一、OX-LDL诱导内皮细胞条件培养液对内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的影响（论文文献综述）
胡龙龙[1]（2021）在《miR-18a在高同型半胱氨酸血症诱导血管损伤中的治疗作用和机制研究》文中研究指明第1章前言心血管疾病（Cardiovascular diseases,CVD）是目前世界范围内死亡和发病的主要原因之一。CVD的主要原因是由于内皮功能的受损或障碍引起的动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）,并导致动脉通过血管壁中斑块的积聚而硬化的慢性疾病。大量的流行病学研究显示高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia,HHcy）是CVD的独立危险因素,血浆同型半胱氨酸水平（Homocysteine,Hcy）每增加5μmol/L,CVD风险增加1.6倍左右。近年来的研究表明,作为CVD的独立危险因素,HHcy诱导的血管功能损伤可能是一系列复杂机制,包括引发长期的慢性炎症、氧化应激和线粒体损伤等共同作用的结果。然而,其根本机制尚不清楚。近几年,miRNAs作为不同细胞类型和功能的调节因子,在AS的起始和进展过程,受到了广泛的关注。miRNAs模拟物或抑制剂的临床试验结果为涉及CVD治疗提供了新的治疗机会和手段,大量的基础研究也证实了miRNAs可成为CVD早期检测和治疗干预提供新的靶点。miRNAs作为潜在的“微小分泌”因子,易于在体液中获得,且具有疾病和组织的特异性,尤其是在循环中是稳定存在。miRNA和基于miRNA的治疗是近年来最具创新性的进展之一,对CVD未来临床应用具有很大的前景。尽管Hcy与CVD之间存在较为明确的关系,但其潜在机制尚不完全清楚。我们课题组前期研究结果也表明,Hcy可抑制血管内皮细胞的迁移和血管生成。在前期基础上,我们发现HHcy诱导内皮损伤过程中miR-18a的表达下降,同时转录组学发现PTEN的异常表达。综上所述,我们推测miR-18a在HHcy引起的血管内皮损伤过程中可能具有一定的治疗作用;其机制可能与miR-18a调控下游靶基因PTEN发挥作用,进而调节炎症反应、氧化应激和线粒体损伤等相关分子的表达水平,减轻Hcy引对内皮细胞迁移和血管再生的抑制作用,防止血管功能的改变。为了证实我们的这一推测,进行了以下研究:首先,通过建立体内外高同型半胱氨酸血症模型,明确其对血管内皮的损伤,同时检测miR-18a的表达。其次,在体内外实验中,分别过表达和沉默miR-18a的表达水平,明确其在HHcy诱导血管内皮损伤中的治疗作用。最后,通过转录组学发现最具价值的差异表达基因PTEN,随后验证miR-18a是否通过靶控PTEN抑制HHcy诱导的血管损伤。第2章HHcy诱导血管内皮损伤和miR-18a的表达降低目的:HHcy刺激诱导血管内皮发生炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进而导致血管内皮的损伤,同时miR-18a表达下调。方法:1)采用特殊定制的高蛋氨酸低维生素低叶酸饲料喂养C57BL/6J小鼠16周,每四周测量小鼠体重、血压、血浆Hcy的浓度等生理参数,以明确HHcy在体动物模型的构建成功与否;2)体内实验明确HHcy诱导血管内皮损伤过程中的炎症反应,主要通过HE染色和免疫组化检测16周内小鼠主动脉血管内皮的变化,和内皮活化因子ICAM1和VCAM1的表达,以及RT-PCR检测促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNFα以及抗炎细胞因子IL-10的m RNA表达水平的变化,同时检测miR-18a的表达水平;3)体内实验明确HHcy诱导血管内皮损伤过程中的氧化应激水平,主要通过DHE染色检测各组血管的ROS水平,酶标仪检测血浆SOD和MDA,以及免疫荧光检测氧化相关蛋白NOX4和抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达变化;4)体内实验明确HHcy诱导血管内皮损伤过程中的线粒体损伤,主要通过免疫荧光检测各组血管线粒体融合蛋白Mfn2和分裂蛋白Drp1的表达,同时透射电镜观察各组血管内皮线粒体的改变,血管TUNEL染色检测血管凋亡水平;5)体外实验证实Hcy诱导内皮细胞损伤过程中炎症反应,主要通过RT-PCR检测ICAM1,VCAM1,IL-1β,IL-6,TNFα和IL-10的m RNA表达水平的变化,同时检测miR-18a的表达水平;6)体外实验证实Hcy诱导内皮细胞损伤过程中的氧化应激水平,主要通过收集各组内皮细胞上清,相关试剂盒检测SOD和MDA的表达,同时WB检测氧化蛋白NOX4和抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达水平;7)体外实验证实Hcy诱导内皮细胞损伤过程中的线粒体的损伤,主要通过WB检测Mfn2和Drp1的表达,以及抗凋亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax的表达,流式细胞仪检测各组凋亡水平。结果:1)每4周监测各组体重、血压和血Hcy的变化。发现HHcy组小鼠收缩压略微升高（P<0.05）,舒张压无明显变化,血Hcy水平显着升高,而体重无明显差异,提示HHcy小鼠模型构建成功。2)HE染色结果发现随着喂养时间的延长,HHcy组小鼠主动脉形态较Control组更不规则,细胞排列更紊乱,细胞核大小均一性更差,胞浆染色不均匀,且纤维断裂更明显。免疫组化染色检测各阶段小鼠主动脉内皮细胞中ICAM-1和VCAM-1表达,发现8周开始HHcy组主动脉中ICAM-1和VCAM-1表达开始变化,16周后明显高于Control组。同时发现HHcy组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达较Control组显着升高,而IL-10的表达较Control组降低（P<0.05）。miR-18a在HHcy小鼠血管内皮中表达明显低于Control组。3)DHE染色发现HHcy组较Control组血管内皮的ROS水平明显升高,同时血清SOD和MDA也较Control组明显升高（P<0.05）。免疫荧光检测发现与对照组相比HHcy组氧化蛋白NOX4的表达升高,以及抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达明显降低（P<0.05）。4)免疫荧光的结果发现HHcy可诱导Drp1的表达水平升高,同时Mfn2的表达水平降低（P<0.05）;透射电镜观察HHcy组血管内皮细胞重度水肿,线粒体（M）数量较少,中度肿胀,部分线粒体嵴膜内基质变淡;HHcy组较Control组Tunel荧光百分比显着升高,提示凋亡水平的升高（P<0.05）;5)体外Hcy组内皮细胞活性明显低于Control组,而Hcy组细胞毒性也明显升高,RT-PCR检测发现Hcy组内皮活化因子ICAM-1和VCAM-1的m RNA水平明显高于Control组;同时Hcy组的IL-1β、IL-6、TNF-α表达均明显升高,而IL-10表达下降,并且发现Hcy刺激抑制了内皮细胞中miR-18a的表达（P<0.05）;6)检测各组细胞上清发现与Control组相比Hcy组MDA表达升高,SOD表达下降;WB检测氧化应激相关蛋白发现,与对照组相比HHcy可促进氧化蛋白NOX4的表达,而抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达降低（P<0.05）;7)与对照组相比Hcy可促进Drp1的升高,而Mfn2则被抑制;与Control组相比,Hcy组Bcl2的表达降低、Bax的表达增加,与此相应的细胞流式检测发现凋亡的水平也显着升高（P<0.05）。结论:1)成功构建了HHcy小鼠动物模型;2)HHcy可诱导血管内皮的活化和刺激炎症因子的表达,进而损伤血管内皮;3)HHcy可诱导血管内皮的氧化应激水平的增加,进而损伤血管内皮;4)HHcy可诱导线粒体融合/分裂的失衡,促进凋亡水平的增加,进而损伤血管内皮。5)HHcy诱导血管内皮损伤过程中,miR-18a表达下调。第3章miR-18a抑制HHcy诱导的血管内皮细胞损伤目的:1)阐明miR-18a可抑制在体HHcy诱导的血管内皮炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进一步降低血管内皮损伤。2)体外Hcy实验,证实miR-18a可抑制Hcy诱导的血管内皮炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进而减轻内皮细胞损伤。方法:1)设计内皮特异性启动子TIE2,同时搭载具有特异亲和血管的腺相关病毒-sig血清型,以此实现针对miR-18a在血管中的特异调控;对各相应处理组的血管进行冰冻切片观察GFP荧光强度的表达的和经RT-PCR检测miR-18a相应转录水平的表达变化。2)miR-18a抑制在体HHcy诱导血管内皮损伤,实验分组和干预为:对照组（Control组）、高同型半胱氨酸血症组（HHcy组）,高同型半胱氨酸血症组+过表达miR-18a组（HOE组）,高同型半胱氨酸血症组+下调miR-18a组（HKD组）。利用免疫组化和免疫荧光,分别检测各处理组ICAM-1和VCAM-1的相关表达水平;ELISA检测各处理组血清中的IL-1β、IL-6、TNFα和IL-10的表达,以及通过免疫组化检测IL1β、IL-6,TNFα,IL-10表达。3)DHE染色检测各组血管的ROS水平,酶标仪检测血浆SOD和MDA,以及免疫荧光检测氧化相关蛋白NOX4和抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达变化;4)利用免疫荧光检测各组Mfn2和Drp1的表达,同时血管TUNEL染色检测各组血管凋亡水平;5)体外验证miR-18a抑制Hcy诱导的内皮细胞损伤,实验分组和干预为:正常对照组（Control组）、高同型半胱氨酸组（Hcy组）,高同型半胱氨酸+过表达miR-18a组（Hcy+Mimic,HM组）,高同型半胱氨酸+过表达miR-18a组（Hcy+Mimic Control,HMC组）,高同型半胱氨酸+下调miR-18a组（Hcy+Inhibitor,HI组）,高同型半胱氨酸+下调miR-18a组（Hcy+Inhibitor Control,HIC组）,主要通过RT-PCR检测ICAM1,VCAM1,IL-1β、IL-6,TNFα和IL-10的m RNA表达水平的变化;6)收集各组内皮细胞上清,相关试剂盒检测SOD和MDA的表达,同时WB检测氧化蛋白NOX4和抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达水平;7)WB检测各处理组Mfn2和Drp1的表达,以及Bcl2和Bax的表达和流式细胞仪检测各组凋亡水平。结果:1)结果发现,各干预组较对照组血管的GFP荧光强度有明显的差异,miR-18a相应转录水平也实现了调控,提示在体实现了miR-18a的特异性调控。2)相比于HHcy组,HOE组血管内皮中ICAM-1和VCAM-1的表达明显降低;而HKD组相较于HOE组的ICAM-1和VCAM-1表达水平较高（P<0.05）。同时,相比于HHcy组,HOE组IL1β、IL-6,TNFα的表达明显降低和改善IL-10的表达;而HKD组相较于HOE组IL-1β、IL-6,TNFα的表达明显升高和抑制IL-10的表达（P<0.05）。3)HOE组较HHcy组ROS的水平有所降低,而HKD组较HOE组水平水平升高。相应的SOD和MDA水平也发生了相应的改变（P<0.05）。与HHcy组相比,HOE组SOD水平升高,而MDA水平略降低。而HKD组较HOE组SOD水平下降,MDA的水平升高;同时,与HHcy组相比,HOE组NOX表达下降,SOD1和SOD2的表达升高;而HKD组较HOE组NOX4水平升高,SOD1和SOD2的水平降低（P<0.05）;4)HOE组较HHcy组Drp1表达降低,Mfn2表达升高。而HKD组较HOE组相比,出现与之相反的结果（P<0.05）;同时,与HHcy组相比,HOE凋亡水平显着降低,而HKD组与HOE组相比,凋亡表达水平升高（P<0.05）;5)HM组与HMC组相比,ICAM-1和VCAM-1,IL-1β,IL-6,TNFα表达降低,而IL-10的表达升高（P<0.05）。而HI组与HIC组结果出现了相反的趋势（P<0.05）;6)检测各组细胞上清发现HM组相比HMC组SOD表达升高,MDA表达下降（P<0.05）。同时,HM组与HMC组相比,过表达miR-18a可抑制NOX4的升高,促进SOD1和SOD2的表达,而HI组与HIC组相比,则出现与之相反的结果（P<0.05）;7)HM组与HMC组相比,miR-18a的过表达可降低Drp1的升高,促进Mfn2的表达（P<0.05）;同时发现Bcl2的表达降低、Bax的表达增加,细胞流式检测凋亡的水平降低,而HI组与HIC组相比,出现与之相反的趋势（P<0.05）。结论:1)成功实现了调控血管内皮特异性表达miR-18a;2)miR-18a可抑制HHcy诱导的血管内皮的活化和炎症因子的表达,进而减轻血管内皮的损伤;3)miR-18a可抑制HHcy诱导的血管内皮的氧化应激水平的增加,进而减轻血管内皮的损伤;4)miR-18a可抑制HHcy诱导的线粒体融合/分裂的失衡和凋亡水平的增加,进而减轻血管内皮的损伤。第4章miR-18a靶控PTEN抑制HHcy诱导的血管内皮损伤目的:1)阐明miR-18a靶控PTEN抑制HHcy诱导的血管内皮炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进一步降低血管内皮损伤。2)体外Hcy实验,证实miR-18a靶控PTEN抑制Hcy诱导的内皮细胞炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进而减轻内皮细胞的损伤。方法:1)将建模成功的HHcy组和正常对照组的主动脉血管进行转录组学测序分析,试图找到HHcy诱导血管损伤过程中差异表达基因,进一步通过生物信息学的方法,进行蛋白互作分析PTEN与本研究的相关通路蛋白之间的关联。2)利用生物信息学结合相关miR研究数据库,预测miR-18a与PTEN之间的关联,随后进行荧光素酶报告基因和细胞水平的验证两者之间的关系。3)利用慢病毒构建过表达和沉默PTEN表达载体,实现在内皮细胞中调控PTEN的表达,进行后续miR-18a的回复实验;4)miR-18a靶控PTEN抑制Hcy诱导的炎症反应,实验分组为HM+LV-Con（过表达miR-18a+过表达PTEN对照）组,HM+LV-PTEN（过表达miR-18a的同时回复PTEN的表达）,HI+Sh-Con（沉默miR-18a+沉默PTEN对照）和HI+Sh-PTEN（沉默miR-18a+沉默PTEN）组,主要通过RT-PCR检测ICAM1和VCAM1,IL-1β,IL-6,TNFα和IL-10的m RNA表达水平的变化;5)收集各组内皮细胞上清,相关试剂盒检测SOD和MDA的表达,同时WB检测氧化蛋白NOX4和抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达水平;6)WB检测各处理组Mfn2和Drp1的表达,以及Bcl2和Bax的表达和流式细胞仪检测各组凋亡水平;7)检测各组内皮细胞相关功能:迁移和小管形成。结果:1)利用生物信息学结合相关miR研究数据库,分析发现miR-18a与PTEN存在着三个相关可能的结合位点;运用荧光素酶报告基因的检测实验结果表明,对突变型PTEN-MT与野生型PTEN-WT相比,荧光强度得到明显回复,表明miR-18a对PTEN的调节是通过特异性结合位点进行调控（P<0.05）;细胞实验表明Mimic（miR-18a过表达）与Mimic Con（miR-18a过表达对照组）相比,PTEN的m RNA和蛋白水平均被抑制;而沉默miR-18a,得到的结果与之相反（P<0.05）。2)m RNA测序结果发现与Control组相比,存在差异明显的表达基因,其中上调基因1722个,下调表达基因707个。对各组表达基因进行交叉分析,共有10667个共有表达基因。随后对该共有基因进行相关生物信息通路富集信息分析发现,其存在对PTEN Regulation和Regulation of PTEN stability and activity通路存在显着关联（P<0.05）。蛋白互作分析,发现PTEN与本研究的相关通路蛋白存在着密切的关联。3)过表达LV-Con载体和沉默Sh-Con载体,转染72小时后,荧光显微镜下观察相应的荧光密度和强度。与对照Control组相比,其余两组GFP绿色荧光有着较高的密度和强度,提示高转染效率;根据之前针对沉默PTEN设计的三对靶点,分别进行了RT-PCR和WB的检测,结果表明各个靶点均能很好的抑制PTEN的表达,后续我们选择了Sh-PTEN-A作为沉默PTEN的干预（P<0.05）。同时也验证了过表达PTEN载体的有效性,与LV-Con组相比,LV-PTEN组的m RNA和蛋白水平均升高（P<0.05）;4)与HM+LV-Con组相比,HM+LV-PTEN组的ICAM1,VCAM1,IL-1β,IL-6,TNFα表达升高,而降低IL-10的表达（P<0.05）;与之相反,与HI+Sh-Con组相比,HI+Sh-PTEN组炎症反应得到了明显的改善（P<0.05）;5)与HM+LV-Con组相比,HM+LV-PTEN的内皮细胞有着较高的氧化应激水平,表现为SOD水平的降低,MDA水平的升高;同时升高氧化蛋白NOX4的表达,抑制抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达水平（P<0.05）;与此同时,HI+Sh-PTEN组与HI+Sh-Con组则表现出相反趋势,可降低氧化应激相关指标,升高抗氧化SOD和抗氧化蛋白SOD1和SOD2的表达,抑制氧化MDA和氧化蛋白NOX4的表达（P<0.05）;6)与HM+LV-Con组相比,HM+LV-PTEN组Mfn2表达下降,而Drp1表达升高（P<0.05）;最终表现为促进Bcl2/Bax水平的降低,以及细胞流式检测的凋亡水平的升高（P<0.05）;而HI+Sh-PTEN组与HI+Sh-Con组相比结果出现了相反的趋势（P<0.05）;7)与正常组相比Hcy组可显着抑制内皮细胞的迁移和小管形成的能力。HM组与HMC相比,内皮细胞的迁移和小管形成的数量得到了一定程度的改善（P<0.05）;HM+LV-PTEN较HM+LV-Con组,可抑制内皮细胞迁移和小管形成能力（P<0.05）;之相反,HI组与HIC组相比,显着抑制内皮细胞迁移和小管形成;HI+Sh-PTEN组与HI+Sh-Con组相比,内皮细胞迁移和小管形成能力得到了相应的改善（P<0.05）。结论:1)miR-18a靶控PTEN抑制HHcy诱导的血管内皮炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进一步降低血管内皮损伤。2)体外Hcy实验也表明,miR-18a靶控PTEN抑制Hcy诱导的内皮细胞炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进而减轻内皮细胞的损伤。第5章总结本研究中,我们证实在HHcy刺激环境下,miR-18a通过抑制血管内皮炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进而减轻血管损伤。此外,转录组测序发现PTEN及其通路的表达差异。我们进一步探讨miR-18a在抑制HHcy诱导血管内皮损伤的分子机制,发现miR-18a靶向调控PTEN的表达,减少血管内皮炎症反应,氧化应激和线粒体损伤,进而降低血管内皮的损伤。总之,我们在本研究中探索了miR-18a在HHcy诱导血管内皮损伤中的作用及其分子机制,这将为HHcy在CVD中的防治提供了新的思路和新的靶点。
耿嘉男[2]（2020）在《基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究》文中研究指明动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是导致不稳定冠状动脉综合征和心源性猝死的重要原因之一,流行病学统计结果显示,自2015年以来亚洲众多国家中因脂代谢异常引发AS导致的心血管疾病发病率急剧上升,已成为除传染性疾病外有较高死亡率的疾病。内皮细胞是血管内膜的主要组成细胞,是保护血管的第一道重要屏障,内膜异常是AS典型病理改变,表现为内皮细胞愈合能力降低、抗炎症细胞浸润能力下降以及细胞凋亡等,进而累及血管进一步损伤。人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3,Rg3）是人参的主要活性成分之一,其抗肿瘤和免疫调节等药理作用已经被熟知。随着研究的不断深入,Rg3对心血管系统的保护作用亦被证实,但有关Rg3抗AS作用及相关机制尚未明确。瑞舒伐他汀属他汀类药物,为HMG-Co A还原酶抑制剂,因具有比其他同类药物调节血脂作用更强、半衰期更短以及生物利用度更高等优点而备受青睐,但其抗AS机制及是否与内皮保护作用有关尚需深入研究。本论文基于吉林省科技厅自然科学基金项目:“瑞舒伐他汀对ox-LDL导致内皮细胞内质网应激的干预作用及分子机制研究”（编号:20150101200JC）,探讨瑞舒伐他汀在脂代谢异常引发AS中除降脂外的内皮保护作用及机制,同时对比研究Rg3的内皮保护和抗AS作用及机制。并通过体内实验比较瑞舒伐他汀、Rg3或二者联用对ApoE-/-小鼠AS的保护作用,以期为临床不能耐受全剂量他汀类药物或高肝酶活性患者,联合应用瑞舒伐他汀和Rg3治疗,确保更有效的冠状动脉护理提供理论依据。主要研究如下:1.Rg3对ox-LDL诱导内皮细胞功能异常的作用及机制研究为确定Rg3是否对ox-LDL导致内皮细胞异常有改善作用,建立ox-LDL（200μg/mL）诱导的内皮细胞（HUVECs）损伤模型,Rg3（15、30μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用划痕实验、单核细胞黏附实验和Western blotting等方法,研究Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的影响。实验结果显示,Rg3可显着对抗ox-LDL导致的HUVECs愈合能力及抗单核细胞黏附功能下降,减少FAK的磷酸化,抑制黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达,抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达,表明Rg3可抑制ox-LDL诱导HUVECs功能异常,且与抑制FAK介导的黏附因子表达有关。为阐明Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的作用机制,采用了迁移实验、单核细胞黏附实验、Western blotting、免疫荧光和qPCR等方法和技术,对相关指标进行了检测。实验结果显示,Rg3可显着增强ox-LDL抑制HUVECs的PPARγ表达,抑制损伤的内皮细胞内NF-κB活化后核易位,降低炎症因子MCP-1和IL-6 mRNA水平;给予GW9662（PPARγ特异性抑制剂）对HUVECs进行预处理,可显着抑制Rg3增强HUVECs迁移及抗单核细胞黏附能力的作用,并抑制Rg3下调FAK的磷酸化、黏附因子和基质金属蛋白酶表达、NF-κB活化后核易位以及炎症因子的作用,表明Rg3可能通过上调内皮细胞PPARγ表达发挥抑制ox-LDL诱导HUVECs异常的作用。2.瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究建立ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型,瑞舒伐他汀（0.01、0.1及1μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用试剂盒、MTT、流式细胞术、DAPI染色和Western blotting等技术和方法,探究瑞舒伐他汀的抗AS作用是否与内皮保护及抗内皮凋亡有关。实验结果显示,瑞舒伐他汀可显着增强ox-LDL刺激下HUVECs分泌NO水平降低,降低细胞氧化应激水平,增强HUVECs的PI3K/Akt/eNOS通路活化及Bcl-2/Bax的比率;MTT结果显示,瑞舒伐他汀可抑制ox-LDL诱导的HUVECs生存率下降;流式细胞术检测结果显示,瑞舒伐他汀可显着降低ox-LDL诱导的HUVECs凋亡率升高;DAPI染色结果显示,瑞舒伐他汀可显着抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞核损伤,以上均表明瑞舒伐他汀可以抑制ox-LDL诱导的HUVECs损伤及凋亡。此外,内皮细胞因其含有丰富的内质网,提示其可能对内质网应激异常导致细胞凋亡更为敏感,为阐明瑞舒伐他汀抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡的作用机制,对内质网应激相关通路进行检测,结果显示瑞舒伐他汀显着降低CHOP、sXBP1和Caspase-12mRNA水平,抑制GRP78表达,降低PERK、IRE1α及eIF2α的磷酸化,表明瑞舒伐他汀可能通过抑制内质网应激相关通路来抑制ox-LDL诱导的HUVECs凋亡。3.Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化作用研究为比较Rg3与瑞舒伐他汀的抗AS作用,探究Rg3与瑞舒伐他汀联用是否可更有效抑制AS发生及发展,本研究采用高脂饲料（含40%脂肪,1.25%胆固醇）饲养ApoE-/-小鼠成功复制动脉粥样硬化模型后,随机分为4组:模型组、Rg3组（Rg3）、瑞舒伐他汀组（RSV）和Rg3与瑞舒伐他汀联用组（Rg3+RSV）,以C57BL/6J小鼠保持喂养普通饲料作为正常对照。给药4 w后,检测小鼠血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C及CRP水平,HE染色和油红O染色观察小鼠主动脉AS斑块情况,MASSON染色检测小鼠主动脉胶原含量,免疫荧光染色检测小鼠主动脉内皮细胞凋亡情况,免疫组织化学染色检测主动脉和斑块巨噬细胞及平滑肌细胞含量,进而统计各组小鼠AS斑块核帽比及易损指数。本研究结果表明,与正常对照组比较,模型组小鼠T-CHO、TG、LDL-C以及CRP水平均显着升高,HDL-C水平显着降低;主动脉内膜及内膜下细胞排列紊乱,大量胞质呈空泡状,且主动脉内膜隆起纤维斑块层,动脉壁炎细胞浸润、泡沫化严重;主动脉内皮细胞凋亡显着增多,动脉壁胶原纤维含量显着减少;主动脉及斑块部位巨噬细胞表达显着增多,平滑肌细胞显着减少,小鼠AS斑块核帽比及易损指数显着升高。首先,与模型组比较,Rg3+RSV组及RSV组均显着降低小鼠血清LDL-C水平,显着抑制小鼠主动脉内皮细胞凋亡,且两组水平无显着差异,同时Rg3+RSV组显着降低小鼠血清T-CHO水平,但较正常仍呈较高水平,RSV组小鼠血清TG水平显着下降,提示瑞舒伐他汀可能发挥主要降低小鼠血清脂蛋白及抗内皮细胞凋亡作用;其次,Rg3+RSV组和Rg3组均显着降低AS小鼠血清中CRP水平,两组无显着差异,提示Rg3可能发挥主要降低小鼠炎症水平作用;另外,Rg3+RSV组和RSV组小鼠主动脉的胶原纤维含量较模型均显着增加,Rg3+RSV组和Rg3组巨噬细胞表达较模型组减少更为显着,而Rg3+RSV组α-SMA阳性表达增多显着,使得Rg3+RSV组AS斑块核帽比及易损指数降低更为显着。综上所述,Rg3可增强血管内皮细胞愈合能力及抵御炎症细胞黏附的能力,降低炎症因子和促AS细胞因子水平,可能与调节PPARγ/FAK信号通路有关,且Rg3可降低AS小鼠炎症水平,降低主动脉内膜及AS斑块巨噬细胞浸润,表明其可能通过抑制炎症对内皮损伤发挥抗AS作用;瑞舒伐他汀除改善AS小鼠血脂水平外,具有抑制AS小鼠血管内皮细胞凋亡作用,可能与增强血管内皮细胞PI3K/Akt/eNOS通路活化以及抑制内质网应激相关通路有关;另外,Rg3显示出显着抑制ApoE-/-小鼠的AS发生发展的作用,且Rg3与瑞舒伐他汀联用抗AS效果更为显着,提示当临床应用他汀类药物治疗AS效果不理想或对他汀类药物不耐受时,联合应用Rg3可能更有效发挥治疗AS作用。
黄菲[3]（2020）在《suPAR在抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎的作用及机制研究》文中提出抗中性粒细胞胞浆抗体（Antineutrophil cytoplasmic autoantibody,ANCA）相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis,AAV）是一种以坏死性小血管炎为特征的累及全身多系统的自身免疫性疾病,肾脏是最易受累器官之一。可溶性尿激酶受体（soluble urokinase plasminogen activator receptor,suPAR）作为一种血管炎症生物标记物,不仅参与免疫系统激活,还与多种肾脏疾病相关,并可能为肾功能进展的预测因子。目前suPAR在AAV中的临床意义很少被关注,因此本研究旨在分析suPAR与AAV疾病活动度的相关性,探讨suPAR是否在AAV疾病发生发展过程中存在潜在的作用,为AAV的诊断评估或治疗提供新的思路。首先,临床研究部分,我们收集90例AAV患者血液,采用商品化试剂盒检测血浆中suPAR水平,分析血浆suPAR水平与AAV患者相关临床指标及疾病预后的相关性。发现急性期AAV患者血浆suPAR水平显着高于缓解期AAV患者和健康对照组,且患者血液suPAR水平与多项临床指标存在明显相关性,较高的suPAR水平与不良预后密切相关。接下来在细胞实验部分,我们使用人u PAR重组蛋白和AAV患者血浆提取的IgG刺激肾小球内皮细胞（GEn C）,检测内皮细胞活化与损伤相关指标。结果显示u PAR联合ANCA阳性IgG刺激可显着活化内皮细胞,加重细胞损伤,并上调Toll样受体4（TLR4）表达,而下调TLR4表达或采用TLR4抑制剂可有效逆转u PAR和ANCA阳性IgG诱导的内皮细胞活化。综上所述,AAV患者血浆suPAR水平与疾病活动度和预后显着相关,u PAR蛋白可通过TLR4途径增强ANCA阳性IgG诱导的内皮细胞活化,suPAR可能是参与AAV发生发展的潜在标记物。因此,降低u PAR表达可能为AAV的治疗提供新思路和潜在治疗靶点。第一部分ANCA相关性血管炎患者血浆suPAR的表达及意义目的:探讨血浆suPAR水平与ANCA相关性血管炎患者疾病活动程度及预后的相关性。方法:收集90例AAV患者并进行随访。采用标准的酶联免疫吸附法（ELISA法）检测血浆suPAR水平,分析血浆suPAR水平与AAV患者临床相关指标及预后的相关性。结果:AAV患者的血浆suPAR水平显着高于健康对照组（5,920.08±3,447.17 pg/m L vs.1,441.97±835.04 pg/m L,P<0.001）,活动期AAV患者suPAR水平显着高于部分缓解期AAV患者（6,492.19±3,689.48 pg/m L vs.5,031.86±2,489.01 pg/m L,P=0.039）。相关性分析结果显示AAV患者血浆suPAR水平与BVAS、血清肌酐、CRP和PCT水平呈正相关,与血清C3和e GFR水平呈负相关。Kaplan-Meier生存分析发现血浆suPAR水平大于5683.3 pg/m L的AAV患者生存时间明显短于suPAR水平低于5683.3 pg/m L的AAV患者（log-rank,P=0.001）。多元COX回归分析提示在校正年龄、性别的条件下,血浆suPAR水平是患者发生终点事件（ESRD或者死亡）的独立危险因素（HR=1.05,95%CI=1.01-1.11,P=0.043）。受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curves,ROC）提示suPAR水平为6,662.2 pg/m L时对终点事件的预测效率最高,灵敏度为68%,特异性为88%,曲线下面积（AUC）为0.82（95%CI=0.68-0.96,P<0.001）。结论:AAV患者血浆suPAR水平与疾病活动度和预后显着相关,suPAR可能是评估AAV疾病活动的潜在生物标记物。第二部分suPAR通过TLR4途径参与ANCA阳性IgG诱导的肾小球内皮细胞活化目的:根据我们前期研究AAV患者血浆suPAR水平与疾病活动度和预后显着相关的结果,进一步明确人u PAR重组蛋白是否诱导的肾小球内皮细胞活化。方法:使用人uPAR重组蛋白和MPO-AAV患者血清提取的ANCA阳性IgG刺激人肾小球内皮细胞（glomerular endothelial cell,GEn C）。采用q RT-PCR检测ICAM-1、VCAM-1 m RNA水平,试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶、s ICAM-1、s VCAM-1水平,评估内皮活化损伤情况。采用渗透性实验检测内皮屏障功能改变,免疫荧光检测内皮细胞形态变化。q RT-PCR、Western-blot法检TLR4表达情况,进一步使用TLR4 si RNA或TLR4抑制剂处理内皮细胞,再次采用q RT-PCR、ELISA等方法检测内皮细胞活化损伤情况。结果:AAV患者血清或人uPAR重组蛋白刺激可显着增加肾小球内皮细胞活化标记分子ICAM-1和VCAM-1在RNA水平的表达。与u PAR蛋白或ANCA阳性IgG单独刺激相比,u PAR联合ANCA阳性IgG刺激可显着活化内皮细胞,ICAM-1和VCAM-1在RNA水平的表达显着上调,内皮细胞渗透性明显增加,紧密连接受损,TLR4水平明显上调。沉默TLR4可显着下调u PAR联合ANCA阳性IgG诱导的ICAM-1、VCAM-1m RNA水平增高。而TLR4抑制剂预处理可显着下调u PAR联合ANCA阳性IgG诱导的内皮细胞ICAM-1 m RNA、s ICAM-1、LDH的增高。结论:人u PAR重组蛋白可通过TLR4途径增强ANCA阳性IgG诱导的肾小球内皮细胞活化,suPAR在AAV中可能存在潜在的病生理作用,本研究可为AAV的临床干预提供潜在的治疗靶点。
刘远凤[4]（2020）在《大气PM2.5干扰内皮细胞自噬及大蒜素的改善作用机制》文中指出目的:1)研究大气PM2.5干扰人脐静脉内皮细胞（HUVECs）自噬的潜在分子机制,为科学评价大气PM2.5对人体心血管系统的影响提供理论依据;2)探究大蒜素改善由于大气PM2.5干扰HUVECs功能的作用及分子机制,为预防和改善大气PM2.5暴露影响人体心血管系统的健康提供新的思路和策略。方法:（1）用不同浓度的PM2.5（1,5,25μg/mL）处理HUVECs后,透射电子显微镜（TEM）观察PM2.5在细胞中的分布,以及自噬小体的形成;吖啶橙（AO）和单丹磺酰尸胺（MDC）染色观察酸性小泡;间接免疫荧光法（IF）检测LC3和p62 puncta水平;Western blot检测自噬蛋白（LC3 A、LC3 B、Beclin 1、p62、ATG3、ATG7、ATG5、ATG12、STX17）和溶酶体相关蛋白（CTSB、CTSD、LAMP1、LAMP2）的表达;并选择AKT、ERK1/2、TFEB信号通路来探讨其潜在的分子机制。（2）大蒜素（5,10,20μg/mL）与PM2.5（5μg/mL）联合暴露HUVECs后,乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞损伤;Hoechst 33258染色观察细胞（凋亡小体）形态;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞技术检测细胞凋亡率;TEM观察自噬小体;IF检测LC3和p62puncta水平;ELISA检测炎症因子（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α）、趋化因子（MCP-1）和粘附分子（VCAM-1、sICAM-1）;Western blot检测内皮功能相关蛋白（TF、PAI-1）,凋亡蛋白（Bcl-2、Bax、caspase-3、Cleaved caspase-3、caspase-9、Cleaved caspase-9、PARP、Cleaved PARP）,自噬蛋白（p62、Beclin 1、LC3 II/I）和氧化应激蛋白（Nrf2、HO-1、keap 1）以及NF-κB和MAPK信号通路（ERK1/2、p38、JNK1、JNK2）相关蛋白的表达。结果:（1）PM2.5内化入HUVECs后,主要位于细胞质内有被膜包裹的小囊中,表明PM2.5主要通过胞呑作用进入细胞,进而对细胞产生毒性效应;PM2.5暴露组HUVECs内,自噬小体、LC3 puncta和蛋白（LC3 II/I、Beclin 1、ATG3、ATG7、ATG5、ATG12）等升高,表明PM2.5使HUVECs内自噬泡增加;暴露组细胞内的p62 puncta和蛋白水平升高,表明自噬泡包裹的内容物（’cargo’）没有得到有效降解;暴露组细胞内的溶酶体数、溶酶体膜蛋白LAMP1和溶酶体标志性蛋白酶CTSB和CTSD均升高,以及上游调节因子ERK1/2和TFEB的磷酸化增加,表明细胞的溶酶体活性增强;暴露组细胞内STX17和LAMP2蛋白水平降低,表明自噬体与溶酶体融合受阻。同时,暴露组细胞的自噬上游调节因子AKT磷酸化增加,它可通过活化mTORC1蛋白复合物,而抑制细胞自噬过程。综上所述,PM2.5暴露通过活化AKT而抑制自噬泡的形成及其与溶酶体的融合,从而阻断了HUVECs细胞正常的自噬流（autophagic flux）。（2）与PM2.5单独暴露组相比,大蒜素与PM2.5联合暴露组,LDH活性明显降低,凋亡率下降,相应地,Bcl-2/Bax上调,caspase-3,caspase-9,PARP活性降低,表明大蒜素可在一定程度上保护PM2.5暴露对HUVECs的损伤,减少凋亡;同时,与PM2.5单独暴露组相比,大蒜素与PM2.5联合暴露组,TF、PAI-1表达也减少,促炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1、VCAM-1、sICAM-1）和NF-κB的磷酸化均降低,抑炎症因子IL-4升高,表明大蒜素通过抑制NF-κB活化而阻抑PM2.5诱导的细胞炎症反应。同样,与PM2.5单独暴露组比较,大蒜素与PM2.5联合暴露组细胞内自噬小体、LC3和p62 puncta及蛋白（p62、Beclin 1、LC3 II/I）均下降,表明大蒜素能恢复PM2.5对内皮细胞自噬的干扰;相反,与PM2.5单独暴露组比较,大蒜素与PM2.5联合暴露组细胞内,Nrf2磷酸化增加,HO-1升高,keap 1降低,表明大蒜素可改善PM2.5诱导的内皮细胞氧化损伤。大蒜素与PM2.5联合暴露组细胞内MAPK信号通路ERK1/2、p38、JNK的磷酸化均增加,表明大蒜素通过激活MAPK信号通路参与PM2.5对内皮细胞的调控。综上所述,大蒜素通过激活MAPK,使Nrf2磷酸化增加,抑制NF-κB活性,从而在一定程度上减少PM2.5诱导的内皮细胞凋亡、炎症反应、自噬和氧化应激,改善内皮细胞的功能。结论:（1）PM2.5通过激活AKT,使STX17和LAMP2表达降低,抑制自噬体与溶酶体的融合,阻断HUVECs正常的自噬流（autophagic flux）。（2）大蒜素可激活MAPK信号通路,促进Nrf2磷酸化,抑制NF-?B活化,一定程度上降低PM2.5诱导的内皮细胞氧化应激、炎症反应和凋亡,并恢复内皮细胞的自噬流和改善其功能。
黄丹[5]（2020）在《络病理论指导八子补肾胶囊干预绝经后动脉粥样硬化理论探讨与作用机制研究》文中提出女性绝经后因为雌激素缺乏,导致动脉粥样硬化风险明显上升。随着人口老龄化的发生,绝经后动脉粥样硬化已成为威胁老年女性健康的重大公共卫生问题之一。“脉络学说”和“气络学说”是络病理论的两大学科分支,脉络学说主要研究心脑血管疾病为代表的脉络病变,气络学说主要研究神经、内分泌、免疫类疾病为代表的气络病变。动脉粥样硬化属于典型的脉络病变,而绝经后女性以雌激素水平降低为代表的性激素功能紊乱则与气络病变相关,因此“绝经后动脉粥样硬化”属于“气络-脉络”共患疾病。目前以络病理论指导该病防治未见报道,络病理论指导下“络虚通补”代表性药物八子补肾胶囊具有填补肾精、燮理阴阳之功,且文献研究显示其药味中含有植物雌激素,因此,从脉络学说、气络学说分别探讨该病病机与治法,开展八子补肾胶囊防治该病的物质基础及作用机制研究具有重要意义。目的:本课题分别从中医络病理论和基础实验两个层面进行研究,理论部分基于该病属于“气络-脉络”共患病,从气络、脉络功能切入探讨该病中医病机、治法及组方,揭示络病理论对绝经后动脉粥样硬化的防治指导价值。实验部分通过建立绝经后动脉粥样小鼠模型及炎症致内皮细胞损伤模型,从整体动物、组织器官、分子等不同水平探讨八子补肾胶囊治疗绝经后动脉粥样硬化药效作用,重点围绕对雌激素膜受体、炎症、凋亡等方面探讨其作用机制,通过本课题为络病理论指导该病防治提供理论及实验数据支持。方法:1.理论探讨:本课题通过系统梳理气络、脉络、气血相关、肾精及补肾填精法的理论文献,从络病理论气血相关的角度探讨绝经后动脉粥样硬化属于“气络-脉络”共患疾病,从气络络属调节、自稳调控功能紊乱,脉络渗灌气血、濡养代谢功能异常角度切入,探讨该病中医病机、治法及组方,为络病理论指导绝经后动脉粥样硬化的防治提供理论依据。2.实验研究:实验一:应用Waters H-class UPLC色谱分析仪,紫外检测器,对八子补肾胶囊的指纹图谱进行实验研究。色谱条件:色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm,2.1*100mm;设置如下参数为初始条件,流速:0.3mL/min;波长:全波长扫描;柱温:30℃;进样体积:1μL;流动相:乙腈—酸水（0.1%磷酸水溶液）。样品处理方法:筛选含量较高的对照品可指认的优势成分,以其峰面积加和为指标,通过正交实验优化提取条件确定提取次数、提取溶剂、超声时长、溶剂体积。6-8周龄SPF级雌性C57BL/6J和雌性ApoE-/-小鼠（体重18～22g）,适应性喂养3天后,所有ApoE-/-小鼠行双侧卵巢切除术（Ovx）,C57BL/6J小鼠行假手术,术后恢复期7天,待体内残留雌激素消除后,将造模后的ApoE-/-小鼠随机分为4组,每组15只,即模型组（Model）、阳性对照组（G1）、八子补肾高剂量组（HD-BZ）和八子补肾低剂量组（LD-BZ）;C57BL/6小鼠作为对照组（Control）。对照组给予标准饲料喂养,其他组给予不含雌激素的高脂饲料喂养。G1组皮下注射G1 0.2 μg/d,八子补肾组每日给予八子补肾灌胃（HD-BZ组2.8g/kg/d、LD-BZ组1.4g/kg/d）,对照组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液每日灌胃。每日给药1次,连续12周。实验结束后,称量小鼠体重,处死小鼠,收集各组小鼠的血清、主动脉根部、主动脉弓、胸腹主动脉全程及子宫,检测相关指标。①称量各组小鼠的体重以及子宫重量,计算子宫萎缩指数。②采用放射免疫法检测各组小鼠血清雌二醇（E2）的含量。③采用代谢组学技术检测各组小鼠血清代谢产物的变化。④采用全自动生化分析仪检测小鼠血脂水平。⑤采用油红O染色技术观察各组小鼠胸腹主动脉的动脉粥样硬化斑块形成情况。⑥采用H&E染色和油红O染色技术观察各组小鼠主动脉根部的脂质沉积。实验二:动物实验部分:6-8周龄SPF级雌性C57BL/6J和雌性ApoE-/-小鼠（体重18～22g）,适应性喂养3天后,所有ApoE-/-小鼠行双侧卵巢切除术（Ovx）,C57BL/6J小鼠行假手术,术后恢复期7天,待体内残留雌激素消除后,将造模后的ApoE-/-小鼠随机分为4组,每组15只,即模型组（Model）、阳性对照组（GI）、八子补肾高剂量组（HD-BZ）和八子补肾低剂量组（LD-BZ）;C57BL/6小鼠作为对照组（Control）。对照组给予标准饲料喂养,其他组给予不含雌激素的高脂饲料喂养。G1组皮下注射G1 0.2 μg/d,八子补肾组每日给予八子补肾灌胃（HD-BZ组2.8g/kg/d、LD-BZ组1.4g/kg/d）,对照组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液每日灌胃。每日给药1次,连续12周。实验结束后,处死小鼠,收集各组小鼠血清、主动脉弓、胸主动脉及腹主动脉全程,检测炎症及凋亡形态学变化及相关分子生物学指标。①采用免疫荧光法观察各组小鼠主动脉弓动脉粥样硬化病变区域的炎症细胞聚集。②采用TUNEL凋亡检测各组小鼠血管动脉粥样硬化斑块中内皮细胞凋亡。③采用ELISA法检测各组小鼠血清粘附因子VCAM-1和ICAM-1分泌水平。④采用qRT-PCR法检测各组小鼠主动脉VCAM-1、ICAM-1、Bcl-2及Bax基因的表达。⑤采用Western blot法检测各组小鼠主动脉炎症相关蛋白p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、VCAM-1、ICAM-1 及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、cleaved caspase3 及 caspase3 的表达。细胞实验部分:体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,用氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）构建内皮细胞损伤模型。实验随机分为5组:即正常组（Control）:无血清培养基,模型组（Model）:无血清培养基+Ox-LDL、阳性对照组（G1）:G1（预给药4h）+无血清培养基+Ox-LDL、八子补肾高剂量组（HD-BZ）:HD-BZ（预给药4h）+无血清培养基+Ox-LDL和八子补肾低剂量组（LD-BZ）:LD-BZ（预给药4h）+无血清培养基+Ox-LDL。①采用MTS方法检测各组细胞生存活性变化,确定造模条件及G1、HD-BZ和LD-BZ剂量。②采用ELISA法检测各组细胞上清液中VCAM-1和ICAM-1含量。③采用流式细胞术检测各组HUVECs的凋亡率。④采用qRT-PCR技术检测各组细胞VCAM-1、ICAM-1、Bcl-2及Bax基因的表达水平。⑤采用Western blot技术检测各组HUVECs的炎症相关蛋白p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、VCAM-1、ICAM-1 及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、cleaved caspase3及caspase3的表达。实验三:体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,利用瞬时转染技术构建GPER1基因沉默内皮细胞模型。细胞随机分为6组:即空转对照组（siNC-Control）、空转模型组（siNC-Model）、空转八子补肾组（siNC-BZBS）、GPER1 基因沉默对照组（siGPER I-Control）、GPER1基因沉默模型组（siGPERl-Model）、GPER1基因沉默八子补肾组（siGPER1-BZBS）。①利用荧光显微镜下观察红色荧光物质的表达及Western blot技术鉴定GPER1沉默效率。②采用ELISA法检测各组细胞上清液中VCAM-1和ICAM-1含量。③采用流式细胞术检测各组转染细胞的凋亡率。④采用TUNEL凋亡检测各组转染细胞的凋亡率。⑤利用Western blot技术检测各组转染细胞炎症相关蛋白p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、VCAM-1、ICAM-1及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、cleaved caspase3 及 caspase3 的表达。结果:1.理论研究:①气络学说与脉络学说相结合是指导绝经后动脉粥样硬化的新理论学说。②肾精亏虚所致元气虚乏、宗气不足以贯心脉、营卫失和,引起气机气化异常导致络气虚滞,脉络瘀阻是老年女性脉络损伤的重要病机,补精化气是治疗绝经后动脉粥样硬化的主要治法。③八子补肾胶囊具有补肾填精、燮理阴阳之功,为绝经后动脉粥样硬化的临床预防和治疗提供了新的治疗手段。2.实验研究:实验一:①超高效液相色谱（Ultra high performance liquid chromatography,UPLS）指纹图谱鉴定出八子补肾胶囊含有14种化合物,分别是:新绿原酸（neochlorogenic acid）、绿原酸（chlorogenic acid）、隐绿原酸（cryptochlorogenic acid）、异槲皮苷（isoquercitrin,ISO）、金丝桃苷（Hyperoside,Hyp）、毛蕊花糖苷（verbascoside,VB）、朝藿定 A（epimedin A）、淫羊藿苷（icariin,ICA）、宝藿苷 I（baohuoside I）、欧前胡素（imperatorin,IMP）、蛇床子素（osthole,Ost）、梓醇（catalpol,CP）、五味子甲素（deoxyschizandrin）、五味子乙素（schisandrin B）。其中,除了新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸,另外11种均为PEs。②子宫萎缩指数结果显示,G1及BZBS均无明显刺激子宫增生作用。③血清E2结果显示,与Model组相比,G1组E2水平无明显变化,而HD-BZ组及LD-BZ组的E2浓度均上升。④血清代谢组学结果显示:OPLS-DA模型成功区分了各组,并揭示了 BZBS具有一定的治疗作用。鉴定出含量最高的4种化合物中,G1和BZBS能提高血清二十二碳六烯酸、3-羟基丁酸和5（Z）、8（Z）、11（Z）-二十碳三烯酸的含量,并降低溶血磷脂酰乙醇胺（18:0）含量。⑤血生化结果显示,与Model组相比,G1和BZBS可以明显降低血清TC、TG、LDL-C水平,同时提高HDL-C水平。⑥主动脉大体油红O染色显示:G1和BZBS能减少动脉粥样硬化斑块形成。⑦主动脉弓H&E染色和主动脉根部油红O染色结果显示:G1和BZBS能减少主动脉根部及主动脉弓的脂质沉积。实验二:动物实验部分:①免疫荧光结果显示:G1和BZBS能减少小鼠主动脉弓动脉粥样硬化病变区域的炎症细胞聚集。②TUNEL凋亡结果显示:G1和BZBS能减少小鼠血管动脉粥样硬化斑块内皮细胞凋亡。③ELISA结果显示:G1和BZBS能降低小鼠血清粘附因子VCAM-1和ICAM-1分泌水平。④qRT-PCR结果显示:G1和BZBS能使小鼠主动脉VCAM-1、ICAM-1、Bcl-2及B3x mRNA的表达减少。⑤Western blot结果显示:G1和BZBS 抑制 了小鼠主动脉 IκBα及 NFκB p65 磷酸化,使 p-IKBα/IκBα及 p-NFκB p65/NFκB p65比值降低,进而抑制下游VCAM-1、ICAM-1的表达;G1和BZBS还能上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase3的表达。细胞实验部分:(①MTS方法结果显示:Ox-LDL120μg/mL为造模浓度,G1 10nmol/L、HD-BZ 400μg/mL和LD-BZ 100μg/mL为后续实验浓度。②ELISA结果显示:G1和BZBS能降低细胞上清液中VCAM-1和ICAM-1含量。③流式细胞术结果显示:G1和BZBS降低细胞凋亡率。④qRT-PCR结果显示:G1和BZBS降低细胞VCAM-1、ICAM-1、Bcl-2及Bax mRNA的表达水平。⑤Western blot结果显示:G1和BZBS抑制NF-κB通路,降低 p-IκBα/IκBα及 p-NFκB p65/NFκB p65 比值,并抑制 VCAM-1、ICAM-1 的表达,还能上调Bcl-2水平,下调Bax水平及抑制caspase3的剪切和活化。实验三:①荧光显微镜下观察可见:细胞转染率达80%以上;Western Blot结果显示:与空转对照组相比,成功转染的细胞GPER1表达明显降低。②ELISA结果显示:siNC-Model组和siGPERl-Model组VCAM-1和ICAM-1蛋白含量明显上升,siGPER1-Model组更显着。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组显着抑制粘附分子表达;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组的抑制粘附分子表达的作用减弱。③流式细胞术结果显示:siNC-Model组和siGPER1-Model组凋亡率明显上升,siGPER1-Model组更显着。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组显着抑制凋亡;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组的抗凋亡作用减弱。④TUNEL凋亡结果显示:siNC-Model组和siGPER1-Model组凋亡率明显上升,siGPER1-Model组更显着。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组显着抑制凋亡;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组的抗凋亡作用减弱。⑤Western blot结果显示:siNC-Model 组和 siGPER1-Model组,NF-κB 信号通路相关蛋白（p-IκBα/IκBα、p-p65/p65）及下游VCAM-1和ICAM-1的表达均明显上调,siGPER1-Model组更显着。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组炎症相关蛋白表达水平明显下降;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组对炎症的抑制作用明显减弱。siNC-Model组和siGPER1-Model组,Bcl-2水平明显降低,而Bax及cleaved-caspase3的表达明显上升,siGPER1-Model组更显着。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组显着抑制凋亡;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组的抗凋亡作用明显减弱。结论:1.首次以络病理论指导绝经后动脉粥样硬化防治,基于气血相关的络病理论特色认为绝经后动脉粥样硬化属于“气络-脉络”共患病,提出肾精亏虚、络气虚滞、脉络瘀阻为该病主要病机,确立补精化气治法,八子补肾胶囊具有补肾填精、燮理阴阳的作用,成为防治绝经后动脉粥样硬化的有效药物。2.实验证实,八子补肾胶囊补精化气,补充植物雌激素,激活雌激素受体,系统调节血清代谢物谱紊乱,阻断血管炎症反应;调节脉络渗灌气血、濡养代谢功能,减轻炎症介导的血管内皮细胞凋亡,抑制动脉粥样硬化斑块形成,为八子补肾胶囊治疗绝经后动脉粥样硬化提供实验支持。
王子楠[6]（2020）在《硒蛋白S通过调节Akt/mTOR自噬通路抵抗高糖高脂诱导的血管内皮损伤》文中认为背景:糖尿病（DM）患者常处于高血糖、脂代谢紊乱、高血压等多重危险因素簇集的状态,这些危险因素互相影响,共同促进动脉粥样硬化（AS）的发生与发展。AS是心脑血管疾病的病理基础,内皮功能障碍（ED）不仅是AS发生的始动环节,也是促进其进展的重要因素,但是ED的发病机制极其复杂,至今尚未完全阐明。血管内皮细胞中的自噬是针对许多病理生理刺激的一种保护机制。近年来研究发现,自噬与ED及AS的发生发展均密切相关。当内皮受到氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、晚期糖基化终末产物（AGEs）等刺激时,内皮细胞可通过激活自身自噬来抵抗内皮炎症反应或氧化应激,而自噬受损可能是引发ED的主要机制之一。细胞自噬的发生是多因素参与的复杂过程,可受雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途径的负向调控。硒蛋白S（SelS）是一种跨膜的糖调节蛋白,可通过抗氧化应激、炎症反应、凋亡等途径发挥内皮保护作用。但SelS能否通过调节Akt/mTOR自噬通路保护内皮免受高糖和/或高脂的损伤尚不清楚。本研究拟通过观察不同SelS表达水平对高糖和/或高脂诱导的血管内皮损伤及Akt/mTOR自噬通路的影响,探讨SelS对内皮保护作用及可能机制,为SelS成为防治AS新的、有效的干预靶点提供实验依据及理论基础。方法:利用不同浓度糖或脂干预人主动脉内皮细胞（HAECs）,测定细胞生存率,构建高糖和/或高脂诱导HAECs损伤模型。应用Western Blot方法检测内皮一氧化氮合酶（eNOS）、内皮素-1（ET-1）、细胞间粘附因子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附因子-1（VCAM-1）及SelS蛋白表达水平的变化,探讨高糖和/或高脂对HAECs损伤与SelS的关系。应用透射电镜观察高糖和/或高脂干预后HAECs自噬小体,荧光显微镜观察指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集,Western Blot 方法检测 LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1 表达及 Akt/mTOR 磷酸化水平的变化,探讨高糖和/或高脂诱导HAECs损伤与自噬及Akt/mTOR自噬通路的关系;应用慢病毒感染技术获得过表达及低表达SelS的HAECs,高糖和/或高脂干预过表达或低表达SelS的HAECs,应用Western Blot方法检测eNOS、ET-1、ICAM-1,荧光显微镜观察指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集,Western Blot方法检测LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1表达及Akt/mTOR自噬通路蛋白磷酸化水平的变化,探讨调节SelS表达对高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤及Akt/mTOR自噬通路的影响。结果:成功构建高糖和/或高脂诱导HAECs损伤模型:高糖（Glu 35mmol/L）干预导致 HAECs 存活率为（76.57± 4.47）%,高脂（ox-LDL 50mg/L）干预导致HAECs存活率为（72.74± 6.59）%,高糖联合高脂（35mmol/L Glu+50mg/L ox-LDL）干预导致 HAECs 存活率为（55.84±5.35）%。高糖和/或高脂干预下,eNOS蛋白水平呈时间依赖性减少（P<0.05）,ET-1、ICAM-1蛋白水平呈时间依赖性增加（P<0.05）,表明随高糖和/或高脂干预时间的延长,HAECs损伤逐渐加重。高糖和/或高脂干预下,SelS蛋白水平呈时间依赖性增加（P<0.05）,提示,SelS与高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤有关。高糖和/或高脂诱导HAEC自噬水平先增加后减少,干预6h自噬水平最高。高糖和/或高脂干预HAECs 6h时,导致HAECs损伤:eNOS表达减少,ET-1、ICAM-1表达增加,尤以高糖联合高脂组最为显着（P<0.05）;同时伴有SelS表达增加,其中高糖联合高脂组与高脂组增加最显着（P<0.05）;均导致HAECs自噬显着增加:自噬小体增加,指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集增加,LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达增加,自噬产物降解相对不足,P62表达增加,其中高糖联合高脂组增加最显着（P<0.05）。高糖和/或高脂干预6h时,HAECs表达p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比值均显着减少,提示Akt/mTOR通路受到抑制,其中高糖联合高脂组抑制最显着（P<0.05）。高糖和/或高脂干预6h时,SelS表达均增加,其中高糖联合高脂组及高脂组较高糖组增加更显着（P<0.05）,提示SelS可能与高糖和/或高脂诱导的HAECs自噬及Akt/mTOR通路有关。过表达SelS能改善高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤:显着增加eNOS表达水平,显着降低ET-1、ICAM-1表达水平（P<0.05）;抑制HAECs自噬:显着减少指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集,减少LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平,增加P62蛋白表达（P<0.05）。而低表达SelS时,与过表达SelS结果正好相反,使高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤进一步加重:显着减少eNOS表达,增加ET-1、ICAM-1表达水平（P<0.05）;激活HAECs自噬:增加指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集,增加LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达,减少P62蛋白表达（P<0.05）。过表达SelS时,高糖和/或高脂诱导HAECs 表达 p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比值增加（P<0.05）,提示 Akt/mTOR通路被激活;低表达SelS时,高糖或高脂诱导HAECs表达p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比值减少（P<0.05）,提示Akt/mTOR通路被抑制。结论:1.高糖和/或高脂以时间依赖的趋势损伤内皮细胞,同时伴有自噬水平和SelS蛋白表达水平的变化,提示SelS与高糖和/高脂导致的内皮损伤及自噬有关。2.高糖和/或高脂诱导HAEC自噬呈先增加后减少的动态变化,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比值显着减少,SelS表达增加,提示SelS与高糖和/或高脂诱导的内皮细胞损伤及Akt/mTOR通路有关。3.高表达SelS时,Akt/mTOR通路激活,HAEC自噬受抑制,高糖和/或高脂诱导的内皮细胞损伤改善;而低表达SelS与此结果相反。表明SelS可能通过调节Akt/mTOR自噬通路保护内皮免受高糖和/或高脂的损伤。
白仲杰[7]（2020）在《杂化型H2S供体分子的设计、合成及生物活性研究》文中研究表明硫化氢（H2S）是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体;而在哺乳动物体内H2S可以由含硫氨基酸在酶催化下内源性生成。作为继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后被发现的第三种气体信号分子,生理水平的H2S可以通过减轻心肌损伤、保护血管、限制炎症和调节血压等机制促进心血管稳态和健康,对心脏和血液循环有非常深远的影响。为此本论文以心肌保护和动脉粥样硬化等心血管疾病为研究目标,设计及合成了两大类杂化型H2S供体分子,并对其进行了活性评价。内容主要包括:第一类,基于H2S和CO在抗炎、心肌保护等方面的协同作用,合成了一系列CO-H2S双释放分子22个,结构通式为[Mn（CO）4CS2NR1R2],用IR、NMR、HRMS及X-射线单晶衍射对其进行了表征;并从以下几方面对其进行了评价。（1）H2S和CO的释放能力,实验证实所有化合物不仅释放CO,而且释放H2S,但两者释放半衰期不同。（2）毒性评价:所有化合物对5种肿瘤细胞系和正常细胞系WI38均具有一定的增殖抑制作用,化合物1对HepG2细胞的抑制效果最好(IC50=26.9μM);以斑马鱼为模型的生殖抑制毒性结果表明,化合物1和2对斑马鱼胚胎的死亡率和孵化率具有剂量依赖性的诱导作用,而且随着孵化期的延长影响越显着。（3）生物活性评价:在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型中,化合物1和2表现出很强的抗炎活性,它们可以降低亚硝酸盐含量,下调TNF-α表达水平,并同时上调HO-1和IL-10的表达水平;但是未能降低COX-2的表达水平。在同一浓度下它们比仅释放H2S的化合物A1和A2的抗炎活性更加明显。这表明化合物1和2的抗炎作用可能是由CO和H2S协同作用引起的。在H9c2心肌细胞氧化损伤模型中,化合物表现出明显的心肌保护作用,其中以化合物1（50μM）在H2O2处理1h轻度损伤中的保护作用最为明显,这可能和CO和H2S能够降低MDA水平并同时恢复细胞内SOD水平有关。此外,化合物1和2还可使自发性高血压大鼠的收缩压和舒张压在一定时间范围内呈剂量依赖性降低。综上所述,双释放供体具有很好的心血管活性,同时它们也存在较小的安全边际。第二类,基于H2S的抗动脉粥样硬化潜力,在烟酸和氯贝丁酯的结构基础之上,合成了一系列杂化型的H2S供体18个,并对其进行表征和生物活性评价。（1）H2S释放:所有化合物均能有效释放H2S,其中化合物S1、S2和S3的H2S释放量最大且释放速率较慢,而含有COS基团的化合物的释放半衰期较短,甚至不超过2min。（2）细胞毒性:所有化合物对H9c2、HUVEC、RAW264.7和W138四种正常细胞系未显示出明显的毒性(IC50>500μM)。（3）在生物活性实验中,化合物S1、S3、S9和S14可明显提高ox-LDL处理的HUVEC细胞的存活率。Hoechst3342、PI和JC-1三种荧光染色和凋亡相关蛋白含量测定结果都能表明,这种保护作用和化合物能够抑制ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡有关。另外,化合物S1和S3可以显着降低ox-LDL诱导的泡沫细胞模型中TC和FC的含量,而且它们对脂质的影响比烟酸和氯贝特更加明显。化合物S1和S3还可以通过降低ROS和MDA并增加SOD的表达水平抑制泡沫细胞中的脂质氧化水平升高,同时降低由ox-LDL引起的泡沫细胞炎症反应。免疫印迹结果表明化合物对泡沫细胞形成的抑制作用和PI3K/Akt/NF-κb信号通路有关。此外,化合物S3还可以纠正高脂血症大鼠的脂质紊乱,并改善高脂饮食引起的大鼠肝细胞脂肪变性和主动脉血管壁结构紊乱。综合以上结果表明,化合物S3具有潜在的抗动脉粥样硬化作用。
赵健[8]（2020）在《不同品系Apoe-/-小鼠颈动脉结扎后内膜增生的比较及N-乙酰半胱氨酸（NAC）的干预研究》文中认为目的:脑卒中是我国成年人致残的重要原因,严重影响病患的劳动能力和生活质量。颈动脉动脉硬化是缺血性脑卒中的主要原因之一,颈动脉狭窄或闭塞的介入腔内治疗短期效果良好,但动脉成形术后再狭窄或闭塞仍是目前临床治疗面临的难题。动脉内膜增生是介入治疗后再狭窄的主要病理过程,前期的研究发现载脂蛋白E敲除的小鼠高脂饮食条件下结扎颈动脉可以在短期内出现颈动脉硬化病变,病变从由巨噬细胞源性泡沫细胞组成的脂肪条纹发展到包含平滑肌细胞的纤维斑块,再发展到含有新生血管的严重管腔狭窄,在增生的动脉内膜中我们可以观察到巨噬细胞、中性粒细胞浸润和中层迁移而来的血管平滑肌细胞（VSMC）,前期的研究发现局部的炎症反应和氧化应激是影响血管平滑肌细胞迁移和增殖的影响因素。C3H/HeJ（C3H）和C57BL6（B6）载脂蛋白E敲除小鼠在动脉硬化遗传易感性存在较大差异,分析这两种品系小鼠动脉内膜增生病变成分的差异有助于分析二者动脉硬化遗传易感性差异的机制。本研究首先通过比较上述两种品系小鼠高脂饮食下动脉内膜增生病变的成分差异,分析出可能影响早期动脉内膜增生的因素。然后通过干预病变巨噬细胞、中性粒细胞浸润和干预病变局部的氧化应激水平,观察其对动脉硬化易感的B6载脂蛋白E敲除小鼠动脉内膜增生病变的影响,分析可能的主要影响因素。最后通过细胞实验,明确N-乙酰半胱氨酸（NAC）能否调节ox-LDL刺激后血管平滑肌细胞的氧化应激水平,与血管平滑肌细胞的增殖和迁移的关系,及其对血管平滑肌细胞炎性因子的分泌影响。研究方法:1、在动物实验中,A组两种性别的B6-Apoe-/-和C3H-Apoe-/-小鼠在6周龄时开始高脂饮食,并持续12周,获取双侧颈动脉标本。B组选用4-8周龄的两种性别的B6-Apoe-/-和C3H-Apoe-/-小鼠,进行左侧颈动脉动脉结扎手术,术前1周开始喂饲高脂饮食,术后继续给予高脂饮食,结扎术后1天、3天、1周、2周、4周安乐死小鼠,获得双侧颈动脉标本;ELISA法检测分析空腹血脂水平,组织病理学测量比较动脉内膜增生面积、动脉中层面积等形态学指标。免疫组织化学方法分析病变的细胞成分。干预实验中,C组选用8周龄的两种性别的Mep1α-/-/Apoe-/-小鼠进行左侧颈动脉动脉结扎手术,术前1周及术后持续给予高脂饮食,颈动脉结扎术前1天开始每隔一天腹腔注射抗Ly6G抗体250微克/只治疗,持续4周,对照组腹腔注射生理盐水。术后4周安乐死小鼠,获取心脏及双侧颈动脉;D组选用5-12周龄的两种性别的B6-Apoe-/-小鼠进行左侧颈动脉动脉结扎手术,术前1周及术后给予高脂饮食,颈动脉结扎术前1天开始每隔2天腹腔注射抗CSF-1R抗体（AFS98）200微克/只治疗,持续2周,对照组注射生理盐水。术后2周安乐死小鼠,获取肝脏及双侧颈动脉组织;E组选用8周龄的两种性别的B6-Apoe-/-小鼠进行左侧颈动脉动脉结扎手术,术前1周及术后给予高脂饮食,术前1周开始N-乙酰半胱氨酸（NAC）按照1.5g/每公斤体重/每天和20g小鼠每日饮水约4-6ml计算,将NAC混于小鼠的饮用水中,术后继续口服混有NAC的饮用水,持续4周。对照组口服正常饮用水,术后4周安乐死小鼠,获取双侧颈动脉。病理学检查比较动脉内膜增生面积。免疫组织化学分析颈动脉内膜病变、主动脉根部病变及肝脏组织的特定细胞成分。ELISA法检测动物血浆炎性因子分泌水平。2、细胞实验使用人血管平滑肌细胞系,以50μg/ml的ox-LDL刺激血管平滑肌细胞,MTT法检测血管平滑肌细胞的增殖能力,划痕试验检测血管平滑肌细胞的迁移能力,流式细胞学方法测量血管平滑肌ROS水平。ELISA法检测细胞培养液中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）和分光光度法检测一氧化氮NO的水平。结果:1、在喂饲高脂饮食12周后,B6-Apoe-/-和C3H-Apoe-/-小鼠均出现了严重的高脂血症,C3H-Apoe-/-小鼠与B6-Apoe-/-小鼠相比,具有更高的血浆血脂水平。在未干扰颈动脉血流的情况下,高脂饮食12周后,B6-Apoe-/-小鼠出现进展期动脉粥样硬化病变,而C3H-Apoe-/-小鼠没有病变。而在结扎颈动脉后,在1周、2周、4周三个时间点,B6-Apoe-/-小鼠结扎侧动脉比C3H-Apoe-/-小鼠出现更大的动脉内膜病变。组织学上,C3H-Apoe-/-小鼠2周时出现脂纹,C3H-Apoe-/-小鼠4周时和B6-Apoe-/-小鼠2周时出现中等大小的纤维性病变。B6-Apoe-/-小鼠4周时出现进展期的动脉内膜病变,出现新生血管及严重管腔狭窄。两个品系小鼠的颈动脉均可观察到早期中性粒细胞粘附于内皮细胞及内膜病变中的中性粒细胞浸润。B6-Apoe-/-小鼠动脉最早在1周时出现内膜病变巨噬细胞浸润,两个品系小鼠在2周和4周时的动脉内膜病变中出现明显的巨噬细胞浸润。在C3H-Apoe-/-小鼠的病变中观察到CD4+T细胞,但在B6-Apoe-/-小鼠的病变中没有观察到。两个品系小鼠的动脉硬化内膜病变出现血管平滑细胞染色,动脉中层α-平滑肌肌动蛋白的免疫反应性均下降。抗Ly6G抗体治疗组与对照组相比,病变中性粒细胞浸润明显减少,但内膜增生病变大小相当。抗CSF-1R抗体治疗后小鼠巨噬细胞清除结果不稳定,治疗组与对照组内膜增生病变大小相当。抗氧化剂NAC治疗后颈动脉内膜增生小于对照组,MCP-1表达受到抑制,治疗组小鼠血浆MCP-1、TNF-α分泌水平减低,而IL-10分泌增加。2、以50μg/ml浓度的ox-LDL刺激血管平滑肌细胞后,测量发现每孔8000个细胞组血管平滑肌细胞在刺激后能平稳的增殖。NAC在1mM和2m M浓度能明显抑制血管平滑肌细胞增殖。划痕试验中2mM NAC治疗组24h和48h血管平滑肌细胞迁移面积小于对照组。流式细胞学实验发现1mM NAC及2mM NAC干预可以抑制血管平滑肌细胞的氧自由基ROS水平。ELISA检测细胞培养液中的MCP-1、TNF-α、IL-10,发现NAC可以抑制由ox-LDL诱导血管平滑肌细胞分泌的MCP-1、TNF-α（P<0.05）,促进血管平滑肌细胞分泌IL-10（P<0.05）;分光光度法检测发现NAC促进血管平滑肌细胞分泌NO（P<0.05）。结论:1、遗传背景、动脉血流对高脂血症Apoe-/-小鼠颈动脉粥样硬化形成具有显着影响。中性粒细胞对B6-Apoe-/-小鼠颈动脉结扎后动脉内膜增生不起主要作用。NAC治疗抑制B6-Apoe-/-小鼠颈动脉结扎后动脉内膜增生,部分因为NAC治疗可调节小鼠血浆MCP-1、TNF-α、IL-10水平。2、NAC通过抑制ROS进而抑制了血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移。NAC通过抑制VSMC MCP-1和TNF-α分泌而抑制VSMC的增殖和迁移,NAC促进VSMC IL-10和NO的分泌。抗氧化剂NAC有望成为预防动脉硬化闭塞和介入治疗后再狭窄的有效药物。
马萍萍[9]（2019）在《高盐环境下NFAT5介导动脉粥样硬化形成的分子机制探究》文中指出动脉粥样硬化（AS）是导致心脑血管疾病发病和死亡的主要原因之一。高盐摄入、脱水、糖尿病以及高渗治疗等高渗微环境因素均有助于AS的高发病率。在AS发生的初期,血管内皮细胞（ECs）可感知并响应这些心血管高危险因素,诱发自身功能障碍。血管内皮损伤是触发AS发生的起始环节,在AS的形成过程中起着至关重要的作用。尽管广泛的临床研究显示高盐摄入与内皮功能障碍密切相关,但对于高盐诱导AS形成的分子机制知之甚少。鉴于此,本文考察了高盐对ECs中NFAT5活化、炎症小体激活、纤维蛋白沉积及巨噬细胞浸润的影响,并建立高盐动物模型,验证高盐调控AS形成的相关分子机制。主要研究内容及相关结果如下:1.高盐诱导ECs中NFAT5的激活及AS形成构建高盐饮食动物和体外血管内皮细胞模型并对其AS形成、NFAT5表达及入核等情况进行分析。体内实验结果显示:高盐饮食显着提高了ApoE-/-小鼠血清中的钠离子和胆固醇等含量;高盐饮食显着增加ApoE-/-小鼠主动脉中AS的病变区域,尤其在主动脉弓区域斑块的形成更为严重;高盐的摄入明显促进了小鼠主动脉ECs中NFAT5的表达和核易位,且主动脉弓（aortic arch,AA）区域NFAT5的激活明显高于胸主动脉（thoracic aorta,TA）部位。体外细胞实验结果显示:高盐可显着上调人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中NFAT5基因和蛋白的表达,且呈剂量依赖性;高盐显着促进NFAT5蛋白在细胞核中的表达。2.NFAT5介导ECs中NLRP3炎症小体的激活及炎症反应利用实时定量PCR、蛋白质免疫印迹（WB）、酶联免疫吸附测定（ELISA）及免疫荧光染色技术,考察了NFAT5介导ECs中炎症小体激活及炎症反应的分子机制。体外结果显示:高盐呈浓度依赖性显着上调HUVECs中NLRP3和IL-1β的基因/蛋白表达水平。NLRP3基因的敲减可显着抑制HUVECs内高盐诱导的炎症小体的活性和IL-1β蛋白的分泌,下调下游粘附分子（E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1）等的表达,显着降低单核细胞的粘附数量。另外,敲减HUVECs的NFAT5基因可显着抑制NLRP3和IL-1β基因/蛋白的表达,以及炎症小体的活性和粘附分子的表达。相反,过表达NFAT5则显着增加HUVECs中NLRP3和IL-1β基因/蛋白的表达,以及炎症小体的活性和炎性粘附分子的表达。生物信息学分析预测了位于NLRP3和IL-1β基因转录起始位点分别存在着NFAT5结合位点（TGGAAGCTCT）和（ACAATATTCCA）,并且染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证实,高盐环境下NFAT5可直接结合在NLRP3和IL-1β启动子区域,上调HUVECs中NLRP3和IL-1β基因的转录。此外,NFAT5 siRNA可显着抑制高盐诱导的活性氧（ROS）的产生;ROS抑制剂（NAC）预处理HUVECs可显着降低NLRP3炎症小体的活性。进一步的体内实验证实:高盐摄入诱导ECs中炎症小体的激活及粘附分子的高表达,促进了ApoE-/-小鼠主动脉中巨噬细胞的浸润。3.NFAT5介导PAI-1纤溶酶系统的活性及纤维蛋白沉积实时定量PCR、WB及免疫荧光染色结果显示:高盐呈浓度依赖性显着上调HUVECs中PAI-1基因/蛋白表达水平,抑制纤溶酶原的表达和活性。敲减PAI-1基因可显着降低HUVECs中黏附分子的表达,抑制单核细胞的粘附和浸润行为。同时,NFAT5 siRNA处理显着下调PAI-1的表达,促进纤维蛋白溶解过程中相关蛋白（PLAT、PLAU和PLG）的高表达。相反,NFAT5过表达则显着增加PAI-1的表达,增强其抗纤维蛋白溶解活性。生物信息学分析预测了位于PAI-1基因转录起始位点存在着NFAT5结合位点（TGGAATTATTT）,并且ChIP实验证明高盐促进了NFAT5与PAI-1基因启动子的靶向结合,上调PAI-1基因的转录活性。体内实验结果证实,高盐摄入诱导了ApoE-/-小鼠主动脉ECs中PAI-1的高表达,增强抗纤维蛋白溶解活性及内皮粘附分子表达,促进小鼠主动脉中纤维蛋白的沉积和巨噬细胞的浸润。综上所述,本文研究结果表明,高盐刺激增加了ECs中转录因子NFAT5的表达和核易位,诱导靶基因NLRP3、IL-1β及PAI-1的基因转录和表达,导致ECs中炎症小体的激活及炎症反应,并促进主动脉内皮层中纤维蛋白沉积和巨噬细胞浸润,进而加速AS的形成。本研究的发现为内皮功能障碍和AS病变的形成机制提供了一种新的认识,并提示ECs是感受引发AS危险因素的直接靶细胞。这一AS发病机制的新认识具有明确的临床应用价值。
张晓东[10]（2019）在《桑色素在血管内皮细胞功能中的作用及机制研究》文中指出高血压是我国最常见的心血管疾病,其本质是微循环障碍。血压的升高是以外周阻力的增加为基础,其中阻力血管功能的改变促进了高血压的发生和发展。血管中的内皮细胞对维持血管功能尤为重要,内皮损伤导致血管功能障碍,引起血压升高。目前高血压患者主要通过服用降压药来控制血压,但是这些药物在维持血压的平稳性中具有局限性。研究发现,黄酮类化合物具有降血压的作用,桑色素被报道具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用。但是,桑色素在血管内皮细胞功能中的作用还有待深入探究。本研究从桑色素在阻力血管内皮细胞功能和炎症诱导的内皮细胞损伤中的作用及机制两方面来探究其在高血压中的作用。主要结果如下:1、通过血管张力实验检测桑色素对离体大鼠肠系膜动脉血管功能的影响发现,桑色素可浓度梯度性的引起大鼠肠系膜动脉血管的舒张。在N-硝基-L-精氨酸甲酯（N?-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride,L-NAME）诱导的高血压大鼠动物模型中,桑色素也可浓度梯度性引起模型大鼠肠系膜动脉血管舒张。并且,桑色素与离体的模型大鼠肠系膜动脉血管共孵育,显着提高模型大鼠肠系膜动脉血管对乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）介导的血管舒张的能力。通过对大鼠血压的测量,发现,在给定的桑色素喂食量下可降低模型大鼠的血压,并可提高模型大鼠肠系膜动脉血管对乙酰胆碱介导的血管舒张能力。2、阻力血管对血压的控制起着重要作用。内皮衍生的超极化因子（Endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF）通过引起内皮细胞超极化介导血管舒张,是介导阻力血管舒张的关键途径。内皮细胞中瞬时受体电位香草素亚家族4（Transient receptor potential vanilloid,TRPV4）通道的激活引起Ca2+内流可介导EDHF的产生。通过对离体大鼠肠系膜动脉血管进行血管张力实验发现,桑色素可内皮依赖性引起大鼠肠系膜动脉血管舒张。随后,在离体血管和细胞水平证明了桑色素通过激活TRPV4通道诱导内皮细胞中Ca2+内流介导血管舒张。由于TRPV4通道激活引起的细胞内Ca2+浓度的升高可激活参与EDHF机制的小电导钙激活的钾离子通道(small conductance Ca2+activated K+channels,SK)通道。通过对离体大鼠肠系膜动脉血管进行血管张力实验发现,SK通道参与桑色素介导的内皮依赖性的血管舒张。通过对原代内皮细胞中K+和细胞极化状态变化的研究发现,桑色素通过激活TRPV4和SK通道引起原代内皮细胞发生K+外流和细胞超极化。3、由于高血压的发生常伴有炎症水平的升高,炎症可使内皮细胞发生损伤,影响内皮细胞正常的功能。由于桑色素具有抗炎抗氧化的作用,因此,本研究在体外细胞水平探究桑色素对炎症引起的内皮细胞损伤的作用。细胞活力检测显示,氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）可显着降低人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的细胞活力,桑色素作用下可显着提高细胞活力。ox-LDL通过抑制HUVECs的细胞迁移能力、提高细胞氧化应激和细胞炎症因子水平引起HUVECs的损伤;桑色素作用下可显着缓解ox-LDL对HUVECs造成的损伤,说明桑色素对HUVECs起到保护作用。4、自噬是应激状态下的一种细胞保护机制,研究发现,天然化合物可以通过诱导内皮细胞产生自噬,起到心血管保护作用。本研究通过对自噬相关蛋白的表达和介导自噬产生的信号通路的分析来探究桑色素对内皮细胞的保护作用。结果显示:桑色素作用于ox-LDL处理的HUVECs可显着提高细胞内LC3蛋白和降低p62蛋白的表达,提高了HUVECs的自噬水平。自噬抑制剂氯喹（chloroquine phosphate,CQ）作用下,显着抑制HUVECs的细胞迁移能力、提高细胞氧化应激和提高细胞炎症因子水平。通过CQ抑制细胞自噬可以逆转桑色素对HUVECs的保护作用。对诱导自噬产生的信号通路的探究发现,在桑色素的作用下,细胞中p-AMPK的表达提高、p-mTOR的表达降低,说明AMPK信号通路被激活。在AMPK抑制剂Compoud C（CC）的作用下,AMPK信号通路被抑制、桑色素诱导的自噬水平的升高被抑制、桑色素对HUVECs起到保护作用被逆转。说明,桑色素通过激活AMPK信号通路诱导自噬产生介导对HUVECs的保护作用。
二、OX-LDL诱导内皮细胞条件培养液对内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、OX-LDL诱导内皮细胞条件培养液对内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的影响（论文提纲范文）
（1）miR-18a在高同型半胱氨酸血症诱导血管损伤中的治疗作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 Hcy的合成与代谢 |
| 1.2 HHcy与 CVD的关系 |
| 1.3 HHcy可能的致病机理 |
| 1.4 miRNA治疗进展 |
| 1.5 本课题研究工作 |
| 第2章 HHcy诱导血管内皮损伤和miR-18a的表达降低 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 体内HHcy动物模型的构建 |
| 2.4.2 体内探讨HHcy诱导的血管内皮损伤 |
| 2.4.3 体外探讨Hcy诱导的内皮细胞损伤 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 miR-18a抑制HHcy诱导的血管内皮细胞损伤 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 研究目的 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 试剂与材料 |
| 3.3.2 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 体内证实miR-18a可抑制HHcy诱导的血管内皮损伤 |
| 3.4.2 体外验证miR-18a抑制Hcy诱导的内皮细胞损伤 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第4章 miR-18a靶控PTEN抑制HHcy诱导的血管内皮损伤 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 试剂与材料 |
| 4.3.2 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 miR-18a靶向调控PTEN的表达 |
| 4.4.2 mRNA测序发现PTEN差异表达 |
| 4.4.3 过表达和沉默PTEN细胞模型的构建 |
| 4.4.4 miR-18a靶控PTEN抑制Hcy诱导的内皮细胞损伤 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第5章 全文总结 |
| 5.1 论文总结 |
| 5.2 研究结论 |
| 5.3 创新和意义 |
| 5.4 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 MicroRNAs在动脉粥样硬化抗炎治疗中的新进展 |
| 参考文献 |
（2）基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化 |
| 1.1 氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化关系 |
| 1.2 氧化型低密度脂蛋白对血管内皮细胞的影响 |
| 1.2.1 氧化型低密度脂蛋白与内皮功能异常 |
| 1.2.2 氧化型低密度脂蛋白促内质网应激与内皮细胞凋亡 |
| 1.3 氧化型低密度脂蛋白对血管炎症细胞的影响 |
| 1.4 氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞的影响 |
| 2.抗动脉粥样硬化药物研究进展 |
| 2.1 他汀类药物在抗动脉粥样硬化治疗中的应用 |
| 2.2 人参皂苷Rg3抗动脉粥样硬化作用研究进展 |
| 2.3 药物联合应用治疗动脉粥样硬化 |
| 第二章 人参皂苷Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液及配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 HUVECs的培养、传代和冻存 |
| 2.2 THP-1的培养、传代和冻存 |
| 2.3 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度的确定 |
| 2.4 Rg3对HUVECs生存率的影响 |
| 2.5 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用 |
| 2.6 划痕实验 |
| 2.7 THP-1细胞黏附实验 |
| 2.8 Transwell实验 |
| 2.9 免疫荧光检测 |
| 2.10 qPCR检测炎症因子表达的影响 |
| 2.11 Western Blot |
| 2.12 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度 |
| 3.2 Rg3对HUVECs生存率的影响 |
| 3.3 Rg3对ox-LDL降低HUVECs细胞生存率的作用 |
| 3.4 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs愈合能力的改善作用 |
| 3.5 Rg3对ox-LDL诱导THP-1对HUVECs黏附的抑制作用 |
| 3.6 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响 |
| 3.7 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs FAK磷酸化的影响 |
| 3.8 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs内MMP-2及MMP-9表达的影响 |
| 3.9 Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的影响 |
| 3.10 GW9662抑制PPARγ表达的浓度确定 |
| 3.11 GW9662和Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的作用 |
| 3.12 GW9662和Rg3对ox-LDL导致HUVECs迁移抑制、THP-1黏附及相关信号通路的作用 |
| 4.小结 |
| 第三章 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响 |
| 2.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用 |
| 2.3 试剂盒检测NO和氧化应激水平 |
| 2.4 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡 |
| 2.5 DAPI染色 |
| 2.6 qPCR检测 |
| 2.7 Western Blot |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响 |
| 3.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL导致HUVECs损伤的改善作用 |
| 3.3 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs NO分泌的影响 |
| 3.4 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs氧化应激的影响 |
| 3.5 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECse NOS磷酸化的影响 |
| 3.6 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs PI3K/Akt磷酸化的影响 |
| 3.7 瑞舒伐他汀对各组细胞Bcl-2/Bax表达的影响 |
| 3.8 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的影响 |
| 3.9 瑞舒伐他汀对各组HUVECs内CHOP、sXBP1及Caspase-12 mRNA水平的影响 |
| 3.10 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导的HUVECs内质网应激的影响 |
| 4.小结 |
| 第四章 人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导的ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化作用研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 动物的饲养 |
| 2.3 动脉粥样硬化模型复制及给药 |
| 2.4 血脂四项指标检测 |
| 2.5 Elisa试剂盒检测小鼠血清CRP水平 |
| 2.6 小鼠主动脉分离及主动脉大体油红O染色 |
| 2.7 HE及MASSON染色 |
| 2.8 免疫组织化学及免疫荧光染色 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 药物对AS小鼠体重及一般状态的影响 |
| 3.2 药物对AS斑块水平对影响 |
| 3.3 药物对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响 |
| 3.4 药物对AS小鼠血清CRP水平的影响 |
| 3.5 药物对AS小鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响 |
| 3.6 药物对AS小鼠主动脉纤维斑块层及胶原纤维水平的影响 |
| 3.7 药物对AS小鼠主动脉CD68及α-SMA表达的影响 |
| 4.小结 |
| 第五章 讨论 |
| 1.体外实验研究 |
| 1.1 Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究 |
| 1.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究 |
| 2.体内实验研究 |
| 2.1 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响 |
| 2.2 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清CRP水平的影响 |
| 2.3 Rg3与瑞舒伐他汀联用对ApoE~(-/-)小鼠AS病理改变的影响 |
| 结论及创新点 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得科研成果 |
| 致谢 |
（3）suPAR在抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词索引表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ANCA相关性血管炎患者血浆SUPAR的表达及意义 |
| 引言 |
| 研究对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SUPAR通过TLR4途径参与ANCA阳性IGG诱导的肾小球内皮细胞活化 |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 ANCA相关性血管炎生物标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表及待发表的论文 |
（4）大气PM2.5干扰内皮细胞自噬及大蒜素的改善作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写索引 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 大气PM_(2.5)干扰HUVECs自噬 |
| 1.2 大蒜素改善PM_(2.5)对内皮细胞功能的干扰 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 大气PM_(2.5)样本 |
| 2.2 细胞系 |
| 2.3 主要仪器和试剂 |
| 2.3.1 主要仪器 |
| 2.3.2 试剂和耗材 |
| 2.4 主要试剂的配制 |
| 2.4.1 细胞培养液和冻存液 |
| 2.4.2 磷酸盐缓冲液 |
| 2.4.3 PM_(2.5)和大蒜素工作液 |
| 2.4.4 3%牛血清白蛋白溶液 |
| 2.4.5 0.3 %TritonX-100 溶液 |
| 2.4.6 Western Blotting相关试剂 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 吖啶橙染色观察细胞内的酸性小体 |
| 2.5.3 单丹磺酰尸胺染色观察细胞内的自噬溶酶体 |
| 2.5.4 间接免疫荧光观察细胞内LC3、p62 puncta水平 |
| 2.5.5 透射电子镜显微镜观察细胞内自噬小体 |
| 2.5.6 LDH法检测大蒜素改善PM_(2.5)所致HUVECs的损伤 |
| 2.5.7 Hoechst33258 观察细胞内的凋亡小体 |
| 2.5.8 细胞凋亡率的检测 |
| 2.5.9 竞争酶联免疫吸附试验检测细胞因子 |
| 2.5.10 蛋白质免疫印迹法检测细胞蛋白的表达 |
| 2.6 统计分析处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PM_(2.5)干扰内皮细胞自噬 |
| 3.1.1 PM_(2.5)在HUVECs中的分布 |
| 3.1.2 TEM观察HUVECs的自噬小体 |
| 3.1.3 PM_(2.5)对HUVECs自噬相关蛋白表达的影响 |
| 3.1.4 PM_(2.5)对溶酶体功能的影响 |
| 3.1.5 PM_(2.5)对HUVECs中 AKT、ERK1/2-TFEB信号通路的影响 |
| 3.1.6 PM_(2.5)对HUVECs中 p62、STX17、LAMP2 蛋白表达的影响 |
| 3.2 大蒜素改善PM_(2.5)对内皮细胞功能的损伤 |
| 3.2.1 大蒜素降低PM_(2.5)诱导HUVECs释放LDH |
| 3.2.2 大蒜素改善PM_(2.5)所致内皮细胞功能紊乱 |
| 3.2.3 大蒜素改善PM_(2.5)所致HUVECs凋亡 |
| 3.2.4 大蒜素改善PM_(2.5)诱发HUVECs的炎症反应 |
| 3.2.5 大蒜素改善PM_(2.5)干扰HUVECs自噬 |
| 3.2.6 大蒜素降低PM_(2.5)所致HUVECs的氧化应激水平 |
| 3.2.7 大蒜素通过MAPK通路参与PM_(2.5)对HUVECs的调控作用 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 PM_(2.5)干扰HUVECs自噬 |
| 4.2 大蒜素改善PM_(2.5)干扰内皮细胞功能效应 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表(待发)论文 |
| 本论文得到以下课题的资助 |
| 致谢 |
（5）络病理论指导八子补肾胶囊干预绝经后动脉粥样硬化理论探讨与作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 络病理论指导八子补肾胶囊干预绝经后动脉粥样硬化理论探讨 |
| 1 气络学说与脉络学说相结合——指导绝经后动脉粥样硬化的新理论学说 |
| 1.1 络病理论概述 |
| 1.2 气血相关是络病理论特色——形而上“道”的哲学思想与形而下“器”的格物致知 |
| 1.3 气络与(血)脉络——行气血而营阴阳 |
| 1.4 脉络的渗灌气血、濡养代谢功能失常是动脉粥样硬化发生的基础 |
| 1.5 女子绝经导致的气络的络属调节和自稳调控功能紊乱与“下丘脑-垂体-性腺”轴功能失调具有相关性 |
| 1.6 绝经后动脉粥样硬化病机为肾精亏虚导致元气虚乏,宗气不足以贯心脉,营气不通、络气虚滞,脉络瘀阻 |
| 2 络病理论指导绝经后动脉粥样硬化防治研究 |
| 2.1 络虚通补之补精化气是绝经后动脉粥样硬化防治之本 |
| 2.2 八子补肾胶囊防治绝经后动脉粥样硬化具有独特优势 |
| 2.2.1 八子补肾胶囊重在补肾填精、燮理阴阳、补充肾气 |
| 2.2.2 八子补肾胶囊研究基础 |
| 3 小结 |
| 第二部分 实验研究八子补肾胶囊对绝经后动脉粥样硬化的干预作用研究 |
| 实验一 八子补肾胶囊对高脂饮食诱导的Ovx/ApoE~(-/-)小鼠脂代谢紊乱的干预作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 八子补肾胶囊对绝经后动脉粥样硬化炎症和凋亡影响及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 GPER1基因沉默后八子补肾胶囊对Ox-LDL诱导的HUVECs炎症和凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）硒蛋白S通过调节Akt/mTOR自噬通路抵抗高糖高脂诱导的血管内皮损伤（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 高糖和/或高脂诱导血管内皮细胞损伤及硒蛋白S表达的变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验室材料及设备 |
| 2.实验方法 |
| 3.数据分析 |
| 结果 |
| 1.构建高糖和/或高脂诱导HAECs损伤模型 |
| 2.高糖和/或高脂干预对HAECs存活率及功能的影响 |
| 3.高糖和/或高脂干预不同时间 HAECs SelS蛋白表达的变化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 高糖和/或高脂诱导血管内皮损伤与Akt/m TOR自噬通路的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料及设备 |
| 2.实验方法 |
| 3.数据分析 |
| 结果 |
| 1.不同时间高糖和/或高脂干预对HAECs表达LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及Beclin-1的影响 |
| 2.高糖和/或高脂干预6h对HAECs内皮功能及SelS蛋白表达的影响 |
| 3.高糖和/或高脂干预6h对HAECs自噬水平的影响 |
| 4.高糖和/或高脂干预6h对HAECs Akt/mTOR通路相关蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 调节Sel S表达对高糖和/或高脂诱导的血管内皮损伤及Akt/mTOR通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料及设备 |
| 2.实验方法 |
| 3.数据分析 |
| 结果 |
| 1.建立慢病毒感染HAECs过表达及低表达Sel S细胞模型 |
| 2.过表达及低表达SelS对高糖和/或高脂诱导的HAECs功能的影响 |
| 3.过表达及低表达SelS对高糖和/或高脂诱导的HAECs自噬水平影响 |
| 4.过表达及低表达SelS对高糖和/或高脂诱导的HAECs Akt/mTOR信号通路相关蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 本研究的局限性 |
| 本课题的创新点 |
| 综述 自噬与糖尿病并发症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）杂化型H2S供体分子的设计、合成及生物活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 H_2S的物理和化学性质 |
| 1.3 H_2S生物合成和代谢 |
| 1.3.1 CBS |
| 1.3.2 CSE |
| 1.3.3 3-MST |
| 1.3.4 非酶促途径 |
| 1.3.5 H_2S分解代谢 |
| 1.4 H_2S供体化合物 |
| 1.4.1 硫化盐 |
| 1.4.2 天然释放供体 |
| 1.4.3 合成的H_2S供体 |
| 1.5 H_2S供体抗动脉粥样硬化潜力 |
| 1.5.1 H_2S供体&氧化应激 |
| 1.5.2 H_2S供体&炎症 |
| 1.5.3 H_2S供体&脂质代谢 |
| 1.5.4 H_2S供体&巨噬细胞 |
| 1.5.5 H_2S供体&内皮细胞 |
| 1.5.6 H_2S供体&血管平滑肌细胞 |
| 1.5.7 H_2S供体&粘附分子 |
| 1.5.8 H_2S供体&血小板 |
| 1.6 选题思路 |
| 参考文献 |
| 第二章 羰基锰CO-H_2S双释放分子的合成及生物活性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2.2 化合物的合成及表征 |
| 2.2.3 CO释放能力的检测 |
| 2.2.4 H_2S释放能力的检测 |
| 2.2.5 肿瘤细胞增殖抑制 |
| 2.2.6 斑马鱼毒性 |
| 2.2.7 抗炎作用测定 |
| 2.2.8 心肌保护作用测定 |
| 2.2.9 抗高血压作用测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 合成和属性 |
| 2.3.2 H_2S和CO释放试验 |
| 2.3.3 肿瘤细胞增殖抑制活性 |
| 2.3.4 化合物对斑马鱼的毒性 |
| 2.3.5 抗炎作用 |
| 2.3.6 化合物的心肌保护作用 |
| 2.3.7 SHR中复合物的抗高血压作用 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于降脂结构H_2S供体的抗动脉粥样硬化作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器及试剂 |
| 3.2.2 化合物的合成及表征 |
| 3.2.3 硫化氢释放能力的检测 |
| 3.2.4 细胞毒性测定 |
| 3.2.5 化合物对ox-LDL诱导的HUVEC损伤的保护作用 |
| 3.2.6 化合物对泡沫细胞形成的影响 |
| 3.2.7 化合物对泡沫细胞内脂质积累的影响 |
| 3.2.8 泡沫细胞中脂质氧化水平的测定 |
| 3.2.9 泡沫细胞中炎症因子的测定 |
| 3.2.10 免疫印迹 |
| 3.2.11 化合物对高血脂大鼠的影响 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 合成与表征 |
| 3.3.2 化合物的硫化氢释放测试 |
| 3.3.3 化合物的细胞毒性 |
| 3.3.4 化合物对ox-LDL诱导的HUVEC损伤的保护作用 |
| 3.3.5 化合物对ox-LDL介导的泡沫细胞形成的影响 |
| 3.3.6 化合物对泡沫细胞中脂质积累的影响 |
| 3.3.7 化合物对泡沫细胞中脂质氧化的影响 |
| 3.3.8 化合物对泡沫细胞中炎症因子的影响 |
| 3.3.9 化合物对泡沫细胞中PI3K/Akt/NF-κb信号通路的影响 |
| 3.3.10 化合物3对高血脂大鼠体重的影响 |
| 3.3.11 化合物3对高血脂大鼠脂质代谢的影响 |
| 3.3.12 化合物3对高血脂大鼠肝脏和动脉血管壁的形态学影响 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 总结和展望 |
| 博士期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）不同品系Apoe-/-小鼠颈动脉结扎后内膜增生的比较及N-乙酰半胱氨酸（NAC）的干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:C57BL/6-Apoe~(-/-)与C3H-Apoe~(-/-)小鼠颈动脉结扎后动脉内膜增生的差异分析及针对炎症细胞、氧化应激的干预研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组 |
| 2.2.2 小鼠颈动脉结扎动脉硬化模型的建立 |
| 2.2.3 小鼠颈动脉获取及形态学测量 |
| 2.2.4 H&E染色 |
| 2.2.5 油红O染色 |
| 2.2.6 免疫组织化学分析 |
| 2.2.7 ELISA检测血脂 |
| 2.2.8 血中性粒细胞和T淋巴细胞的流式细胞学分析 |
| 2.2.9 ELISA法检测炎症介质 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 B6-Apoe~(-/-)小鼠与C3H-Apoe~(-/-)小鼠的空腹血脂水平 |
| 3.2 在不干扰颈动脉血流的情况下B6-Apoe~(-/-)小鼠与C3H-Apoe~(-/-)小鼠的颈动脉动脉硬化 |
| 3.3 B6-Apoe~(-/-)小鼠与C3H-Apoe~(-/-)小鼠颈动脉结扎后的颈动脉硬化 |
| 3.4 B6-Apoe~(-/-)小鼠与C3H-Apoe~(-/-)小鼠内膜病变的细胞学分析 |
| 3.5 外周血中性粒细胞和T淋巴细胞的流式细胞学分析 |
| 3.6 抗中性粒细胞抗体干预实验 |
| 3.6.1 抗Ly6G抗体治疗后动脉内膜增生病变形态学测量 |
| 3.6.2 抗Ly6G抗体治疗后内膜增生病变的细胞学分析 |
| 3.7 干扰巨噬细胞分化抗体干预实验 |
| 3.7.1 抗CSF-1R抗体治疗实验动脉内膜增生病变形态学测量 |
| 3.7.2 抗CSF-1R抗体治疗实验动脉内膜增生病变的细胞学分析 |
| 3.8 抗氧化剂NAC治疗实验结果 |
| 3.8.1 NAC治疗实验动脉内膜增生病变形态学测量 |
| 3.8.2 NAC治疗后内膜病变的免疫组织化学分析 |
| 3.8.3 NAC治疗后小鼠血浆炎性因子测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 遗传背景、血流对两个品系Apoe~(-/-)小鼠颈动脉硬化的影响 |
| 4.2 血脂与脂质沉积对两个品系Apoe~(-/-)小鼠颈动脉硬化的影响 |
| 4.3 炎症细胞对颈动脉结扎后颈动脉内膜增生的影响 |
| 4.4 血管平滑肌细胞参与颈动脉结扎后动脉内膜病变形成 |
| 4.5 氧化应激与颈动脉内膜增生 |
| 4.6 血浆炎性细胞因子与颈动脉内膜增生 |
| 5 结论 |
| 第二部分:N-乙酰半胱氨酸(NAC)通过调节氧化应激及炎症反应抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ox-LDL刺激血管平滑肌细胞 |
| 2.2.2 MTT法检测血管平滑肌细胞的增殖能力 |
| 2.2.3 划痕试验检测血管平滑肌细胞的迁移能力 |
| 2.2.4 流式细胞学方法测量血管平滑肌ROS水平 |
| 2.2.5 ELISA法检测细胞上清液中的MCP-1、TNF-α及 IL-10 的含量 |
| 2.2.6 分光光度法检测血管平滑肌细胞培养液中的一氧化氮(NO)的含量 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NAC对血管平滑肌细胞增殖的影响 |
| 3.2 NAC对血管平滑肌细胞迁移能力的影响 |
| 3.3 NAC对血管平滑肌细胞氧化应激的影响 |
| 3.4 NAC对血管平滑肌细胞分泌的炎性因子(MCP-1、TNF-α、IL-10)的影响 |
| 3.5 NAC对血管平滑肌细胞分泌一氧化氮(NO)的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）高盐环境下NFAT5介导动脉粥样硬化形成的分子机制探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 主要缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题提出及研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 致AS发生的高危因素 |
| 1.2.2 AS发生及发展进程 |
| 1.2.3 血管内皮细胞及功能 |
| 1.2.4 NFAT5因子与疾病 |
| 1.3 本文研究目的、意义及主要内容 |
| 1.3.1 本文研究目的及意义 |
| 1.3.2 本文研究的主要内容 |
| 1.3.3 本文研究的主要创新点 |
| 2 高盐诱导动脉粥样硬化中NFAT5因子表达评估 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 实验动物及HUVECs来源 |
| 2.2.2 主要实验仪器及耗材 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物高盐模型建立 |
| 2.3.2 AS形成的血管组织学检测 |
| 2.3.3 小鼠主动脉中NFAT5基因/蛋白表达检测 |
| 2.3.4 体外HUVECs的培养和高盐处理 |
| 2.3.5 体外HUVECs中 NFAT5 基因/蛋白表达检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 高盐摄入促进主动脉中AS形成 |
| 2.4.2 高盐摄入诱导主动脉ECs中 NFAT5 的表达及核易位 |
| 2.4.3 高盐处理对HUVECs形态及增殖的影响 |
| 2.4.4 高盐处理促进体外HUVECs中 NFAT5 表达及核易位 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 NFAT5 通过激活ECS中 NLRP3 炎症小体介导动脉粥样硬化形成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与试剂 |
| 3.2.1 实验动物及细胞的来源 |
| 3.2.2 主要实验仪器及耗材 |
| 3.2.3 主要实验试剂 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 高盐环境下,HUVECs中NLRP3及IL-1β表达的检测 |
| 3.3.2 高盐环境下,NLRP3 调节THP-1 粘附的分析 |
| 3.3.3 NFAT5 调控NLRP3 炎症小体活性及相关粘附分子表达的分析 |
| 3.3.4 NFAT5 调控NLRP3 基因转录的ChIP实验分析 |
| 3.3.5 ROS表达检测及其调控NLRP3 炎症小体活性的分析 |
| 3.3.6 小鼠主动脉/肾脏ECs中 NLRP3 等蛋白表达分析 |
| 3.3.7 小鼠主动脉壁巨噬细胞浸润检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 高盐促进了HUVECs中 NLRP3 炎症小体的激活及IL-1β的分泌 |
| 3.4.2 NLRP3 调节了下游相关蛋白的表达及对THP-1 的粘附 |
| 3.4.3 NFAT5 调控了NLRP3 炎症小体的活性及粘附分子的表达 |
| 3.4.4 高盐促进了NFAT5 蛋白与NLRP3和IL-1β基因启动子的结合 |
| 3.4.5 ROS参与了NFAT5 诱导的NLRP3 炎症小体激活 |
| 3.4.6 高盐摄入促进了小鼠ECs中 NLRP3 炎症小体激活及炎症反应 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 NFAT5 通过激活PAI-1 诱导的纤维蛋白沉积和巨噬细胞浸润介导动脉粥样硬化形成 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.1 实验动物及细胞的来源 |
| 4.2.2 主要实验仪器及耗材 |
| 4.2.3 主要实验试剂 |
| 4.2.4 主要试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 高盐环境下,HUVECs中 PAI-1 等基因/蛋白表达的检测 |
| 4.3.2 NFAT5 调控HUVECs中 PAI-1 基因/蛋白表达及其纤溶活性等的分析 |
| 4.3.3 高盐环境下,PAI-1 调节THP-1 粘附/迁移的分析 |
| 4.3.4 NFAT5 调控PAI-1 基因转录的ChIP实验分析 |
| 4.3.5 小鼠主动脉/肾脏ECs中 PAI-1 等蛋白表达检测 |
| 4.3.6 小鼠体内纤维蛋白沉积检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 高盐处理对HUVECs中 PAI-1 等基因表达的影响 |
| 4.4.2 NFAT5调控HUVECs中 PAI-1 等的表达及纤溶活性 |
| 4.4.3 PAI-1 调节HUVECs对 THP-1 的粘附和迁移 |
| 4.4.4 高盐促进了转录因子NFAT5与PAI-1 基因启动子的结合 |
| 4.4.5 高盐摄入促进小鼠主动脉/肾脏ECs中 PAI-1 的表达及抗纤溶活性 |
| 4.4.6 高盐摄入促进了小鼠主动脉壁纤维蛋白的沉积 |
| 4.5 分析与讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 后续研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B.作者在攻读学位期间参与的科研项目目录 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（10）桑色素在血管内皮细胞功能中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血管内皮细胞与高血压 |
| 1.1.1 血管内皮细胞 |
| 1.1.2 高血压 |
| 1.1.3 内皮细胞功能障碍与高血压 |
| 1.2 黄酮类化合物 |
| 1.2.1 黄酮类化合物概述 |
| 1.2.2 桑色素简介 |
| 1.2.3 桑色素与高血压 |
| 1.3 瞬时电位离子通道 |
| 1.3.1 TRP通道概述 |
| 1.3.2 TRPV4 通道简介 |
| 1.3.3 TRPV4 通道与高血压 |
| 1.4 自噬 |
| 1.4.1 自噬概述 |
| 1.4.2 自噬在内皮细胞中的作用 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 |
| 1.5.1 研究背景及立题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 桑色素对L-NAME诱导的高血压的作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 动物 |
| 2.2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2.3 试剂和溶液的配制 |
| 2.2.4 Wire myography血管张力检测 |
| 2.2.5 Pressure myography血管张力检测 |
| 2.2.6 血压检测 |
| 2.2.7 高血压大鼠造模 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 桑色素对离体大鼠肠系膜动脉血管功能的影响 |
| 2.3.2 桑色素通过体外作用对离体高血压大鼠肠系膜动脉血管功能的影响 |
| 2.3.3 桑色素对高血压大鼠血压的影响 |
| 2.3.4 桑色素喂食对高血压大鼠肠系膜动脉血管功能的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 桑色素在肠系膜动脉血管舒张中的作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 动物、质粒和细胞 |
| 3.2.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2.3 试剂和溶液的配制 |
| 3.2.4 Wire myography血管张力检测 |
| 3.2.5 Pressure myography血管张力检测 |
| 3.2.6 肠系膜原代动脉内皮细胞分离与培养 |
| 3.2.7 免疫荧光染色 |
| 3.2.8 Western Blot分析 |
| 3.2.9 细胞内Ca~(2+)检测 |
| 3.2.10 细胞培养和转染 |
| 3.2.11 细胞内K+检测 |
| 3.2.12 细胞膜电位检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 内皮细胞对桑色素介导的血管舒张功能的影响 |
| 3.3.2 NO通路对桑色素介导血管舒张作用的影响 |
| 3.3.3 PGI2 通路对桑色素介导血管舒张作用的影响 |
| 3.3.4 H2O2 通路对桑色素介导血管舒张作用的影响 |
| 3.3.5 TRPV4 通道对桑色素介导的血管舒张作用的影响 |
| 3.3.6 TRPV4 通道对桑色素介导的肠系膜原代动脉内皮细胞Ca~(2+)内流的影响 |
| 3.3.7 桑色素对TRPV4 基因敲除小鼠肠系膜原代动脉内皮细胞中Ca~(2+)内流的影响 |
| 3.3.8 桑色素对过表达TRPV4的HEK293 细胞中Ca~(2+)内流的影响 |
| 3.3.9 SK通道对桑色素介导的血管舒张作用的影响 |
| 3.3.10 桑色素对肠系膜原代动脉内皮细胞K+外流的影响 |
| 3.3.11 桑色素对肠系膜原代动脉内皮细胞膜电位变化的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 桑色素在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中的作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞株 |
| 4.2.2 实验试剂和仪器 |
| 4.2.3 试剂和溶液的配制 |
| 4.2.4 细胞活力检测(台盼蓝染色计数法) |
| 4.2.5 细胞迁移(transwell) |
| 4.2.6 细胞活性氧(ROS)检测 |
| 4.2.7 SOD和 MDA检测 |
| 4.2.8 qRT-PCR分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 桑色素对ox-LDL处理的HUVECs细胞活力变化的影响 |
| 4.3.2 桑色素对ox-LDL处理的HUVECs细胞迁移变化的影响 |
| 4.3.3 桑色素对ox-LDL处理的HUVECs细胞氧化应激水平的影响 |
| 4.3.4 桑色素对ox-LDL处理的HUVECs细胞炎症因子变化的影响 |
| 4.3.5 桑色素对ox-LDL处理的HUVECs细胞粘附分子变化的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 桑色素在内皮细胞损伤中的作用机制探究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 试剂和溶液的配制 |
| 5.2.4 Western Blot分析 |
| 5.2.5 细胞迁移(transwell) |
| 5.2.6 细胞活性氧(ROS)检测 |
| 5.2.7 qRT-PCR分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 桑色素对HUVECs细胞自噬水平的影响 |
| 5.3.2 桑色素介导的自噬对HUVECs细胞迁移的影响 |
| 5.3.3 桑色素介导的自噬对HUVECs细胞氧化应激水平变化的影响 |
| 5.3.4 桑色素介导的自噬对HUVECs细胞炎症水平的影响 |
| 5.3.5 AMPK信号通路对桑色素介导的HUVECs自噬水平的影响 |
| 5.3.6 桑色素介导的AMPK信号通路对HUVECs细胞迁移的影响 |
| 5.3.7 桑色素介导的AMPK信号通路对HUVECs氧化应激水平的影响 |
| 5.3.8 桑色素介导的AMPK信号通路对HUVECs细胞炎症水平的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
四、OX-LDL诱导内皮细胞条件培养液对内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的影响（论文参考文献）
- [1]miR-18a在高同型半胱氨酸血症诱导血管损伤中的治疗作用和机制研究[D]. 胡龙龙. 南昌大学, 2021(01)
- [2]基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究[D]. 耿嘉男. 吉林大学, 2020(01)
- [3]suPAR在抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎的作用及机制研究[D]. 黄菲. 华中科技大学, 2020(01)
- [4]大气PM2.5干扰内皮细胞自噬及大蒜素的改善作用机制[D]. 刘远凤. 南华大学, 2020
- [5]络病理论指导八子补肾胶囊干预绝经后动脉粥样硬化理论探讨与作用机制研究[D]. 黄丹. 南京中医药大学, 2020(08)
- [6]硒蛋白S通过调节Akt/mTOR自噬通路抵抗高糖高脂诱导的血管内皮损伤[D]. 王子楠. 大连医科大学, 2020(01)
- [7]杂化型H2S供体分子的设计、合成及生物活性研究[D]. 白仲杰. 兰州大学, 2020(01)
- [8]不同品系Apoe-/-小鼠颈动脉结扎后内膜增生的比较及N-乙酰半胱氨酸（NAC）的干预研究[D]. 赵健. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]高盐环境下NFAT5介导动脉粥样硬化形成的分子机制探究[D]. 马萍萍. 重庆大学, 2019(01)
- [10]桑色素在血管内皮细胞功能中的作用及机制研究[D]. 张晓东. 江南大学, 2019(05)