯病毒的致病机理 |
| 1.2.7 甘薯病毒病的防治方法 |
| 1.3 植物抗病基因研究进展 |
| 1.4 甘薯抗病基因研究进展 |
| 1.5 WRKY转录因子在植物抗病反应中的研究进展 |
| 1.6 甘薯遗传转化的研究与进展 |
| 1.6.1 受体材料 |
| 1.6.2 转化方法 |
| 1.6.3 筛选方法 |
| 1.7 本试验目的与意义 |
| 1.8 技术路线图 |
| 第2章 甘薯SPW5 基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 试剂盒及生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2.2 总RNA的反转录 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 SPW5 基因克隆 |
| 2.3 甘薯SPW5 基因的生物信息学分析 |
| 2.3.1 序列翻译 |
| 2.3.2 氨基酸的初步分析 |
| 2.3.3 蛋白质高级结构的分析 |
| 2.3.4 同源性搜索和进化树分析 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 SPW5 基因的克隆 |
| 2.4.2 甘薯SPW5 基因的生物信息学分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 表达载体构建及遗传转化的探索 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试剂耗材 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 表达载体构建 |
| 3.2.2 甘薯再生体系的建立 |
| 3.2.3 甘薯转基因体系的建立 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 SPW5-p101 载体构建 |
| 3.3.2 再生体系的建立 |
| 3.3.3 甘薯遗传转化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 甘薯再生体系的建立 |
| 3.4.2 甘薯转基因体系的建立 |
| 第4章 结论和展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的应答机制及NBS类抗病基因筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 黑籽南瓜利用与研究进展 |
| 1.1.1 黑籽南瓜栽培与资源利用概况 |
| 1.1.2 黑籽南瓜遗传多样性 |
| 1.1.3 黑籽南瓜抗逆性及其生理基础 |
| 1.1.4 细胞生物学及细胞工程 |
| 1.1.5 基因克隆 |
| 1.1.6 总结与展望 |
| 1.2 瓜类枯萎病研究进展 |
| 1.2.1 枯萎病致病机制 |
| 1.2.2 尖孢镰刀菌基因组测序及致病相关基因 |
| 1.2.3 寄主枯萎病抗性遗传及其相关基因 |
| 1.2.4 瓜类—枯萎病菌互作分子机制 |
| 1.2.5 总结与展望 |
| 1.3 转录组学在作物应答病原菌胁迫中的研究概况 |
| 1.4 蛋白组学在作物应答病原菌胁迫中的研究概况 |
| 1.5 转录组学与蛋白组学的联合研究 |
| 1.6 植物NBS类抗病基因(蛋白)研究进展 |
| 1.6.1 抗病基因(蛋白)的类型 |
| 1.6.2 NBS-LRR抗病基因(蛋白)的结构和功能 |
| 1.6.3 NBS-LRR抗病基因(蛋白)对效应分子的识别 |
| 1.6.4 总结与展望 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要试剂和试剂盒 |
| 3.2.3 主要溶液和培养基 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 序列分析及同源性比较 |
| 3.2.6 黑籽南瓜室内抗性鉴定 |
| 3.2.7 NBS类抗病基因序列表达分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 黑籽南瓜RGAs的克隆 |
| 3.3.2 RGAs聚类分析及相似性比较 |
| 3.3.3 HQRGA2的核苷酸序列相似性分析 |
| 3.3.4 HQRGA2的保守结构域分析和氨基酸同源性比较 |
| 3.3.5 系统进化树分析 |
| 3.3.6 3种黑籽南瓜枯萎病抗性鉴定 |
| 3.3.7 枯萎病菌胁迫下3种黑籽南瓜NBS同源序列的表达差异 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的转录组学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料及接种方法 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 测序数据的处理 |
| 4.2.4 Unigene功能注释 |
| 4.2.5 差异表达基因筛选 |
| 4.2.6 差异表达基因的功能富集分析 |
| 4.2.7 Q-PCR验证关键差异表达基因 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 测序数据统计 |
| 4.3.2 unigene的功能注释 |
| 4.3.3 蛋白编码区预测(CDS) |
| 4.3.4 差异表达基因分析 |
| 4.3.5 差异表达基因的GO富集分析 |
| 4.3.6 差异表达基因的KEGG代谢通路分析 |
| 4.3.7 抗性相关代谢途径及基因分析 |
| 4.3.8 差异表达的转录因子TF家族分析 |
| 4.3.9 差异基因R基因家族分析 |
| 4.3.10 差异表达基因的Q-PCR验证及转录组与Q-PCR的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 枯萎病菌胁迫下黑籽南瓜的转录组测序 |
| 4.4.2 关于的生物信息学注释问题 |
| 4.4.3 硫胺素与抗病性的关系 |
| 4.4.4 过氧化物酶体与抗病的关系 |
| 4.4.5 ABA和SA介导黑籽南瓜主要的抗枯萎病信号传导途径 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的蛋白组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验仪器与试剂 |
| 5.2.3 实验方法与步骤 |
| 5.2.4 蛋白组分析方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 蛋白质检测 |
| 5.3.2 蛋白质基本鉴定信息 |
| 5.3.3 差异表达蛋白分析 |
| 5.3.4 差异表达蛋白的GO富集分析 |
| 5.3.5 差异表达蛋白的Pathway富集分析 |
| 5.3.6 蛋白相互作用(PPI分析) |
| 5.3.7 差异表达蛋白表达模式聚类 |
| 5.3.8 差异蛋白和差异表达基因的关联分析 |
| 5.3.9 黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的应答机制分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 黑籽南瓜NBS类基因的鉴别与关键基因分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 黑籽南瓜三代转录组测序 |
| 6.2.3 全长转录组的数据分析 |
| 6.2.4 NBS类抗性基因的鉴别 |
| 6.2.5 进化分析 |
| 6.2.6 CfNBS类差异表达关键基因的鉴定 |
| 6.2.7 差异表达CfNBS类基因的GO功能分析 |
| 6.2.8 CfNBS类关键基因的Q-PCR验证与组织表达特性分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 CfNBS类基因的鉴定 |
| 6.3.2 CfNBS类基因的分类 |
| 6.3.3 黑籽南瓜CfNBS类基因的进化树分析 |
| 6.3.4 黑籽南瓜CfNBS类差异表达基因的鉴定 |
| 6.3.5 CfNBS类基因的GO功能分析 |
| 6.3.6 黑籽南瓜差异表达的CfNBS类关键基因的Q-PCR验证 |
| 6.3.7 CfNBS类关键基因的组织表达特性 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 NBS类抗病基因CfRFN2的克隆与功能验证 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料和方法 |
| 7.2.1 材料 |
| 7.2.2 菌株及载体 |
| 7.2.3 仪器及试剂 |
| 7.2.4 黑籽南瓜总RNA提取及反转录PCR |
| 7.2.5 CfRFN2全长基因序列的克隆 |
| 7.2.6 CfRFN2全长基因序列分析 |
| 7.2.7 接种枯萎病菌后CfRFN2表达量检测、组织表达特性分析 |
| 7.2.8 CfRFN2基因的VIGS体系功能初步验证 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 黑籽南瓜总RNA的提取 |
| 7.3.2 黑籽南瓜CfRFN2基因的扩增及拼接 |
| 7.3.3 CfRFN2的核苷酸相似性分析 |
| 7.3.4 CfRFN2的保守结构域分析 |
| 7.3.5 CfRFN2的亲疏水性分析 |
| 7.3.6 CfRFN2的信号肽分析 |
| 7.3.7 CfRFN2的蛋白跨膜域预测 |
| 7.3.8 CfRFN2蛋白进化树分析 |
| 7.3.9 黑籽南瓜CfRFN2的组织表达特性分析 |
| 7.3.10 黑籽南瓜CfRFN2的VIGS载体构建 |
| 7.3.11 VIGS侵染黑籽南瓜的体系有效性验证 |
| 7.3.12 VIGS侵染黑籽南瓜植株的PCR检测 |
| 7.3.13 pTRV2-CfRFN2沉默植株观察和Q-PCR分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加课题一览表 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（9）抗稻瘟病和稻曲病种质资源筛选与雅恢2115抗瘟基因鉴定及改造利用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物免疫系统研究概况 |
| 1.1.1 植物免疫系统 |
| 1.1.2 水稻PTI免疫反应 |
| 1.1.3 水稻ETI免疫反应 |
| 1.2 水稻稻瘟病研究进展 |
| 1.2.1 稻瘟病的发生及危害 |
| 1.2.2 稻瘟病菌的侵染过程 |
| 1.2.3 稻瘟病菌无毒基因研究进展 |
| 1.2.4 水稻抗稻瘟病基因研究进展 |
| 1.2.5 水稻抗瘟基因的特点 |
| 1.2.6 水稻抗稻瘟病遗传机制 |
| 1.3 水稻稻曲病研究进展 |
| 1.3.1 稻曲病的发现及分类地位 |
| 1.3.2 稻曲病症状及危害 |
| 1.3.3 稻曲病侵染循环 |
| 1.3.4 水稻抗稻曲病的遗传机制 |
| 1.3.5 水稻稻曲病抗性QTL研究进展 |
| 1.4 水稻抗病育种策略及新技术应用进展 |
| 1.4.1 抗病种质资源筛选的重要性 |
| 1.4.2 水稻抗病育种策略 |
| 1.4.3 水稻抗病育种技术及应用情况 |
| 1.5 本文研究内容与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 抗稻瘟病和稻曲病种质资源筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 稻瘟病抗性鉴定 |
| 2.2.2 抗稻瘟病基因检测 |
| 2.2.3 稻曲病抗性鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 有效抗稻瘟病基因筛选 |
| 2.3.2 223份种质资源稻瘟病抗性鉴定 |
| 2.3.3 37份稻瘟病抗源的抗瘟基因检测 |
| 2.3.4 种质资源稻曲病抗性鉴定 |
| 2.3.5 抗稻瘟病及稻曲病种质资源材料筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 有效抗稻瘟病基因筛选 |
| 2.4.2 抗稻瘟病种质资源筛选 |
| 2.4.3 稻瘟病抗性基因在抗源中的分布 |
| 2.4.4 抗稻曲病种质资源筛选 |
| 2.4.5 多抗种质资源筛选 |
| 第三章 雅恢2115抗瘟基因鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料和稻瘟菌菌株 |
| 3.1.2 构建载体所用质粒、大肠杆菌 |
| 3.1.3 引物序列 |
| 3.1.4 试剂和仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 试验水稻培养 |
| 3.2.2 稻瘟菌培养与接种 |
| 3.2.3 水稻叶片DNA提取(CTAB法) |
| 3.2.4 水稻叶片RNA的提取 |
| 3.2.5 cDNA反转及qRT-PCR检测 |
| 3.2.6 PCR扩增及片段回收 |
| 3.2.7 构建过表达载体 |
| 3.2.8 转基因植株的获得及阳性检测 |
| 3.2.9 植株中基因表达分析 |
| 3.2.10 转基因植株的抗病性鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 雅恢2115中5个NBS-LRR类基因表达量分析 |
| 3.3.2 LOC_Os11g44960 基因序列分析 |
| 3.3.3 过表达载体的构建 |
| 3.3.4 水稻遗传转化及转基因植株阳性鉴定 |
| 3.3.5 LOC_Os11g44960 基因过表达T0 代植株表达分析 |
| 3.3.6 LOC_Os11g44960 过表达转基因株系稻瘟病抗性鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 LOC_Os11g44960 基因功能分析 |
| 3.4.2 多个抗稻瘟病基因聚合的利用 |
| 第四章 雅恢2115的改造及利用 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 稻瘟病抗性鉴定 |
| 4.2.2 稻曲病抗性鉴定 |
| 4.2.3 抗稻瘟病基因检测 |
| 4.2.4 农艺性状调查 |
| 4.2.5 稻米品质鉴定 |
| 4.2.6 新恢复系测交组合产量优势评价 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 以雅恢2115为核心种质创制的新恢复系 |
| 4.3.2 新恢复系主要农艺性状 |
| 4.3.3 10个新恢复系稻瘟病抗性评价 |
| 4.3.4 新恢复系抗稻瘟病基因分子检测 |
| 4.3.5 新恢复系稻曲病抗性水平 |
| 4.3.6 新恢复系的稻米品质特征 |
| 4.3.7 新恢复系测交组合产量优势评价 |
| 4.3.8 新恢复系组合参试情况 |
| 4.3.9 水稻新品种雅优2116特征特性 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 小结与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（10）蜡质芽胞杆菌AR156和植物蛋白酶AtMC1参与调控植物抗病的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 植物免疫及芽胞杆菌生防机理研究进展 |
| 1 植物天然免疫 |
| 1.1 病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI) |
| 1.2 效应因子触发的免疫反应(ETI) |
| 1.2.1 病原菌效应因子 |
| 1.2.2 植物抗病蛋白 |
| 2 植物激素在先天免疫中的重要作用 |
| 2.1 信号途径串扰 |
| 2.2 水杨酸和茉莉酸信号途径串扰 |
| 3 系统获得性抗性(SAR) |
| 3.1 水杨酸(SA)与系统获得性抗性(SAR) |
| 3.2 系统获得性抗性(SAR)信号转导 |
| 3.2.1 病程相关基因非表达子1(NPR1) |
| 3.2.2 WRKY转录因子 |
| 4 诱导性系统抗性(ISR) |
| 4.1 茉莉酸(JA)/乙烯(ET)与诱导性系统抗性(ISR) |
| 4.2 诱导性系统抗性(ISR)的信号转导 |
| 5 芽胞杆菌生物防治机理 |
| 5.1 拮抗作用 |
| 5.2 竞争作用---营养和空间位点竞争 |
| 5.3 诱导植物抗病性 |
| 5.4 促进植物生长 |
| 6 芽胞杆菌功能拓展 |
| 7 芽胞杆菌的应用 |
| 第二章 参与植物细胞程序性死亡的Metacaspase研究进展 |
| 1 Metacaspase的起源与结构 |
| 2 植物metacaspase的生化特性 |
| 3 Metacaspase在植物细胞程序性死亡(PCD)过程中的作用 |
| 4 结论 |
| 第三章 可变性剪接(AS)在植物免疫中的功能研究 |
| 1 可变性剪接(AS)的剪接机制 |
| 2 可变性剪接(AS)的基本形式 |
| 3 可变性剪接(AS)的调控 |
| 3.1 顺式作用元件 |
| 3.2 反式作用因子 |
| 4 抗性(R)基因的可变性剪接(AS) |
| 4.1 TIR-NBS-LRR基因的可变性剪接(AS) |
| 4.2 CC-NBS-LRR基因的可变性剪接(AS) |
| 5 展望 |
| 第四章 参与植物内源免疫的Small RNAs研究进展 |
| 1 参与Small RNAs的基本成分 |
| 2 sRNAs途径成分在植物免疫中的作用 |
| 2.1 DCL和dsRNA结合蛋白 |
| 2.2 RDR蛋白 |
| 2.3 AGO蛋白 |
| 2.4 RNA聚合酶和RdDM途径 |
| 3 miRNAs的生物合成 |
| 4 miRNAs的转录后调控 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 蜡质芽孢杆菌AR156诱导拟南芥产生PTI反应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料,菌株及生长条件 |
| 1.2 培养基及试剂配制 |
| 1.3 AR156悬液的制备 |
| 1.4 Pst菌液的制备 |
| 1.5 叶片预处理 |
| 1.6 致病性测定 |
| 1.7 活性氧爆发的测定 |
| 1.8 胼胝质积累的测定 |
| 1.9 GUS染色 |
| 1.10 Western blotting分析 |
| 1.11 MAPK活性的测定 |
| 1.12 荧光定量PCR |
| 1.12.1 RNA提取 |
| 1.12.2 反转录成cDNA |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 AR156处理叶片中的胼胝质、活性氧和PR1蛋白 |
| 2.2 AR156处理叶片中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性 |
| 2.3 AR156处理叶片中PTI应答基因的表达 |
| 2.4 AR156处理对拟南芥抗性的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 第二章 蜡质芽孢杆菌AR156诱导拟南芥产生和flg22类似的对Pst的免疫反应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料,菌株及生长条件 |
| 1.2 AR156悬液的制备 |
| 1.3 Pst菌液的制备 |
| 1.4 叶片预处理 |
| 1.5 致病性测定 |
| 1.6 转录组测序 |
| 1.7 荧光定量PCR |
| 1.8 Northern blot检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 AR156诱导抗病信号通路 |
| 2.2 AGO1、DCL和FLS2在AR156诱导抗性中的功能 |
| 2.3 与AGO1相结合的miRNAs在AR156处理和flg22处理中的表达检测 |
| 2.4 AR156处理和flg22处理诱导的转录组变化 |
| 3 讨论与分析 |
| 第三章 植物蛋白酶AtMC1与类SM蛋白LSM4互作反向调控植物抗病反应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料,菌株及生长条件 |
| 1.2 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备与转化 |
| 1.3 农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化 |
| 1.3.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 |
| 1.3.2 农杆菌GV3101感受态细胞的转化 |
| 1.4 载体构建 |
| 1.5 拟南芥蘸花转化构建过表达株系 |
| 1.6 烟草瞬时表达 |
| 1.7 Co-IP(免疫共沉淀) |
| 1.8 Western blotting分析 |
| 1.9 Split-luciferase生物素发光 |
| 1.10 致病性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 AtMC1负向调控植物免疫 |
| 2.2 AtMC1与LSM4互作 |
| 2.3 LSM4负向调节植物免疫 |
| 3 讨论 |
| 第四章 植物蛋白酶AtMC1在拟南芥抗病免疫反应中的机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料,菌株及生长条件 |
| 1.2 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备与转化 |
| 1.2.1 大肠杆菌JM109超级感受态细胞的制备 |
| 1.2.2 大肠杆菌JM109感受态细胞的转化 |
| 1.3 农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化 |
| 1.3.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 |
| 1.3.2 农杆菌GV3101感受态细胞的转化 |
| 1.4 烟草瞬时表达 |
| 1.5 Western blotting分析 |
| 1.6 RIP (RNA免疫共沉淀) |
| 1.7 荧光定量PCR检测 |
| 1.8 Northern blot检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 AtMC1参与调控信使RNA前体的可变性剪接 |
| 2.2 AtMC1影响拟南芥中miRNAs的积累 |
| 2.3 AtMC1不影响miRNAs生物合成途径加工因子的蛋白表达水平 |
| 2.4 AtMC1与pri-miRNAs相结合 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结及创新点 |
| 1 全文总结 |
| 2 创新点及不足之处 |
| 附录 实验常用试剂 |
| 攻读博士学位期间发表的研究论文 |
| 致谢 |
四、植物抗病基因类似序列研究进展及展望（论文参考文献）
- [1]红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化[D]. 蒲小剑. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]Botryosphaeria dothidea侵染后山核桃酚类物质合成相关酶活及关键基因的表达特性[D]. 费莉玢. 浙江农林大学, 2020(02)
- [3]茶树抗炭疽病和抗冻机制及评价研究[D]. 施云龙. 浙江大学, 2020(01)
- [4]杨生褐盘二孢菌专化寄生特性及效应分子研究[D]. 张琰锋. 北京林业大学, 2019(04)
- [5]核桃黑斑病抗性评价及抗病机理研究[D]. 蒋时姣. 四川农业大学, 2019(07)
- [6]甘蓝染色体片段替换系的构建和黑腐病抗性QTL定位及候选基因分析[D]. 刘泽慈. 甘肃农业大学, 2019(02)
- [7]甘薯SPW5基因克隆、表达载体构建及遗传转化探索[D]. 肖梅. 西南大学, 2019(01)
- [8]黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的应答机制及NBS类抗病基因筛选[D]. 丁玉梅. 西南大学, 2019(01)
- [9]抗稻瘟病和稻曲病种质资源筛选与雅恢2115抗瘟基因鉴定及改造利用[D]. 李德强. 四川农业大学, 2018(03)
- [10]蜡质芽胞杆菌AR156和植物蛋白酶AtMC1参与调控植物抗病的机理研究[D]. 汪顺娥. 南京农业大学, 2018(05)