一、大鼠βB2晶体蛋白的克隆、高效表达及纯化（论文文献综述）
陆启荣[1]（2021）在《基于STSBPT策略探究ZPF及新型类似物靶向COX-2/PPAR-γ缓解LPS诱导的ALI/ARDS作用》文中研究指明由于多因素疾病的复杂性,单靶点药物并不总是表现出令人满意的治疗效果,而多靶点药理学被认为是发现新药并治疗复杂疾病的一种重要策略。与单靶点药物相比,多靶点药物可同时调节多个靶点进而提高治疗的有效性和安全性。急性肺损伤（ALI）与病情进一步严重的形式急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种多系统、多靶点、高死亡率的复杂性疾病,其病理特征包括不受控制的炎症反应、严重的肺水肿及其他肺部损伤的发生,且目前尚无有效的药物针对性的治疗ALI/ARDS。ALI/ARDS在畜禽中主要是会影响畜禽的各种呼吸道疾病,并伴随着炎症的爆发。因此,从源头上控制炎症风暴的发生则成为治疗和控制ALI/ARDS的重要策略。扎托布洛芬（ZPF）是一种选择性COX-2抑制剂具有强大的抗炎效果,在人体内代谢成多种代谢产物,与其他非甾体抗炎药,如吲哚美辛、普拉洛芬相比,ZPF能有效的抑制COX-2且对胃肠道的损伤更小。然而,ZPF是否通过其几种代谢物发挥抗炎作用及其深入机制仍需进一步研究,ZPF和活性代谢产物是否具有多靶点药物的潜能,以及ZPF及其活性代谢物是否可以通过多靶点来抑制炎症反应起到缓解ALI/ARDS的作用仍未被揭示。因此,本研究开发一种名为“靶蛋白类拓扑结构结合特性（STSBPT）”的策略用于预测ZPF和关键活性代谢物的蛋白靶点以及用于基于ZPF和活性代谢物母体结构、多重蛋白靶点的新型类似物的筛选;使用LPS诱导的RAW264.7细胞为炎性细胞模型,在细胞水平探讨ZPF及其活性代谢物在拮抗LPS诱导的RAW264.7细胞炎症中的作用以及调控机制;使用LPS诱导的雄性C57BL/6小鼠的ALI/ARDS模型,在动物水平探究ZPF,活性代谢物和新型类似物在治疗LPS诱导的ALI/ARDS炎症中的潜能,取得了以下结果:1.ZPF和活性代谢产物M2呈现高COX-2抑制活性和低COX-1抑制活性通过化学合成的方法成功合成了ZPF已知的3种代谢产物,M2、M3和M5。应用COX-1和COX-2抑制剂筛选试剂盒,对ZPF及其代谢物的COX酶抑制活性进行分析,结果显示M2比ZPF具有更强的COX-2抑制活性以及相对较弱的COX-1抑制活性,而M3和M5基本不具备COX酶活性。此外,应用SYBYL-X 2.0、Py MOL以及关键氨基酸位点突变试验探究ZPF及其代谢物与COX酶结合的关键氨基酸,从分子对接的对接打分角度发现ZPF和代谢物与COX结合的潜能与COX抑制剂筛选的结果呈现一致性,从对接结果和位点突变试验验证发现Arg120、Tyr355和Ser530是ZPF和M2与COX-2结合的关键氨基酸残基（AAR）。2.基于STSBPT策略预测PPAR-γ是ZPF和M2的另一关键抗炎靶点从受体与配体结合的活性口袋的空间密度、受体与配体结合的关键AAR的空间方向性、以及原型药物与代谢物药理活性的多重角度出发提出STSBPT策略。应用STSBPT策略筛选与COX-2靶点通路有关的抗炎蛋白,预测PPAR-γ可能是ZPF和M2的另一关键抗炎靶点。应用CETSA试验和DARTS试验进一步的验证发现ZPF和M2具有与COX-2和PPAR-γ结合的潜能,说明ZPF和M2具备COX-2和PPAR-γ双靶点的功能。3.ZPF和M2以MAPKs-PPAR-γ/NF-κB途径拮抗炎症反应应用LPS诱导的RAW264.7细胞为炎症细胞模型发现ZPF和M2能够不同程度的抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症相关基因和蛋白的表达（如i-NOS、COX-2、PPAR-γ、IL-1β、TNF-α）。应用细胞核和细胞质分离试验和免疫荧光试验,本研究发现ZPF和M2能够抑制NF-κB p65的核转移并激活PPAR-γ的核转移,进而起到抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应的作用。应用PPAR-γ的抑制剂GW9662探究PPAR-γ与NF-κB p65的关联性,发现GW9662能够在一定程度上降低ZPF和M2拮抗LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症反应,主要体现在GW9662能够一定程度上拮抗PPAR-γ的核转移以及促进NF-κB p65的核转移。应用LPS诱导的RAW264.7细胞为炎症细胞模型发现ZPF和M2能够不同程度的抑制MAPKs三种亚型（ERK1/2、p38 MAPK和JNK）的磷酸化状态。应用MAPKs的信号通路抑制剂,p38抑制剂（SB203580）和ERK1/2的抑制剂（PD98059）,发现ZPF及M2抑制LPS诱导的炎症反应的发生具有差异性,具体体现在M2侧重于对p-p38途径的调控作用以及对PPAR-γ的激活作用发挥抗炎作用,而ZPF侧重于对p-ERK途径的调控作用进而发挥抗炎作用。综合分析表明,ZPF及M2均可以通过MAPKs-PPAR-γ/NF-κB参与COX-2和i-NOS的表达,进而拮抗LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症反应。4.基于STSBPT策略筛选具备COX-2和PPAR-γ双抗炎靶点潜能的新型类似物从ZPF和M2的母体结构以及化学骈合的原理出发,应用STSBPT策略筛选具备COX-2和PPAR-γ双抗炎靶点潜能的新型类似物,成功筛选了具有COX-2和PPAR-γ双靶点的新型类似物D63、E63、JMC2、JMC5和JMC6。应用CCK-8试验对新型类似物的RAW264.7细胞毒性进行评价,并应用LPS诱导的RAW264.7细胞为炎症细胞模型发现新型类似物具有抑制COX-2蛋白表达以及促进PPAR-γ蛋白表达的潜能,且比ZPF和M2对COX-2和PPAR-γ的作用效果强。5.ZPF、M2及新型类似物具备缓解LPS诱导的雄性C57BL/6小鼠ALI/ARDS的炎症损伤作用以LPS诱导雄性C57BL/6小鼠ALI/ARDS的炎症损伤为动物模型探究ZPF、M2及新型类似物对LPS诱导的ALI/ARDS的炎症损伤的治疗作用。结果显示LPS能够显着的诱导小鼠肺组织出现肺水肿,而ZPF、M2和新型类似物均能不同程度的降低LPS诱导的肺水肿的发生。组织病理学观察和免疫组织化学分析发现ZPF、M2和新型类似物均能不同程度的降低LPS所致的肺组织的炎性损伤,并且ZPF、M2和新型类似物均可通过COX-2和PPAR-γ依赖的方式缓解LPS诱导的雄性C57BL/6小鼠ALI/ARDS的炎症损伤作用。本研究致力于从STSBPT策略的可行性和COX-2和PPAR-γ双靶点的角度,挖掘ZPF、活性代谢物M2和新型类似物的多重抗炎靶点、抗炎作用机制以及治疗ALI/ARDS的潜能,旨在实现“一种药物、多种靶点、一种疾病”的策略,为畜牧行业中的多系统性炎症反应性疾病,尤其是ALI/ARDS的预防和治疗提供理论依据。
李美慧[2]（2021）在《βB2晶体蛋白对卵巢癌细胞侵袭转移和化疗抵抗的影响及机制研究》文中认为研究背景及目的卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,发病率次于子宫颈癌和子宫内膜癌,但死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤首位,对女性生命健康造成严重威胁。卵巢恶性肿瘤中以上皮性卵巢癌最为多见。由于起病隐匿,70%卵巢癌患者就诊时已是晚期,手术和化疗综合治疗是目前中、晚期卵巢癌治疗的主要方法。肿瘤复发转移及化疗药物抵抗则是影响卵巢癌治疗效果的主要原因。因此,探究卵巢癌复发转移、化疗抵抗的分子机制,探寻有效的诊断治疗方法十分迫切。晶体蛋白是哺乳动物晶状体细胞质中主要的结构蛋白,主要分为α、β、γ三大类,βB2晶体蛋白（βB2 crystallin,Crybb2）是β族晶体蛋白中的主要组成成分。研究显示,Crybb2不仅在晶状体内作用,在晶状体外也是一种具有生理和病理特征的多功能蛋白。课题组研究发现βB2晶体蛋白与生殖能力密切相关,且可以作为影响小鼠卵巢、睾丸生殖功能的独立因素,βB2晶体蛋白通过引起颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌改变,使卵巢相应结构及功能受损,从而影响小鼠生殖。近年来,Crybb2在肿瘤中的独特作用被逐渐认知,Crybb2在恶性肿瘤组织如乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、神经胶质母细胞瘤等肿瘤中亦存在表达,并在相应组织中均发挥重要作用。相关研究提示,Crybb2与肿瘤细胞生长分化、侵袭转移相关,并且Crybb2过度表达与恶性肿瘤不良预后密切相关。目前尚未有报道提示Crybb2在卵巢癌中的作用。为进一步深入研究Crybb2在卵巢癌中的作用,我们临床卵巢癌病人标本中发现Crybb2在肿瘤组织中同样存在表达。预实验研究发现,Crybb2表达水平上调后卵巢癌细胞迁移能力增加,并且在相同浓度化疗药物处理下,Crybb2过表达卵巢癌细胞其细胞凋亡率降低。因此,本研究将首先探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响。卵巢癌细胞干性特征与化疗耐药、肿瘤转移及复发密不可分。进一步研究发现,过表达Crybb2可促进卵巢癌细胞EMT（上皮细胞-间充质细胞转换）能力,并且过表达Crybb2的卵巢癌细胞干性水平显着增强。上述结果提示,过表达Crybb2的卵巢癌细胞对化疗药物抵抗可能与介导卵巢癌细胞干性调控密切相关。相关研究提示,Crybb2作用与Wnt信号通路相关,Wnt信号通路是细胞存活的重要途径,与卵巢癌干细胞的耐药机制密切相关。那么Wnt信号通路是否在其中具有作用也值得深入研究。因此,我们将探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。综上所述,我们将探究Crybb2对卵巢细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响,并进一步探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。第一部分:Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响我们选用HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞,采用慢病毒细胞转染技术构建过表达Crybb2卵巢癌细胞模型,Western blot验证慢病毒转染效果后提示构建过表达Crybb2卵巢癌细胞模型成功,构建对照组及实验组:HO-8910、HO-LV-Ctrl、HO-LV-Crybb2;SKOV-3、SK-LV-Ctrl、SK-LV-Crybb2,分别为无病毒组、对照病毒组、实验病毒组。首先采用划痕实验处理HO-8910、HO-LV-Ctrl、HO-LV-Crybb2;SKOV-3、SK-LVCtrl、SK-LV-Crybb2组卵巢癌细胞,分别于0h、12h、24h记录细胞迁移改变,观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-LV-Crybb2、SK-LV-Crybb2组较Crybb2正常表达的卵巢癌细胞转移能力的改变;采用transwell实验观察48小时后,过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-8910、SKOV-3较Crybb2正常表达的卵巢癌细胞侵袭能力的改变。其次我们选用不同计量的化疗药物顺铂（Cisplatin）、紫杉醇（PTX;Paclitaxel）处理过表达Crybb2及正常表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞,采用cck-8实验观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞在不同顺铂、紫杉醇药物浓度处理48小时后细胞增殖较正常表达Crybb2的卵巢癌细胞的变化;再次利用流式细胞学实验验证CCK8实验的结果,观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞在顺铂、紫杉醇化疗药物处理48小时后细胞凋亡的改变。最后我们采用裸鼠构建裸鼠卵巢癌皮下成瘤模型,计量顺铂、紫杉醇化疗药物处理后裸鼠皮下成瘤大小的改变,体内实验观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞与正常表达Crybb2的卵巢癌细胞在裸鼠皮下成瘤后对化疗药物治疗敏感性的差异。结果提示,过表达Crybb2的HO-LV-Crybb2、SK-LV-Crybb2组卵巢癌细胞,其细胞侵袭转移能力较对照组HO-8910、HO-LV-Ctrl组及SKOV-3、SK-LV-Ctrl组卵巢癌细胞增强;并且,在顺铂、紫杉醇化疗药物处理后,过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-8910、SKOV-3较Crybb2正常表达的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞,其细胞存活率高、凋亡率低;同时,裸鼠皮下成瘤结果提示在相同条件顺铂、紫杉醇化疗药物处理后,过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞成瘤体积较大,对化疗药物敏感性较低,而正常表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞成瘤体积较小,对化疗药物敏感性高。综上,结果提示过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞侵袭转移能力更强,对化疗药物敏感性较低。第二部分:Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的机制研究卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗均与卵巢癌细胞的干性特征密切相关,卵巢癌细胞的EMT水平也是影响卵巢癌细胞侵袭转移的重要因素,本部分实验我们将初步探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。首先我们利用细胞免疫荧光实验检测过表达Crybb2的卵巢癌细胞与Crybb2正常表达的卵巢癌细胞,其E-cadherin、vimentin的表达差异,观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞较正常表达Crybb2的卵巢癌细胞EMT能力的改变。其次我们利用如下实验观察Crybb2对卵巢癌细胞干性水平的影响:细胞克隆实验观察在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对细胞克隆形成能力的影响;q RT-PCR、Western-blot检测在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对细胞干性标志物CD133、Nanog、Sox2表达的影响;裸鼠皮下成瘤实验观察在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对裸鼠皮下成瘤能力的差异;将裸鼠皮下成瘤取材后利用免疫组织化学染色观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞与正常表达Crybb2的卵巢癌细胞,其成瘤后细胞干性标志物的表达差异。结果提示,在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2后,其EMT表型明显增强、干性水平也有显着提高。其次,我们利用Western-blot检测Wnt通路关键蛋白Cyclin-D1、c-Myc、Wnt3a在过表达Crybb2及正常表达Crybb2的卵巢癌细胞的表达水平。最后我们采用Wnt通路抑制剂Wnt-c59反向干预过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞,再次通过CCK8实验观察Wnt通路抑制后过表达Crybb2的卵巢癌细胞在化疗药物顺铂、紫杉醇处理后细胞增殖、凋亡的改变,通过克隆形成实验观察Wnt通路抑制后过表达Crybb2的卵巢癌细胞干性特征的改变。结果显示,过表达Crybb2的卵巢癌细胞,其Wnt通路关键蛋白Cyclin-D1、c-Myc、Wnt3a表达升高;并且,过表达Crybb2的卵巢癌细胞经过Wnt通路抑制剂Wnt-c59反向干预处理后,其在化疗药物顺铂、紫杉醇处理后细胞存活率降低,敏感性升高,提示了Wnt通路在此过程中的重要作用。综述所述,我们的研究可得出如下结论:Crybb2可提高卵巢癌细胞侵袭转移能力,促进EMT的发生;Crybb2可促进卵巢癌细胞化疗抵抗的发生;Crybb2可通过提高卵巢癌细胞干性水平促进卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的发生;Crybb2可能通过介导Wnt信号通路提高卵巢癌细胞干性水平促进卵巢癌细胞化疗抵抗的发生。
督文军[3]（2021）在《新型JAK抑制剂的设计、合成及活性研究》文中研究说明炎症是机体受到损伤或受到外源性病原体入侵时,人体的免疫系统被激活,产生自我防御的反应。炎症的主要症状是红、肿、热、痛以及功能障碍。炎症会攻击自身组织,释放IL-1、IL-6、IL-1β、TNF-α之类的炎症因子,从而导致一系列疾病的发生。例如类风湿关节炎、动脉粥样硬化、帕金森病、银屑病等。JAK激酶是细胞内的非受体酪氨酸激酶家族,介导细胞因子产生的信号,并且通过JAK-STAT信号通路（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription）传递下去。该信号通路在近几年已经成为研究的热点,JAK抑制剂能够显着抑制多种炎症因子的产生从而起到治疗类风湿关节炎的作用。Filgotinib是一个口服的1,2,4-三唑[1,5-a]吡啶小分子JAK抑制剂,目前正在进行治疗类风湿性关节炎的Ⅲ期临床试验。本研究以Filgotinib为先导化合物,保留其优势片段,将分子结构中的苯环、苄基以及环丙酰基用不同的基团取代,设计出新型的三唑吡啶类化合物（A1-A4）,并经过加成、水解、酰化、suzuki偶联、脱氨基保护,以及取代等六步反应合成这些化合物。接着利用生物电子等排原理,将环丙基用三氟甲基取代、三唑吡啶用咪唑吡嗪取代,又设计出了新型咪唑吡嗪类化合物（B1-B4）。先经过还原、取代以及Gabriel反应得到5-氯吡嗪-2-甲胺中间体,然后在经过氨化还原、水解、酰化、脱水、取代等六步反应合成化合物B1-B4。通过激酶抑制活性实验筛选化合物的活性。得出化合物B2有最好的活性。在此基础上我们又以B2为先导化合物设计出了七个咪唑吡嗪类化合物,并经过氨化还原、水解、酰化、脱水、取代等六步反应合成了其中的四个化合物（B5-B8）。采用CCK-8法对化合物B5-B8和化合物B2进行了细胞增殖-毒性实验,在此基础上选择合适的浓度,对RAW264.7细胞进行了抗炎实验。以验证化合物的抗炎效果。研究的内容及结果如下:1.使用2-氨基-6-溴吡啶作为原料,经过加成、水解、酰化反应,得到化合物N-（5-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基）环丙烷甲酰胺（4）,然后在钯配合物的催化下,经过suzuki偶联反应、脱氨基保护反应得到化合物N-（5-（1,2,3,6-四氢吡啶-4-基）-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基）环丙烷甲酰胺（6）。化合物6分别与二甲基碳酰氯、硫代吗啉-1,1-二氧化物化反应得到化合物4-（2-（环丙烷甲酰胺基）-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-5-基）-N,N-二甲基-3,6-二氢吡啶-1（2H）-甲酰胺（A1）和化合物N-（5-（1-（1,1-二氧硫代吗啉-4-羰基）-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基）-[1,2,4]三唑[1,5-a]吡啶-2-基）环丙烷甲酰胺（A2）。2.以6-氧代-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯作为原料,经硼化还原和脱氨基保护反应得到化合物4-（2-氮杂螺[3.3]庚-6-基）-1,1-二氧化物硫代吗啉（9）跟化合物4-（2-氮杂螺[3.3]庚-6-基）吗啉（10）。然后分别与化合物N-（5-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基）环丙烷甲酰胺（4）发生取代反应得到化合物N-（5-（6-（1,1-二氧化硫代吗啉代）-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基）-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基）环丙烷甲酰胺（A3）和化合物N-（5-（6-吗啉代-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基）-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基）环丙烷甲酰胺（A4）。3.以5-氯吡嗪-2-羧酸甲酯为原料经过还原、取代和Gabriel反应合成了化合物5-氯吡嗪-2-甲胺（14）。4.使用对甲酰基苯甲酸甲酯作为原料,与不同的仲胺化合物经过氨化还原、水解、酰化、脱水和取代反应得到含伯胺的一系列化合物。其中与三氟乙酸酐反应得到化合物N-（3-（4-（（1,1-二氧化硫代吗啉代）甲基）苯基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基）-2,2,2-三氟乙酰胺B1。与环丙甲酰氯反应会得到化合物N-（3-（4-（（1,1-二氧化硫代吗啉代）甲基）苯基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基）环丙烷甲酰胺（B2）和化合物N-（3-（4-（吗啉代甲基）苯基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基）环丙烷甲酰胺（B5）、N-（3-（4-（（4,4-二氟哌啶-1-基）甲基）苯基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基）环丙烷甲酰胺（B6）和N-（3-（4-（（二甲基氨基）甲基）苯基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基）环丙烷甲酰胺（B7）。5.使用2-戊炔酸乙酯作为原料,经过偶极环加成反应、氢化反应、取代反应、水解反应、酰化反应和脱水反应得到化合物（±）3-（6-氯咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基）-4-乙基吡咯烷-1-羧酸苄酯（24）。化合物24通过偶联、脱氨基保护跟酰化这三步反应得到化合物（±）3-（6-（环丙烷甲酰胺基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基）-4-乙基-N-（2,2,2-三氟乙基）吡咯烷-1-羧酰胺（27）,然后通过手性高效液相色谱法的分离分别得到化合物（3R,4S）-3-（6-（环丙烷甲酰胺基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基）-4-乙基-N-（2,2,2-三氟乙基）吡咯烷-1-羧酰胺（B3）跟化合物（3S,4R）-3-（6-（环丙烷甲酰胺基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基）-4-乙基-N-（2,2,2-三氟乙基）吡咯烷-1-羧酰胺（B4）。6.使用4-（氨甲基）苯甲酸作为原料,经三氟乙酸酐的氨解、酰化、脱水三步反应生成具有咪唑并吡嗪环结构的化合物。然后再次经过取代,酰化反应得到目标化合物N-（3-（4-（（2,2,2-三氟乙酰氨基）甲基）苯基）咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基）环丙烷甲酰胺的（B8）。7.对化合物A1-A4和B1-B4进行体外激酶抑制实验。结果显示化合物B2对JAK1和JAK3的抑制效果最好,剩余活性分别为62.33%和34.07%。8.应用CCK-8法测定化合物B2和B5-B8对RAW264.7细胞的增殖-毒性实验。结果表明化合物B2跟化合物B5-B8在浓度为10-40（μmol/L）时与对照组相比无显着性差异。9.对化合物B2跟B5-B8进行细胞实验,以验证其抗炎效果。利用LPS诱导RAW264.7细胞,使其产生炎症因子IL-6,然后给予10、20、40μmol/L的药物浓度,采用ELISA法测定炎症因子IL-6的量。从结果可以看出LPS组的炎症因子明显增加,为101.4 pg/m L。与正常组（只含细胞）相比差异明显,P<0.05,说明建模成功。化合物B2、B5和B6组与LPS组相比IL-6的含量明显减少,且有显着性差异。说明化合物B2、B5和B6的抗炎效果呈剂量依赖性。10.对活性较好的三个化合物（B2、B5和B6）进行分子对接实验,以探讨化合物与JAK激酶相互作用的机制。综上所述,本课题使用Filgotinib为先导化合物,总共设计出了15个化合物,合成了其中12个未见报道的新型JAK抑制剂,并且还合成了两个未见报道的关键中间体。并对合成的化合物A1-A4和B1-B4进行体外激酶实验,在浓度为0.2μM时,化合物B2对JAK1和JAK3的剩余抑制率为62.33%和34.07%。又通过细胞实验发现化合物B2,B5和B6在浓度为10-40（μmol/L）具有较好的抗炎效果,与LPS模型相比差异明显,P<0.05。通过分子对接实验解释了化合物B2,B5以及B6与JAK激酶相互作用的机制,为JAK抑制剂在抗炎方面的研究奠定了基础。
翁少亭[4]（2020）在《利用rAAV-SaCas9系统敲除肌细胞的myostatin基因并评价其对肌肉萎缩的改善作用》文中提出目的:一体化的AAV-Cas9-sg RNA系统有免疫原性低,宿主范围广,安全性高,能长时间稳定表达,构建快捷等优势,已经在基因组编辑和基因表达调控上得到应用。但是,该系统自身的容量小,蛋白表达水平少,基因的特异性识别以及编辑能力较低等都限制了体内应用。与此同时,通过CRISPR/Cas9调控TGF-β家族信号通路影响肌肉细胞增殖与分化,从而改善癌症,恶病质,肌肉衰减综合征等肌肉萎缩性疾病的治疗方法有广阔前景。因此,一种理想的AAV-Cas9-sg RNA系统是该技术应用于基因研究与治疗的基础。本文对AAV-Cas9-sg RNA系统进行了优化构建出r AAV-Sa Cas9-sg RNA系统,并通过体内外敲除肌细胞的myostatin基因,分析敲除后的肌细胞形态变化和相关细胞因子的变化,探索利用r AAV-Sa Cas9-sg RNA系统敲除肌细胞myostatin基因改善肌肉萎缩性疾病的效果。方法:1.我们在p X601质粒中插入了嘌呤霉素抗性基因,然后设计出打靶myostatin基因的sg RNA,构建出有敲除能力的p X601-puro-sg Mstn质粒。然后通过转染C2C12细胞,嘌呤霉素抗性培养基进行细胞筛选,有限浓度稀释法培养单细胞克隆,最后鉴定出myostatin基因敲除的单克隆细胞系。通过RT-PCR和Western Bloting分析C2C12单克隆细胞系中TGF-β信号通路,AKT-m TOR信号通路以及MRFs中关键细胞因子的变化;并通过CCK8法和流式细胞术分析C2C12单克隆细胞系在细胞增殖活性以及细胞周期的变化。2.我们用EF1α启动子,t RNA启动子替换了p X601质粒中的CMV与U6启动子,构建出新的含Sa Cas9的质粒R-p X601。然后在质粒R-p X601中插入了e-GFP荧光蛋白的表达序列,通过3质粒共转染HEK293细胞的方法包装并纯化出r AAV-Sa Cas9-sg Mstn。通过基因测序和Western Bloting分析r AAV-Sa Cas9-sg Mstn对myostatin基因及其蛋白的表达影响;通过流式细胞术以及荧光成像的方法摸索不同病毒量以及时间段r AAV-Sa Cas9-sg Mstn在体内与体外表达的效果。然后用摸索条件后的AAV-Sa Cas9-sg Mstn作用于肌肉萎缩的小鼠模型并分析小鼠肌细胞组织学及细胞学变化。3.最后我们分别包装了含有R-p X601和p X601的AAV重组病毒,并分别对老龄鼠的大腿肌肉进行了myostatin基因编辑。通过组织切片及组织免疫荧光的方法对肌纤维以及卫星细胞进行了分析。最后通过RT-PCR和Western Bloting分析相关信号通路中细胞因子的变化,探究部分敲除老龄鼠的myostatin基因对肌细胞增殖的影响。结果:1.我们成功构建了含嘌呤霉素抗性的p X601-puro-sg Mstn质粒。通过T7酶切鉴定,测序分析以及打靶效率分析等证明构建质粒在细胞中有基因编辑能力;通过该质粒转染筛选出myostatin基因敲除的C2C12单克隆细胞系;通过对C2C12单克隆细胞系相关信号通路TGF-β,AKT-m TOR以及MRFs的分析证明敲除myostatin后细胞周期变活跃,胞内蛋白质合成增加以及促肌细胞生成蛋白增加。通过CCK-8及流式细胞术结果分析证明myostatin蛋白表达对C2C12细胞增殖以及细胞周期有明显促进作用。2.我们证明r AAV-Sa Cas9系统的启动子能够稳定、长期地表达基因编辑元件,并且一定范围内随着r AAV在体内外剂量的增加,myostatin的编辑效率和e GFP蛋白的表达水平增加。通过e GFP蛋白的表达水平可以间接了解Cas9蛋白的基因编辑效率。此外,我们还证明了在小鼠肌肉萎缩模型中通过靶向敲除部分myostatin基因能改善小鼠肌肉细胞的性状。3.我们用两个系统R-p X601和p X601分别成功包装出r AAV9,并证明它们有效地编辑了myostatin基因。通过敲除老龄鼠的myostatin基因,我们观察到试验鼠体重增加,肌纤维数量和横截面积增加。myostatin基因敲除导致TGF-β信号传导途径改变,并增加Myo D、Pax7和Myo G蛋白水平,增加卫星细胞数量,促进肌肉细胞分化与增殖。此外,敲除myostatin基因使MURF1和Atrogin1蛋白水平下降,有效抑制了肌肉细胞萎缩。结论:我们构建了一个小巧的一体化r AAV-Sa Cas9基因组编辑系统,它能有效的进行体内外myostatin基因的敲除。敲除myostatin基因后的肌细胞增殖分化能力增强并且抑制其凋亡,通过分析相关细胞因子发现myostatin基因对肌调控生长因子以及促蛋白合成/降解因子有明显影响。这在基因治疗肌肉萎缩疾病,如恶病质,癌症以及老龄性肌肉衰减综合征等一些慢性消耗性疾病上有潜在的应用价值。
曾友根[5]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中研究指明目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
周定港[6]（2016）在《转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究》文中提出甘蔗（Saccharum spp.）是最重要的糖料作物,虫害是影响甘蔗产量、品质和宿根年限的主要限制因素之一,其中螟虫危害最为严重,并具有全生长季危害的特点,对产业造成严重损失。与大多数作物一样,甘蔗基因池中缺乏抗虫基因,加上甘蔗遗传背景复杂,因此,传统杂交育种培育抗虫品种难度大,导致甘蔗栽培品种抗虫性差。转cey1Ac基因在玉米、棉花等作物抗虫性改良上效果显着并已大面积商业化应用,且其安全性已经得到证实,因此,通过转基因技术改造甘蔗抗虫性,培育抗虫品种并创制可用于杂交利用的抗虫种质是目前最为有效的途径。甘蔗又是工业原料作物和营养繁殖作物,转基因安全风险等级为最低（I级）,而蔗糖结晶经过107℃高温过程,并未在转基因甘蔗加工而成的蔗糖中检出外源基因成分或蛋白成分,因此,转基因甘蔗的商业化应用值得期待。本研究以基因枪轰击获得的转cry1Ac基因甘蔗群体为实验材料,开展了外源基因成分特异、高效、灵敏的检测技术研究以及对抗性拟转基因甘蔗株系进行了真实性鉴定,奠定了转基因甘蔗深入研究的重要基础性工作;而外源基因的相对低拷贝是外源基因稳定整合和适度表达的前提,甘蔗上是否也有类似情况尚未可知。考虑到甘蔗基因组高达10Gb且倍性复杂,生物素标记的Southern杂交信号弱、效果差,我们建立了高效、安全稳定的外源基因拷贝数鉴定技术,实现了对转基因群体外源基因的拷贝数的高效低成本鉴定;继而探究了转基因甘蔗株系的遗传稳定性及外源基因的插入位点或旁侧序列,探究了转基因群体cry1Ac蛋白的时空表达特性等,对后续系统生物学研究具有重要意义。在此基础上,对外源基因拷贝数、转基因甘蔗产量、品质性状和抗虫性进行了关联分析,以期探索转cry1Ac基因甘蔗的分子特征与生物学特性之间的关系,并对外源目的蛋白表达对甘蔗根际土壤微生态中微生物的影响进行了评价。进一步,通过典型转基因株系与非转基因对照的RNA-seq转录组学分析转基因的非预期效应,试图从分子和基因整体水平上,揭示抗虫转基因甘蔗及其受体FN15非转基因甘蔗相关代谢和信号通路应答机制的差异,从而解析生物学特性差异的分子基础。该研究具有重要的科学意义和实际应用价值。本研究得到国家自然科学基金项目（No.31271782）和福建农林大学优秀博士学位论文基金（No.1122YB015）的资助。相关研究的主要结果与结论如下:1.基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术原理,针对转基因甘蔗外源目的基因cry1Ac序列（GenBank:KF630361.1）和bar基因序列（GenBank:EU048867.1）设计特异性的LAMP扩增引物,优化了 cry1Ac-LAMP的主要体系成分,25.0μL反应体系含有:5.25mMMg2+、4:1的内外引物比、2.0U的M大片段DNA聚合酶,其敏感性较常规PCR灵敏10倍,检测限为43.1 copies的质粒1Ac0229和1.0 ng·μL/-1的转基因甘蔗（cry1Ac拷贝数为21.89 copies·cell-1）基因组DNA。bar-LAMP优化后的25.0μL反应体系含有:5.25 mMMg2+、6:1的内外引物比、6.0 U的Bst大片段DNA聚合酶;其敏感性较常规PCR灵敏10倍,检测限是10 copies的质粒1Ac0229;特异性探究实验发现cry1Ac-LAMP和bar-LAMP只能检测到含有特异cry1Ac基因或bar基因的甘蔗样品,拟转基因系的应用检测试验发现所建立的方法cry1Ac-LAMP和bar-LAMP技术是可靠的。结果表明,建立的cry1Ac-LAMP和bar-LAMP检测技术方法特异性强、灵敏度高、快速省时、结果可靠,可视化检测尤其适用于转基因甘蔗的田间现场筛查检测与监管,具有很好的应用价值和推广前景。2.基于前人报道腺苷 5-磷酰硫酸还原酶（Adenosine 5’-phosphosulfatereductase,APRT）、细胞周期素（Cyclin,CYC）和脯氨酰-4-羟化酶（Prolyl4-hydroxylase,P4H）三个基因是甘蔗潜在的具有高特异性和低拷贝数内标准基因。我们克隆了APRT、CYC和P4H基因并构建了多元内标准基因靶标标准质粒（p1AcAPC）,建立了基于这个标准质粒的TaqMan实时荧光定量PCR技术,对转cry1Ac基因的抗性再生甘蔗植株群体的拷贝数进行了鉴定。该方法具有高特异性和高敏感性,检测操作简便,效率高等特点,其定量结果不仅可作为转cry1Ac基因甘蔗真实性鉴定的佐证,更主要的是可以实现快速鉴定转基因甘蔗的拷贝数,相关研究也是转cry1Ac基因甘蔗遗传稳定分析及后续系统生物学研究的基础。3.外源基因拷贝数、转基因甘蔗产量、品质和抗虫性进行关联分析的研究结果与结论如下:（1）外源目的基因cry1Ac以中等拷贝数导入和整合,有利于抗虫目标性状改良,并增加获得对非目标性状影响不大的转化事件的几率,可能是由于现代甘蔗栽培种至少为八倍体,且染色体数目约为120条,基因组达10 Gb,因此,低拷贝数外源目的基因的导入和整合,其所表达的蛋白对抗虫目标性状的改良效果不明显,这与二倍体物种如水稻等有较大的不同,但高拷贝的导入和整合又导致非目标性状如甘蔗产量和品质性状变劣。此外,我们还观察到蛋白表达与外源基因拷贝数之间没有确定的线性关系或剂量效应;（2）在FN15为受体的转基因系群体中,中拷贝型的转基因株系表现出更好的产量与品质性状表型,并从中筛选到1个（a1株系）单位面积产糖量优于非转基因对照、2个（a5和a6株系）与对照相当但螟害率显着低于对照的株系,待完成安全性评价后,有望直接作为甘蔗生产性品种利用或作为杂交亲本用于甘蔗抗螟虫育种。4.转基因甘蔗的蛋白时空表达情况,其研究结果如下:（1）FN15受体转基因群体和ROC22受体转基因群体,cry1Ac蛋白在甘蔗不同的组织部位的表达均呈现出蔗叶中表达量最高、根次之、茎中最低的趋势;（2）FN15受体转基因群体和ROC22受体转基因群体,cry1Ac蛋白在不同生长阶段的表达呈现出分蘖期最高、成熟期次之、拔节期最低的趋势;（3）根中的cry1Ac蛋白表达情况最为复杂:FN15受体转基因系中,蔗根中cry1Ac蛋白表达呈现出成熟期最高、拔节期次之、分蘖期最低的趋势;而ROC22受体转基因系中,蔗根中cry1Ac蛋白表达呈现出分蘖期最高、拔节期次之、成熟期最低的趋势;（4）对于FN15受体的转基因株系,中拷贝型的al和a5株系在各生育期其cry1Ac表达量均高于低拷贝型的19b-2和19b-4株系;而ROC22为受体的转基因株系,则没有这个趋势。发现转cry1Ac基因甘蔗外源cry1Ac蛋白存在一定的动态时空表达特性,并具有受体基因型的差异。5.通过单引物PCR、Genome walking试剂盒（TaKaRa）和hi-Tail PCR等三种方法,对转cry1Ac基因甘蔗外源基因插入位点进行了研究。研究发现,单引物PCR法特异性较低;Genome walking试剂盒（TaKaRa）获得克隆条带过大（约5 Kb）、加上随机引物（AP）为混合物且为专利产品,给TA克隆测序带来了挑战、实验成本和周期长,不利于序列分析;hi-Tail PCR法中加入了 AC1及其LAD引物的巧妙设计,极大地提高了获得旁侧序列的能力。采用hi-Tail PCR法,成功鉴定了 a1株系左右边界和a5株系右边界的旁侧序列,发现基因枪法轰击转化的转基因甘蔗外源基因趋向于整合到线粒体等环状DNA中。6.通过PCR-DGGE法,对6个转cry1Ac基因甘蔗株系根际土壤微生态的微生物物群落和进化关系进行了研究,发现土壤微生物群落的变化是动态的,可能与生长时期、季节和环境等因素有关,但从整体和长期趋势来看,转基因系和非转基因系对土壤微生态的作用是一致的。7.转cry1Ac基因甘蔗及非转基因对照的RNA-seq转录组表达谱分析转基因甘蔗的非预期效应,其研究结果如下:（1）本研究RNA-seq测序与组装的质量高。12个甘蔗样品共获得了 83.50 Gb的数据量和668,017,350条的总reads数。组装得到的甘蔗Unigene库总共含有65,995条Unigenes,N50长度达到了 1,049 bp,平均组装长度为715.14 bp。（2）差异基因表达统计发现,上/下调表达情况较丰富,转基因系和非转基因系差异表达的基因总共有1,067个,共同上调表达的基因总共有199个,共同下调表达的基因总共有473个。（3）转基因系和非转基因系相比,上调表达基因的代谢途径主要涉及与植物次生代谢途径相关,有苯丙氨酸代谢途径、甘油酯代谢途径、亚油酸代谢途径、类黄酮生物合成和二萜生物合成途径等,其次是植物激素转导途径。下调表达基因的代谢途径主要涉及异羟肟酸生物合成等化学防御代谢途径,脂肪酸代谢等基础代谢途径以及植物激素信号转导、植物-病原互作等代谢通路。这些有关转基因甘蔗转录本潜在功能的分析,初步揭示了转基因甘蔗典型株系的抗虫性和其他表型性状形成的分子基础,而这些途径中与植物抗逆和防御相关的基因以及中、低拷贝型株系间的差异基因是后续深入研究的重点,不仅有助于揭示上述基因在甘蔗抗逆、防御和产量形成中的作用,还有助于指导培育抗虫性、产量和品质兼优符合育种目标的转基因新品系。
陈靖[7]（2011）在《苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基于反相液相色谱分离的蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理目前，苏云金芽孢杆菌（简称BT）是世界上应用最广的微生物农药，占总量的90%，已在60多个国家生产了120多种产品，是生物农药开发与研究的热点。近年来蛋白质组学迅猛发展，其研究的技术手段日趋成熟与多样，尤其是现代分析技术中的高效液相色谱和质谱技术。为了高效，准确地分离分析苏云金芽孢杆菌中的有效杀虫成分，本论文使用高效液相色谱和生物质谱技术，对国内市售的苏云金芽孢杆菌杀虫粉剂进行快速的分离测定。论文共分为四章，主要工作内容：第一章对苏云金芽孢杆菌进行了概述，介绍了杀虫晶体蛋白的种类、结构、杀虫机理和分类，以及对杀虫晶体蛋白的研究现状，同时介绍了蛋白质组学及其研究技术，并对课题的研究工作进行了概述。第二章主要目的是获得苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的冻干粉。首先考察了杀虫晶体蛋白样品溶解与沉淀的条件，进一步优化了透析沉淀法提取杀虫晶体蛋白所需的缓冲液浓度和缓冲沉淀时间，通过将碱溶后BT蛋白的离心上清液置于透析袋中，在含有1mM EDTA、pH值为4.5、100mM的CH3COONaCH3COOH缓冲液里，透析5小时的透析沉淀法，并冷冻干燥制到杀虫晶体蛋白的冻干粉。第三章主要通过RPLC实现了对杀虫晶体蛋白的快速分离。先利用蛋白变性的方法，使杀虫晶体蛋白在溶液中的性质发生改变，以满足反相液相色谱分离的上样条件，再依据中心切割法将色谱分离中的目标蛋白组分进行收集浓缩，并使用SDS-PAGE凝胶电泳对收集浓缩的蛋白组分进一步分离分析。第四章分别利用MALDI-TOF-MS质谱和LTQ ORBITRAP XL质谱串联质谱技术对凝胶上蛋白条带胰酶酶切后的多肽样品进行检测，针对一级质谱图和二级串联质谱图提取的数据信息，分别进行肽质量指纹图谱搜索和MS/MS数据多肽序列蛋白数据库搜索；最终鉴定到24个苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白中Cry1A类蛋白的多肽序列，其中肽段AVNALFTSTNQIGLK氨基酸序列在整个Bacillusthuringiensis蛋白数据库中只匹配上一个蛋白gi169788589-pesticidal crystalprotein cry1Ac [Bacillus thuringiensis serovar kurstaki]，另一个氨基酸序列EIYTNPVLEDFNGSFR在Bacillus thuringiensis蛋白数据库中也只匹配于一个蛋白gi46409861-cry1Atype crystal protein [Bacillus thuringiensis serovar kenyae]，而其余氨基酸序列同时为几十个Cry类杀虫蛋白所共有。
胡书群,裴冬生,陆梁,赵惠仁[8]（2011）在《大鼠βB2-晶体蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备》文中研究表明目的表达并纯化βB2-晶体蛋白,制备其多克隆抗体,用以研究βB2-晶体蛋白聚合的机制。方法用RT-PCR的方法扩增了βB2-晶体蛋白的cDNA并克隆到原核表达载体pMON5473中。用萘啶酮酸诱导recA启动子后,蛋白质在大肠杆菌中得到了高效表达。表达的蛋白质用DEAE纤维素层析和凝胶过滤纯化,SDS-PAGE显示一条带。与佐剂混合后免疫新西兰大白兔。结果纯化了大鼠βB2-晶体蛋白,成功制备了其多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。
王蕊[9]（2011）在《重组人αB-晶体蛋白对大鼠视神经损伤修复作用的研究》文中提出视神经损伤是一种视功能损伤严重,预后极差的眼外伤类型和致盲原因。因为中枢神经系统组织损伤后不能再生,和缺乏修复功能,目前尚无确切的治疗方式。我们的研究小组近十年的研究结果表明晶体损伤后释放的晶体蛋白对视神经损伤有修复和再生作用,这一现象为视神经损伤的治疗带来了希望。近年的国内外研究表明晶体蛋白中的αB-晶体蛋白是这一家族中最活跃的小分子蛋白,属于热休克蛋白家族,不仅可以对变性神经组织有保护和促进修复作用,还具有抑制炎症、应激反应,维护细胞骨架蛋白和骨架网络稳定性,及抵抗缺氧、高温、反射线及药物等因素诱导的细胞凋亡的作用。但由于αB-晶体蛋白不能从提取的天然α-晶体蛋白中分离出来,重组人αB-晶状体蛋白是开发应用的唯一途径。国外文献报道重组αB-晶体蛋白用于治疗多发性硬化动物实验取得了良好的疗效。而重组人αB-晶体蛋白全身应用,是否具有视神经保护作用未见文献报道。由此,探讨如何重组有高活性的人αB-晶体蛋白,明确重组人αB-晶体蛋白静脉应用,对视神经保护作用,并对全身重要器官和行为学是否有影响,可能为重组人aB-晶体蛋白临床应用奠定基础,为临床治疗视神经损伤提供新的途径。【目的】建立重组蛋白表达体系,重组人αB-晶体蛋白和有更强分子伴侣活性的Trx-αB-crystallin融合蛋白;通过建立大鼠视神经钳夹伤模型,进一步明确重组人αB-晶体蛋白对视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用;在此基础上,通过动物模型电生理检查分析重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白治疗视神经损伤的疗效,并通过显微组织学检查明确静脉应用重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白对全身重要脏器的影响,为开发重组人αB-晶体蛋白药物治疗视网膜神经节细胞损伤和视神经损伤奠定实验基础。【方法】1、根据已知人αB-晶体蛋白基因序列构建目的基因,并建立目的基因载体质粒pET32a和pET28a,通过BL21大肠杆菌细胞为宿主的表达系统,IPTG诱导表达后纯化,得到高纯度的重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白,通过免疫印迹和蛋白质谱分析鉴定重组蛋白。并利用小分子热休克蛋白胰岛素活性实验,验证重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白的体外活性,同时,通过对比研究观察两者分子伴侣活性强弱。2、以成年Long Evans大鼠为研究对象,建立视神经钳夹损伤模型,静脉注射重组人αB-晶体蛋白、Trx-αB-crystallin融合蛋白、Trx蛋白和生理盐水。通过大脑上丘和外侧膝状体荧光金逆行标记和视网膜铺片的免疫组化染色方法,分别于损伤后2周和4周观察视网膜内存留有活性的视网膜神经节细胞,并定量分析和比较各组视网膜神经节细胞数量。3、以成年Long Evans大鼠建立视神经钳夹损伤模型,静脉注射重组人αB-晶体蛋白、Trx-αB-crystallin融合蛋白、Trx蛋白和生理盐水。利用闪光视觉诱发电位检测方法,于损伤后2、4周观察各组大鼠视功能情况,探讨重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白对视神经损伤后视功能修复的影响。4、利用行为学方法,观察上述各组实验动物于损伤后2、4周的行为学变化,并在4周时处死大鼠,取心、肝、脾、肾重要脏器行组织病理学检查,评估静脉应用重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白的安全性。【结果】1、构建的载体质粒pET32a-αB-crystallin和pET28a-αB-crystallin,通过BL21大肠杆菌细胞表达和纯化可以得到高纯度的重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白。2、重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白均具有分子伴侣活性,且Trx-αB-crystallin融合蛋白的活性大于重组人αB-晶体蛋白。3、视神经钳夹伤后荧光金逆行标记示,静脉注射重组人αB-晶体蛋白组和Trx-αB-crystallin融合蛋白组在损伤后2周和4周与对照组相比均有较多的具有轴浆运输功能的视网膜神经节细胞存活,统计学差异显着（P<0.05）。4、视网膜神经节细胞免疫组化荧光染色示,视神经钳夹伤后2周和4周静脉注射重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白组较Trx蛋白和生理盐水组有更多的视网膜神经节细胞存活,统计学差异显着（P<0.05）。5、视神经钳夹伤后2周脉注射重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白组大鼠较Trx蛋白和生理盐水组视功能检查（闪光视觉诱发电位）示P1波波幅较大,差异显着（P<0.05）。但4周时,各组间P1波波幅和潜时差异不显着。6、大鼠视神经钳夹伤后4周,重组人αB-晶体蛋白、Trx-αB-crystallin融合蛋白组大鼠、Trx蛋白和生理盐水组行为学检测无显着性差异,且各组重要脏器组织学检查未见明显异常。【结论】1、大肠杆菌表达体系可以成功表达有分子伴侣活性的重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白。2、重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白在视神经损伤后修复中发挥重要作用。通过静脉多次给药,可明显减少视神经损伤引起的视网膜节细胞死亡,保存更多有轴浆运输功能的视网膜神经节细胞,提示重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白有促进视神经损伤修复的作用,并可以在损伤早期有效保护视功能。3、全身静脉应用重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白安全,不会引起重要脏器病变和行为学改变。4、Trx-αB-crystallin融合蛋白中Trx标签可以增强αB-晶体蛋白的分子伴侣活性,但不能提高αB-晶体蛋白保护功能,提示αB-晶体蛋白的分子伴侣活性和保护细胞功能可能不完全是一个功能结构域。
杜植鹏,吴燕,李闻捷[10]（2009）在《晶体蛋白与白内障发病机制研究》文中研究指明白内障是严重影响人类健康的常见病、多发病。研究白内障的病因学及影响因素,是预防和治疗该病的有力措施。白内障主要是因晶状体的透光性改变所引发;晶状体的透光性是由晶体蛋白的有序结构所决定的。本文综述近年来有关晶体蛋白的组成与结构、翻译后修饰及热休克蛋白与白内障发病机制的关系。
二、大鼠βB2晶体蛋白的克隆、高效表达及纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠βB2晶体蛋白的克隆、高效表达及纯化（论文提纲范文）
（1）基于STSBPT策略探究ZPF及新型类似物靶向COX-2/PPAR-γ缓解LPS诱导的ALI/ARDS作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用中英文缩略词表 |
| 1.前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.2.1 NSAIDs的研究进展 |
| 1.2.2 ALI/ARDS的研究进展 |
| 1.2.3 靶点药物的局限性和优越性 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 2.ZPF主要代谢物的合成、结构表征鉴定及活性鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 ZPF相关代谢物的合成 |
| 2.1.6 ZPF及其相关代谢物的结构表征鉴定及活性鉴定 |
| 2.1.7 ZPF及其相关代谢物与COX结合的关键AAR的鉴定 |
| 2.1.8 数据处理 |
| 2.2 结果和分析 |
| 2.2.1 ZPF及相关代谢物的结构表征 |
| 2.2.2 ZPF及相关代谢物抑制COX-1和COX-2 酶活性 |
| 2.2.3 分子对接软件分析ZPF及其代谢物与COX酶结合的关键AAR |
| 2.2.4 COX-2 关键AAR位点野生型和突变型载体的构建 |
| 2.2.5 COX-2 活性氨基酸的突变试验进一步确证COX-2 酶的关键AAR |
| 2.3 讨论 |
| 3.基于STSBPT策略预测PPAR-γ作为ZPF和 M2 的关键抗炎靶点 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 |
| 3.1.5 基于STSBPT策略的活性口袋的类空间结合性比较 |
| 3.1.6 细胞培养 |
| 3.1.7 CETSA |
| 3.1.8 DARTS |
| 3.1.9 Western blot方法测定蛋白表达水平 |
| 3.1.10 数据处理 |
| 3.2 结果和分析 |
| 3.2.1 STSBPT策略的评判标准 |
| 3.2.2 STSBPT策略预测PPAR-γ是 ZPF及 M2 的另一潜在抗炎靶点 |
| 3.2.3 CETSA验证PPAR-γ是 ZPF及 M2 的另一潜在抗炎靶点 |
| 3.2.4 DARTS验证PPAR-γ是 ZPF及 M2 的另一潜在抗炎靶点 |
| 3.3 讨论 |
| 4.ZPF及 M2 抑制LPS所致的炎症反应机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 主要仪器和设备 |
| 4.1.5 细胞培养 |
| 4.1.6 CCK-8 法检测ZPF及 M2对RAW264.7细胞活力的影响 |
| 4.1.7 RT-qPCR检测炎症相关基因的mRNA表达 |
| 4.1.8 细胞核蛋白与细胞浆蛋白分离试验 |
| 4.1.9 Western blot方法测定蛋白表达水平 |
| 4.1.10 间接免疫荧光试验 |
| 4.1.11 LPS诱导的小鼠ALI/ARDS模型 |
| 4.1.12 肺组织含水量的测定 |
| 4.1.13 肺组织病理HE染色 |
| 4.1.14 免疫组织化学检测肺组织COX-2和PPAR-γ表达 |
| 4.1.15 数据处理 |
| 4.2 结果和分析 |
| 4.2.1 ZPF及M2对RAW264.7 细胞的毒性 |
| 4.2.2 ZPF及M2抑制对LPS诱导的炎症反应 |
| 4.2.3 ZPF及M2调控NF-κB和 PPAR-γ活性抑制LPS所致的炎症反应 |
| 4.2.4 ZPF及M2调控MAPK-PPAR-γ/NF-κB途径缓解LPS所致的炎症反应 |
| 4.2.5 ZPF及M2改善LPS诱导的小鼠肺部水肿和病理损伤 |
| 4.2.6 ZPF及M2通过调控COX-2和PPAR-γ的表达改善LPS诱导的小鼠肺部病理损伤 |
| 4.3 讨论 |
| 5.基于STSBPT策略的新型类似物的设计、合成及活性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 溶液配制 |
| 5.1.4 主要仪器和设备 |
| 5.1.5 细胞培养 |
| 5.1.6 新型类似物的设计和筛选 |
| 5.1.7 新型类似物的合成 |
| 5.1.8 新型类似物的结构表征鉴定 |
| 5.1.9 CCK-8 法检测新型类似物对RAW264.7 细胞活力的影响 |
| 5.1.10 Western blot方法测定蛋白表达水平 |
| 5.1.11 LPS诱导的小鼠ALI/ARDS模型 |
| 5.1.12 肺组织含水量的测定 |
| 5.1.13 肺组织病理HE染色 |
| 5.1.14 免疫组织化学检测肺组织COX-2和PPAR-γ表达 |
| 5.1.15 数据处理 |
| 5.2 结果和分析 |
| 5.2.1 新型类似物的筛选 |
| 5.2.2 新型类似物的结构表征 |
| 5.2.3 新型类似物对RAW264.7 细胞的细胞毒性 |
| 5.2.4 新型类似物不同程度地缓解LPS诱导的RAW264.7 细胞COX-2和PPAR-γ的表达 |
| 5.2.5 新型类似物改善LPS诱导的小鼠肺部水肿和病理损伤 |
| 5.2.6 新型类似物通过调控COX-2和PPAR-γ的表达改善LPS诱导的小鼠肺部病理损伤 |
| 5.3 讨论 |
| 6.全文总结 |
| 6.1 本研究的主要结果 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 本研究的不足之处与进一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）βB2晶体蛋白对卵巢癌细胞侵袭转移和化疗抵抗的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 Crybb2 对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)构建过表达Crybb2 卵巢癌细胞模型 |
| (二)Crybb2 对卵巢癌细胞侵袭转移的影响 |
| (三)Crybb2 对卵巢癌细胞化疗药物敏感性的影响 |
| (四)Crybb2 对卵巢癌裸鼠皮下成瘤化疗药物敏感性的影响 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 Crybb2 对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的机制研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)Crybb2 对卵巢癌细胞EMT水平的影响 |
| (二)Crybb2 对卵巢癌细胞干性水平的影响 |
| (三)Crybb2对Wnt通路关键蛋白表达的影响 |
| (四)Wnt通路抑制后Crybb2 对卵巢癌细胞化疗药物敏感性、干性水平的影响 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 βB2晶体蛋白在多器官中的生理和病理功能 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）新型JAK抑制剂的设计、合成及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 序言 |
| 1.1 类风湿性关节炎 |
| 1.1.1 类风湿性关节炎概况 |
| 1.1.2 类风湿性关节炎的药物治疗 |
| 1.2 JAK-STAT信号通路在类风湿性关节炎中的作用 |
| 1.2.1 JAK-STAT的信号通路 |
| 1.2.2 JAK-STAT信号通路跟类风湿关节炎的关系 |
| 1.3 与类风湿关节炎相关JAK抑制剂的研究进展 |
| 1.3.1 非选择性JAK抑制剂 |
| 1.3.2 选择性JAK抑制剂 |
| 1.4 本课题的研究目的与内容 |
| 1.4.1 课题研究的目的 |
| 1.4.2 课题研究的内容 |
| 1.4.3 本课题拟解决的问题 |
| 第二章 新型JAK抑制剂的设计与合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 化合物的设计 |
| 2.3 实验试剂与实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 中间体4-(2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)-1,1-二氧化物硫代吗啉(9)与 4-(2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)吗啉(10)的合成 |
| 2.4.2 中间体5 氯吡嗪-2-甲基胺(14)的合成 |
| 2.4.3 化合物A1-A4 的合成 |
| 2.4.4 化合物B1-B2 和B5-B7 的合成 |
| 2.4.5 化合物B3-B4 的合成 |
| 2.4.6 化合物B8 的合成 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 新型JAK抑制剂的活性评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 酶实验 |
| 3.3.2 酶实验结果与讨论 |
| 3.3.3 RAW264.7细胞实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 分子对接实验 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验工具 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.3.1 晶体蛋白跟小分子配体的处理 |
| 4.3.2 对接位点的选择 |
| 4.3.3 参数的设定 |
| 4.3.4 对接结果选择 |
| 4.3.5 结果分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 化合物图谱 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文 |
（4）利用rAAV-SaCas9系统敲除肌细胞的myostatin基因并评价其对肌肉萎缩的改善作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1.CRISPR系统的发展、作用机制和优点 |
| 1.1 CRISPR系统的发现和发展 |
| 1.2 CRISPR系统的基本结构 |
| 1.3 CRISPR/Cas多样性和分类 |
| 1.4 CRISPR系统作用机制 |
| 1.5 CRISPR/Cas系统的运送载体 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 系统的应用 |
| 1.7 风险问题与改进方法 |
| 2.MSTN结构以及相关信号通路 |
| 2.1 MSTN简介 |
| 2.2 MSTN的分类及结构 |
| 2.3 MSTN对肌源细胞的影响 |
| 2.4 MSTN对骨骼肌相关信号通路的影响 |
| 2.5 MSTN与肌肉萎缩性疾病的治疗 |
| 第一章 敲除Myostatin基因的C2C12 单克隆细胞系的增殖变化 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞和质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 sgRNA在 Mstn基因打靶位点的设计 |
| 2.5 载体的构建 |
| 2.6 细胞复苏,培养以及转染 |
| 2.7 DNA酶切及测序鉴定 |
| 2.8 嘌呤霉素基因插入重组载体 |
| 2.9 质粒转染C2C12细胞 |
| 2.10 RT-PCR分析 |
| 2.11 Western blot分析 |
| 2.12 CCK-8测定C2C12细胞增殖活力 |
| 2.13 PI测定C2C12细胞生长周期 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 sgRNA位点的筛选与酶切效率鉴定 |
| 3.2 pX601-SaCas9-puro-sgRNA载体构建 |
| 3.3 T7酶切鉴定基因编辑效率及测序结果 |
| 3.4 Mstn基因敲除的C2C12 细胞系测序鉴定 |
| 3.5 MSTN蛋白表达鉴定 |
| 3.6 CCK-8法检测细胞增殖 |
| 3.7 流式分析MSTN基因敲出的C2C12 细胞周期的变化 |
| 3.8 RT-PCR和 Western Bloting检测C2C12 细胞相关细胞生长因子的表达 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组rAAV-SaCas9 基因编辑系统在体内外的表达并靶向敲除肌肉Myostatin基因改善肌肉萎缩 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 细胞、小鼠和质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 载体的构建 |
| 2.5 细胞培养和转染 |
| 2.6 CRISPR/Cas9 系统的重组AAV的包装及纯化 |
| 2.7 rAAV-DJ/8 在体外的转导 |
| 2.8 rAAV9在体内转导 |
| 2.9 建立小鼠肌肉萎缩模型 |
| 2.10 DNA酶切及测序鉴定 |
| 2.11 靶向深度测序分析 |
| 2.12 细胞及肌肉组织蛋白质提取及Western Bloting分析 |
| 2.13 组织学和免疫荧光分析 |
| 2.14 小鼠肌肉重量 |
| 2.15 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 SaCas9系统重组载体的构建以及打靶位点筛选 |
| 3.2 重组SaCas9系统在体外基因组编辑效率 |
| 3.3 rAAV-DJ/8-SaCas9 感染C2C12 细胞及eGFP蛋白表达 |
| 3.4 rAAV-DJ/8-SaCas9 感染的C2C12 细胞中Mstn基因的敲除效果 |
| 3.5 rAAV9-SaCas9 感染小鼠肌细胞及eGFP蛋白的表达 |
| 3.6 rAAV9-SaCas9 感染的小鼠肌细胞中Mstn基因的敲除效果 |
| 3.7 rAAV9-SaCas9 对肌肉萎缩小鼠的肌肉质量的作用 |
| 3.8 rAAV9-SaCas9 对肌肉萎缩细胞的作用效果 |
| 3.9 rAAV9-SaCas9 在小鼠组织中的扩散 |
| 3.10 rAAV9-SaCas9 在基因组中的脱靶概率 |
| 4.讨论 |
| 第三章 AAV-SaCas9 介导的Myostatin基因编辑对老年小鼠肌肉萎缩的改善作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 载体构建 |
| 2.5 细胞培养和转染 |
| 2.6 载有CRISPR/Cas9 系统的rAAV包装 |
| 2.7 rAAV的纯化与滴度测定 |
| 2.8 rAAV9在体内转导 |
| 2.9 DNA酶切及测序鉴定 |
| 2.10 靶向测序分析 |
| 2.11 RT-PCR分析 |
| 2.12 Western Bloting分析 |
| 2.13 组织学和免疫荧光分析 |
| 2.14 小鼠肌肉重量 |
| 2.15 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 重组SaCas9系统基因编辑载体的构建 |
| 3.2 重组SaCas9系统对基因的编辑效率 |
| 3.3 rAAV-SaCas9 对老龄鼠肌细胞Mstn基因的敲除效率 |
| 3.4 rAAV-SaCas9 对老龄鼠骨骼肌质量的影响 |
| 3.5 老龄鼠肌细胞Mstn基因敲除后对细胞形态的影响 |
| 3.6 Mstn缺失对衰老龄鼠肌细胞周期以及相关信号通路的影响 |
| 3.7 Mstn缺失通过激活肌源性细胞因子促进细胞增殖和分化 |
| 3.8 Mstn缺失通过抑制泛素-蛋白酶体连接酶减少肌细胞中蛋白降解 |
| 4.讨论 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
（5）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（6）转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 甘蔗螟虫是甘蔗生产上最重要的害虫 |
| 1.1.1 甘蔗螟虫的发生及危害 |
| 1.1.2 甘蔗螟虫的防治 |
| 1.2 转基因育种是改良甘蔗的一条有效途径 |
| 1.2.1 甘蔗转基因研究远滞后于其他作物且未商业化种植 |
| 1.2.2 甘蔗转基因研究历程及主要进展 |
| 1.3 甘蔗抗虫转基因育种 |
| 1.3.1 Bt/cry等抗虫基因及利用情况 |
| 1.3.2 cry1Ac基因及转cry1Ac基因作物 |
| 1.3.3 转cry1Ac基因甘蔗研究现状 |
| 1.4 基因工程甘蔗的系统生物学研究 |
| 1.4.1 基因工程甘蔗的分子特征研究 |
| 1.4.2 组学技术研究基因工程甘蔗 |
| 1.5 立题依据与研究意义 |
| 1.6 主要研究内容与技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 基于环介导等温扩增技术(LAMP)鉴定转cry1Ac基因甘蔗研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料与基因组DNA |
| 2.1.2 阳性质粒1Ac0229制备与检测 |
| 2.1.3 cry1Ac基因和bar基因LAMP引物、PCR引物设计与合成 |
| 2.1.4 LAMP反应混合物 |
| 2.1.5 LAMP体系优化 |
| 2.1.6 LAMP产物检测 |
| 2.1.7 PCR反应 |
| 2.1.8 LAMP和常规PCR敏感性比较 |
| 2.1.9 LAMP特异性检测 |
| 2.1.10 拟转cry1Ac基因甘蔗和拟转bar基因甘蔗无性系的鉴定 |
| 2.1.11 拟转cry1Ac基因甘蔗和拟转bar基因甘蔗无性系的拷贝数鉴定和蛋白表达鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 基于cry1Ac基因的LAMP方法的建立和应用 |
| 2.2.2 基于bar基因的LAMP方法的建立和应用 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 利用实时荧光定量PCR鉴定转基因甘蔗cry1Ac的拷贝数 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料与基因组DNA |
| 3.1.2 内标准基因APRT、CYC和P4H的克隆 |
| 3.1.3 多元靶标重组质粒的构建与检测 |
| 3.1.4 TaqMan实时荧光定量PCR |
| 3.1.5 Southern blot法鉴定转cry1Ac基因甘蔗拷贝数 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 内标准基因CYC、APRT和P4H的PCR克隆 |
| 3.2.2 多元靶标重组质粒的构建与检测 |
| 3.2.3 标准曲线的绘制 |
| 3.2.4 转基因甘蔗外源目的基因cry1Ac的拷贝数鉴定 |
| 3.2.5 Southern blot法鉴定转cry1Ac基因甘蔗拷贝数 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 转cry1Ac基因甘蔗的蛋白表达与表型性状 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 工农艺性状和螟害情况调查 |
| 4.1.3 转cry1Ac基因甘蔗的拷贝数 |
| 4.1.4 转cry1Ac基因甘蔗的蛋白表达 |
| 4.1.5 外源基因拷贝数和主要工农艺性状关联分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转cry1Ac基因甘蔗及对照的螟害情况 |
| 4.2.2 转cry1Ac基因甘蔗及对照的主要工农艺性状表现 |
| 4.2.3 转基因甘蔗及对照叶片中cry1Ac蛋白表达情况 |
| 4.2.4 灰色关联分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及根系土壤微生物群落研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 转cry1Ac基因甘蔗外源蛋白的时空表达 |
| 5.1.2 转cry1Ac基因甘蔗部分株系的旁侧序列研究 |
| 5.1.3 根际土壤细菌16S rDNA和18S rDNA的DGGE分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转cry1Ac基因甘蔗外源蛋白的时空表达特性 |
| 5.2.2 旁侧序列和插入位点分析 |
| 5.2.3 根际土壤的PCR-DGGE及序列分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 转录组学分析转cry1Ac基因甘蔗典型株系的非预期效应 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料及总RNA提取 |
| 6.1.2 mRNA的富集、cDNA文库构建和Illumina测序 |
| 6.1.3 甘蔗样品的de novo组装及其注释 |
| 6.1.4 甘蔗样品的RNA-seq表达谱分析 |
| 6.1.5 外源cry1Ac基因和bar基因的表达分析 |
| 6.1.6 与抗虫性相关防御基因的差异表达分析 |
| 6.1.7 与产量性状相关基因的差异表达分析 |
| 6.1.8 与蔗糖分积累相关基因的差异表达分析 |
| 6.1.9 实时荧光定量PCR验征 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 甘蔗总RNA的检测 |
| 6.2.2 测序数据评估 |
| 6.2.3 甘蔗样品的de novo组装及其注释结果 |
| 6.2.4 甘蔗样品的RNA-seq表达谱分析结果 |
| 6.2.5 实时荧光定量PCR验证 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 主要结论、创新点及后续工作 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ: 缩略词表 |
| 附录Ⅱ: RNA-seq表达谱差异表达基因筛选 |
| 附录Ⅲ: Trizol法提取总RNA |
| 附录Ⅳ:个人简介 |
| 致谢 |
（7）苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基于反相液相色谱分离的蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 论文综述 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌 |
| 1.1.1 苏云金芽孢杆菌概述 |
| 1.1.2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白概述 |
| 1.1.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白研究现状 |
| 1.2 蛋白质组学研究内容及主要技术手段 |
| 1.2.1 蛋白质组学的研究背景 |
| 1.2.2 蛋白质组学研究的主要技术手段 |
| 1.3 本论文的研究工作 |
| 第二章 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白透析沉淀法的分离纯化 |
| 摘要 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 样品来源 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的完全沉淀条件的确定 |
| 2.3.2 透析法提取苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的条件优化 |
| 2.3.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体的分离提纯 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白完全沉淀的 pH 值结果 |
| 2.4.2 透析法提取苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的优化结果 |
| 2.4.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的提取方法的讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 BT 杀虫晶体蛋白的反相液相色谱分离 |
| 摘要 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 样品来源 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 色谱进样前苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的多种预处理方法 |
| 3.3.2 用于高效液相色谱分析的杀虫晶体蛋白预处理 |
| 3.3.3 高效液相色谱分离 |
| 3.3.4 垂直平板 SDS-PAGE 凝胶电泳 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 杀虫晶体蛋白色谱进样前预处理方法的优化与讨论 |
| 3.4.2 反相液相色谱流动相的选择 |
| 3.4.3 反相高效液相色谱分离的结果 |
| 3.4.4 反相液相色谱分离蛋白组分的情况 |
| 3.4.5 色谱收集组分 SDS-PAGE 凝胶电泳的结果与分析 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 SDS-PAGE 凝胶中杀虫晶体蛋白的质谱鉴定 |
| 摘要 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 样品来源 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 胶内蛋白的酶切 |
| 4.3.2 MALDI-TOF-MS 质谱检测 |
| 4.3.3 MALDI-TOF-MS 质谱数据的数据库检索 |
| 4.3.4 液质联用中液相部分的参数条件： |
| 4.3.5 LTQ ORBITRAP XL 质谱检测 |
| 4.3.6 LTQ ORBITRAP XL 质谱数据的检索 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 蛋白质条带的 MALDI-TOF-MS 肽质量指纹分析 |
| 4.4.2 SDS-PAG 凝胶中蛋白多肽的二级质谱测定与序列查询结果 |
| 4.4.3 差异蛋白质的鉴定分析 |
| 4.4.4 多肽氨基酸序列与其所属蛋白的关系 |
| 4.4.5 ICPS 蛋白 MALDI-TOF-MS 质谱与 LTQ ORBIRAP XL 质谱检测数据结果的比较 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 已发表论文目录 |
（9）重组人αB-晶体蛋白对大鼠视神经损伤修复作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人αB-晶体蛋白的重组及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白静脉注射对大鼠视神经损伤后RGCs存活作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白静脉注射的安全性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 αB-晶体蛋白的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文及获课题资助 |
（10）晶体蛋白与白内障发病机制研究（论文提纲范文）
| 0引言 |
| 1晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.1 α-晶体蛋白 |
| 1.2 β-晶体蛋白 |
| 1.3 γ-晶体蛋白 |
| 2晶体蛋白的翻译后修饰 |
| 2.1磷酸化作用 |
| 2.2糖基化 |
| 2.3氨甲酰化作用 |
| 2.4脱酰胺化作用 |
| 2.5紫外线辐射作用 |
| 3热休克蛋白 |
| 4结语 |
四、大鼠βB2晶体蛋白的克隆、高效表达及纯化（论文参考文献）
- [1]基于STSBPT策略探究ZPF及新型类似物靶向COX-2/PPAR-γ缓解LPS诱导的ALI/ARDS作用[D]. 陆启荣. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]βB2晶体蛋白对卵巢癌细胞侵袭转移和化疗抵抗的影响及机制研究[D]. 李美慧. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [3]新型JAK抑制剂的设计、合成及活性研究[D]. 督文军. 广东药科大学, 2021(02)
- [4]利用rAAV-SaCas9系统敲除肌细胞的myostatin基因并评价其对肌肉萎缩的改善作用[D]. 翁少亭. 河南农业大学, 2020(04)
- [5]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [6]转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究[D]. 周定港. 福建农林大学, 2016(05)
- [7]苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基于反相液相色谱分离的蛋白质组学研究[D]. 陈靖. 福州大学, 2011(06)
- [8]大鼠βB2-晶体蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备[J]. 胡书群,裴冬生,陆梁,赵惠仁. 免疫学杂志, 2011(05)
- [9]重组人αB-晶体蛋白对大鼠视神经损伤修复作用的研究[D]. 王蕊. 第三军医大学, 2011(12)
- [10]晶体蛋白与白内障发病机制研究[J]. 杜植鹏,吴燕,李闻捷. 国际眼科杂志, 2009(10)