一、在胆管癌组织中检测p53,p21~(WAF1)的表达（论文文献综述）
匡彦蓓[1]（2021）在《p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究》文中进行了进一步梳理放射治疗是治疗癌症的一种常用手段,超过50%的癌症患者需要采用放疗技术进行治疗。放疗不仅可以单独作为一种治疗策略来缩小肿瘤体积,也经常与手术切除以及化学药物治疗联合应用,来达到最佳的治疗效果。因此,放疗是一种非常重要的癌症治疗手段。随着对放疗研究的深入,越来越多的证据表明,放疗失败的主要原因之一是肿瘤乏氧微环境。肿瘤乏氧微环境会造成肿瘤细胞的葡萄糖代谢途径重编程,即原本占代谢主导地位的线粒体氧化磷酸化过程被抑制,而糖酵解途径被增强。代谢途径的改变可以满足肿瘤细胞快速增殖所需的大量能量和代谢物质,并且通过多种途径增加肿瘤的辐射抗性。因此,本研究的目的在于筛选与肿瘤乏氧及辐射敏感性相关的分子标志物,并探究该分子标志物增强乏氧肿瘤辐射抗性的分子机制,为乏氧肿瘤的放射治疗提供新的理论依据。胶质瘤是常见的颅内肿瘤,其中胶质母细胞瘤是最致命的肿瘤之一。高级别胶质瘤患者预后差的主要原因是肿瘤的抗药性和辐射抗性强,治疗后极易复发,随后造成患者死亡。胶质瘤是常见的以乏氧为特征的实体肿瘤,其乏氧程度和肿瘤恶性程度密切相关,肿瘤内部氧分压越低的胶质瘤恶性程度越严重。因此,胶质瘤复发的主要原因之一是乏氧肿瘤微环境增强了胶质瘤的辐射抗性,在放疗后仍有一些肿瘤细胞未被清除,造成复发。因此,本研究以胶质瘤细胞作为实验材料来研究乏氧增强肿瘤细胞辐射抗性的机制。我们首先利用生物信息学分析胶质瘤患者肿瘤组织中的基因表达情况,筛选出一部分与胶质瘤发生发展具有密切关系的蛋白分子。随后在胶质瘤细胞中验证了待选分子中p21蛋白在乏氧处理后表达量显着升高,即p21可以参与胶质瘤细胞对乏氧处理的应答。然后通过克隆存活实验,发现p21能够增强胶质瘤细胞在乏氧条件下的辐射抗性。实验过程中还发现调控p21可以改变乏氧条件下细胞培养基的酸化程度,因此推测p21很有可能参与乏氧条件下糖酵解途径的调控。通过检测胶质瘤细胞培养基中一定时间内乳酸的产量以及细胞对葡萄糖的摄入量,我们证实p21的确参与了糖酵解途径的调控。通过Real-time PCR技术和免疫印迹杂交技术,我们发现p21能够在乏氧条件下上调Glut1和LDHA来促进胶质瘤细胞在乏氧条件下的糖酵解。后续的实验也证明p21调控的糖酵解途径的确能够增强胶质瘤细胞在乏氧条件下的辐射抗性。因此,p21在乏氧条件下通过促进胶质瘤细胞的糖酵解途径增强肿瘤的辐射抗性。在分子机制方面,我们通过双荧光素酶报告基因系统验证了p21在乏氧条件下的表达升高是由于乏氧诱导因子HIF-1α直接结合在其启动子上并激活其转录。有趣的是,我们还发现被HIF-1α转录激活的p21能够反过来促进HIF-1α的转录,并且是乏氧条件下HIF-1α转录所必需的。因此,HIF-1α与p21之间存在着相互作用的正反馈调节回路。众所周知,HIF-1α是调控糖酵解途径的重要分子,HIF-1α能够与Glut1和LDHA的启动子结合并激活其转录。所以,HIF-1α与p21之间的正反馈调节回路能够增强乏氧条件下胶质瘤细胞内的糖酵解途径。为了验证上述在细胞和分子水平得到的结论,我们构建了能够稳定过表达p21的胶质瘤细胞用于动物实验。动物实验的结果表明,过表达p21可以增强胶质瘤的辐射抗性。通过对瘤体进行免疫组化染色,发现p21过表达的肿瘤中,HIF-1α、Glut1和LDHA的表达量均高于对照组。动物实验的结果与细胞水平的结果一致,因此我们得出结论:在胶质瘤中,p21与HIF-1α之间相互作用的正反馈调节回路通过促进糖酵解途径增强了乏氧导致的辐射抗性。
李丕宏[2]（2021）在《组蛋白去乙酰化酶抑制剂Romidepsin在胆管癌中的作用及机制研究》文中研究说明研究背景在肝胆系统中,胆管癌属于一种恶化程度很高的恶性肿瘤疾病,目前的治疗中,主要是以根治性手术切除为主。但该疾病在发病初期具有隐匿性,致使部分患者在确诊时已处于疾病的中晚期,从而错失最佳的手术治疗时机,导致其预后状况很差。对于晚期或不可切除的胆管癌患者,化疗是其主要的治疗手段,如吉西他滨联合顺铂一线化疗方案能使一部分患者获益,但也仅仅让这部分患者的中位生存时间增加3个月左右。目前临床上没有针对胆管癌的特效药物,随着胆管癌相关研究的不断深入,寻找新的治疗药物和诊治靶点是提高治疗胆管癌治疗效果的关键。组蛋白和DNA的修饰改变对肿瘤的表观遗传产生影响,最终引起细胞癌变。组蛋白可发生共价修饰,其中去乙酰化、乙酰化具有对应作用,乙酰化程度与染色质核心组蛋白发挥生物学效应具有相关性。组蛋白去乙酰化酶、组蛋白乙酰转移酶是保持去乙酰化与乙酰化作用的关键蛋白酶,当致病因子引起组蛋白去乙酰化酶催化作用增强,组蛋白去乙酰化明显,引起DNA转录过程发生阻断,进而会对有关分子信号通路产生影响,肿瘤发生率升高。组蛋白去乙酰酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor,HDACi）能够抑制去乙酰化酶活性,破坏组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶之间的动态平衡,导致组蛋白发生乙酰化,进而激活抑癌基因的表达,抑制肿瘤的形成。HDACis是一类具有抗肿瘤作用的靶向治疗药物,当前临床对该类药物的关注度日益升高。越来越多的学者围绕HDACis开展研究,希望在接下来临床中得到更广泛的应用。Romidepsin是一类新型的HDACi,已于2009年11月正式被美国FDA批准上市,起初主要用于治疗血液系统肿瘤。近年来,随着研究的深入,相继有报道Romidepsin对实体瘤也有生物学效应。在消化道肿瘤中,目前有报道Romidepsin对胃癌、肝癌等有抗肿瘤作用,但截止本课题开展前没有关于Romidepsin在胆管癌中的相关研究报道。在我国胆管癌治疗效果不佳、病死率仍然居高不下的背景下,为了改善胆管癌患者预后,延长胆管癌患者总体生存期,有必要探索新型的胆管癌靶向药物。本课题旨在研究Romidepsin抗胆管癌的作用及相关机制,该科学问题的解决有可能为临床胆管癌治疗提供新的策略,为胆管癌的综合治疗提供新的方向和选择。目的1.研究Romidepsin对胆管癌细胞系增殖抑制和凋亡诱导作用。2.研究Romidepsin对胆管癌细胞系增殖抑制和凋亡诱导的潜在分子机制。3.研究Romidepsin对胆管癌细胞体内成瘤的抑制作用。方法1.通过CCK-8实验检测不同浓度Romidepsin对胆管癌细胞系CCLP-1、HCCC-9810细胞活力的影响。2.利用流式细胞术检测不同浓度Romidepsin作用下胆管癌细胞系CCLP-1、HCCC-9810细胞周期变化。3.利用蛋白免疫印迹技术检测不同浓度Romidepsin对胆管癌细胞系CCLP-1、HCCC-9810关键细胞周期蛋白Cyclin B1、p-cdc2的表达。4.利用流式细胞术检测不同浓度Romidepsin作用下胆管癌细胞系CCLP-1、HCCC-9810细胞凋亡水平。5.利用蛋白免疫印迹技术检测不同浓度Romidepsin对胆管癌细胞系CCLP-1、HCCC-9810 关键凋亡相关蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP 的表达。6.构建胆管癌裸鼠移植瘤模型给予Romidepsin治疗,评估Romidepsin在体内抗胆管癌的作用。通过IHC检测裸鼠瘤体组织中Ki67蛋白的表达水平,评估Romidepsin在体内抑制胆管癌细胞增殖效应。结果1.CCK-8实验检测细胞活力。在CCLP-1与HCCC-9810的胆管癌细胞系中,伴随着Romidepsin作用浓度的逐步升高,胆管癌细胞活力随之降低。同样,伴随着其作用时间的逐步延长,细胞活力也随之降低。2.流式细胞术检测细胞周期变化。相对对照组,在胆管癌细胞CCLP-1中,Romidepsin处理组（5 nM,10 nM）位于G2/M期的细胞显着增多,而位于S期的细胞减少（p<0.01）。而在胆管癌细胞HCCC-9810中,Romidepsin处理组（2.5 nM,5 nM,10 nM）位于G2/M期的细胞显着增多,而位于S期的细胞也同样减少（p<0.05）。3.蛋白免疫印迹技术检测细胞周期蛋白。Romidepsin（5 nM,10 nM）处理48h后,在CCLP-1与HCCC-9810中,促进G2/M期进展的周期相关蛋白Cyclin B1表达水平明显下降;Romidepsin（2.5 nM,5 nM,10 nM）处理48h后,抑制G2/M期进展的周期相关蛋白p-cdc2的表达水平明显升高（p<0.05）。4.流式细胞术检测细胞凋亡。在胆管癌细胞系CCLP-1和HCCC-9810中,Romidepsin（2.5 nM,5 nM,10 nM）处理后,凋亡细胞的百分比均明显增多（p<0.05）。5.蛋白免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白。分别用2.5 nM、5 nM、10 nMRomidepsin对胆管癌细胞系CCLP-1和HCCC-9810进行干预。48 h后,PARP表达无明显变化（p>0.05）,促进凋亡的关键蛋白Cleaved-caspase-3及其底物Cleaved-PARP的表达水平明显升高（p<0.05）。6.裸鼠移植瘤模型实验。与对照组相比,Romidepsin（0.5 mg/kg）组移植瘤的体积明显减小（p<0.05）,移植瘤的重量也明显变轻（p<0.05）。各实验组的裸鼠体重呈稳定升高,但其体重比较并无明显差异（p>0.05）。与对照组相比,Romidepsin（0.5 mg/kg）组移植瘤Ki67蛋白的表达水平明显下降（p<0.05）。结论1.Romidepsin在体外能够有效抑制胆管癌细胞系CCLP-1、HCCC-9810的增殖,其效应呈时间和浓度依赖性。2.Romidepsin通过抑制关键细胞周期蛋白CyclinB1、促进p-cdc2的表达引起胆管癌细胞系CCLP-1、HCCC-9810发生G2/M期阻滞,其效应呈浓度依赖性。3.Romidepsin促进关键凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3及其底物Cleaved-PARP的表达诱导胆管癌细胞系CCLP-1、HCCC-9810发生细胞凋亡,其效应呈浓度依赖性。4.Romidepsin在体内能够有效抑制裸鼠移植瘤的生长,抑制胆管癌细胞增殖,具有抗胆管癌作用。
钱建新[3]（2020）在《核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究》文中提出根据解剖位置胆管癌分为三类:肝内（intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA）、肝门部（perihilar cholangiocarcinoma,pCCA）以及远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma,dCCA）,其中肝门部胆管癌是最常见类型,占比超过60%。虽然位置不同,各类胆管癌发生的相关风险因素比较类似:原发性硬化性胆管炎（PSC）、胆道内的结石和寄生虫所导致的肝脏疾病。淋巴结浸润和边缘肿瘤细胞是否残留是决定术后预后的最重要因素。根治性手术切除的肝门部胆管癌5年生存率在10%到40%之间,然而,即使是R0切除,其复发率高达50～70%,高侵袭性和高复发性是pCCA两大病理特性。对于肝门部胆管癌发生发展分子机制的探寻以及胆管癌预后预测、治疗靶点筛选等一直是其临床研究重点。核糖体是细胞活动中极为重要的细胞器,负责将“RNA翻译成蛋白质”这一生物合成过程。此外,核糖体蛋白（ribosomal proteins,RPs）可调控细胞周期和细胞生长,促进肿瘤发生和发展。RPL34隶属于核糖体蛋白RPL34E家族成员。RPL34既往主要集中于非人类标本如昆虫和植物中进行研究。近年来,大量数据表明RPL34在不同类型恶性肿瘤如非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌等中表达异常,其主要功能是通过调控细胞周期,促进细胞增殖。这些发现提示RPL34可能参与胆管癌发生发展。然而RPL34及功能在肝门部胆管癌中的研究少见报道。本实验拟研究RPL34在肝门部胆管癌中的表达,并分析其与临床病理参数和复发预后之间的相关性。进一步通过细胞学和动物实验探寻其在肝门部胆管癌中功能作用,最后利用高通量筛选寻找RPL34调控或者相关的靶基因。通过本课题的一系列研究,探索RPL34及其靶基因是否能够成为一种预测pCCA复发及预后的有效标志物,以及其能否成为pCCA潜在的临床治疗研究靶点。第一部分肝门部胆管癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义目的:检测核糖体蛋白在人pCCA中的表达谱系,并统计分析其与临床病理参数以及复发和预后的相关性,初步探寻核糖体蛋白在人pCCA发生发展中的潜在意义。方法:收集肝门部胆管癌以及部分癌旁非肿瘤性样本,首先从形态学观察肝门部胆管癌的病理特征;其次收集新鲜肝门部胆管癌样本,RT-PCR检测RPs家族成员在肿瘤样本中的表达谱系情况;然后采用组织芯片（tissue microarray,TMA）技术结合免疫组化（immunohistochemistry,IHC）技术,从蛋白水平针对RPL34蛋白检测其在pCCA细胞和癌旁非肿瘤组织中的表达;进而总结分析统计染色结果,并与临床病理信息、复发以及总生存时间相关联,探寻RPL34在人肝门部胆管癌中的表达和临床价值。结果:（1）肝门部胆管癌的临床病理学分析:肿瘤细胞呈不规则腺管样排列,可见筛状结构,浸润性生长。肿瘤细胞核异型明显,可见核仁,核分裂像或病理性核分裂像多见。间质可见明显的促结缔组织反应。根据肿瘤间质比（tumor-stroma ratio,TSR）=50%的最佳截断值,将患者分为“stroma-rich,间质丰富”和“stroma-poor,间质贫乏”,本研究中85例（70.2%）患者为间质贫乏,36例（29.8%）患者为间质丰富。TSR低（间质丰富）的肝门部胆管癌患者更加易于发生淋巴结转移和疾病进展迅速。TSR高（间质贫乏）的患者中位无复发生存期为1.5年,TSR低的患者中位无复发生存期为0.5年,P=0.073。TSR高的患者中位生存期为1.7年,TSR低的患者中位生存期为1.0年,P=0.028。神经侵犯（perineural invasion,PNI）是肝门部胆管细胞癌的另一个显着的病理特征。本研究中94例（77.7%）组织样本中存在神经侵犯,27例（22.3%）患者组织样本中未见明显的神经侵犯,PNI更常见于伴有淋巴结转移和晚期肝门部胆管癌患者。（2）RPs家族成员在肝门部胆管癌中表达均出现不同程度的上调,提示该家族主要成员在肝门部胆管癌发生中可能起重要的作用。其中RPSA（P=0.0266）、RPS2（P=0.0309）、RPL34（P=0.0034）、RPL37（P=0.0584）、RPP0（P=0.0345）在肿瘤组织中的表达要明显高于癌旁非肿瘤组织中的表达,RPL34最为显着。（3）在pCCA癌旁非肿瘤上皮细胞中RPL34不表达或呈微弱表达,pCCA肿瘤组织中RPL34染色定位于细胞浆和细胞核,呈棕黄色或深褐色。RPL34在pCCA肿瘤组织中表达率为77.7%（94/121）。（4）pCCA肿瘤细胞中RPL34表达与肿瘤细胞分化不良和淋巴结转移高度相关。主要表现为:肿瘤细胞的分化程度越低,RPL34表达越高;低分化组的阳性率（82%）要显着高于中、高分化组（30%）（P=0.001）。RPL34表达与淋巴结的转移率呈正相关（淋巴结转移阳性组vs淋巴结转移阴性组为84.6%vs 69.6%,P=0.049）。RPL34阳性与患者年龄、性别、肿瘤体积以及临床分期均没有统计学关联（P>0.05）。（5）单因素分析显示,边缘阳性（P=0.024）、区域淋巴结（P=0.015）、晚期（P=0.023）与pCCA肿瘤复发相关。与RPL34阴性表达的患者相比,RPL34阳性的患者中位无复发生存期更短（1.46年vs 3.73年,P<0.001）。在Cox模型中,RPL34表达是肿瘤复发的独立预测因素。单因素生存分析表明肝门部胆管癌患者的不良预后与手术切缘阳性（P=0.013）、T分期（P=0.019）、淋巴结转移（P=0.001）、TSR（P=0.028）、TNM分期（P=0.003）以及组织分化程度（P=0.025）呈正相关。与RPL34阴性表达的患者相比,RPL34阳性的患者中位生存期更短（1.70年vs 3.63年,P<0.001）。在多因素模型中,RPL34表达和TSR是肝门部胆管癌的独立预后预测因子。结论:肝门部胆管癌具有显着异常的TSR和PNI,两者均与pCCA的淋巴结转移和疾病进展迅速相关。RPs在pCCA中泛化表达,提示核糖体生物发生在肝门部胆管癌发生发展中起到重要作用。RPL34在pCCA中高表达,其表达与疾病进展和淋巴结转移相关,RPL34的高表达患者更加易于复发,并伴随不良转归。本研究结果提示了RPL34在肝门部胆管癌中具有促癌的作用。第二部分核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响目的:为探索RPL34在肝门部胆管癌中的促癌作用及机制,观察其对癌细胞增殖、侵袭和体内成瘤及转移能力的影响。方法:合成RPL34-shRNA,包装慢病毒颗粒,靶向肝门部胆管癌细胞内源性RPL34,Western blotting检测RPL34的表达,CCK8法观察其对pCCA细胞增殖的影响,Transwell检测RPL34-sh RNA对pCCA细胞侵袭能力的改变,裸鼠成瘤实验观察RPL34-shRNA对pCCA细胞体内成瘤和转移能力的影响。结果:慢病毒载体携带shRNA成功对RPL34基因进行敲减,内源性RPL34的下降表达能够抑制肝门部胆管癌细胞的生长和迁移能力,同时也能够降低肿瘤细胞的体内成瘤能力以及向肝脏转移能力。结论:在肝门部胆管癌中RPL34可能起到促癌基因的功能,其促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长,主要通过增强pCCA细胞转移和增殖能力。第三部分核糖体蛋白RPL34促肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制目的:应用基因芯片检测RPL34-shRNA感染敲减RPL34的肝门部胆管癌细胞QBC939与对照胆管癌细胞的基因表达差异,初步探寻RPL34促进肿瘤侵袭生长的分子机制。方法:（1）Western blotting检测RPL34-shRNA感染后部分EMT相关指标和代谢相关指标的表达;（2）收集感染空白对照的肝门部胆管癌细胞和感染RPL34-sh RNA的肝门部胆管癌细胞,Trizol保存,送至基因检测平台;（3）利用Affymetrix?人类基因组U219微阵列检测感染RPL34-shRNA后基因表达的改变情况。Gene ontology和KEGG通路分析确定基因敲减后影响的信号通路和/或基因;（4）选择部分关键基因,进行Western blotting验证、利用TMA+IHC进行临床验证和统计分析;（5）构建了全长BCAS2（breast carcinoma amplified sequence 2）的质粒,并在RPL34敲减细胞中过表达BCAS2,采用CCK8检测细胞增殖、Transwell检测侵袭能力的改变。结果:（1）RPL34敲减后引起E-cadherin的表达上调,提示RPL34可能通过影响EMT促进肝门部胆管癌细胞的侵袭。而代谢相关指标未发生明显变化。（2）基因芯片结果显示160个基因在敲减内源性RPL34后发生显着改变。功能分类显示排名前八位的信号通路分别是:钾离子跨膜运输、核小体组装、心脏传导、细胞蛋白质代谢过程、蛋白质分解代谢、非同源端接双链修复、通过端粒酶端粒维持和信使RNA剪接等。前5位下调差异基因包括:SETD2（SET domain containing 2）（Fold change=-2.20,P=0.043）、COA6（cytochrome c oxidase assembly factor 6）（Fold change=-2.05,P=0.035）、TSEN15（tRNA splicing endonuclease subunit 15）（Fold change=-1.94,P=0.011）、BCAS2（breast carcinoma amplified sequence 2）（Fold change=-1.94,P=0.039）和HNRNPLL（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-like）（Fold change=-1.92,P=0.00029）。经过生物信息学分析,发现BCAS2和HNRNPLL两个基因与肿瘤相关。（3）RPL34调控蛋白BCAS2定位于细胞核和细胞浆,在非肿瘤上皮中呈弱表达,在肿瘤组织中呈强表达,肿瘤中的表达率为76.0%（92/121）。其表达与肿瘤分化呈正相关。与BCAS2阴性的患者相比,BCAS2阳性的患者中位无复发生存期更短（1.69年vs3.14年,P=0.012）。（4）敲减RPL34后肝门部胆管癌细胞的侵袭生长能力下降,当过表达BCAS2后,癌细胞的侵袭生长能力有所恢复。提示BCAS2能够部分逆转RPL34敲减所致的异常生物学行为。结论:本部分研究从机制上初步揭示了RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的潜在机制:RPL34可能通过EMT促进肿瘤侵袭生长;RPL34敲减后基因分析结果提示RPL34通过影响细胞核的翻译、转录、剪切和组装等功能,增强肝门部胆管癌细胞侵袭生长能力;基因芯片筛选出的RPL34相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达,其阳性表达与肝门部胆管癌的恶性生物学行为和不良预后密切相关,过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞侵袭生长能力的下降,提示RPL34可能通过BCAS2发挥促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用。总结RPL34在肝门部胆管癌中显着高表达,具有促肝门部胆管细胞侵袭生长作用。基因芯片检测、生物信息分析和蛋白免疫印迹验证提示RPL34可能通过EMT以及多种信号传导通路促进肝门部胆管癌的侵袭生长。高通量筛选所发现相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达,过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞增殖能力和侵袭能力的下降,提示BCAS2是RPL34可能的下游分子。RPL34有望成为一种预测肝门部胆管癌复发和预后的肿瘤标志物,靶向RPL34介导的信号通路可能成为pCCA潜在的治疗策略。
王小磊[4]（2019）在《microRNA-224在胆管癌患者中的表达及其临床意义》文中认为目的:胆管癌是一种治愈率低、死亡率高、远期存活率不理想的胆道系统恶性肿瘤。随着医学界对小分子非编码RNA（microRNA）的深入研究,多学者已证实microRNA在多种生物学途径特别是在多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。本课题探讨miR-224在胆管癌患者癌组织和癌旁组织中表达水平的差异以及其表达与胆管癌患者年龄、性别、肿瘤分化程度、是否存在淋巴结转移以及肿瘤TNM分期的关系,明确其在胆管癌患者中的临床病理学意义;随访并比较不同miR-224表达水平的胆管癌患者的术后生存时间,分析其与其他临床指标和患者术后生存期的关系,进而明确其在评估胆管癌患者预后中的临床意义。方法:严格按照纳入标准和排除标准选择符合本课题研究条件、临床病理资料完整、经病理组织学确诊的初诊初治胆管癌患者30例,分别留取纳入患者的癌组织和癌旁组织并保存备用。利用RT-PCR技术进行总RNA抽提、逆转录获取cDNA以及RT-PCR分别检测胆管癌患者癌组织及癌旁组织中miR-224的表达,并运用配对资料的t检验比较其分别在癌组织和癌旁组织中的表达情况,分析miR-224在两者中的表达差异是否具有统计学意义。收集患者完整的临床病理学资料,运用Fisher确切概率法比较胆管癌组织中miR-224的相对表达量与胆管癌患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况以及肿瘤TNM分期等临床病理特征之间的关系;通过电话回访的方式对此30例胆管癌患者术后的生存情况进行调查,记录其术后生存期,应用Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线,用Cox比例风险回归模型分析多种因素对术后生存时间的影响,进而判断miR-224在判断胆管癌患者预后中的价值。结果:胆管癌患者癌组织中miR-224-5p的相对表达量为10.23±0.8861,癌旁组织中的相对表达量为0.4734±0.0402。胆管癌组织中miR-224-5p的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平（p<0.05）。以miR-224-5p的表达中位数将30例患者分为miR-224-5p高表达组与miR-224-5p低表达组,研究结果显示miR-224-5p高表达组淋巴结转移阳性率高于miR-224-5p低表达组（p<0.05）;另外,miR-224-5p的表达水平与患者的TNM病理分期密切相关,miR-224-5p低表达组偏早期患者比例（I期、II期）明显高于miR-224-5p高表达组（p<0.05）。而两组在年龄、性别以及肿瘤的分化程度等临床病理因素方面的差异无统计学意义（p>0.05）。miR-224-5p高表达组患者的中位生存时间为22.54个月（95%CI 16.76-28.32个月）,miR-224-5p低表达组患者的中位生存时间为32.23个月（95%CI 29.86-34.60个月）,后者生存时间明显长于前者（χ2=9.169,p<0.05）。Cox比例风险回归模型分析多种因素对胆管癌患者术后生存时间的影响,结果显示miR-224-5p高表达、淋巴结转移阳性以及肿瘤TNM分期晚是影响胆管癌患者预后的独立危险因素,淋巴结转移阴性以及TNM分期较早的胆管癌患者预后明显好于淋巴结转移阳性以及TNM分期晚的患者,miR-224-5p高表达的胆管癌患者较miR-224-5p低表达的患者预后差,差异均具有统计学意义（p<0.05）。结论:miR-224在胆管癌中具有潜在的癌基因作用;miR-224的高表达对于胆管癌患者的预后起到消极作用。miR-224高表达是独立于其他临床病理特征的预示胆管癌预后不良的标志物,其表达水平的高低可作为重要指标加入胆管癌预后评价体系。
王晓雷[5]（2019）在《Krüppel样因子4及Ki-67蛋白在胆管癌中的表达及意义》文中研究说明目的:研究Krüppel样因子4与Ki-67蛋白在胆管癌组织中的表达意义及相关性,探讨它们在胆管癌的发生与发展过程中的作用机理,为胆管癌治疗提供相关理论支持。方法:收集并整理河北医科大学第二医院2010.01.012018.12.30期间胆管癌患者完整的临床资料以及病理资料胆管癌组织蜡块标本95例;选取25例病理证实为阴性的胆管癌癌旁组织蜡块标本作为阴性对照。采用免疫组织化学（S-P法）技术检测这些标本中KLF4和Ki-67蛋白的表达水平,并结合患者的年龄、性别及肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结转移、分期等因素进行综合分析。所得结果用SPSS21.0统计软件进行分析。结果:1.Krüppel样因子4与Ki-67在胆管癌组织中阳性表达率分别为41.0%、73.7%,与阴性对照组相比较表达率明显存在差异（P<0.05）。2.KLF4因子在Ⅰ+Ⅱ期的表达水平明显高于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）,中低分化组中的表达水平明显低于高分化组（P<0.05）,淋巴结转移组中的表达水平显着低于无淋巴结转移组（P<0.05）;Ki-67蛋白在Ⅰ+Ⅱ期的表达水平明显低于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）,低分化组的表达表达水平明显高于高分化组（P<0.05）,淋巴结转移组中的表达水平明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）;然而KLF4因子和Ki-67蛋白的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小无明显相关（P>0.05）。3.研究结果显示KLF4因子和Ki-67蛋白在胆管癌组织中的表达水平与胆管癌的进展具有负相关性（r=-0.376,P<0.01）。结论:1.与胆道恶性肿瘤瘤旁的正常组织相比,KLF4蛋白在胆道恶性肿瘤组织中表达率较低,且明显低于癌旁正常组织,其在阳性率的差别上具有统计学意义。KLF4蛋白表达水平的变化与胆道恶性肿瘤细胞的淋巴转移、肿瘤细胞的分化程度和肿瘤分期有关。提示其参与胆管癌发生、浸润、转移过程。2.与胆管癌旁的正常组织相比,Ki-67蛋白在胆道恶性肿瘤组织中表达率增高,且明显高于癌旁正常组织,其阳性率的差别具有统计学意义。Ki-67蛋白表达水平的变化与胆管癌细胞的分化程度、淋巴结转移和肿瘤分期相关。这些信息说明Ki-67可能参与了胆道恶性肿瘤的发生、浸润和转移过程。3.KLF4与Ki-67蛋白在胆道恶性肿瘤组织中的表达存在负相关性。KLF4和Ki-67可能与胆道恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移相关,它们可能在胆管细胞癌发生、发展中发挥了重要的作用,而联合检测或可更为有效的判断胆管癌的这一生物学行为。
尹玉瑶[6]（2017）在《Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶HDAC3抑制胆管癌细胞凋亡的机制研究》文中认为背景:I类组蛋白去乙酰化酶（HDAC）在许多肿瘤的发生发展中扮演着癌基因的角色。组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）作为I类HDACs在肿瘤中具有抑制癌细胞凋亡并促进癌细胞增殖的作用。MI192是一种新型HDAC3特异性抑制剂,在许多肿瘤细胞中显示出抗肿瘤活性。然而,HDAC3的作用及其抑制剂的抗肿瘤活性在胆管癌（CCA）中是未知的。目的:本研究旨在确定I类HDACs在胆管癌中的表达,并探讨HDAC3对胆管癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。然后,我们确定HDAC3抑制剂的靶点以及评估它对胆管癌的治疗作用。方法:首先我们收集了 60例鼓楼医院手术样本的胆管癌样本。采用免疫组化技术检测I类组蛋白去乙酰化酶在癌组织和邻近正常胆管组织中的表达并分析与预后的关系。此外,我们还运用蛋白质印迹法检测9个胆管癌组织和2个正常胆管组织中的HDAC3蛋白表达水平。随后我们用siRNA-HDAC3和HDAC3质粒转染两株胆管癌细胞（HuCCT-l和RBE）,用CCK8、集落形成和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡情况。然后我们用HDAC3抑制剂处理胆管癌细胞株后通过CCK8和集落形成法来检测细胞活力变化情况。最后,我们采用裸鼠皮下移植瘤模型来评估在体内MI192对HDAC3抑制活性以及其抗肿瘤活性。结果:本实验结果证明了 I类HDACs中HDAC1、2和8在癌和癌旁表达无差异,与癌旁组织相比,HDAC3在肿瘤组织中上调,并与患者生存率降低有关。CCK8和集落形成测定显示结果提示,上调HDAC3可促进胆管癌细胞增殖,相反,下调HDAC3会抑制肿瘤细胞增殖。HDAC3抑制剂MI192可抑制胆管癌细胞生长,降低肿瘤细胞集落形成能力并诱导细胞凋亡。此外,用MI192处理裸鼠皮下移植瘤模型,发现裸鼠的肿瘤增殖受到抑制,同时凋亡增加,证实MI192的具有抗肿瘤活性。最后,我们证明HDAC3选择性抑制剂在体外和体内均可抑制HDAC3活性并抑制其下游靶标靶点的去乙酰化。总之,这些结果首次证明MI192通过靶向抑制HDAC3来抑制胆管癌细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。结论:本文研究结果表明HDAC3是细胞增殖和凋亡的关键调节因子,并与胆管癌患者预后不良有关。我们的研究结果首次揭示下调HDAC3可诱导胆管癌细胞凋亡,因此HDAC3选择性抑制剂在胆管癌的治疗上具有很好的前景。
霍奇[7]（2017）在《MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究》文中指出大量研究结果显示MDIG基因与人类多种恶性肿瘤（如食管癌、胃癌、结肠癌和肺癌等）的发展及预后相关,但是MDIG在肝细胞癌中的功能及调控机制尚不清楚。本研究中,我们发现在肝细胞癌细胞中过表达IKZF1或干扰IKZF1的表达可以影响MDIG的表达水平,MDIG与IKZF1两者之间的m RNA表达水平呈负相关性。染色质免疫沉淀实验（Ch IP）结果显示,IKZF1直接结合MDIG的启动子区域,在转录水平上调控MDIG的表达。体外功能实验结果显示,MDIG促进肝细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移,稳定干扰MDIG表达抑制肝细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移,裸小鼠肝脏原位成瘤实验结果显示MDIG促进肝细胞癌细胞体内成瘤。体外进一步实验显示,MDIG降低肝细胞癌细胞对药物索拉菲尼（sorafenib）的敏感性。MDIG含有组蛋白去甲基化酶,实验结果显示,肝细胞癌细胞中MDIG影响组蛋白3赖氨酸9三甲基化表达水平（H3K9me3）,H3K9me3在表观遗传上调控p21（CIP1/WAF1）的表达,染色质免疫沉淀实验结果显示,H3K9me3直接结合p21（CIP1/WAF1）的转录区而影响其表达水平。本研究通过免疫组织化学染色对155例原发性肝细胞癌患者临床样本分析,发现MDIG在肝细胞癌中表达高于配对的癌旁组织,MDIG表达与病理组织学分级和乙型肝炎病毒感染呈正相关。研究结果提示,MDIG在肝细胞癌中促进肝细胞癌细胞的增殖,有望作为临床治疗肝细胞癌的一个候选分子靶标。
李浩[8]（2016）在《miR-191调控肝内胆管癌的表观遗传机制研究》文中认为目的:肝内胆管癌仍是死亡率极高的一种疾病。文献证明microRNAs（miRNAs）在肝内胆管癌形成发挥重要的作用,但如何参与肝内胆管癌的发病机理仍需要进一步深入研究。方法:首先应用human microRNA microarray分析3对肝内胆管癌及癌旁组织miRNAs差异表达,并应用Taqman q PCR在18对肝内胆管癌和癌旁组织验证miRNAs芯片结果。体外和体内裸鼠皮下成瘤及原位肝内胆管癌肿瘤模型研究miR-191对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学功能的影响。利用生物信息学软件预测miR-191下游靶基因,并结合荧光素酶报告基因、western blot及免疫组化等实验技术体内外鉴定miR-191下游的靶基因。结果:通过分析肝内胆管癌和癌旁组织样本microRNAs差异表达谱,得到72个明显差异性表达miRNAs（Fold Change≥2,p<0.05）。经Taqman q PCR在18对肝内胆管癌组织和癌旁组织样本验证,发现miR-191在胆管癌中差异性表达比较明显,胆管癌细胞株和正常胆管上皮细胞也发现miR-191表达差异明显。Kaplan-Meier生存分析发现miR-191高表达的患者预后更差。多因素分析发现miR-191可以预测胆管癌术后患者的预后,是胆管癌患者术后总体生存和无瘤生存的独立危险因素。ROC（Receiver-operating characteristic）曲线分析发现miR-191可以预测70%胆管癌患者的预后,但是联合TNM分期可以较高敏感性和特异性预测胆管癌（77%）的预后。体内外功能实验发现,miR-191的高表达能够明显促进胆管癌细胞的增殖、侵袭和转移。通过荧光素酶报道基因等实验技术发现miR-191可与TET1 3’UTR区域相结合。Western blot和免疫组化分析发现miR-191可负性调控TET1蛋白的表达。miR-191和TET1共同转染后,TET1的高表达可减弱miR-191在胆管癌中的生物学行为,包括增殖、侵袭和转移。进一步发现TET1可以与p53转录起始点特异性结合,通过去甲基化正向调控p53的表达。结论:miR-191的高表达与胆管癌的临床指标TNM分期相关,可以预测胆管癌患者的预后,联合TNM则能更准确的预测预后。miR-191在胆管癌中高表达可以促进增殖、侵袭和转移,其主要机制是通过负性调控TET1促进胆管癌细胞的增殖、侵袭和转移。TET1与p53转录起始点区域结合,通过去甲基化正向调控p53的表达。miR-191可以作为预测胆管癌预后的分子标志物。首次揭示miR-191/TET1/p53信号通路在胆管癌发生、发展中起到重要的作用,为胆管癌的治疗提供了一种新的治疗措施。
肖平[9]（2015）在《LKB1对p21WAF1/CIP1的调控及相关机制研究》文中提出背景和目的:恶性肿瘤已经成为危害人类健康的疾病,世界卫生组织报告显示全球恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈迅猛上升的趋势。在肿瘤的发生、发展的过程中,癌基因的激活或抑癌基因的失活起着十分重要的作用。近年来一个新的抑癌基因LKB1（Liver Kinase B1）在肿瘤学中的作用引起越来越多的关注。LKB1基因功能异常与全身多种肿瘤的发生密切相关,但绝大多数散发性肿瘤中,LKB1的突变是罕见的;而在NSCLC中LKB1的突变率高达30%。研究发现将LKB1转染至宫颈癌和恶性黑色素瘤等无LKB1表达的细胞系中,LKB1可以通过上调p21WAF1/CIP1的表达,将细胞周期阻滞在G1期,从而抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡。然而在LKB1突变率较高的NSCLC细胞中LKB1对p21WAF1/CIP1的调节作用尚不明确。此外,研究发现当细胞处于饥饿和体外分离的状态下,作为LKB1的下游激酶AMPK可以直接磷酸化p53 Ser15,增强p21WAF1/CIP1的表达,从而阻滞细胞周期的顺利进行。因此,LKB1是否通过其下游激酶AMPK磷酸化激活p53,从而增强p21WAF1/CIP1的表达尚不十分清楚。本研究首先在LKB1突变率较高的NSCLC细胞系中探讨LKB1对调节p21WAF1/CIP1的调节作用;其次,构建稳定表达LKB1sh RNA的同源细胞系;最后进一步探讨LKB1是否通过其下游激酶AMPK磷酸化激活p53,上调p21WAF1/CIP1的表达,阻滞细胞周期的顺利进行,为揭示肿瘤的发生发展提供理论基础。方法:（1）首先在NSCLC细胞系中选用LKB1突变型、p53野生型细胞（A549）转染LKB1质粒和LKB1-K78M激酶突变质粒,应用克隆形成实验检测LKB1对细胞生长的作用。其次选用LKB1突变型、p53野生型NSCLC细胞系（A549和H460）分别转染转染LKB1质粒、LKB1-K78M质粒和C2空白对照质粒,24小时后Western Blot检测p21WAF1/CIP1的表达变化;并应用流氏细胞仪检测细胞周期的变化水平;再次选用LKB1野生型、p53突变型NSCLC细胞系（H1299和Calu-1）,分别转染LKB1质粒和C2空白对照质粒,24小时后应用荧光定量PCR和Western Blot检测p21WAF1/CIP1的变化水平;最后应用同源细胞系H1299-411（LKB1 sh RNA）和H1299-PLKO.1,收集细胞沉淀,检测p21WAF1/CIP1的表达变化。（2）采用慢病毒载体系统将靶基因LKB1sh RNA转入HCT116细胞中,构建LKB1稳定抑制的同源细胞系HCT 116-LKB1sh RNA（HCT116 408）/HCT116-PLKO.1（HCT116 407）,并通过荧光定量PCR、Western Blot在m RNA和蛋白水平检测构建细胞系中LKB1的表达情况。（3）首先选用HCT 116 408（LKB1 knock down）/HCT 116 407（对照）这对同源细胞系,收集细胞沉淀,检测p21WAF1/CIP1的表达变化;应用HCT 116p53-/-/HCT116同源细胞系通过转染LKB1si RNA,24小时后Western Blot检测p21WAF1/CIP1的表达变化;其次选用HCT 116细胞系转染LKB1质粒、LKB1-K78M质粒和C2空白对照质粒,24小时后Western Blot检测p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的表达变化;再次用25Mm 2-DG处理HCT116细胞,24h后Western Blot检测p21WAF1/CIP1的变化水平;最后通过对HCT 116 408（LKB1 knock down）/HCT 116 407（对照）和HCT 116p53-/-/HCT 116两对同源细胞系分别给予2-DG25Mm 24h处理后,Western Blot检测p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的变化水平。结果:（1）通过克隆形成实验发现,与转入LKB1 K78M无激酶活性质粒相比,转入LKB1质粒的细胞克隆数明显减少,说明LKB1具有抑制细胞生长的作用。在LKB1突变型、p53野生型NSCLC细胞系中,转染LKB1的质粒上调p21WAF1/CIP1的表达,而空载体C2和无激酶活性的载体LKB1 K78M无此作用。同时,流式细胞结果显示与转染LKB1 K78M质粒和空白对照质粒相比,转染LKB1质粒的A549细胞G1期比例明显增加。在LKB1野生型、p53突变型NSCLC细胞系中,与空载体和无激酶活性的LKB1 K78M相比,转染LKB1质粒后在m RNA水平和蛋白水平均未见p21WAF1/CIP1的表达上调,并且流式细胞周期未见G1期比例增加。最后在p53缺失的NSCLC同源细胞系H1299-411和H1299-PLKO.1中的p21WAF1/CIP1表达也没有明显差异。（2）荧光定量PCR及Western Blot结果显示与对照细胞株HCT 116 407相比HCT116 408（LKB1sh RNA）中LKB1在m RNA水平和蛋白水平的表达水平明显降低,说明构建HCT116 408/HCT116 407同源细胞系成功。（3）HCT116 408（LKB1 sh RNA）和HCT116 407（对照）这对同源细胞系Western Blot结果显示LKB1表达下降后p21WAF1/CIP1的表达也下降。HCT116 p53-/-和HCT116这对同源细胞转染LKB1 Si RNA 48h后,Western Blot结果显示HCT116 p53-/-转染后p21WAF1/CIP1的表达没有明显变化,而HCT116转染LKB1 Si RNA后p21的表达明显下降。HCT116细胞外源性转入转染LKB1质粒、LKB1 K78M质粒和C2对照质粒,转染LKB1质粒的细胞与对照组相比,p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的表达均上调;2-DG处理后的HCT116与对照组比较,p21WAF1/CIP1的表达明显上调;HCT116 408和HCT116 407同源细胞系,2-DG 25Mmol处理24h后,与未加药组相比HCT116 407细胞p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的表达均上调,而HCT 116 408细胞p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的表达未见明显变化。HCT116 p53-/-加入2-DG后与对照组HCT116相比,p21WAF1/CIP1的表达未见明显变化。结论:（1）在NSCLC细胞系中LKB1具有抑制细胞生长的作用;LKB1可以上调p21WAF1/CIP1的表达,将细胞周期阻滞在G1期,且此过程依赖激酶活性。（2）LKB1依赖p53上调p21WAF1/CIP1的表达。（3）LKB1调节p21WAF1/CIP1的机制是:LKB1通过其下游激酶AMPK磷酸化p53-Ser15,上调p21WAF1/CIP1的表达。
李娟娟[10]（2013）在《c-Met在胆管癌恶性进展中的作用及其抑制剂对胆管癌治疗作用的研究》文中认为研究背景和目的胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，主要分为肝内胆管癌和肝外胆管癌。胆管癌恶性程度高、预后差，根治性手术切除后患者的5年生存率也仅为20%～40%。胆管癌细胞强大的局部侵犯和远处转移能力是胆管癌预后极差的两大主要危险因素。目前，在胆管癌的治疗中也缺乏有效的特异性的化疗药物，因而开发靶向特定分子的化疗药物显得尤为重要。酪氨酸蛋白激酶c-Met是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）的受体。目前研究表明其激活可影响细胞的增殖、迁移、凋亡、形态发生和血管的生成。文献报道多种癌细胞中存在c-Met的突变以及过度激活，因此靶向c-Met的生物治疗可以运用到多种恶性肿瘤的治疗中。目前针对c-Met的抑制剂不断出现，由注射用的su11274和PHA-665752发展到口服用的PF-2341066。PF-2341066是ATP竞争性的口服小分子化合物，它具有良好的生物可用性及极高的水溶性，目前已经进入到三期临床，是目前针对c-Met靶向治疗的潜力药物。该部份实验对c-Met在胆管癌细胞中的作用及其选择性小分子抑制剂PF-2341066对胆管癌的治疗作用进行了探讨。实验发现c-Met在三种胆管癌细胞系中磷酸化水平均明显升高。以靶向Met的siRNA下调c-Met表达后，胆管癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制。组织水平的检测结果显示，胆管癌组织中c-Met及p-Met的水平也明显增高。值得注意的是，胆管癌样本芯片的结果显示，p-Met的表达水平与患者的预后呈负相关。我们进一步验证了c-Met小分子抑制剂对胆管癌细胞的作用，结果显示c-Met小分子抑制剂PF-2341066能够抑制胆管癌细胞的增殖、迁徙、侵袭和细胞周期的进程，同时诱导细胞的凋亡，动物实验结果也表明，PF-2341066抑制胆管癌细胞体内移植瘤的生长。本部份研究阐述了p-Met的表达水平与胆管癌患者预后的关系，可作为胆管癌预后判断的指标。新兴的c-Met ATP竞争性的口服小分子化合物PF-2341066对胆管癌细胞的生长具有抑制作用，是胆管癌分子靶向治疗的潜力药物。实验方法1.通过Western blot技术检测胆管癌细胞和组织中c-Met及p-Met的表达水平；2.通过siRNA介导的基因沉默技术检测c-Met对胆管癌细胞生物学行为的影响；3.通过胆管癌组织芯片数据分析p-Met的表达水平与患者预后指标的相关性。4.用c-Met选择性抑制剂处理胆管癌细胞，检测c-Met对胆管癌细胞生物学行为的影响。结果1.胆管癌细胞中c-Met呈高水平磷酸化；2. c-Met对胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭起促进作用；3.胆管癌组织中c-Met呈高水平磷酸化；4.胆管癌组织样本芯片数据分析结果显示p-Met的表达水平标志着胆管癌的预后；5.在胆管癌细胞系中c-Met抑制剂对c-Met磷酸化以及下游信号通路有抑制作用；6. c-Met的抑制剂PF2341066能够抑制胆管癌细胞的增殖，诱导胆管癌细胞周期的终止和凋亡的发生，抑制其迁移和侵袭，抑制裸鼠皮下荷瘤的移植瘤的生长。结论本研究发现在胆管癌细胞和组织中c-Met呈高水平磷酸化，c-Met对胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭起促进作用，p-Met的表达水平标志着胆管癌的预后，可作为胆管癌治疗的新靶点。最新研制的针对c-Met的ATP竞争性的口服小分子化合物PF-2341066能够明显抑制胆管癌细胞的各种生物学功能以及裸鼠皮下移植瘤的生长，是目前针对c-Met靶向治疗的潜力药物。
二、在胆管癌组织中检测p53,p21~(WAF1)的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、在胆管癌组织中检测p53,p21~(WAF1)的表达（论文提纲范文）
（1）p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 胶质瘤的研究进展 |
| 1.1.1 胶质瘤的发生发展 |
| 1.1.2 胶质瘤的治疗现状 |
| 1.2 肿瘤乏氧微环境的研究现状 |
| 1.2.1 肿瘤乏氧微环境 |
| 1.2.2 乏氧肿瘤的代谢重编程 |
| 1.2.3 乏氧肿瘤的辐射抗性 |
| 1.3 p21在肿瘤放疗中的功能多样性 |
| 1.3.1 p21参与电离辐射应答 |
| 1.3.2 p21与细胞周期 |
| 1.3.3 p21与DNA损伤修复 |
| 1.3.4 p21与细胞凋亡 |
| 1.3.5 p21与其他细胞进程 |
| 1.4 研究目的及章节安排 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备及仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞培养主要试剂及耗材 |
| 2.2.2 细胞转染主要试剂及耗材 |
| 2.2.3 CCK-8 检测细胞增殖主要试剂及耗材 |
| 2.2.4 免疫印迹杂交主要试剂及耗材 |
| 2.2.5 RNA提取、反转录以及Real-time PCR主要试剂及耗材 |
| 2.2.6 EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)细胞增殖检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.7 胞内葡萄糖摄入量的检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.8 培养基中乳酸产量的检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.9 双荧光素酶报告基因实验主要试剂及耗材 |
| 2.2.10 构建稳定过表达p21的U87细胞株主要试剂及耗材 |
| 2.2.11 异种移植小鼠模型的构建及相关动物实验主要试剂及耗材 |
| 2.2.12 本研究所用到的小分子抑制剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞乏氧处理 |
| 2.3.3 细胞辐照 |
| 2.3.4 细胞转染 |
| 2.3.5 克隆存活 |
| 2.3.6 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 2.3.7 免疫印迹杂交 |
| 2.3.8 RNA提取及浓度测定 |
| 2.3.9 RNA反转录和Real-time PCR |
| 2.3.10 EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)细胞增殖检测 |
| 2.3.11 胞内葡萄糖摄入量的检测 |
| 2.3.12 培养基中乳酸含量的测定 |
| 2.3.13 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.14 构建稳定过表达p21的U87细胞株 |
| 2.3.15 异种移植小鼠模型的构建及相关动物实验 |
| 2.3.16 统计学方法 |
| 第3章 胶质瘤乏氧及辐射抗性相关生物标志物的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 乏氧处理增加胶质瘤细胞的辐射抗性 |
| 3.2.2 对待选生物标志进行生物信息学分析 |
| 3.2.3 检测待选生物标志在乏氧条件下的表达情况 |
| 3.2.4 p21对胶质瘤增殖及辐射敏感性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 乏氧条件下p21通过增强糖酵解途径提高胶质瘤细胞的辐射抗性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 乏氧条件下p21对糖酵解途径的影响 |
| 4.2.2 p21通过调控Glut1和LDHA影响糖酵解途径 |
| 4.2.3 乏氧条件下Glut1和LDHA对胶质瘤增殖的影响 |
| 4.2.4 乏氧条件下Glut1和LDHA对胶质瘤辐射敏感性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 p21与HIF-1α间的相互正反馈调节回路 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 HIF-1α与p21的表达成正相关 |
| 5.2.2 乏氧条件下HIF-1α直接转录激活p21 |
| 5.2.3 乏氧条件下HIF-1α通过p21上调Glut1和LDHA |
| 5.2.4 乏氧诱导的p21促进HIF-1α的转录 |
| 5.2.5 HIF-1α能够调控Glut1和LDHA的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 体内实验验证HIF-1α/p21信号轴增强胶质瘤辐射抗性 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 稳定过表达p21的U87细胞株的构建 |
| 6.2.2 p21过表达增强胶质瘤的辐射抗性 |
| 6.2.3 过表达p21增强胶质瘤内的糖酵解途径 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）组蛋白去乙酰化酶抑制剂Romidepsin在胆管癌中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 前言(含综述内容) |
| 1.1 胆管癌诊治现状 |
| 1.2 流行病学及危险因素 |
| 1.3 分子发病机制 |
| 1.4 诊断与外科治疗 |
| 1.5 辅助化疗 |
| 1.6 分子靶向治疗 |
| 1.7 免疫治疗 |
| 1.8 表观遗传与肿瘤治疗 |
| 1.9 本文研究思路 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材、仪器和设备 |
| 2.4 主要实验配方 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 Romidepsin对胆管癌细胞系的增殖抑制情况 |
| 3.2 Romidepsin作用后胆管癌细胞系细胞周期的变化 |
| 3.3 Romidepsin对胆管癌细胞系周期相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 Romidepsin作用后胆管癌细胞系细胞凋亡的情况 |
| 3.5 Romidepsin对胆管癌细胞系凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.6 Romidepsin在体内对胆管癌细胞成瘤能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章(一) |
| 英文文章(二) |
（3）核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肝门部胆管细胞癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义 |
| 一、肝门部胆管细胞癌的临床病理学分析 |
| 二、核糖体蛋白家族成员在肝门部胆管癌中的表达谱系 |
| 三、RPL34在肝门部胆管癌中的表达及其临床意义 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果分析 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 核糖体蛋白RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果分析 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 肝门部胆管癌发生发展的分子生物学基础进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）microRNA-224在胆管癌患者中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 临床资料及研究方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 病例选择标准 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 3 实验数据收集 |
| 3.1 实验试剂及仪器 |
| 3.2 实验技术路线 |
| 3.3 实验操作步骤 |
| 3.3.1 总RNA抽提 |
| 3.3.2 逆转录获取c DNA |
| 3.3.3 RT-RCR检测 |
| 4 记录结果 |
| 5 统计分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 1 所抽提总RNA纯度及miR-224-5p和内参U6 引物的检测 |
| 2 miR-224-5P在胆管癌与癌旁组织中的表达水平 |
| 3 miR-224-5P的表达与胆管癌患者临床病理学特征的关系 |
| 4 miR-224-5p的表达水平对胆管癌患者预后的影响 |
| 5 胆管癌患者预后影响因素的分析 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| microRNA-224与肿瘤关系的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（5）Krüppel样因子4及Ki-67蛋白在胆管癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 KLF4在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶HDAC3抑制胆管癌细胞凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 缩略词表 |
| 附录二: 硕士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 IKZF1 在肝细胞癌中转录调控MDIG的表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 MDIG基因在肝细胞癌中的功能 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 MDIG在肝细胞癌中表观遗传调控p21(CIP1/WAF1)的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 MDIG在肝细胞癌中差异表达及其临床意义 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）miR-191调控肝内胆管癌的表观遗传机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 胆管癌中差异性microRNA的筛选和验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1 RNA的质控 |
| 2 MicroRNAs芯片筛选结果 |
| 3 芯片筛选结果经Taqman qPCR验证 |
| 4 利用细胞系验证miR-191的表达 |
| 讨论 |
| 第二部分 miR-191与临床的关系及在胆管癌组织表观遗传学变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 miR-191表达水平与临床因素的关系 |
| 2 miR-191 与胆管癌预后的ROC分析 |
| 3 胆管癌患者预后miR-191的Kaplan-Meier生存分析和多因素分析 |
| 4 miR-191在胆管癌组织和胆管癌细胞甲基化情况 |
| 讨论 |
| 第三部分 miR-191对胆管癌细胞生物学特性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 体外证明miR-191促进胆管癌细胞增殖 |
| 2 体内证明miR-191促进胆管癌细胞增殖 |
| 3 miR-191影响胆管癌细胞的凋亡 |
| 4 体内、体外证明miR-191促进胆管癌细胞的侵袭和转移 |
| 讨论 |
| 第四部分 miR-191调控下游基因的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 miR-191 直接与TET1结合负性调节TET1的表达 |
| 2 恢复TET1 的表达减弱miR-191 促进胆管癌细胞增殖,侵袭和转移能力 |
| 3 TET1表观遗传修饰p53基因 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及科研成果目录 |
（9）LKB1对p21WAF1/CIP1的调控及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、LKB1在非小细胞肺癌中对p21~(WAF1/CIP1)的调控 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验细胞株及质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备及用材 |
| 1.1.4 主要溶液及药品配制 |
| 1.1.5 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 二、慢病毒载体构建稳定表达LKB1 shRNA的细胞系 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验质粒、菌株和细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要器材 |
| 2.1.4 主要溶液及药品配置 |
| 2.1.5 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 三、LKB1调节p21~(WAF1/CIP1)的机制的进一步探讨 |
| 3.1 .对像和方法 |
| 3.1.1 实验细胞和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液及配置 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 .结果 |
| 3.3 .讨论 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 LKB1/AMPK对p21~(WAF1/CIP1)调节的研究 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）c-Met在胆管癌恶性进展中的作用及其抑制剂对胆管癌治疗作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 研究内容 |
| 第一部分 c-Met在胆管癌恶性进展中的作用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 c-Met抑制剂对胆管癌治疗作用的研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 第二部分 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
四、在胆管癌组织中检测p53,p21~(WAF1)的表达（论文参考文献）
- [1]p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究[D]. 匡彦蓓. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2021(01)
- [2]组蛋白去乙酰化酶抑制剂Romidepsin在胆管癌中的作用及机制研究[D]. 李丕宏. 山东大学, 2021(11)
- [3]核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究[D]. 钱建新. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [4]microRNA-224在胆管癌患者中的表达及其临床意义[D]. 王小磊. 青岛大学, 2019(02)
- [5]Krüppel样因子4及Ki-67蛋白在胆管癌中的表达及意义[D]. 王晓雷. 河北医科大学, 2019(12)
- [6]Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶HDAC3抑制胆管癌细胞凋亡的机制研究[D]. 尹玉瑶. 南京大学, 2017(05)
- [7]MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究[D]. 霍奇. 上海交通大学, 2017(05)
- [8]miR-191调控肝内胆管癌的表观遗传机制研究[D]. 李浩. 上海交通大学, 2016(05)
- [9]LKB1对p21WAF1/CIP1的调控及相关机制研究[D]. 肖平. 天津医科大学, 2015(05)
- [10]c-Met在胆管癌恶性进展中的作用及其抑制剂对胆管癌治疗作用的研究[D]. 李娟娟. 第二军医大学, 2013(04)