rAAV-2-HBsAg 和 rAAV-2-GM-CSF 的共感染增强了人外周血单个核细胞衍生的树突状细胞的免疫刺激功能

一、rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能（论文文献综述）

朱雄鹏^[1]（2006）在《重组腺病毒介导Survivin和GM-CSF基因修饰树突状细胞体外诱导抗血液肿瘤免疫的实验研究》文中认为血液系统恶性肿瘤是当前威胁人类健康的重要疾病，具有很高的发病率和死亡率。白血病／淋巴瘤等肿瘤经联合化疗，虽可以获得完全缓解，但难彻底消灭肿瘤微小残留病（MRD）。因此，通过肿瘤特异性免疫治疗最大限度地杀灭残留肿瘤细胞是防止复发，延长缓解期和无病生存期的关键。本研究拟以腺病毒载体将Survivin与GM-CSF基因导入树突状细胞，诱导特异性CTLs，观察对血液肿瘤细胞的杀伤效应，为肿瘤的基因免疫治疗奠定基础。 目的 构建含有人survivin和人GM-CSF基因的重组腺病毒载体，对人外周血单核细胞进行诱导培养，获得树突状细胞（DC）；以腺病毒载体介导survivin基因与GM-CSF基因修饰树突状细胞，使之作为抗原呈递细胞，在呈递肿瘤抗原的同时又持续分泌高滴度的GM-CSF，从而诱导更强的特异性CTLs，对血液系统恶性肿瘤细胞发挥强大的杀伤效应，为以DC为基础的肿瘤免疫治疗提供实验依据。 方法 1、合成一对分别含有Kpn Ⅰ和HindⅢ酶切位点的survivin和GM-CSF基因的上下游引物，以质粒pcDNA3.0-survivin和质粒pBlu-hGM-CSF为模板，通过PCR法获得survivin和GM-CSF基因全长序列。片段回收后经酶切，定向插入腺病毒穿梭质粒pshuttle-CMV，分别获得重组质粒pshuttle-CMV-survivin和pshuttle-CMV-GM-CSF，并通过酶切、PCR及插入片段测序等方法鉴定。 2、将正确的重组体pshuttle-CMV-survivinh和pshuttle-CMV-GM-CSF转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛

冷怀明^[2]（2004）在《第三军医大学学报 2004年第26卷总目次》文中进行了进一步梳理

胡贵方,俞守义,吴小兵,尹芳,陈清,候云德^[3]（2004）在《rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能》文中指出目的 探讨rAAV 2 HBsAg（表达乙肝表面抗原的重组腺相关病毒 ）和rAAV 2 GM CSF（表达粒细胞 /巨嗜细胞-集落刺激因子的重组腺相关病毒 ）共感染对人外周血单核细胞来源树突状细胞 （DC）免疫刺激功能的影响。方法 用rAAV 2 HBsAg和rAAV 2 GM CSF同时感染新分离的树突状细胞 ;CytoTox 96 Non RadioactiveCtoxicityAssay试剂盒检测细胞毒性T淋巴细胞 （CTL）反应 ;混合白细胞反应 （MLR）检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力 ;流式细胞仪检测DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA DR。结果 rAAV 2 HBsAg和rAAV 2 CM CSF共感染的DC刺激同种异体淋巴细胞增值的能力和激发的自身淋巴细胞的CTL效应增强 ,CD83表达水平提高。结论 内源性表达的GM CSF能促进DC成熟、增强DC的免疫刺激功能

胡贵方^[4]（2003）在《表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的严重威胁人类健康的传染性疾病，目前全球范围内大约有超过3.5亿人受到HBV危害。大约有15～40％的HBV感染者最终会发展为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝硬化和肝衰竭。我国是乙型肝炎主要的流行区，现患慢性乙型肝炎的病人已突破1000万。迄今为止，慢性乙型肝炎的治疗仍无良策，因此，研制新型HBV疫苗和寻求有效的治疗乙型肝炎的手段迫在眉睫。2型重组腺相关病毒（adeno-associated vires type 2，rAAV-2）作为一种大有希望的基因转移载体，因能有效转导多种组织和细胞而引起了人们的高度重视。为此，本研究以研制新型HBV疫苗为目的，构建了表达HBV外膜主蛋白、大蛋白基因的rAAV-2，初步研究了其免疫原性，并探讨了表达HBV抗原基因的rAAV-2用于以树突状细胞（dendritic cell，DC）为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。 采用PCR法从PTHBV—1质粒中扩增HBV（ayw亚型）外膜主蛋白（HBsAg）、大蛋白（LHBsAg）基因；将PCR扩增产物插入rAAV-2表达质粒pSNAV中，构建重组质粒pSNAV-HBsAg和pSNAV-LHBsAg；用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK—21细胞中，G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因细胞系BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg；用具有rAAV包装功能的重组单纯疱疹病毒（HSV1-rc/ΔUL2）感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg，纯化后得到rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg；用高效液相色谱仪（HPLC）检测和SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测了rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg的纯度；以点杂交方法检测重组病毒的物理滴度；ELISA检测混合细胞系博士论文:，、HB、，卜膜主蛋。、、蛋。、重组腺，关病毒的构减巍免。性研究BHK一HBsAg和BHKLHBsAg中表面抗原（HBsAg）的表达，rAA认HBsAg和rA戌认LHBsAg在BHK一21细胞和293细胞中的表达。结果表明，H卫LC分析显示主峰为总面积大于99%;SDS一PAGE电泳结果显示3条特征性条带，其间的杂蛋白量非常少;点杂交检测rA戌瞬2一HBsAg和rAA认2.LHBsAg的物理滴度分别为sxlo，‘和ZxlolZ virusp耐cles/nil（vp翔吐）;混合细胞株BHK一HBsAg中HBsAg的表达量为28.6士6.7ng乃x ro6eells，BHKLHBsAg中HBsAg的表达量为15.4士5.5 ng zsxl06eeus;rA戌认2HBs^g和rAAv-2LHBsAg感染BHK一21细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达，表达量随感染复数（伽ltiplicityofinfection，MOI）的增加而升高。提示我们已经获得了高滴度、高纯度、在体外能有效地感染培养细胞的rAAV-2一HBsAg和rAAv-2.LHBSAg，为下一步工作奠定了基础。 本文首次报道了rA戌认2载体介导HBV抗原基因用于HBV疫苗的研究。通过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲给药途径，我们观察了rA入v-2HBsAg和rAA认2.LHBsAg在小鼠体内的转导效率和诱导小鼠产生HBv抗原特异性的体液和细胞免疫反应的能力。结果显示，rAAv-2HBsAg和rAAv-2.LHBsAg通过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲途径进入小鼠体内后能有效表达HBsAg，同一给药途径，rA戌瞬2.HBsAg和rA入叭2LHBsAg在小鼠体内HBsAg的表达水平无明显差异（p>0 .05）;同一重组病毒（rA戌认2一HBsAg或rAAV一2一LHBsAg）不同给药途径之间HBsAg的表达水平亦无明显差异（p>0 .05）。重组病毒通过不同途径在小鼠体内表达的同时，可在较长时间（80天）诱导小鼠产生HBV抗原特异性的体液和细胞免疫反应:不同给药途径之间的免疫效果比较发现，肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲都能诱发机体产生HBV保护性抗体和激发CTL产生，但以尾静脉注射效果最好，腹腔注射、肌肉注射和胃饲三者之间差别不大 （p>0 .05）;在各种给药途径中，免疫反应能否出现、以及免疫反应的强度与剂量（给予的重组病毒颗粒数）有关。结果提示，基于rAAV载体的HBV疫苗，对于防止HBV感染，尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗和应用于对现有HBV疫苗无反应的患者无疑具有潜在的应用价值，值得做进一步的系统研究。 近年来，以DC为基础的免疫治疗已成为抗肿瘤和抗感染等研究的热点，本文也探讨了表达HBV抗原基因的rAA认2载体用于DC为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。首先，我们用表达报告基因一绿色荧光蛋白（GFP）基因和荧光素酶（luciferase，Luc）的rA月认2（分别简称为rAA认GFP和rAAV-Luc）感染了人外周血单核细胞来源DC以观测感染效能，在激光共聚焦显微镜观察了F仃C博士论文:表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究（fluorescein 150而Ocyanate，FITC，异硫氰酸荧光素）标记的rAA认2进入Dc的动态过程;结果显示，激光共聚焦显微镜下观察到了rAAV-2能进入DC;只有当Mol（multiplicity of infeetion，感染复数）大于1 X losvp/c ell时，乙AAV-2一lue和rA戌认2一GFP才能有效感染DC，需较高的MOI值的重组病毒才能有效感染Dc，报告基因的表达水平在MOI值为1 X 105一5 x 106vPlcell之间呈剂量依赖趋势，此后再提高MOI值并不能明显提高表达水平，感染后的DC表达水平不高。表明rAA认2可以有效感染DC，但转导效率?

二、rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能（论文提纲范文）

（1）重组腺病毒介导Survivin和GM-CSF基因修饰树突状细胞体外诱导抗血液肿瘤免疫的实验研究（论文提纲范文）

（3）rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能（论文提纲范文）

（4）表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究（论文提纲范文）

四、rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能（论文参考文献）

• [1]重组腺病毒介导Survivin和GM-CSF基因修饰树突状细胞体外诱导抗血液肿瘤免疫的实验研究[D]. 朱雄鹏. 福建医科大学, 2006(12)
• [2]第三军医大学学报 2004年第26卷总目次[J]. 冷怀明. 第三军医大学学报, 2004(24)
• [3]rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能[J]. 胡贵方,俞守义,吴小兵,尹芳,陈清,候云德. 第三军医大学学报, 2004(01)
• [4]表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究[D]. 胡贵方. 中国人民解放军第一军医大学, 2003(03)

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