一、直接消化法分离单克隆贴壁细胞（论文文献综述）
黄磊[1]（2021）在《脐带间充质干细胞及其外泌因子干预白消安致雄性小鼠生殖损伤的实验研究》文中提出目的:探讨人脐带间充质干细胞及其人脐带间充质干细胞分泌因子注射对白消安导致的无精子症模型小鼠的治疗作用。方法:1.人脐带间充质干细胞（HUMSCs）的分离主要采用组织贴壁法获得,将分离的人脐带间充质干细胞进行成骨、成脂诱导分化和细胞表面标记物的鉴定;2.收集第四代HUMSCs体外培养无血清培养基的上清液,经过0.22μm滤器超滤得到浓缩HUMSCs分泌因子（条件培养基,CM）记为HUMSCs-CM;3.将40 mg/kg剂量白消安注射入雄性BALB/C小鼠腹腔中,对照组为生理盐水组。在注射白消安的第4周末,通过苏木素-伊红（HE）染色,观察生精小管的结构;通过荧光定量PCR检测减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3、DDX4、OCT4 mRNA相对表达量;通过蛋白质印迹实验（western-blot）检测睾丸生殖细胞之间黏附蛋白P-钙黏蛋白（P-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、细胞间黏附分子（ICAM-1）的表达;4.将40 mg/kg剂量白消安注射入雄性BALB/C小鼠腹腔中的4周末,随机分为4组:生理盐水组、白消安（busulfan）组、HUMSCs组、HUMSCs-CM组。HUMSCs组和HUMSCs-CM组通过尾静脉分别注射HUMSCs悬液200μl（1×107细胞）和HUMSCs-CM 200μl,按照每3天注射1次的频率进行尾静脉注射,连续注射4周。第8周末,通过睾丸组织苏木素-伊红（HE）染色,观察生精小管的结构;通过实时荧光定量聚合酶链反应（q PCR）来检测STRA8、TNP2、SCP3减数分裂基因mRNA相对表达量;通过蛋白质印迹实验（western-blot）检测睾丸细胞黏附蛋白P-钙黏蛋白（P-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、细胞间黏附分子（ICAM-1）的表达。结果:1.原代的HUMSCs使用组织贴壁法分离培养获得,将原代的HUMSCs利用胰酶消化法传代至第4代。镜下观察细胞排列紧密,细胞形态多样,以梭形、椭圆形为主。HUMSCs表面标记物CD90、CD44、CD45、CD29的阳性率分别为99.66%、97.40%、0.10%、94.47%。通过茜素红和油红O对成骨、成脂诱导的细胞进行染色,HUMSCs可以成功分化为钙盐颗粒和脂肪细胞;2.对HUMSCs进行体外无血清F12/DMEM培养基的培养,并收集了上清培养液HUMSCs-CM,测定蛋白浓度为0.60 mg/ml;3.将40 mg/kg剂量白消安注射到小鼠腹腔内,第4周末通过HE染色观察小鼠睾丸生精小管结构,小鼠生精小管中各级生精细胞减少严重,精子活动度减低。基底膜与生精细胞出现断层、分离,生精小管中精原细胞和支持细胞减少严重,精原细胞和精母细胞呈现空泡化;4.第4周末,白消安组（busulfan组）与对照组比较,睾丸中生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3、DDX4、OCT4基因表达明显降低（P均<0.01）;白消安组的细胞黏附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin、ICAM-1表达量明显低于对照组蛋白表达量（P均<0.01）;5.第8周末,通过睾丸组织HE染色,HUMSCs-CM组与白消安组和HUMSCs组比较,基底膜与生精细胞分离和细胞空泡化情况有所改善,生精小管中各级生殖细胞大量存在;6.与白消安组比较,HUMSCs-CM组生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3的表达水平均有增加（P均<0.01）,而HUMSCs组减数分裂基因的表达水平没有明显增加;与HUMSCs组相比,HUMSCs-CM组生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3的表达水平均有增加（P均<0.05）;7.HUMSCs-CM组与白消安组相比,小鼠睾丸生殖细胞之间的黏附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin、ICAM-1表达水平均有增加（P均<0.01）。而HUMSCs组与白消安组相比,细胞黏附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin表达水平没有显着的增加,但是HUMSCs组与白消安组相比,ICAM-1蛋白表达量有增加（P<0.05）。结论:1.使用组织贴壁法和胰酶消化法可以成功分离HUMSCs;2.HUMSCs使用无血清F12/DMEM培养基培养,收集上清液并用0.22μm的滤器超滤得到浓缩HUMSCs分泌因子;3.腹腔注射白消安抑制了减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3、DDX4、OCT4的表达和细胞粘附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin、ICAM-1的表达,导致了小鼠生精损伤;4.HUMSCs分泌因子保护了白消安导致的生精损伤小鼠,促进了生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3和细胞粘附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin、ICAM-1的表达。
吴乙时[2]（2020）在《人羊水间充质干细胞通过外泌体改善顺铂诱导的卵巢颗粒细胞损伤》文中指出研究背景恶性肿瘤一直是威胁人类健康的重要原因之一。随着检测方法的日益改进,癌症早期诊断率逐渐增加。同时,随着治疗手段的提升和药品研发的飞速发展,女性恶性肿瘤患者的生存期逐渐延长,使得化疗对卵巢功能所造成的影响日益显现出来。卵泡储备对化疗十分敏感,化疗后短期可造成卵巢功能受损,长期可致生育率降低,早绝经风险明显增加,如潮热、失眠、骨钙流失等,这些严重影响了患者的生活质量,为此与卵巢功能保护相关的研究越来越多。现有的卵巢保护措施包括:卵巢组织冻存、胚胎或卵母细胞冻存、促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）以及干细胞治疗等。其中,干细胞治疗被认为是目前最有前景的治疗方法。干细胞能够不断进行自我更新,并且具有多向分化潜能。生理情况下能够替代衰老和凋亡的细胞,保证了机体组织结构的完整以及正常生理功能的发挥。病理情况下,能够抑制炎症反应,促进组织修复,有助于受损组织结构和功能的恢复。然而,干细胞治疗也存在一定潜在风险,例如,移植的细胞可能会引起血管栓塞、遗传物质发生突变、或造成机体肿瘤的发生,同时,干细胞的应用还存在伦理上的争议等。随着干细胞旁分泌物质外泌体的发现,人们逐渐将研究重心转向了干细胞分泌的外泌体。外泌体不仅具有来源干细胞的治疗效果,与干细胞相比外泌体更加安全稳定,并且具有良好的柔韧性和较高的细胞亲和力,不存在免疫排斥反应及伦理上的争议。越来越多的研究证实外泌体参与了许多生物学过程,包括调节免疫反应、维持体内平衡、凝血、炎症、血管生成和癌症进展。这些优势使得干细胞来源外泌体成为了一种非常有前景的无细胞治疗方法,在组织再生工程中被广泛关注。近年来,干细胞来源外泌体已经在神经系统、心脏疾病、肺损伤、骨缺损以及创伤等众多疾病中表现出了很好的组织损伤修复功能,但与卵巢功能保护的相关研究极少。为此,在本研究中首次选用人羊水间充质干细胞（human amniotic fluid stem cells,hAFSc）,将其分泌的外泌体（exosomes derived from hAFSc,hAFSc-EXO）作为研究对象,探讨hAFSc-EXO在化疗所致卵巢功能损伤中的作用。研究目的寻找合适的分离方法制备hAFSc-EXO;建立顺铂诱导的卵巢颗粒细（GCs）体外损伤模型;探讨hAFSc-EXO在顺铂所致卵巢功能损伤中的作用,为进一步研究干细胞分子作用机制奠定基础。研究方法:第1部分:hAFSc-EXO的分离与鉴定1.收集孕中期孕妇的羊水,通过细胞形态进行分选,分离培养,获得纯化的hAFSc;2.流式细胞术检测hAFSc表面干细胞标志物。采用Western blot检测P3、P8代hAFSc表面Oct4、Nanog和SOX-2表达情况,评估不同代数hAFSc的干性;3.分别应用常规超速离心方法、浓缩后超速离心方法以及SBI外泌体提取试剂盒三种方式提取hAFSc-EXO,透射电镜下观察;4.Western blot检测外泌体富集蛋白的表达情况。第2部分:大鼠GCs的原代培养和顺铂诱导的体外损伤模型的建立1.应用孕马血清促进小月龄大鼠排卵,提取原代GCs;2.结晶紫染色观察GCs形态;3.免疫荧光染色鉴定GCs表面FSHR的表达;4.结晶紫染色观察不同浓度顺铂对GCs的损伤程度;5.CCK8评估顺铂对GCs增殖的影响,建立稳定的体外细胞损伤模型。第3部分:hAFS-EXO对顺铂诱导的GCs损伤的保护作用根据培养条件和作用试剂的不同,将实验对象分为3组:对照组、顺铂组和hAFSc-EXO组。对照组应用正常培养基培养细胞,加入无菌PBS。顺铂组应用含2.5mg/L顺铂的培养基培养细胞,加入无菌PBS。hAFSc-EXO组应用含2.5mg/L顺铂的培养基培养细胞,加入hAFSc-EXO与细胞共孵育。1.CCK8检测顺铂组和hAFSc-EXO组GCs增殖受抑制程度,从细胞增殖水平评估hAFSc-EXO对顺铂诱导的GCs损伤的影响;2.TUNEL法检测,从细胞凋亡角度评估hAFSc-EXO对顺铂诱导损伤的GCs的影响;3.Western blot检测3组细胞FSHR、Bax和Bcl-2表达情况,进一步评价hAFSc-EXO在卵巢功能、细胞凋亡中所起到的作用。研究结果:第1部分:1.通过细胞形态进行分选,从人孕中期羊水中可以获得纯化的h AFSc,显微镜观察可见细胞呈细长的纺锤形,细胞排列紧密;2.流式细胞术结果表明分离得到的h AFSc具有较强的干性,能够表达干细胞标志物CD29、CD90、SSEA、Oct3/4,同时具有低免疫原性,仅表达主要相容性复合体（MHC）I类分子蛋白HLA-ABC,不表达MHC II类分子蛋白HLA-DR,且不表达造血干细胞分子标志物CD34和CD45;3.Western blot结果显示P3、P8代h AFSc表面干细胞标志物Oct4、Nanog和Sox-2表达无明显差异,说明随着h AFSc不断扩增和传代,h AFSc仍然具有很好的干性;4.应用超速离心法,可以从无血清外泌体培养基中分离获得h AFSc-EXO,于透射电镜下观察,h AFSc-EXO为直径30-100nm的圆盘状小囊泡,具有典型的外泌体形态;5.分离提取的外泌体能够表达外泌体富集蛋白CD9、TSG101和LAMP1,h AFSc也可以表达同种蛋白,说明我们从培养基中分离获得的外泌体来自于h AFSc。第2部分:1.显微镜下观察,从大鼠体内分离提取的GCs具有和以往研究相同的形态,细胞呈多角形或星形,可见伪足,结晶紫染色结果相同;2.免疫荧光染色细胞核被染成蓝色,细胞核以外能够表达FSHR的部位被染成红色,结果发现细胞被染成弥漫的红色,说明GCs内的FSHR呈高表达,细胞活力良好;3.正常完全培养基培养48h,结晶紫染色见GCs生长旺盛,细胞融合达100%。2.5mg/L顺铂作用细胞48h,孔内的细胞减少,部分细胞坏死脱落。5mg/L顺铂作用48h,GCs坏死脱落明显;4.应用CCK8检测2.5mg/L和5mg/L顺铂对GCs增殖的抑制情况,结果两组细胞增殖均受到抑制,后者对细胞增殖抑制更加明显。2.5mg/L顺铂组24h增殖抑制率为30.69%±1.53%,48h增殖抑制率为48.86%±1.93%,5mg/L顺铂组24h增殖抑制率为54.69%±1.62,48h增殖抑制率为70.80%±1.96%。第3部分:1.2.5mg/L顺铂作用GCs 48h,CCK8检测各组细胞增殖抑制率,h AFSc-EXO组细胞增殖受抑制情况明显减轻,h AFSc-EXO组细胞增殖抑制率为38.4%±2.9%,顺铂组细胞增殖抑制率为49.7±1.9%;2.h AFSc-EXO组和顺铂组用含2.5mg/L顺铂培养基培养细胞48h后进行TUNEL检测,顺铂组中可见大量的凋亡细胞,而h AFSc-EXO组中凋亡的细胞很少;3.Western blot结果显示,与对照组相比,顺铂组和h AFSc-EXO组GCs的FSHR表达减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达增高,说明顺铂造成两组细胞功能受损,细胞凋亡增加。与顺铂组相比,h AFSc-EXO组GCs的FSHR、Bcl-2表达水平更高,Bax表达水平更低,说明h AFSc-EXO减轻了顺铂对GCs的损伤,抑制了细胞凋亡。研究结论1.通过细胞形态学分选,获得的h AFSc干性强,免疫原性低,且不具有造血干细胞成分;2.应用常规超速离心方法获得的h AFSc-EXO含量较多,杂质较少;3.用2.5mg/L顺铂可以建立稳定的GCs损伤体外模型;4.h AFSc-EXO能够减少顺铂诱导的大鼠GCs凋亡,降低顺铂对GCs增殖的抑制作用,改善卵巢功能。
高子茏[3]（2020）在《补骨脂素联合TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究》文中指出目的:建立有效的骨髓干细胞培养及鉴定体系;探索补骨脂素对于骨髓间充质干细胞的最佳生长浓度;观察补骨脂素联合转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化的作用。为细胞组织工程技术治疗大鼠膝关节软骨损伤的动物实验提供实验基础,进而探索中药在组织工程修复技术中的潜力和实用价值;同时为补骨脂“益肾气、强筋骨”的中医功效提供可靠基础实验依据。方法:实验一:对SD大鼠骨髓间充质干细胞进行提取、纯化及鉴定:采用大鼠股骨全骨髓提取+细胞贴壁法分离、提取大鼠骨髓间充质干细胞,对大鼠BMCS进行体外培养及扩增;通过研究其形态结构、流式细胞术共同鉴定。实验二:配置不同浓度梯度的补骨脂素培养液培养骨髓间充质干细胞,用CCK-8法检测含不同浓度补骨脂素培养液对细胞生长的作用。实验三:补骨脂素体外联合转移生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。1.体外诱导及分组,设置正常对照组（LG-DEME、10%FBS、双抗）,补骨脂素组（10umol/L补骨脂素、LG-DEME、10%FBS、双抗）,补骨脂素联合TGF-β1组（10umol/L补骨脂素、10ng/m LTGF-β1、LG-DEME、10%FBS、双抗）,阳性诱导组（10ng/m LTGF-β1、LG-DEME、10%FBS、双抗）。14d后,光学显微镜观察诱导后的细胞形态,进行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色;运用RT-PCR技术检测软骨分化标记基因Ⅱ型胶原和Sox9的m RNA表达情况;采用Western-blot检测Ⅱ型胶原蛋白和Sox9的表达量。结果:1.光镜观察原代培养后首次换液,去除未贴壁细胞,大部分细胞呈梭型、三角形,小部分呈圆形。代后细胞纯化,形态均一,杂质细胞极少见。2.骨髓间充质干细胞流式细胞学鉴定显示实验所培养的细胞广泛高度表达CD90、CD44,而极少表达CD43、CD45。3.CCK-8法检测不同浓度的含补骨脂素完全培养基均可促进骨髓间充质干细胞生长增殖,尤以浓度为10umol/L的补骨脂素完全培养基效果最佳。4.骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向诱导后鉴定:4.1倒置显微镜观察:诱导两周骨髓间充质干细胞后体积增大,表现为多边形、三角形、星形,有多个突起。4.2 II型胶原免疫细胞化学染色:正常对照组未见阳性细胞,其余3组均可见阳性细胞,胞浆呈棕红色。4.3 Western-blot结果:与正常对照组相比,其余3组Ⅱ型胶原和Sox9的表达增高（P<0.05）,其中联合组效果最佳（P<0.01）;与补骨脂素组和阳性诱导组比较,联合组的Ⅱ型胶原的表达均增高（P<0.05）。4.4 RT-PCR结果:与正常对照组相比,其余3组Ⅱ型胶原基因和Sox9基因表达增高（P<0.05）,其中联合组效果最佳（P<0.01）;与补骨脂素组和阳性诱导组比较,联合组的Ⅱ型胶原基因的表达均增高（P<0.05）。结论1.全骨髓贴壁法贴壁效率高、首次传代时间短、持续增殖能力及细胞活力强;1.CD44、CD90是两种MSCs重要的表面标志物,BMSCs的CD44、CD90表达阳性。因此可作为鉴定BMSCs的一种实用方法。3.不同浓度和时间段的补骨脂素的刺激,BMSCs的增殖得到了增强,以10μmol/L情况下效果最好。4.补骨脂素联合TGF-β1能促进大鼠骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达,诱导其向软骨细胞分化。且效果要优于单独使用补骨脂素效果。为进一步将中药用于组织工程技术治疗大鼠骨关节炎的在体实验提供了实验基础。
徐筑秋[4]（2020）在《肌源性干细胞改良培养法及构建肌源性人工神经导管修复小鼠坐骨神经缺损的实验研究》文中指出研究背景周围神经损伤是整复外科常见的疾病之一,主要来源于物理创伤、肿瘤、代谢性疾病等,每年全球有超过五十万患者忍受着周围神经损伤所带来的功能障碍。周围神经相比于中枢神经系统,有更强组织再生能力,然而其功能恢复率仍不尽人意。在临床上,经过手术修复的周围神经缺损,功能恢复率低于40-50%[1,2]。部分神经断伤中,神经可通过手术无张力直接缝合,然而更多的神经断伤中出现神经组织缺损,损伤两段无法直接缝合,需通过移植物桥接修复。目前自体神经移植（ANG）作为手术治疗周围神经缺损的金标准,但由于移植物来源有限、供区功能受损、移植后神经瘤及瘢痕形成等,均影响其临床应用[3]。寻找ANG的替代方法,提高功能恢复效率,成为整复外科及组织工程领域的热点及难点问题。构建组织工程神经桥接修复周围神经缺损,是目前的主要方向之一。组织工程神经主要由神经导管和种子细胞及其他添加因子构成,神经导管的来源包括自体组织和人工材料[4]。本课题组携带少量肌纤维的小鼠腹外斜肌外膜通过显微外科技术制备成中空神经导管,并成功通过桥接移植肌外膜神经导管修复了小鼠坐骨神经缺损。肌外膜组织易于获取,供区肌肉无功能损伤,考虑到单纯的肌外膜组织生物学力强度不足支撑管腔形状,且往往与肌纤维组织链接紧密难以彻底分离,因此我们获取肌外膜时会附带少量肌纤维,这些平行排布的肌纤维对神经轴突的延伸具有一定导向性,且其中含有的多种活细胞成分、细胞因子以及纤维支架结构等均使其成为较为理想的神经导管材料来源[5]。我们希望通过在肌外膜导管内添加种子细胞,以提高其修复能效,探究更深层的作用机制。在挑选适当种子细胞的过程中,我们注意到了骨骼肌来源干细胞（MDSCs）,MDSCs是来源于骨骼肌组织中,具有跨胚层多向分化潜能的干细胞。研究证实,MDSCs在体外通过诱导可向肌细胞、雪旺细胞、成骨细胞、血管内皮细胞以及造血细胞等方向分化[6-8],即具有多胚层分化的潜力,同时分泌多种细胞生长因子如IGF、NGF、b-FGF、VEGF[9,10]等。而在体内研究中,通过移植MDSCs则可促进肌肉、肌腱、血管、骨、软骨及神经等组织再生[8,11,12]。考虑到肌外膜导管与MDSCs来源的一致性,我们猜想将MDSCs作为种子细胞,与肌外膜神经导管共同构建肌源性组织工程神经,可以相互促进对损伤神经的促再生作用,并且将进一步探索MDSCs作为种子细胞在组织工程领域的应用潜力。研究目的:1.寻找并获取肌源性人工神经的种子细胞2.将肌外膜导管与种子细胞结合,构建肌源性人工神经导管,并从组织学、神经功能等方面评价其修复效率3.分析种子细胞相关促进周围神经修复的具体机制实验方法和结果:1.改良传统的多次贴壁培养法,寻找更合理的肌源性干细胞获取途径方法:根据既往文献,尝试通过传统多步贴壁法获取MDSCs,发现这种方法获取细胞效率低下,难以满足研究需要。因此我们通过改变培养基及培养环境等方式,提出了改良多步贴壁培养法,并从细胞形态、细胞增殖曲线、细胞相关标记物鉴定等方面评价了两种培养方法。结果:改良培养法能减少重复贴壁的时间,更为高效、简便地获取MDSCs。两种方法所得MDSCs均表达相关肌源性干细胞标记物,且随着重复贴壁过程,相关标记物阳性率逐渐升高。2.对骨骼肌来源的不同细胞亚群成神经分化能力进行评估方法:骨骼肌组织消化培养可得到多种不同的细胞群,其相关细胞特性具有较大差异,根据细胞贴壁时间的不同可通过多步贴壁将不同细胞群分开。我们将不同贴壁时间的细胞群进行成神经分化诱导,随后通过细胞形态学、免疫荧光染色、Real—time PCR等方法评价不同细胞群的成神经能力,寻找更合理的肌源性人工神经种子细胞。结果:改良培养法所得末次贴壁细胞群（PP2）相比前期贴壁的细胞群（PP1）在成神经诱导处理后,形态学特征改变更显着,神经相关蛋白的表达量更高,因此PP2比PP1具有更强的成神经分化能力,成为后续实验的种子细胞。3.构建肌源性人工神经修复小鼠坐骨神经缺损方法:通过手术切除小鼠一侧坐骨神经3mm,形成约5mm长的神经缺损。取小鼠腹外斜肌外膜,通过显微外科技术构建约7mm长,内径0.7mm的肌外膜导管,桥接修复神经缺损。随后在管腔内注入混合GFP—MDSCs的Matrigel,支撑管腔形态,对照组仅注入Matrigel不添加MDSCs。结果:成功通过显微外科技术构建肌源性人工神经,桥接修复小鼠坐骨神经缺损模型,术后实验动物均情况良好。4.对肌源性人工神经的修复效率进行评价方法:修复手术后,我们每两周对小鼠的坐骨神经指数（SFI）进行测量,同时还通过Von Frey实验评估痛触觉的恢复情况。术后第四周和第八周,分别取材,对再生神经进行免疫荧光染色、masson染色、甲苯胺蓝染色、透射电镜等组织学实验,分别从神经功能学及组织学方面评价其坐骨神经再生情况。结果:在术后八周时,两组实验动物坐骨神经均表现出不同程度的再生。添加了 MDSCs的实验组,其坐骨神经指数恢复曲线、痛触觉评价实验等,均显着优于不添加MDSCs的对照组,腓肠肌的去神经萎缩情况也更轻微。在组织学检测中,实验组的再生髓鞘厚度及有髓神经纤维直径均显着大于对照组,WB检测也显示实验组相关髓鞘蛋白表达量更高。5.分析MDSCs促进坐骨神经再生的相关机制方法:根据添加的MDSCs来源GFP小鼠,表达绿色荧光的特性,我们在术后四周及八周时取材,通过免疫荧光染色及对GFP阳性细胞的观察,对移植后的MDSCs进行示踪,分析其对坐骨神经修复的作用及相关机制。结果:根据GFP阳性细胞在不同时间点的分布情况,我们发现术后四周时,移植的GFP—MDSCs可以和肌外膜导管融合,分化构成肌纤维组织;术后八周时,可分化形成类髓鞘结构包绕再生神经轴突,此外还可分化形成类新生血管结构,由此促进损伤后坐骨神经的再生过程。研究结论:改良多步培养法可以便捷、高效的获取MDSCs,并且可以有效将肌源性细胞群分开,各细胞群在形态学、细胞生理特质、标记物表达情况及分化能力等方面均具有显着差异。而MDSCs作为种子细胞添加到肌外膜导管中修复小鼠坐骨神经缺损,其多向分化能力可以促进再生轴突成熟化、帮助新生髓鞘和血管形成,从而帮助小鼠运动及感觉功能恢复,提高肌外膜神经导管的促神经修复效能,是一种极具潜力的神经组织工程种子细胞。
唐琳[5]（2020）在《人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究》文中进行了进一步梳理目的建立小鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）系作为细胞模型,采用RNA-seq技术结合生物信息学手段,分析人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）对小鼠骨髓EPCs增殖影响的差异表达基因及其主要意义,探讨人参皂苷Rg1对小鼠骨髓EPCs促增殖作用的分子机制,为利用人参皂苷Rg1治疗内皮损伤性疾病提供分子生物学水平依据,同时寻找促进EPCs体外生长的关键靶点,为培养数量充足、富有活力的EPCs提供新思路。方法1.采用全骨髓差速贴壁培养法与二次酶消化法相结合,分离和纯化小鼠骨髓EPCs。通过形态学观察、细胞表面抗原表达率检测,进行所获EPCs的细胞鉴定。2.在EPCs的传代培养过程中,选择增殖能力强的细胞,通过有限稀释培养获得单克隆细胞系,并进行传代培养扩增。通过形态学观察、生长特性观察、细胞表面抗原检测、核型分析、体外成血管实验,进行所建细胞系MBMME2的鉴定。3.取小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞,每种细胞分为7个组,即4个人参皂苷Rg1处理组（终浓度分别为5、10、15、20μmol/L）,空白对照组、溶剂对照组（1.25‰乙醇）和阳性对照组（10-8μmol/L雌激素）,培养96 h,用MTT法检测细胞增殖水平。取小鼠骨髓EPCs传代细胞,按上述分为7个组,培养3周,观察集落形成能力。以上每种细胞分为10μmol/L人参皂苷Rg1组和溶剂对照组,培养96 h,用流式细胞术进行细胞周期分析。4.将MBMME2细胞分为4个组,即3组人参皂苷Rg1处理组（终浓度分别为5、10、20μmol/L）和溶剂对照组,培养96 h,收集总RNA样本,构建cDNA文库、HiSeq测序,建立转录组数据库。经差异表达分析,筛选出差异表达基因（DEGs）,并以DEGs为对象进行基因功能注释、信号通路富集分析,以及蛋白质互作网络分析。根据RNA-seq分析结果,选出20个DEGs进行RT-qPCR验证。结果1.分离和纯化所获小鼠骨髓内EPCs贴壁生长良好,细胞多为短梭形或椭圆形。细胞传代接种后,早期形成集落,逐渐长大,而至汇合。较大集落中心的细胞重叠,外围细胞为单层,形态清晰。单层细胞密集时,呈典型的铺路石样排列。所获EPC传代细胞的表面抗原阳性细胞率检测显示,CD90为97.1%,CD133为83.4%,CD34为90.8%,CD29为23.5%,CD45为8.8%。2.本研究建立的细胞系MBMME2为连续传代细胞系,具有EPCs的一般生物学特征。细胞贴壁生长速率高,对血清的依赖性低,5%FBS的生长培养基能维持细胞的快速增殖。细胞增殖指数为44.8%～47.9%。流式细胞术检测显示,CD90、CD133、CD34、CD31和CD45的阳性细胞率依次为99.7%、36.4%、96.8%、97.5%和0.1%,并得到细胞免疫荧光染色结果的支持。染色体核型多为三倍体。体外成血管实验显示,细胞能排列成多个管横截面样的网络状结构。本细胞系传代方便,大集落和融合层上浮的细胞即能接种培养。3.在人参皂苷Rg1浓度为5～20μmol/L的条件下培养96 h后,小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞的MTT实验结果显示,两种细胞的吸光值均随人参皂苷Rg1浓度增高表现为先升后降。10μmol/L人参皂苷Rg1组的MTT吸光值最大,5～15μmol/L范围内各组的MTT吸光值均显着高于对照组,20μmol/L浓度组与对照组之间的吸光值差异无显着性意义。集落形成实验显示,5～20μmol/L人参皂苷Rg1各组的EPC集落生成能力都显着高于对照组;10μmol/L组的集落生成率最高,显着高于其它各组。10μmol/L人参皂苷Rg1组的细胞增殖指数显着高于对照组。4.RNA-seq数据显示,与对照组相比,3个人参皂苷Rg1处理组都有许多基因显着差异表达。DEGs功能富集分析表明,DEGs主要与细胞通讯、分子功能调控、发育过程、细胞膜受体、细胞外基质、离子转运等相关,涉及的主要信号通路包括细胞周期、PI3K-Akt、Wnt、MAPK、雌激素、细胞分化等通路。RT-q PCR结果表明,Celsr3、Mapk4、Col3a1、Nos3、Mmp9、Cdkl3、Notch1、Grk4、Bnip3、Mapk7、Mapk11、Mapk8、Stat5a、Gper1、Bnip1、Cdk20基因的表达显着上调,显着下调P21、Casp12、Casp4、Casp6的表达显着下调,支持RNA-seq的结果,这些基因与细胞凋亡和增殖调控等功能密切相关。蛋白互作网络分析显示,Cdc20、CDK4、CDK6、P21、Bub1b等差异基因编码的蛋白处于一些信号转导网络中的重要位置,这些网络主要与细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡、细胞分化及癌症等相关。结论1.采用细胞克隆选择和长期自然传代培养相结合,首次成功建立小鼠骨髓内皮祖细胞系MBMME2。2.在体外培养条件下,人参皂苷Rg1能促进小鼠骨髓内皮祖细胞传代细胞及其细胞系细胞的增殖,并呈明显的浓度依赖性;浓度过高时,其促增殖作用减弱。3.转录组研究揭示,人参皂苷Rg1对MBMME2细胞体外生长的影响机制涉及许多基因表达的上调和下调,这些基因主要参与Jak-Stat、MAPK、Wnt、PI3K-Akt、细胞分化及雌激素等信号通路。
辛道[6]（2020）在《二甲双胍通过抑制IL-6信号通路下调食管鳞癌细胞PD-L1表达的机制研究》文中研究指明背景及目的根据国家癌症中心最新公布的全国癌症统计数据,2015年间,全国共新发恶性肿瘤约392.9万例,发病率为285.83/10万,0-74岁累积发病率为21.44%,死亡率为170.09/10万。其中,我国发病率排前五名的肿瘤依次为肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌与肝癌,死亡率前五名则依次为肺癌、肝癌、胃癌、食管癌与结直肠癌。全球大约有半数食管癌发生在中国,中国食管癌患者病理类型以鳞状细胞癌为主。绝大多数患者会经历复发或转移,对于晚期食管癌患者,首选全身性化疗,然而由于化疗耐药及剂量限制性毒副反应,目前我国存在大量未被满足治疗的患者人群。因此,急需改进现有治疗措施,特别是寻找新型治疗模式,对于改善我们国家食管癌患者生存预后状态,具有重要现实意义。近几年来肿瘤免疫疗法已成为肿瘤治疗领域的焦点。美国免疫学家詹姆斯·艾利森（James Allison）和日本生物学家本庶佑（TasukuHonjo）凭借“发现负性免疫调节治疗肿瘤的疗法”获得了 2018年诺贝尔生理学或医学奖。与直接杀伤肿瘤细胞的传统治疗手段不同,肿瘤免疫疗法是利用人体自身免疫系统对肿瘤进行杀伤。其中,以PD-1/PD-L1单克隆抗体为代表的免疫检查点抑制剂在恶性黑色素瘤、肺癌、肠癌等诸多实体瘤中已被证实疗效确切,亦有多项临床试验结果证实,PD-1抗体在食管癌患者中具有可观疗效。最新NCCN指南指出,对于伴有微卫星高度不稳定/错配修复基因缺失（MSI-H/dMMR）的食管癌患者,抗PD-1抗体哌姆单抗可应用于二线治疗或后续治疗;对于PD-L1表达阳性的食管癌患者,哌姆单抗可作为三线方案选择。作为肿瘤免疫治疗的重要组成部分,PD-1抗体为广大患者带来明显生存获益,但也同时发生了许多耐药现象,而与治疗敏感以及耐药相关的具体分子机制仍然没有完全阐明,并已成为该领域研究重点。一直以来,研究人员致力于寻找PD-1/PD-L1抗体应用的疗效预测指标。有研究报道,PD-L1阳性率增加,通常与较好疾病控制率相关。但不同临床研究也存在不一致结果。在一些PD-L1表达阴性的晚期食管鳞癌患者中,接受PD-1抗体治疗后,同样观察到部分缓解与病情控制,提示其他机制参与PD-1抗体治疗敏感性及耐药机制调节。再者,肿瘤突变负荷（Tumor mutation burden,TMB）增高也与PD-1抗体治疗敏感性相关。Checkmate-026临床试验宣告失败后,研究人员采用肿瘤突变负荷TMB作为标志物对Checkmate-026试验进行回顾性研究,结果发现TMB作为标志物能更好地筛选出获益人群,在突变负荷高的患者群中,免疫治疗客观缓解率可达到47%（化疗组为28%）,无进展生存期（Progression-free survival,PFS）为9.7个月,显着优于化疗组（5.8个月）,但对于突变负荷低的患者群,化疗则优于免疫治疗。研究同时发现,肿瘤局部浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocyte,TIL）增加,免疫治疗效果增强,局部CD8+T细胞数量及比率增加的人群,接受PD-1抗体治疗后获益率更高。更多免疫治疗疗效预测相关研究正在持续进行当中。本研究目的在于从基础实验阐明二甲双胍调控食管鳞癌细胞PD-L1表达及改善局部CD8+T细胞杀伤肿瘤功能的机制,证实二甲双胍联合PD-1抗体治疗食管鳞癌的增效机制,为创新食管鳞癌免疫治疗新模式,改善食管鳞癌患者预后提供依据。资料及方法利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库分析食管癌中IL-6与PD-L1基因表达相关性;选取食管鳞癌细胞系KYSE-450和TE-7进行后续实验研究。通过酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）实验检测二甲双胍对食管鳞癌细胞IL-6分泌水平的影响;通过荧光定量PCR、蛋白印迹实验以及免疫荧光等实验方法,检测二甲双胍对IL-6下游信号分子JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平以及PD-L1转录水平及表达量的影响;同时设置IL-6阳性对照组,进一步证实二甲双胍调节食管鳞癌PD-L1水平与IL-6-JAK2-STAT3信号通路相关。通过敲除食管鳞癌细胞系AMPK分子或选用AMPK特异性阻断剂Compound-C,阻断AMPK-ACC信号通路,证实二甲双胍调控食管鳞癌细胞系PD-L1表达,与二甲双胍经典通路AMPK无关。分离外周血单个核淋巴细胞PBMCs,分别与经二甲双胍或IL-6预处理的食管鳞癌细胞系共培养,模拟肿瘤免疫微环境,采用ELISA方法检测T细胞IL-2分泌水平,western-blot方法检测T细胞ERK蛋白磷酸化水平,证实各预处理组T细胞激活水平改变。同时,行T细胞杀伤实验,证实二甲双胍下调食管鳞癌PD-L1表达后,局部T细胞杀伤肿瘤细胞功能增强。选取雄性NPI小鼠,尾静脉输注PBMCs,进行免疫人源化重建。同时,构建含荧光素酶转染细胞系TE7-luc,通过皮下接种,构建食管鳞癌移植瘤模型。实验分4组,每组小鼠5只,分别给以生理盐水、二甲双胍、PD-1抗体及联合用药,采用活体荧光成像系统观察移植瘤生长情况,免疫组化观察移植瘤PD-L1表达。同时,采用石蜡切片的免疫组织化学染色方法,检测2018年于郑州大学第一附属医院胸外科行手术治疗的食管癌组织切片,结合病史分为服用二甲双胍组与对照组,比较两组组织标本PD-L1表达水平。结果1.TCGA数据分析显示,食管癌组织中IL-6与PD-L1表达正相关。食管癌术后标本检测显示,服用二甲双胍与组织PD-L1低表达相关。2.细胞学水平检验显示二甲双胍降低食管鳞癌细胞系IL-6转录及细胞因子分泌,降低JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平。3.二甲双胍能够降低食管鳞癌细胞系PD-L1表达。4.食管鳞癌细胞与外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs）共培养,二甲双胍预处理组T细胞激活水平更高,T细胞杀伤功能最强。5.动物实验证实二甲双胍下调PD-L1表达,联合二甲双胍与PD-1抗体,治疗效果最佳。结论二甲双胍通过阻断食管鳞癌细胞IL6-JAK2-STAT3信号通路,下调PD-L1表达,这一作用使得局部T细胞激活水平及杀伤肿瘤细胞功能变强,增强抗肿瘤免疫反应。动物实验证实,联合应用二甲双胍与PD-1抗体,能够增强抗肿瘤功效。为增强免疫治疗效果,改善食管鳞癌患者预后,创新食管鳞癌治疗模式提供新的理论依据。
张伟[7]（2020）在《阻断CTLA-4免疫抑制分子增强膀胱癌CD8+T淋巴细胞抗肿瘤效应的实验研究》文中提出恶性肿瘤仍是全球范围内最主要的死亡原因之一。几十年来,恶性肿瘤的治疗因为缺乏可靠有效的治疗手段使得肿瘤患者的生存受到了挑战。术后复发转移或不可切除的进展期肿瘤,必须依靠放化疗等传统手段进行治疗,但临床疗效往往有限,并伴随着严重的不良反应。肿瘤免疫治疗的进步和发展,使得利用免疫疗法治疗癌症变得越来越重要。研究人员开发了多种激活免疫反应的策略,其中IL-2是最早的免疫增强药物之一,因其能够促进T细胞的增殖和分化,增强T细胞功能,而获批用于肾癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤的治疗,成为最早的肿瘤免疫治疗方法之一。但是,第一代免疫疗法的局限性在于其低应答率和高不良事件发生率。寻找可靠的免疫治疗策略及方法,通过调节T细胞活化和增殖来增强免疫治疗的疗效成为肿瘤免疫治疗的主要研究方向。近年研究发现,免疫检测点在T细胞活化及杀伤过程中,发挥着重要的调节功能,其中细胞毒性T淋巴细胞抗原4（Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4,CTLA-4）、程序性死亡受体-1（programmed cell death-1,PD-1）、IDO-1、Tim3等免疫抑制分子对T细胞的免疫调节功能越来越受到重视。有研究证实,T细胞活化的早期出现CTLA-4的表达升高,与其配体B7结合而发挥竞争性抑制,使B7-CD28共刺激信号通路减弱,从而导致“免疫刹车”效应,阻碍了T细胞的活化。T细胞活化的同时,INF-γ大量释放,导致T细胞表面的PD-1大幅升高,与其配体PD-L1结合造成“T耗竭”,从而导致T细胞活化、增殖及杀伤功能的降低。因而,近年来对程序性死亡因子1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）的研究进展迅速。针对免疫检查点的研究及治疗是目前免疫治疗研究的热点[1]。两种T细胞共抑制分子CTLA-4和PD-1的发现使得癌症免疫疗法和靶向疗法在如何治疗癌症,尤其是在晚期疾病患者中带来了革命性的变化[2]。因而大量临床前和临床研究围绕着PD-1和CTLA-4开展,其中以PD-1为靶点的免疫治疗在抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植等方面均有较深入的研究。以CTLA-4为靶点的免疫治疗,在抗肿瘤免疫等方面也表现出显着的治疗作用。随着CTLA-4和PD-1阻滞剂的深入研究及其在癌症治疗中的成功,靶向PD-1及CTLA-4的抗体类药物迅速出现并获得FDA批准上市,逐渐应用于多种恶性实体肿瘤的临床治疗[3]。CTLA-4是成功在临床上应用靶向的免疫检查点之一。针对CTLA-4的单克隆抗体靶向药物（ipilimumab）已获批用于治疗黑色素瘤等疾病,后续的研究表明在肺癌等多种肿瘤治疗中同样有效。迄今为止,已批准7种靶向CTLA-4/PD-1的药物用于治疗各种类型的癌症。众所周知T淋巴细胞是人体主要的免疫细胞,其中CD4+T细胞主要表达于辅助T细胞（Th）,被称为辅助性T细胞（helper T cell）,而CD8+T细胞被称为细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell,CTL）是通过细胞裂解和细胞凋亡的方式特异性杀伤靶细胞而发挥着细胞毒性T细胞的作用,与细胞免疫以及抗肿瘤效应有关。CD4+T细胞的主要功能是辅助CD8+T细胞消灭体内的病毒、细菌以及异常发生的肿瘤细胞。大量研究表明PD-1阻断剂在可增强CD4+和CD8+T细胞反应。本研究的目的在于,采用抗体阻断CTLA-4免疫抑制分子是否能有效的增强细胞毒性CD8+T淋巴细胞的抗肿瘤效应。为此我们通过研究膀胱癌患者的外周血中T细胞PD-1和CTLA-4表达特点,检测PD-1和CTLA-4是否在活化的T细胞上存在高表达。随后,采用抗体阻断外周血T细胞表面的免疫性负调节分子CTLA-4,测试抗体封闭后能否增强细胞免疫反应和细胞杀伤毒性,验证阻断细胞毒T淋巴细胞表面CTLA-4分子的表达,（cytotoxic T cell,CTL）是否能增强其在体外的杀伤效率和皮下移植瘤模型的抗肿瘤效果。第一部分免疫抑制分子PD-1和CTLA-4表达特征的实验研究目的:检测PD-1和CTLA-4两种共抑制分子在膀胱癌患者和健康志愿者的外周血单核细胞的表达特征。方法:1.分别采集膀胱癌患者（n=62）及健康志愿者（n=32）外周血50ml,肝素抗凝并PBS稀释1倍;采用Ficoll法离心获得PBMC;吸出白膜层（PBMC）置于50ml离心管中,加入PBS,800×g、10min离心洗2次。在洗出血小板后获得PBMC。经分离培养,贴壁细胞培育DC细胞,检测DC表型,悬浮细胞培育CIK细胞。2.CD3抗体刺激T细胞活化。检测外周血中T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力。T淋巴细胞特异性的表达CD3,并又进一步分为CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群;3.流式检测膀胱癌患者及健康志愿者两组的PD-1和CTLA-4在CD4+和CD8+T细胞的表达特点,4.进行PD-1和CTLA-4的表达与膀胱癌患者的年龄、性别、组织学分级、肿瘤大小等临床参数的相关性分析。结果:1.膀胱癌患者中CD4+T细胞中PD-1的表达与健康的志愿者相比较无统计学差异（平均14.7%±3.5%比13.6%±4.6%,Fig.1A）。相比之下,在CD8+T细胞中PD-1的表达明显高于健康的志愿者（平均频率12.8%±4.5%比8.1%±2.9%,Fig.1B）。2.在CD4+T细胞中,CTLA-4的表达频率可与膀胱癌患者和健康献血者（Fig.1C）相比较表达无统计学差异。与此同时,在膀胱癌患者中,CD8+T细胞中的CTLA-4的表达比健康对照组的表达高（平均10.2%±3.2%比7.5%±2.8%）（Fig.1D）;3.在CD8+T细胞上的PD-1表达与任何临床参数之间没有显着的相关性。然而CTLA-4的表达与肿瘤大小和TNM分期之间有密切的相关性（表1）。结论:PD-1和CTLA-4在膀胱癌患者的外周血中CD8+T细胞的表达较健康志愿者明显升高。第二部分阻断CTLA-4的CD8+T淋巴细胞体外抗肿瘤效应的实验研究目的:检测抗CTLA-4抗体封闭后的DC-CTL对肿瘤细胞的体外杀伤效应。方法:1.采集肿瘤病人外周血,提取血中的单状核细胞,Focill方法分离,然后贴壁法分离出DC细胞和T细胞;DC细胞扩增并负载细胞株抗原,制备出DC疫苗,2.检测UM-UC-3、TCCSUP、J82、T24,5637五种膀胱癌细胞CTLA-4配体CD80/86的表达水平,选择CD80/86高表达的细胞株作为靶细胞,3.T细胞培养扩增至第7天,应用抗CTLA-4抗体封闭CTLA-4后加入DC疫苗制备CTL;CTL继续扩增2天,应用流式细胞术检测第7、14和21天CTLA-4的表达,4.制备的肿瘤特异性细胞毒T细胞（CTL）分组:第一组:未干预组CTLs（特异性细胞毒性T淋巴细胞）、第二组:生理盐水空白对照组,第三组:抗CTLA-4抗体治疗组,检测CTL的细胞增殖,每7天进行一次检测,持续时间为21天;流式检测三组细胞的CTLA-4的表达水平,5.ELISA测定法测定实验组CTL和对照组CTL的培养基中的IFN-γ和TNF-α分泌量;6.实验组及对照组行96孔板细胞体外杀伤实验;结果:1.抗CTLA-4抗体封闭后,应用流式细胞术检测第7、14和21天CTLA-4的表达,抗CTLA-4治疗组CTL较对照组CTLA-4的表达明显受到抑制,二者相比结果具有统计学上的意义（P<0.05）（图.1A）。对照组CTLA-4在CTL上的表达从9.1%增加到17.6%;在CTLA-4阻断组中,CTLA-4表达从4.1%增加到9.2%。2.对未抗体干预组CTL、空白对照组和抗CTLA-4治疗组CTL的细胞增殖,每7天进行一次检测,持续时间为21天。在培养期间,我们发现CTL的增殖不受CTLA-4阻断的影响。随着时间延长,细胞的增殖逐渐增多,不同组的细胞增殖变化无明显差异,无统计学意义（图.1B）。3.抗CTLA-4治疗组和对照组CTL的上清液中,ELISA法检测细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌能力的变化。CTLA-4阻断后的CTL产生的IFN-γ和TNF-α水平更高（图.1C）。4.在5种膀胱癌细胞UM-UC-3、TCCSUP、J82、T24、5637中检测CTLA-4的配体CD80/86表达水平,其中T24表达最高,UM-UC-3表达水平最低,不同肿瘤细胞CD80/86表达水平相比具有统计学意义（P>0.05）（图.1D）。5.抗CTLA-4抗体阻断的CTLs对T24细胞的细胞毒性显着提高,且呈剂量依赖性,CTL上的CTLA-4的抗体阻断增强细胞的抗肿瘤活性。结论:CTLA-4诱导的T细胞失活被认为是免疫抑制的一种机制,阻断CTLA-4/B7通路后增强CTL对膀胱癌细胞的抗肿瘤活性。第三部分阻断CTLA-4的CD8+T淋巴细胞体内抗肿瘤效应的实验研究目的:进一步验证抗CTLA-4封闭后的CTL抗肿瘤免疫杀伤效果,评估封闭CTLA-4后特异性CTL体内抗肿瘤效应。方法:1.动物模型建立:采用人源单个核细胞建立具有人免疫功能的SCID模型小鼠,并建立了T24细胞的异种移植模型,流式检测重建效率。免疫重建的小鼠,将5周龄雄性SCID小鼠（中国科学院）尾静脉注射4×107外周血淋巴细胞,肿瘤直径为6-9mm,建立SCID小鼠模型。2.预防试验抗-CTLA-4抗体阻断后的1×107CTLs和对照组通过尾静脉注射,然后SCID小鼠皮下移植T24细胞,剂量为1×106个细胞,悬浮于100μl PBS中（每组n=5）（图1A）。自开始接种后测量抗-CTLA-4抗体封闭组或对照CTL后小鼠的肿瘤体积（n=5）（图1B）。采用抗-CTLA-4抗体阻断或对照组CTL对肿瘤组织进行PCNA免疫组化染色（图1C）。3.治疗试验首先将T24细胞接种在SCID小鼠中。当肿瘤生长至接近100mm 3时,将小鼠随机分组,并用抗CTLA-4抗体处理的1×107个实验组CTL和对照组分别行尾静脉注射（每组n=5）。饲养条件遵循动物中心的指导方针:温度20-22℃;湿度50-70%;正常饮食,无特定病原体。每3天用游标卡尺测量肿瘤体积。27天后处死小鼠。通过计算肿瘤体积来监测肿瘤负荷。肿瘤体积计算如下:体积=（长度）×（宽度）2/2。自开始接种后测量抗-CTLA-4抗体封闭组或对照组CTL的小鼠的肿瘤体积（n=5）（图1E）。采用抗-CTLA-4抗体阻断或对照组CTL对肿瘤组织进行PCNA免疫组化染色（图1F）。通过CTLA-4抗体封闭后制备CTL进行杀伤实验。4.分组1)抗CTLA-4抗体封闭的CTL实验组;2)对照组CTL;3)（生理盐水）空白对照组。5.统计学分析数据报告为来自至少三次独立实验的平均值±标准差。使用SPSS（V13.0,Chicago,USA）进行统计学分析。通过χ2检验比较CTLA-4表达与临床参数之间的相关性。通过Student’s t-检验评估体外和体内测定中的组间差异。方差分析用于在多个组之间进行比较。P<0.05有统计学意义。结果:1.尾静脉注射单核细胞方法构建人源化SCID小鼠模型,将人源化移植瘤模型小鼠分为:CTLA-4抗体封闭组和CTL对照组,与对照组相比,抗CTLA-4抗体封闭组的肿瘤生长明显减慢,这表明被抗CTLA-4抗体封闭后肿瘤的生长出现延缓。与此同时,CTLA-4抗体实验组的PCNA阳性细胞也显着减少。2.预防性试验:接种1×107剂量的对照组CTL和抗-CTLA-4抗体封闭的CTL治疗组细胞,然后以1×106细胞的剂量皮下移植T24细胞（图.1A）,每组（n=5）。与对照组相比,抗-CTLA-4实验组肿瘤生长明显减慢,说明CTLA-4抗体延缓了T24移植瘤的潜伏期（图1B）,同时,抗-CTLA-4组中PCNA阳性细胞也明显减少（图.1C）。3.治疗性实验:与对照组相比,抗-CTLA-4治疗组的肿瘤体积明显减小,表明CTLA-4抗体封闭后在体内的抗肿瘤活性增强（每组n=5）（图1E）。同样,CTLA-4抗体封闭组CTL增殖指数PCNA及免疫反应活性也降低（图.1F）。4.CTLA-4抗体封闭组较CTL对照组对T24细胞有更强的抗肿瘤杀伤效应;CTLA-4抗体封闭组较生理盐水组对T24细胞有更强的抗肿瘤杀伤效应,二者相比具有统计学上的意义。DC-CTL组较生理盐水组有更强的抗肿瘤杀伤效应。5.ELISA法检测上清液中细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌量:CTLA-4抗体阻断后的CTL产生更高水平的IFN-γ和TNF-α（表1）。结论:1.CTLA-4抗体封闭后增强了其对膀胱癌细胞免疫反应和细胞毒性,2.CTLA-4抗体封闭后CTL在皮下异种移植的SCID小鼠模型中显示出具有更好的抗肿瘤活性。3.CTLA-4抗体封闭后的CTL产生更高水平的IFN-γ和TNF-α。4.CTLA-4抗体封闭组肿瘤生长明显减慢,说明CTLA-4抗体延缓了肿瘤的生长。
于凡[8]（2020）在《Chemerin对内皮祖细胞生物学特性及动脉粥样硬化小鼠脏器病变的影响》文中进行了进一步梳理目的近年来,脂肪因子在动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）病变发展中所起到的作用受到越来越多的关注。本研究旨在探讨chemerin对健康成人内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）生物学特性的影响,并研究其在ApoE基因敲除（ApoE-knockout,ApoE-/-）小鼠AS病变形成过程对血管及机体其他脏器的作用,以期为深入研究AS病变发展进程中相关分子机制提供的新思路。方法本研究从健康成年人外周血中分离并培养EPCs,利用流式细胞分析技术和特异性荧光染色鉴定EPCs的纯度。使用重组人chemerin蛋白及p38蛋白激酶（p38-Mitogen-Activated Protein Kinase,p38MAPK）通路特异性抑制剂刺激细胞后,采用噻唑兰（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT）法、迁移实验和流式细胞分析技术等方法检测EPCs迁移、粘附、增殖及凋亡率等生物学特性的改变。选用雄性ApoE-/-小鼠,采用高脂饮食饲养诱导构建AS模型,喂养8周后连续4周腹腔注射重组鼠chemerin蛋白及p38MAPK通路特异性抑制剂进行干预,而后继续高脂喂养4周,定期测量体重,实验结束前测量空腹血糖,检测血清及肝脏脂质参数,对主动脉根部进行病理染色以分析斑块组成和性质,对肝脏,肾脏和白色脂肪组织（White Adipose Tissue,WAT）进行苏木精-伊红染色以分析小鼠各脏器中的异常脂质积聚和炎症反应。结果研究结果显示,chemerin可以通过p38MAPK途径以时间和剂量依赖性方式部分增强EPCs的黏附和迁移能力,并降低细胞凋亡率,对细胞的增殖能力也有一定影响。在体内研究中,相较于对照组和抑制剂组的ApoE-/-小鼠,使用chemerin蛋白干预的ApoE-/-小鼠所形成的动脉狭窄更为严重（对照组为34.01±3.59%,chemerin组为35.61±6.26%,抑制剂组为30.80±3.80%）。Chemerin刺激可使ApoE-/-小鼠斑块中脂质含量增高（对照组为21.34±12.13%,chemerin组为22.46±4.12%,抑制剂组为20.90±10.88%）,且胶原蛋白含量表现为降低趋势（对照组为7.83±1.97%,chemerin组为5.67±1.14%,抑制剂组为7.42±0.60%）,但是无统计学意义。此外,外源性的chemerin可以增加肝脏和肾脏中脂质的异常积累,使得肝门静脉区域的炎性细胞聚集增大,而白色脂肪组织来源的脂肪细胞也有增大趋势。结论Chemerin可增强人EPCs的迁移、黏附能力,降低细胞凋亡率,在动物中,chemerin可增加ApoE-/-小鼠AS斑块的不稳定性,加剧AS的发生,同时可造成模型动物肝脏、肾脏中异常的脂质蓄积,特异性阻滞p38MAPK通路后,chemerin产生的作用出现减弱。
周嵘[9]（2019）在《髌下脂肪垫源干细胞应用于软骨修复的实验研究》文中研究表明研究目的关节软骨缺乏自我再生和愈合能力,软骨病损后的修复问题仍是临床上的一项重大难题。再生医学的发展带来了治疗软骨病损的希望,在一些国家和地区已经开展使用干细胞修复关节软骨的临床试验。目前这些研究仍处于摸索、试错阶段,为了提高软骨修复效果,众多研究者开始把重心投在能够优化、改善干细胞治疗功能的策略上,包括干细胞的来源、预处理以及辅助材料上。本研究目的旨在评价IPFP-SCs作为干细胞来源用于修复软骨的可行性,并从PRP的优化选择和细胞分离途径两个方面分别进行研究,探讨IPFP-SCs修复关节软骨的方法,为临床应用提供思路和参考。研究内容及结果本实验研究由三部分组成。第一部分,使用酶消化法提取兔IPFP-SCs并进行体外培养、表型鉴定以及三向分化能力检测;使用两次离心法制备含白细胞PRP（L-PRP）与乏白细胞PRP（P-PRP）,通过体外实验分析比较两种不同形式PRP对IPFP-SCs的影响,如细胞增殖速率、细胞表型以及基因表达,并检测L-PRP与P-PRP对IPFP-SCs的成软骨能力之间的差异。第二部分,使用无酶非消化的方法分离、提取、培养IPFP-SCs,与传统酶消化法获取的IPFP-SCs在细胞的增殖能力、表征以及三向分化能力上做比较,重点比较两者在成软骨诱导分化方面的差异。第三部分,将24只新西兰大白兔随机分为4组,兔关节软骨缺损造模后关节腔注射不同的制剂,A组无酶法分离的IPFP-SCs与P-PRP混合剂,B组消化法分离的IPFP-SCs与P-PRP混合剂,C组无酶法分离的SVF,D组生理盐水。手术后6周、12周,通过大体观和组织学染色方法观察并评估关节标本软骨修复情况,对比不同的IPFP-SCs应用方式修复软骨缺损的效果。研究结果:1、酶消化的方法分离获得的兔IPFP-SCs经表型鉴定和三向分化能力检测,符合间充质干细胞（MSCs）标准;2、两次离心法制备的L-PRP和P-PRP存在下培养IPFP-SCs,均具有促增殖作用,而且促增殖率表现出与PRP浓度相关。干预培养后,细胞表型的流式检测未见明显差异,P-PRP组细胞COL2、ACAN、SOX9表达要高于L-PRP组及对照组。在软骨球法成软骨诱导培养的结果中,两种PRP干预后的软骨球中COL2、ACAN、SOX9的表达升高,在组织学观察上到更多的蛋白多糖沉积和II型胶原蛋白产生;3、使用无酶非消化法分离获得SVF所需时间要明显少于酶消化的方法,而原代细胞的获得率明显低于酶消化的方法,经培养扩增后的两种不同来源的IPFP-SCs在细胞增殖能力、细胞表型以及三向分化能力上并未表现出明显的差异;4、动物实验中,A、B两组软骨缺损区修复效果最佳,两组间无明显差异,C组修复效果要弱于前两组,但相对优于D组。结论1、IPFP-SCs具有干细胞基本特征,具有成软骨分化潜能。髌下脂肪垫组织可以作为未来再生医学干细胞组织来源,IPFP-SCs未来可能具有良好的应用前景;2、白细胞含量不同的L-PRP和P-PRP均能够促进IPFP-SCs的增殖,但不影响IPFP-SCs的细胞表型,相对L-PRP,P-PRP更有利于促进IPFP-SCs成软骨分化;3、无酶非消化法分离法获取髌下脂肪组织的SVF较酶消化法省时,但获得原代细胞的比率要明显降低;两种分离方法扩增获得的IPFP-SCs在细胞鉴定和三向分化潜能的比较,未见明显差异;4、在兔动物软骨缺损模型中使用无酶法分离的SVF对软骨修复有益,而使用扩增的IPFP-SCs和P-RPP的混合剂的修复效果最佳。
马勇[10]（2019）在《坦布苏病毒对宿主单核/巨噬细胞嗜性及其感染机制的初步探索》文中研究说明坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）是近年来出现在我国的一种新发传染病病原,属于黄病毒科、黄病毒属成员,具有传播迅速,宿主范围广泛,跨种间传播等特点。TMUV是目前已知唯一对鸭致病的黄病毒,感染成鸭后主要侵害生殖系统,引发产蛋量的急剧下降,是威胁我国养鸭业的重要病原。宿主免疫细胞是黄病毒属病毒的重要靶细胞,两者间存在着广泛的相互作用。然而,目前的研究主要集中在登革热病毒和寨卡病毒等病原,对TMUV与宿主免疫细胞间的互作却鲜有报道。为探索TMUV感染过程中不同免疫细胞对其增殖能力的影响,本研究分别利用细胞差数分选法和流式细胞仪分选法纯化富集外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）中不同细胞亚群,并检测在体内和体外条件下TMUV对PBMC各亚群细胞的感染情况,发现TMUV对PBMC中的单核吞噬细胞系统（Mononuclear phagocytic system,MPS）具有显着的偏嗜性。本研究进一步利用单核巨噬细胞体内清除剂Clodronate lipsomes清除SPF鸡/鸭MPS,发现清除MPS能够显着降低无特定病原体的（Specific-pathogen-free,SPF）鸡/鸭卵巢和脾中的TMUV载量,同时降低了咽、肛拭子中的病毒基因组拷贝数,并缓解卵巢的病理损伤,表明MPS对TMUV的增殖、传播以及致病性都具有重要影响。MPS主要包括血液中的单核细胞和组织中的巨噬细胞,具有强大的非特异性吞噬能力,是机体抵御病原入侵的第一道防线。为进一步探究TMUV感染MPS后逃逸宿主细胞抗病毒天然免疫应答的具体机制,本研究以鸡巨噬细胞系HD11感染TMUV为研究模型,利用转录组测序（RNA-sequence,RNA-seq）技术分析发现感染后细胞转录谱中上调的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）主要富集在Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）相关信号通路,下调的DEGs主要富集在细胞氧化还原反应相关通路。实验发现,TMUV感染后显着提高IFN-β的转录水平却不影响其蛋白表达,后续研究证明病毒感染能够抑制IFN-β翻译延伸并促进其降解,却不影响其蛋白质翻译起始和释放过程。另外,实验发现TMUV感染后能够激活部分禽干扰素刺激基因（Interferon stimulated genes,ISGs）的表达,暗示宿主可利用IFN-β非依赖途径激活某些ISGs。与此同时,实验发现,TMUV感染不仅不刺激产生活性氧（Reactive oxygen species,ROS）而且还会抑制感染细胞对ROS激活剂PMA的反应性,并发现ROS能够有效抑制TMUV的增殖,提示TMUV感染会影响宿主细胞的氧化还原稳态。RNA-seq数据分析结合分子细胞生物学验证进一步发现,TMUV通过正反两个方向共同作用抑制感染细胞的呼吸爆发反应:一方面通过抑制NADPH氧化酶基因表达来抑制ROS的产生,另一方面通过促进转录因子Nrf2进入细胞核激活其介导的抗氧化基因,如超氧化物歧化酶（SOD-1）的表达促进过氧化物的清除。此外,本研究还发现,TMUV感染HD11后能够显着提高鸡白痢沙门氏菌（S.pullorum）在细胞内的增殖,提示TMUV感染宿主巨噬细胞可能对现地不同病原混合感染有重要影响。本研究鉴定MPS是TMUV感染的重要靶细胞,并初步阐明了TMUV感染后广泛抑制MPS天然免疫反应的分子机制,为深入研究TMUV感染与免疫奠定了基础。
二、直接消化法分离单克隆贴壁细胞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、直接消化法分离单克隆贴壁细胞（论文提纲范文）
（1）脐带间充质干细胞及其外泌因子干预白消安致雄性小鼠生殖损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 HUMSCs的分离培养和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验样本 |
| 1.2 实验试剂与耗材 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HUMSCs形态与生长特征 |
| 2.2 HUMSCs表面标记物的鉴定 |
| 2.3 HUMSCs多重分化能力鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 白消安致无精子症小鼠模型建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂与耗材 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 睾丸生精小管形态学观察 |
| 2.2 白消安抑制生殖细胞减数分裂基因 |
| 2.3 白消安抑制细胞黏附相关蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 脐带间充质干细胞外泌因子治疗白消安致雄性无精子症的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂和耗材 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 睾丸生精小管形态学观察 |
| 2.2 各组小鼠生精细胞减数分裂相关基因表达 |
| 2.3 各组小鼠生精细胞黏附相关蛋白的表达水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞在生精障碍治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）人羊水间充质干细胞通过外泌体改善顺铂诱导的卵巢颗粒细胞损伤（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 外泌体的生物学起源 |
| 1.2 间充质干细胞来源外泌体在再生医学中的研究进展 |
| 1.2.1 MSC-EXO在神经系统中的研究进展 |
| 1.2.2 MSC-EXO在心脏疾病中的研究进展 |
| 1.2.3 MSC-EXO在肺损伤中的研究进展 |
| 1.2.4 MSC-EXO在肝脏损伤中的研究进展 |
| 1.2.5 MSC-EXO在骨缺损中的研究进展 |
| 1.2.6 MSC-EXO在软骨中的研究进展 |
| 1.2.7 MSC-EXO在肾脏疾病中的研究进展 |
| 1.2.8 MSC-EXO在肌肉损伤中的研究进展 |
| 1.2.9 MSC-EXO在创伤中的研究进展 |
| 1.2.10 MSC-EXO与生物材料结合在组织再生中的应用 |
| 第2章 hAFSc-EXO的分离与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验标本 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 hAFSc的分离和培养 |
| 2.3.2 hAFSc的传代和扩增 |
| 2.3.3 hAFSc的冻存和复苏 |
| 2.3.4 流式细胞术检测hAFSc表面蛋白 |
| 2.3.5 Western Blot检测hAFSc表面蛋白标志物 |
| 2.3.6 hAFSc-EXO的分离和定量 |
| 2.3.7 hAFSc-EXO的鉴定 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 hAFSc的形态学 |
| 2.4.2 hAFSc表面蛋白标志物的表达情况 |
| 2.4.3 不同代数hAFSc表面蛋白标志物表达情况 |
| 2.4.4 hAFSc-EXO提取方法的选择 |
| 2.4.5 hAFSc-EXO的鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 大鼠GCs的原代培养和顺铂诱导的体外损伤模型的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 实验流程 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 大鼠GCs的提取和原代培养 |
| 3.3.2 大鼠GCs的鉴定 |
| 3.3.3 顺铂诱导的大鼠GCs损伤体外模型的建立 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 大鼠GCs的提取和原代培养 |
| 3.4.2 大鼠GCs的鉴定 |
| 3.4.3 顺铂诱导的大鼠GCs损伤体外模型的建立 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第4章 hAFS-EXO对顺铂诱导的大鼠GCs损伤的保护作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 |
| 4.2 实验流程 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 CCK8检测hAFSc-EXO对顺铂诱导损伤的GCs增殖的影响 |
| 4.3.2 TUNEL法检测hAFSc-EXO对顺铂诱导损伤的GCs凋亡的影响 |
| 4.3.3 Western Blot方法检测hAFSc-EXO对顺铂诱导损伤的GCs的FSHR、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 hAFSc-EXO对顺铂诱导损伤的GCs增殖的影响 |
| 4.4.2 hAFSc-EXO对顺铂诱导损伤的GCs凋亡的影响 |
| 4.4.3 hAFSc-EXO对顺铂诱导损伤的GCs功能的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（3）补骨脂素联合TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究（论文提纲范文）
| 序言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 :大鼠BMSCs分离培养、纯化及鉴定 |
| 1.材料与设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 BMSCs分离培养 |
| 2.2 细胞传代、冻存与复苏细胞传代 |
| 2.3 BMSCs鉴定 |
| 3.实验结果 |
| 第二部分 :补骨脂素对大鼠BMSCs生长增殖的作用 |
| 1.材料与设备 |
| 1.1主要设备仪器:见表2-1 |
| 1.2主要实验试剂:见表2-2 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 配置不同浓度的含补骨脂素培养基 |
| 2.2 CCK-8细胞毒性实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第三部分 :补骨脂素诱导兔BMSCs成软骨分化的实验研究 |
| 1.材料与设备 |
| 1.1主要设备仪器:见表3-1 |
| 1.2主要实验试剂:见表3-2 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 单层培养诱导分化 |
| 2.2 诱导分化效果鉴定: |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 光学镜检 |
| 3.2 各组免疫细胞化学染色结果 |
| 3.3 western-blot检测结果 |
| 3.4 RT-PCR结果 |
| 讨论 |
| 1 祖国医学对软骨损伤的认识 |
| 1.1 软骨损伤病名: |
| 1.2 祖国医学对骨关节炎的病因认识 |
| 1.3 祖国医学对骨关节炎的病机认识 |
| 1.4 祖国医学关于骨关节炎辩证论治 |
| 1.4.1 骨关节炎的治法治则 |
| 2 现代医学对软骨损伤发病机制的研究 |
| 2.1 软骨细胞的凋亡 |
| 2.2 相关细胞因子 |
| 2.3 基因 |
| 2.4 免疫因素 |
| 2.5 基质蛋白酶(matrixmatalloproteinase,MMPs) |
| 3 中医药治疗软骨损伤的研究 |
| 4 中医药对骨髓间充质干细胞的诱导分化研究 |
| 5 中医药应用于软骨损伤治疗的临床研究进展 |
| 6 间充质干细胞培养方法及意义 |
| 6.1 间充质干细胞获取 |
| 6.2 间充质干细胞换液与传代 |
| 6.3 间充质干细胞培养环境 |
| 6.4 间充质干细胞鉴定 |
| 7 采用CCK-8法来观察骨髓间充质细胞増殖的原理及意义 |
| 8 诱导效果的鉴定及意义 |
| 8.1 光镜下形态学检测及意义 |
| 8.2 Ⅱ型胶原表达旳测定及意义 |
| 8.3 Sox9的表达及意义 |
| 8.4 诱导培养基的运用及意义 |
| 8.5 选择补骨脂素的原因及意义 |
| 8.6 肾精-骨髓间充质干细胞-软骨损伤 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 干细胞治疗膝关节软骨缺损和骨关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）肌源性干细胞改良培养法及构建肌源性人工神经导管修复小鼠坐骨神经缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分: 肌源性干细胞的获取、鉴定及诱导分化 |
| 第一节: 肌源性干细胞(MDSCs)的获取 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法及步骤 |
| (1) 骨骼肌组织的获取 |
| (2) 多步消化法获取原代细胞 |
| (3) 多步贴壁法分离MDSCs |
| (4) 细胞增殖曲线的绘制 |
| (5) 统计学方法 |
| 1.5 实验结果 |
| 第二节: 肌源性干细胞的鉴定 |
| 2.1 实验试剂及仪器 |
| 2.2 实验方法及步骤 |
| (1) 免疫荧光染色鉴定MDSCs |
| (2) 流式细胞学检测鉴定MDSCs |
| (3) 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 第三节: 肌源性干细胞的诱导分化 |
| 3.1 实验试剂及仪器 |
| 3.2 实验方法及步骤 |
| (1) 神经分化诱导 |
| (2) 免疫荧光染色评估分化情况 |
| (3) Real-Time PCR评估分化情况 |
| (4) 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 第四节: 讨论 |
| 第二部分: 肌源性人工神经的构建及术后神经再生情况评价 |
| 第一节: 肌源性人工神经的构建及桥接修复小鼠坐骨神经缺损模型 |
| 1.1 实验试剂和仪器 |
| 1.2 实验动物及分组 |
| 1.3 实验方法及步骤 |
| (1) 提取肌外膜组织构建神经导管 |
| (2) 获取GFP—MDSCs悬液 |
| (3) 免疫荧光染色鉴定GFP—MDSCs |
| (4) 坐骨神经损伤模型的构建及肌外膜导管桥接修复 |
| (5) 统计学方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 第二节: 添加MDSCs对坐骨神经功能学恢复程度评估 |
| 2.1 实验试剂与设备 |
| 2.2 实验方法及步骤 |
| (1) 小鼠步态实验 |
| (2) Von Frey实验测量小鼠痛触觉 |
| (3) 腓肠肌湿重及组织学检测 |
| (4) 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 第三节: 添加MDSCs对坐骨神经组织学恢复程度评估 |
| 3.1 实验试剂及仪器 |
| 3.2 实验方法及步骤 |
| (1) 甲苯胺蓝染色及透射电镜 |
| (2) Western-blot蛋白定量分析实验 |
| (3) 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 第四节 根据移植肌源性干细胞的转归,探究其促神经修复机制 |
| 4.1 实验仪器及试剂 |
| 4.2 实验方法及步骤 |
| (1) 免疫荧光染色 |
| (2) HE染色 |
| (3) Masson染色 |
| 4.3 实验结果 |
| 第五节: 讨论 |
| 全文总结 |
| 综述: 肌源性干细胞在组织工程及干细胞医学中的应用进展 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 学术成果 |
| 参与课题 |
| 获奖情况 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 内皮祖细胞研究进展 |
| 1.1.1 内皮祖细胞的发现及其意义 |
| 1.1.2 内皮祖细胞的培养与鉴定 |
| 1.1.3 内皮祖细胞系 |
| 1.1.4 内皮祖细胞的应用研究 |
| 1.1.5 内皮祖细胞增殖研究进展 |
| 1.2 人参皂苷Rg1的药效及其作用机制的研究进展 |
| 1.2.1 人参皂苷Rg1药效研究的概述 |
| 1.2.2 人参皂苷Rg1作用机制的研究 |
| 1.3 本研究的目的及总体设计 |
| 第二章 小鼠骨髓EPCs的分离、培养与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 差速贴壁法 |
| 2.1.5 二次酶消化法 |
| 2.1.6 纯化传代细胞培养 |
| 2.1.7 集落形成实验 |
| 2.1.8 细胞表面抗原表达检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 细胞形态学观察结果 |
| 2.2.2 集落特征 |
| 2.2.3 细胞表面抗原阳性细胞率 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小鼠骨髓内皮祖细胞系MBMME2的建立与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 骨髓EPCs分离和纯化 |
| 3.1.5 细胞克隆培养和筛选 |
| 3.1.6 传代培养 |
| 3.1.7 细胞系的保存与复苏 |
| 3.1.8 细胞生长对FBS依赖性的观察 |
| 3.1.9 细胞增殖能力的观察 |
| 3.1.10 细胞周期分析 |
| 3.1.11 核型分析 |
| 3.1.12 流式细胞术 |
| 3.1.13 细胞免疫荧光染色 |
| 3.1.14 体外成血管实验 |
| 3.1.15 统计学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 细胞形态学观察结果 |
| 3.2.2 细胞生长特性 |
| 3.2.3 细胞周期分布 |
| 3.2.4 染色体核型 |
| 3.2.5 细胞表面抗原阳性细胞率 |
| 3.2.6 体外成血管实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 细胞传代培养 |
| 4.1.5 MTT比色法 |
| 4.1.6 集落形成实验 |
| 4.1.7 细胞周期分析 |
| 4.1.8 统计学分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 细胞增殖速率 |
| 4.2.2 集落形成能力 |
| 4.2.3 细胞周期分布 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 人参皂苷Rg1 对小鼠内皮祖细胞系MBMME2 细胞生长影响的转录组学研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 实验分组 |
| 5.1.4 RNA-Seq流程 |
| 5.1.5 RT-q PCR |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 RNA样本浓度与质量检测结果 |
| 5.2.2 测序数据质量评价 |
| 5.2.3 样本间Venn分析 |
| 5.2.4 样本间的PCA分析 |
| 5.2.5 差异基因聚类分析 |
| 5.2.6 差异基因表达分析 |
| 5.2.7 功能注释分析 |
| 5.2.8 GO功能富集分析 |
| 5.2.9 KEGG富集分析 |
| 5.2.10 DEGs信号通路分析 |
| 5.2.11 主要差异蛋白互作网络 |
| 5.2.12 RT-q PCR |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 人参皂苷Rg1对MBMME2 促增殖作用机制 |
| 5.3.2 MBMME2 对人参皂苷Rg1 的耐受机制 |
| 5.4 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 专业名词缩略语表(Abbreviations) |
| 附录二 攻读学位期间发表的主要论文及专利 |
| 致谢 |
（6）二甲双胍通过抑制IL-6信号通路下调食管鳞癌细胞PD-L1表达的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 二甲双胍在食管鳞癌中的作用机制及临床应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历和在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）阻断CTLA-4免疫抑制分子增强膀胱癌CD8+T淋巴细胞抗肿瘤效应的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 免疫抑制分子PD-1和CTLA-4 的表达特点 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 阻断CTLA-4的CD8~+T淋巴细胞体外抗肿瘤效应的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 阻断CTLA-4的CD8~+T淋巴细胞体内抗肿瘤效应的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肿瘤免疫治疗的研究与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）Chemerin对内皮祖细胞生物学特性及动脉粥样硬化小鼠脏器病变的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 动脉粥样硬化概述 |
| 1.1.2 Chemerin概述 |
| 1.1.3 Chemerin与动脉粥样硬化 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.3 研究内容与实验设计思路 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 实验设计思路 |
| 第二章 Chemerin通过p38MAPK通路对内皮祖细胞生物学特性的影响 |
| 2.1 实验材料、试剂及仪器设备 |
| 2.1.1 实验相关材料、试剂 |
| 2.1.2 实验相关仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溶液的配制 |
| 2.2.2 内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 |
| 2.2.3 内皮祖细胞的药物干预 |
| 2.2.4 内皮祖细胞黏附能力检测: |
| 2.2.5 MTT法检测内皮祖细胞增殖能力: |
| 2.2.6 Transwell迁移实验检测内皮祖细胞迁移能力: |
| 2.2.7 流式细胞术检测内皮祖细胞凋亡率: |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 内皮祖细胞的鉴定 |
| 2.3.2 Chemerin对内皮祖细胞粘附能力的影响 |
| 2.3.3 Chemerin对内皮祖细胞增殖能力的影响 |
| 2.3.4 Chemerin对内皮祖细胞迁移能力的影响 |
| 2.3.5 Chemerin对内皮祖细胞凋亡的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Chemerin通过p38MAPK通路对ApoE-/-小鼠脏器的影响 |
| 3.1 实验材料、试剂及仪器设备 |
| 3.1.1 实验相关材料、试剂 |
| 3.1.2 实验相关仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶液的配制 |
| 3.2.2 动物模型建立、分组及样本取材 |
| 3.2.3 脂质相关指标检测及病理染色 |
| 3.2.4 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Chemerin对 ApoE-/-小鼠体重的影响 |
| 3.3.2 Chemerin对 ApoE-/-小鼠脂质参数和空腹血糖的影响 |
| 3.3.3 Chemerin对 ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响 |
| 3.3.4 Chemerin对 ApoE-/-小鼠其他脏器组织的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文及其他科研成果 |
（9）髌下脂肪垫源干细胞应用于软骨修复的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 富血小板血浆对髌下脂肪垫源干细胞成软骨分化潜能影响的实验研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 无酶法获取髌下脂肪垫源干细胞成软骨分化潜能的实验研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IPFP-SCs 修复兔膝关节软骨缺损的体内实验研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 全文总结与展望 |
| 一、工作总结 |
| 二、主要创新点 |
| 三、研究展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（10）坦布苏病毒对宿主单核/巨噬细胞嗜性及其感染机制的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 坦布苏病毒 |
| 1.1.1 坦布苏病毒的病原学研究进展 |
| 1.1.2 TMUV的流行病学研究进展 |
| 1.1.3 TMUV的诊断与预防研究进展 |
| 1.2 单核吞噬细胞系统(MPS)与病毒相互作用研究进展 |
| 1.2.1 MPS在病毒增殖中的作用 |
| 1.2.2 病毒感染对MPS功能的影响 |
| 1.3 MPS的氧化还原系统 |
| 1.3.1 呼吸爆发作用 |
| 1.3.2 一氧化氮(NO) |
| 1.3.3 转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2) |
| 1.4 本研究目的意义 |
| 第二章 TMUV对禽MPS偏嗜性的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒株和细胞系 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试验试剂 |
| 2.1.4 其他试剂及配置 |
| 2.1.5 试验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒扩繁及毒价测定 |
| 2.2.2 SPF鸡/鸭外周血单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 2.2.3 差数分离法分离PBMC |
| 2.2.4 差数分离法分离MPS的纯度检测 |
| 2.2.5 RT-qPCR检测TMUV增殖 |
| 2.2.6 流式细胞仪分选PBMC |
| 2.2.7 动物感染实验 |
| 2.2.8 数据统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 TMUV体外感染SPF鸡 /鸭PBMC时对贴壁细胞具有偏嗜性 |
| 2.3.2 差数贴壁法分离MPS纯度的检测 |
| 2.3.3 TMUV体外感染SPF鸡PBMC时对MPS具有偏嗜性 |
| 2.3.4 TMUV体内感染SPF鸡/鸭PBMC时对MPS/贴壁细胞具有偏嗜性 |
| 2.3.5 清除SPF鸡体内MPS能够有效抑制TMUV的感染 |
| 2.3.6 清除SPF鸭体内MPS能够有效抑制TMUV的感染 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 TMUV感染HD11细胞系对IFN-Ⅰ信号通路的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒株和细胞系 |
| 3.1.2 主要试验试剂 |
| 3.1.3 其他试剂及配置 |
| 3.1.4 试验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 测定TMUV在HD11上的生长曲线 |
| 3.2.2 Western blot检测TMUV在HD11中增殖情况 |
| 3.2.3 RNA-seq样品制备 |
| 3.2.4 高通量测序及数据分析 |
| 3.2.5 ELISA检测细胞因子含量 |
| 3.2.6 双荧光素酶报告系统检测IFN-β |
| 3.2.7 提取核糖体新生肽链复合物RNA(RNC-RNA)并利用RT-qPCR检测IFN-β表达量 |
| 3.2.8 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 TMUV在HD11上的增殖情况鉴定 |
| 3.3.2 RNA-seq结果分析 |
| 3.3.3 IFN-α/β抑制TMUV增 殖 |
| 3.3.4 TMUV感染对IF N-α/β具有不同的影响 |
| 3.3.5 TMUV感染不影响IFN-β的释放过程 |
| 3.3.6 TMUV感染不影响IFN-β的翻译起始过程 |
| 3.3.7 TMUV感染促进IFN-β的降解 |
| 3.3.8 TMUV感染不影响部分禽源干扰素刺激基因(chISGs)的产生 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 TMUV感染HD11细胞系后对呼吸爆发反应的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病毒株、细菌株和细胞系 |
| 4.1.2 主要试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 RNA-seq样品制备及数据分析 |
| 4.2.2 NO浓度检测 |
| 4.2.3 超氧化物检测 |
| 4.2.4 活性氧(ROS)检测 |
| 4.2.5 细胞总SOD酶活性检测 |
| 4.2.6 siRNA敲低Nrf2基因 |
| 4.2.7 激光共聚焦试验(confocal) |
| 4.2.8 RT-qPCR检测Nrf2介导基因的表达 |
| 4.2.9 测定S.pullorum在共感染条件下的增殖情况 |
| 4.2.10 数据统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 TMUV感染抑制活性氮(RNS)的产生 |
| 4.3.2 TMUV感染HD11不刺激产生活性氧(ROS)和超氧化物 |
| 4.3.3 TMUV感染抑制ROS和超氧化物的产生 |
| 4.3.4 呼吸爆发作用抑制TMUV的增殖 |
| 4.3.5 TMUV感染促进S.pullorum在HD11中的增殖 |
| 4.3.6 TMUV感染调控NADPH氧化酶(NADPH oxidase)各组分基因表达 |
| 4.3.7 TMUV感染提高HD11细胞SOD酶活性 |
| 4.3.8 TMUV感染促进Nrf2介导的抗氧化基因显着上升 |
| 4.3.9 TMUV感染促进Nrf2蛋白入核 |
| 4.3.10 siRNA敲低Nrf2基因的表达显着拮抗TMUV对呼吸爆发作用的抑制作用 |
| 4.3.11 siRNA敲低Nrf2基因的表达拮抗TMUV对SOD酶活性的促进作用 |
| 4.3.12 siRNA敲低Nrf2基因的表达拮抗TMUV对抗氧化基因的激活作用 |
| 4.3.13 siRNA敲低Nrf2基因的表达抑制TMUV的增殖 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、直接消化法分离单克隆贴壁细胞（论文参考文献）
- [1]脐带间充质干细胞及其外泌因子干预白消安致雄性小鼠生殖损伤的实验研究[D]. 黄磊. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]人羊水间充质干细胞通过外泌体改善顺铂诱导的卵巢颗粒细胞损伤[D]. 吴乙时. 吉林大学, 2020(01)
- [3]补骨脂素联合TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究[D]. 高子茏. 成都中医药大学, 2020(02)
- [4]肌源性干细胞改良培养法及构建肌源性人工神经导管修复小鼠坐骨神经缺损的实验研究[D]. 徐筑秋. 北京协和医学院, 2020(05)
- [5]人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究[D]. 唐琳. 湖南师范大学, 2020(01)
- [6]二甲双胍通过抑制IL-6信号通路下调食管鳞癌细胞PD-L1表达的机制研究[D]. 辛道. 郑州大学, 2020(02)
- [7]阻断CTLA-4免疫抑制分子增强膀胱癌CD8+T淋巴细胞抗肿瘤效应的实验研究[D]. 张伟. 河北医科大学, 2020(01)
- [8]Chemerin对内皮祖细胞生物学特性及动脉粥样硬化小鼠脏器病变的影响[D]. 于凡. 江苏大学, 2020(02)
- [9]髌下脂肪垫源干细胞应用于软骨修复的实验研究[D]. 周嵘. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(03)
- [10]坦布苏病毒对宿主单核/巨噬细胞嗜性及其感染机制的初步探索[D]. 马勇. 中国农业科学院, 2019