一、凋亡调节蛋白BIM的研究进展（论文文献综述）
潘皓[1]（2021）在《利用有机小分子研究Bim调控Hsp70分子伴侣功能》文中认为蛋白质稳态是细胞能够正常发挥基本细胞功能所必须的,分子伴侣蛋白是蛋白质稳态的重要调控者,70 k Da的热休克蛋白（Hsp70）是细胞中普遍存在的分子伴侣之一。从原核生物到真核生物,Hsp70在广泛的细胞基本功能调节过程中发挥重要的作用,例如新合成蛋白的折叠,多肽进入线粒体、叶绿体和内质网,蛋白质复合物的分解和蛋白质活性的调节。Hsp70的分子伴侣功能需要辅伴侣蛋白的调控来完成。Hsp70拥有众多的辅伴侣蛋白,包含J protein家族蛋白和NEF家族蛋白。本课题组首次报道了BH3-only蛋白Bim能够作为Hsp70的辅伴侣蛋白。Bim通过BH3结构域与Hsp70结合,稳定Hsp70的ATP构像,提高了Hsp70的ATPase活性。一直以来,Bim被认为是凋亡激活因子:一方面Bim可以直接激活Bcl-2促凋亡成员Bax/Bak,另一方面还能拮抗抗凋亡的Bcl-2/Mcl-1蛋白。因此在哺乳动物细胞中,Bim通过调控Hsp70促进细胞生存的这一功能受到Bcl-2家族蛋白的干扰导致研究比较困难。酵母中没有Bcl-2家族同源蛋白,Bim可以在酵母中外源表达并且保持活性,又不能发挥其促凋亡功能,因此酿酒酵母是非常适合研究Bim的促生存功能的简单模型。另外,小分子具有结构简单,功能清晰,靶标单一等优点,是研究蛋白质功能的理想工具。本课题组已经研发的第一个Hsp70/Bim的小分子抑制剂S1g-6（2-（6-环己基硫基-2-氰基-1-氧-1H-非那烯基氨基）乙基吗啉）,能够直接地、特异性地结合在Bim在Hsp70表面的结合位点,是研究Bim作为辅助伴侣蛋白调控Hsp70功能的分子工具。本论文首先表达纯化重组的Hsc70蛋白和J protein蛋白用于体外研究Bim对Hsp70的调控,通过酶活实验以及底物热变性实验,证明了Bim在体外正向调控Hsp70的分子伴侣功能,通过刺激Hsp70的ATPase活性来发挥辅伴侣功能。之后,将Bim转化的酵母菌株在S1g-6处理下,通过检测酵母的生长曲线,从酵母生长表型上初步证明了外源蛋白Bim的转入促进了酵母的生长,而S1g-6抑制了酵母的生长。免疫共沉淀Hsp70,Western blot检测Hsp70和Bim的蛋白-蛋白相互作用,证明了Bim通过结合酵母中Hsp70促进了酵母的生长,而S1g-6通过解离这一相互作用抑制酵母的生长。在热应激处理条件下,通过检测酵母生长曲线、Western blot检测Hsp70和底物蛋白的蛋白-蛋白相互作用,证明了Bim提高了酵母的耐热能力及热应激恢复能力。证实了Bim在酵母中发挥正向的辅伴侣作用,促进了Hsp70的分子伴侣功能,展现了Bim的促生存功能。另外,通过串联质谱标签技术（TMT技术）鉴定一系列Bim调控的Hsp70的互作蛋白以及通过S1g-6解离Hsp70/Bim二聚体所调控的Hsp70的互作蛋白,将差异蛋白进行GO富集分析,进一步证实了Bim通过正向调控酵母中Hsp70的功能来促进酵母的生长,在一定程度上揭示了Bim的促生存功能。综上所述,本论文证明了一定浓度的Bim在体外不同温度条件下对Hsp70分子伴侣功能的正向调控作用,以及在无Bcl-2家族蛋白干扰的酵母细胞中证明了Bim的促生存功能,为进一步在哺乳动物细胞中研究Bim这一新的Hsp70辅伴侣蛋白提供了研究方向。
许春梅[2]（2021）在《肾小管上皮细胞Bim蛋白介导管球交流致足细胞骨架损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景近年,全球罹患糖尿病（diabetes mellitus,DM）的人数激增,在我国,DM患者人数俨然跃居全球首位,广大患者的健康问题受到严峻挑战,生存质量受到严重侵害。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是DM的主要慢性并发症,虽然许多大型临床研究,如DCCT和UKPDS等均显示,强化降糖、降压、调脂等治疗能显着减少尿蛋白,但DN发生发展的剩余风险仍高达50%-86%。目前,DN已成为中国住院患者罹患终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）的首位致病原因。指南推荐的DN治疗主要是抗肾素（renin）-血管紧张素（angiotensin）-醛固酮（aldosterone）系统（RAAS）治疗,但其获益有较大的局限性,减少ESRD的证据不足,ESRD不断增长的发病率提示我们DN存在的潜在的发病机制仍有待探索。因此当前,我们亟需进一步明确DN的新的发病机制及干预靶点,以期为DN患者提供更佳的治疗方式。国内外针对DN发病机制的研究一直是热点,当前针对DN源头病变理论存在争议。既往,专家们多认为,DN主要由肾小球病变所致,但之后,越来越多的证据表明,肾小管病变在DN的发生发展,尤其是早期病变过程中发挥关键作用。肾小管病变对早期肾功能的影响更为密切。通常,人体肾小球每天滤过约3.3g白蛋白,其中约97%由肾小管重吸收以至于仅3%的白蛋白最终随尿液排出。在参与白蛋白重吸收中起主要作用的为近端肾小管上皮细胞（proximal renal tubular epithelial cells,PTECs）,其可重吸收滤过白蛋白的71%。在DN的发病过程中,PTECs可先于肾小球发生损伤,即,肾小管重吸收功能异常先于肾小球滤过功能障碍。肾小球滤过膜是一种高度分化的血液滤过性屏障,在保持体内的水、电解质和酸碱平衡中发挥重要的作用。因而,肾小球损伤被视为DN蛋白尿发生和进展中的主要原因。足细胞（podocyte）是肾小球滤过膜的最后一道屏障,在DN中扮演重要角色,也是DN肾内平衡紊乱中最薄弱的环节之一。研究表明足细胞病变与DN蛋白尿发生密切相关。而我们前期通过构建DN大鼠模型,发现在早期DN大鼠的肾脏中存在明显凋亡的PTECs,与之形成鲜明对比的是,此时凋亡的肾小球细胞却极少出现,即早期DN中,凋亡的肾小管先于肾小球出现。Bim是Bcl-2蛋白家族成员,其是一种仅含有一个Bcl-2的同源性（BH3）结构域的促凋亡蛋白,在细胞死亡途径的激活中起重要作用。我们前期通过体外功能实验进一步明确了 Bim蛋白是介导PTECs早期凋亡的关键因子。当前绝大多数针对DN的机制研究都是立足于一个点,如:单纯针对足细胞、肾小管上皮细胞等单一细胞病变在DN中的作用,忽略了肾脏作为一个组织整体,细胞间信息交流在病变发生发展中同样具有重要作用。当前,细胞间交流作用促DN发生发展越来越受到广泛关注。肾单位中,肾小球和肾小管分别发挥滤过和重吸收的功能,而作为两者中最具代表性的两类细胞,肾小球足细胞与PTECs无疑分别是上述功能的有力执行者。目前,针对两者间相互作用机制的研究刚刚起步,二者相互作用介导DN发生的机制尚不明确,仍需进一步探索。足细胞骨架改变是造成DN早期足细胞病变的主要原因,同时也是诱发早期DN蛋白尿的重要因素。因此,阐明足细胞骨架病变的发病机制,延缓并阻止肾小球滤过屏障损伤,成为防治DN的重要环节。另有研究发现,不仅局限于介导凋亡作用,Bim还可诱导细胞因子分泌发挥促凋亡外的其他作用。那么,我们前期发现的促肾小管凋亡的Bim蛋白是否可通过调控某种因子诱导肾小球足细胞骨架损伤,进而致DN进展的作用未见报道。本部分研究以此为重点,拟探索肾小管Bim蛋白介导的管球交流致DN足细胞损伤的作用及分子机制。研究目的1.通过构建PTECs与足细胞体外共培养模型,明确高糖下PTECs致足细胞损伤作用,即管球交流作用的存在。2.明确高糖下PTECs介导足细胞骨架损伤的分子作用机制。3.通过构建体内DN小鼠模型,于体内探究肾小管Bim介导DN足细胞骨架损伤作用。研究方法1.最佳高糖浓度及处理时间筛选:设置不同糖浓度梯度及时间梯度处理人足细胞,检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达情况以确定最佳高糖浓度及高糖最佳处理时间。2.RT-PCR及Western blot:明确高糖处理PTECs 48 h后Bim mRNA及蛋白表达水平。3.下调Bim慢病毒转染PTECs构建稳转细胞株:（1）转染下调Bim慢病毒,构建稳定转染细胞株:1)慢病毒感染预实验,感染复数值（MOI）筛选及感染最佳时间确定:设置不同病毒感染复孔,向PTECs（人HK-2细胞株）转染慢病毒。当达到80%的转染效率时,观察细胞生存情况,以此为依据记录转染条件及MOI值以备正式实验所用。2)慢病毒感染正式实验:应用病毒感染预实验得到的感染条件进行正式实验,对细胞进行长达约72小时的感染后,将其置于荧光显微镜下观察荧光表达情况以明确感染效率。（2）嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株:设置不同浓度的嘌呤霉素进行药物浓度筛选。药物筛选周期为1周,观察慢病毒携带荧光强度,选取存活的具备抵抗能力的细胞进行进一步的传代培养,将一部分细胞冻存,另一部分用于验证蛋白干预情况及功能探索等。4.共培养模型构建:培养人足细胞及HK-2密度达到80-90%进行消化处理。之后向六孔板及Transwell小室加入正糖培养基,将两种细胞按5 ×104分别均匀种至上述器皿,继续正常培养。6小时待细胞完全贴壁后,应用40 mM的高糖培养基孵育,将种有HK-2的Transwell小室中用镊子夹取放到种有人足细胞的六孔板中,向CO2培养箱中置于共培养体系,细胞正常培养48小时后进行观察与处理。5.Western blot:对空白组、病毒干预组及阴性对照组HK-2中Bim蛋白表达进行检测,验证慢病毒转染后干预效果;检测足细胞骨架蛋白synaptopodin蛋白表达情况,明确与不同PTECs共培养后对足细胞中骨架蛋白表达的影响。6.免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin荧光阳染及骨架微丝排列情况:（1）免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin阳性表达:将不同处理组的足细胞行免疫荧光染色,应用免疫荧光显微镜检测足细胞爬片的荧光表达情况并采集图片。（2）罗丹明红标记鬼笔环肽染色细胞骨架排列情况检测:将不同处理组的足细胞行罗丹明红标记的鬼笔环肽染色,之后将爬片置于荧光显微镜下观察并采集图片。7.RT-PCR:对不同PTECs处理组中NFAT家族的不同亚型mRNA表达进行检测。8.免疫荧光检测不同PTECs处理组中NFAT2核转位情况。9.过表达质粒及小干扰RNA（siRNA）分别上调与下调PTECs中NFAT2表达,RT-PCR及Western blot检测干预效果:（1）向稳定下调Bim的HK-2细胞转染NFAT2质粒:将NFAT2质粒和LipofectamineTM 3000混合液转染至已稳定下调Bim的HK-2细胞中。（2）向 HK-2 细胞转染 NFAT2-siRNA:将 NFAT2-siRNA 和 LipofectamineTM 2000混合液转染至HK-2细胞中。（3）RT-PCR及Western blot:对经过不同处理的HK-2中的NFAT2 mRNA及蛋白表达水平进行检测。10.在调控PTECs中NFAT2表达后,再次构建共培养模型,Western blot检测不同处理组足细胞骨架蛋白表达情况;免疫荧光检测不同处理组足细胞骨架蛋白synaptopodin阳性表达及骨架微丝排列情况。11.小鼠饲养:将C57BL/6J雄性6-8周龄小鼠进行为期1周的适应性喂养,选取状态佳、体重相近的小鼠进行随机分组,分别为单侧肾脏切除组（UNX）、糖尿病肾病组（DN）及假手术组（Sham）进行后续处理与操作。12.小鼠DN模型构建:应用单侧肾切+小剂量链脲佐菌素（STZ）连续5天进行注射。13.体重、血糖、尿量、尿蛋白含量、血肌酐、尿素氮水平检测:为了对小鼠的体重及血糖值进行检测,分别于术前,STZ注射后3d,DM成模后第2,4,6,8,10,12周对小鼠尾尖进行采血。第二天通过代谢笼收集小鼠的全天尿液,全天小鼠饮食受限但不限制饮水,尿液收集结束后对小鼠尿量进行检测,并对小鼠尿蛋白水平应用考马斯亮蓝法进行检测;在第12周末,取小鼠心尖血,检测各组小鼠血肌酐、尿素氮水平。14.肾脏糖原染色（periodicacid-Schiff,PAS）:在试验第12周末处死小鼠,应用组织切片机将小鼠肾脏组织进行切割（厚度约3μm）,然后进行肾脏PAS染色,应用普通光学显微镜观察肾脏糖原沉积情况及病理学变化。15.免疫组化检测肾脏组织中Bim在各组小鼠中的定位及表达情况。16.Western blot检测肾脏组织中Bim及足细胞骨架蛋白synaptopodin蛋白表达水平。17.免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin在不同组小鼠中表达情况。18.统计学分析:所有样本重复3次以上进行统计学分析。所得数据均采用SPSS 22.0软件对其进行统计学处理分析。统计学意义的评估:两组间比较采用T检验,数据均以mean±S.E.M.表示;应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对三组以上数据进行比较。P<0.05（双侧）被认为组间差异具有统计学意义。使用GraphPad Prism 5.0软件进绘制柱状图。研究结果1.40 mM高糖处理48 h显着诱导足细胞骨架蛋白synaptopodin表达下调及PTECs中Bim表达上调。（1）为了确定最佳高糖浓度及处理时间,对足细胞行不同高糖浓度及时间处理。Western blot结果显示:与正糖浓度5.5 mM相比,高糖浓度40 mM处理足细胞48小时显着诱导骨架蛋白synaptopodin表达减少（P<0.05）。（2）应用40 mM高糖处理PTECs,Western blot结果显示:与正糖5.5 mM组相比,40 mM高糖组PTECs中Bim蛋白表达明显增加（P<0.05）。2.Bim下调PTECs稳定转染细胞株构建成功。（1）应用Enhance液稀释的病毒滴度MOI为20时转染下调Bim慢病毒的效率最高,荧光表达强度最强。（2）继续应用病毒滴度MOI为20的慢病毒感染PTECs,并应用1 μg/ml嘌呤霉素筛选1周,应用RT-PCR及Western blot验证干预效率,结果示:与转染阴性对照病毒组相比,转染干预Bim病毒组PTECs中Bim mRNA及蛋白表达均明显下调（P<0.05）,证实Bim下调PTECs稳定转染细胞株构建成功,留作后续使用。3.体外共培养模型成功构建:共培养模式图显示不同处理组,包括与对照PTECs高糖共培养足细胞组,与转染下调Bim慢病毒的PTECs高糖共培养足细胞组,与转染对照慢病毒的PTECs高糖共培养足细胞组。4.高糖诱导PTECs中Bim上调促使足细胞骨架损伤、排列紊乱,与下调Bim的PTECs共培养后足细胞骨架损伤得到明显缓解。（1）免疫荧光示:与PTECs在高糖下共培养48小时,足细胞骨架排列发生紊乱,但干预PTECs的Bim后再与足细胞共培养48小时,足细胞骨架排列重新恢复极性。（2）免疫荧光示:与对照PTECs在高糖下共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达明显下调,但与干预Bim的PTECs共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达恢复上调。（3）Western blot检测不同共培养处理组足细胞中synaptopodin蛋白表达结果与前述synaptopodin荧光染色结果一致:与对照PTECs在高糖下共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达明显下调,但与干预Bim的PTECs共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达恢复上调（P<0.05）。5.进一步筛选PTECs中受Bim调控的诱导足细胞骨架损伤的下游分子,发现NFAT2表达及核转位受Bim调控。（1）应用RT-PCR筛选NFAT家族中受Bim调控的亚型,并用Western blot证实蛋白表达,研究结果示:PTECs中的NFAT2 mRNA及蛋白表达均受Bim调控。（2）由于NFAT家族是一类转录因子,主要通过发生核转位发挥基因调控功能。通过免疫荧光共聚焦显微镜检测在调控Bim后,PTECs中的NFAT2的核转位变化。结果示,在干预PTECs的Bim后,NFAT2核转位明显减少。6.RT-PCR及Western blot检测转染NFAT2-siRNA及过表达质粒分别下调与上调NFAT2后PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达变化。结果示,与转染阴性对照小干扰RNA相比,转染NFAT2-siRNA后,PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达明显下调（P<0.05）;与转染阴性对照质粒相比,转染NFAT2质粒后,PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达明显上调（P<0.05）。7.高糖条件下PTECs中的Bim激活NFAT2介导足细胞骨架损伤。为了进一步明确PTECs中Bim调控NFAT2对足细胞骨架的影响,通过向PTECs转染干预NFAT2表达的siRNA,向稳定转染Lenti-Bim-shRNA的PTECs细胞株转染上调NFAT2表达的质粒,在此基础上与足细胞共培养,检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达及骨架微丝排列情况。（1）免疫荧光示:在干预PTECs中Bim的基础上重新上调NFAT2表达,足细胞微丝F-actin排列紊乱,骨架蛋白synaptopodin表达显着下调,提示高糖下PTECs中Bim上调NFAT2表达介导足细胞骨架损伤。（2）Western blot检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达,其结果与免疫荧光染色synaptopodin表达结果一致。8.小鼠外观、形态等基本情况:从实验开始到最终结束,UNX及Sham组小鼠精神可,状态佳,日常表现活跃,拥有光滑整齐且干净的体毛,对外界刺激能够做出快速且正确的反应。DN组小鼠待造模成功后总体状态偏差,日常表现萎靡不振,全身毛发暗黄枯燥,对外界事物无法做出及时且有效的反应。9.小鼠体重、血糖及尿量水平:与Sham及UNX组小鼠相比,DN组小鼠体重增加减缓,部分小鼠体重甚至减轻;随机血糖明显升高,无自发血糖恢复;日常饮水量与尿量明显增加。10.小鼠尿蛋白、肾重/体重比值及血肌酐、尿素氮变化:与Sham及UNX组小鼠相比,DN组小鼠尿蛋白、肾重/体重比值、血肌酐及尿素氮水平明显增加。11.肾脏糖原染色:UNX及Sham组小鼠肾小球结构清晰,肾小管结构正常,排列整齐。DN组小鼠肾脏肥大,系膜细胞轻度增生,糖原沉积明显增多,出现肾小管排列紊乱,基底膜增厚等DN肾脏损伤病理变化。12免疫组化结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾脏近端肾小管中Bim阳性染色明显增多,Bim在肾小球中无阳染。13.Western blot结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾脏组织中Bim蛋白表达明显上调（P<0.05）,肾小球足细胞骨架蛋白synaptopodin表达显着下调（P<0.05）。14.免疫荧光结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾小球足细胞骨架蛋白synaptopodin荧光表达显着下调。研究结论1.通过构建体外共培养模型,明确PTECs与足细胞之间存在管球交流作用。2.管球交流作用的机制初探为:高糖下,肾小管中表达上调的Bim通过激活下游NFAT2诱导足细胞骨架排列紊乱,即Bim/NFAT2介导管球交流在DN发生中具有潜在调节作用。3.DN小鼠肾小管Bim蛋白表达上调,足细胞骨架蛋白表达降低参与介导DN蛋白尿发生。研究背景DN的发生机制包括多种因素,遗传基因及信号转导通路中的蛋白分子常作为重要影响因素参与介导DN关键基因表型的表达。然而,不断增加的DN发生率表明,仍需要更深入地了解其潜在的分子机制,以确定更佳的治疗方法。越来越多的证据表明,与DN发生发展相关的基因不仅受到经典信号通路的调控,还受到组蛋白染色质修饰、DNA甲基化和非编码RNA等表观遗传机制的调控。通过全表观基因组关联研究来鉴定DN表观遗传发生机理也可能为精准医学研究提供信息,对及时诊断及治疗以防止其发展为终末期肾病具有重要价值。我们前期研究发现在DN病程中,肾小管病变早于肾小球,并通过构建体外近端肾小管上皮细胞（PTECs）-足细胞共培养模型,发现肾小管Bim上调致足细胞骨架紊乱参与DN发生发展,即早期的肾小管病变可通过Bim蛋白进一步诱导足细胞损伤。但是当前,针对小管小球间相互作用机制的研究刚刚起步,二者相互作用介导DN的确切机制仍有待探索。并且在实际临床工作中发现,因DN起病隐匿,很多患者在就诊时往往错过了干预早期肾小管病变的时机,病变已蔓延至肾小球,因此阻止肾小球病变的进展成为研究的重点。为寻找DN管球交流后诱导足细胞病变的“元凶”,此部分拟针对足细胞病变的始动机制展开研究。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）是一种非编码RNA,其转录之后的RNA长度超过200个核苷酸,但不能编码任何蛋白质,是研究较多的一种非编码RNA。近来研究表明,lncRNA在生长、发育、衰老、死亡等多种生物学过程中起重要作用。许多证据表明,lncRNA具有独特的基因调控作用,影响着基因转录、剪接、mRNA稳定性、表观遗传调控、细胞周期控制、分化和免疫应答等多种生物学机制和过程。lncRNA也可作为miRNAs的宿主RNA,并作为具有独立结构域的模块分子,使其能够与DNA、RNA和/或蛋白特异性结合,从而影响基因表达。因此,lncRNA常作为重要转录调控因子,参与多种疾病的起病及进展。许多lncRNA表达在人类疾病中被异常调节,lncRNA介导疾病发生发展的作用逐步被揭示。近年来研究表明lncRNA在介导DN发生中也发挥着重要作用。lncRNAPVT1参与纤维化和DN发病;另一项研究发现有21种lncRNAs在两种肾纤维化模型中表达上调,而在Smad3敲除小鼠模型中表达下调,提示这些lncRNA可能受到TGFβ/Smad3信号通路的调节,从而参与介导肾脏炎症及肾脏间质纤维化的发生。2016年的一项研究发现,lncRNAMGC是miR-379簇中近40个miRNA的宿主lncRNA,可以促进早期DN小鼠模型中系膜细胞外基质（ECM）的积累和肥大。另外有研究显示:过表达lncRNACYP4B1-PS1-001抑制DN系膜细胞增殖及纤维化。虽然目前已有较多阐述lncRNA在DN发生发展作用的机制研究,但是这些研究均仅从一个角度进行探索,对于细胞间交流介导DN发生的lncRNA的作用尚未有研究深入报道。为实现DN早期治疗,明确管球交流致足细胞早期病变的始动机制,我们将与不同肾小管细胞共培养的足细胞进行mRNA及lncRNA高通量芯片检测,得到在管球交流之后足细胞中lncRNA及靶基因变化数据,并进行相关机制研究,为进一步完善丰富管球交流致足细胞骨架紊乱机制提供阐释作用。研究目的我们前期研究已证实:肾小管上皮细胞的Bim蛋白能介导肾小球足细胞骨架损伤及其机制,为了能在管球交流的更早环节阻断对足细胞的损伤,我们进行了如下探索。研究方法1.Sino human lncRNA array V3.0 高通量芯片检测本研究利用Sino human lncRNA array V3.0高通量芯片进行检测。检测范围包括 lncRNA 与 mRNA。2.RT-PCR检测lncRNA表达验证lncRNA表达水平是否与芯片结果一致。3.调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,RT-PCR检测调控效果:（1）向足细胞转染下调lncRNANONHSAT179542.1的小干扰RNA及阴性对照小干扰RNA;（2）RT-PCR检测调控足细胞中 lncRNA NONHSAT179542.1 后 lncRNA NONHSAT1 79542.1 mRNA 表达情况。4.调控足细胞中MICAL2表达,RT-PCR检测调控效果:（1）向足细胞转染上调MICAL2的过表达质粒及阴性对照质粒（MICAL2-NC）;（2）RT-PCR检测调控足细胞中MICAL2后MICAL2 mRNA表达。5.免疫荧光检测不同共培养组足细胞骨架排列情况:（1）进一步构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架微丝排列情况。（2）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架微丝排列情况。6.免疫荧光检测不同共培养组足细胞骨架蛋白荧光表达情况:（1）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架蛋白荧光表达情况。（2）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架蛋白荧光表达情况。7.KEGG富集分析及cis/trans靶基因预测:（1）KEGG富集与细胞骨架相关通路;（2）应用cis/trans靶基因预测lncRNANONHSAT179542.1下游靶基因。8.Western blot检测不同共培养组足细胞中蛋白表达变化:（1）检测不同共培养组足细胞中骨架蛋白synaptopodin蛋白表达情况:1)构建共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架蛋白表达情况。2)构建共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架蛋白表达情况。（2）检测不同共培养组足细胞中MICAL2蛋白表达情况:1)构建共培养模型,分别检测在与对照PTECs共培养及与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞中MICAL2表达。2)构建共培养模型,分别检测在与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞,在下调PTECs中Bim的基础上向足细胞转染下调lncRNA NONHSAT179542.1的siRNA,在下调PTECs中Bim的基础上向足细胞转染lncRNANONHSAT179542.1阴性对照小干扰后足细胞中MICAL2表达情况。3)构建共培养模型,分别检测与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞,与敲除Bim的PTECs共培养的基础上向足细胞转染MICAL2过表达质粒,与敲除Bim的PTECs共培养的基础上向足细胞转染MICAL2阴性对照质粒后足细胞中MICAL2表达情况。9.免疫组化检测不同组小鼠肾脏组织中MICAL2定位表达情况。10.统计学分析:对所有样本进行重复操作至少3次以上。应用统计学常用软件SPSS 22.0对所得数据进行统计学处理分析。统计学意义的评估:两组间比较采用T检验,数据均以mean±S.E.M.表示;应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对三组以上数据进行比较。组间差异统计学意义的设定为:P<0.05（双侧）。将所得数据输入GraphPad Prism 5.0软件中对柱状图进行绘制,予以直观展示。研究结果1.差异性lncRNAs筛选结果:（1）设置差异倍数（fold change,FC）1.5倍,P<0.05,将与对照PTECs高糖共培养的足细胞同与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞比较后,得到35个差异性表达的lncRNAs,其中17个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达上调,18个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达下调。我们选取前十位差异表达倍数最大的差异性表达lncRNAs。（2）将与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞vs.与转染阴性对照慢病毒的PTECs高糖共培养的足细胞比较后,得到38个差异性表达的lncRNAs,其中21个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达上调,17个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达下调。（3）由于与对照PTECs高糖共培养的足细胞与Lenti-Bim-shNC高糖共培养的足细胞二者产生的效应相似,故将二者分别同与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞比较,再取二者各自比较后的交集,共得到6个交集lncRNAs。将这6个交集lncRNAs同在与对照PTECs共培养vs.与Lenti-Bim-shRNA共培养比较后得到的前十个lncRNAs进行汇总,共得到14种lncRNAs进行后期验证处理。2.RT-PCR验证所挑选的14种lncRNAs表达水平是否与芯片检测结果一致:结果显示,lncRNANONHSAT179542.1,lncRNANONHSAT040129.2 及 lncRNA NONHSAT203700.1表达与芯片检测结果一致,三者均在与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞中表达上调,而其余11种lncRNA表达未见统计学差异。3.利用lncRNAs富集分析数据,我们选取29个与细胞骨架相关通路进行KEGG富集制图。联合lncRNA靶基因预测结果,选取与上述29个与细胞骨架相关通路相关的lncRNAs及靶基因进行制图,结果表明:lncRNA NONHSAT179542.1的26个靶基因所在通路与细胞骨架相关。结合RT-PCR验证结果,提示lncRNANONHSAT179542.1是介导共培养后足细胞骨架损伤的关键性 lncRNA。4.进一步调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,明确其参与介导足细胞骨架损伤。（1）向与下调Bim的PTECs高糖共培养的足细胞转染干预lncRNA NONHSAT179542.1表达的siRNA及阴性对照小干扰siNC,RT-PCR检测干预效果。发现与阴性对照组相比,转染siRNA后成功下调足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1 表达（P<0.05）。（2）Western blot结果表明:与Lenti-Bim-shRNA共培养组相比,Lenti-Bim-shRNA+转染干预 lncRNA NONHSAT179542.1-siRNA 共培养组足细胞骨架蛋白表达显着减少（P<0.05）。（3）在成功干预足细胞lncRNANONHSAT179542.1表达后,进一步进行体外共培养,免疫荧光染色微丝F-actin发现:与Lenti-Bim-shRNA共培养组相比,Lenti-Bim-shRNA+转染干预 lncRNA NONHSAT179542.1-siRNA 共培养组足细胞骨架再次出现排列紊乱,极性消失甚至发生融合。（4）同样,免疫荧光染色足细胞骨架蛋白synaptopodin得到与Western blot一致的结果。5.靶基因预测及功能验证示MICAL2为lncRNA NONHSAT179542.1潜在下游靶基因。（1）lncRNA NONHSAT179542.1 的 cis/trans 靶基因预测:将lncRNA NONHSAT179542.1进行cis/trans靶基因预测后绘制网络图,预测该lncRNA共有218个潜在下游靶基因。（2）结合mRNA芯片数据结果,发现218个靶基因中仅MICAL2在对照PTECs共培养足细胞与Lenti-Bim-shRNA共培养足细胞中差异性表达。进一步应用Western blot验证发现与对照PTECs共培养足细胞相比,MICAL2在与Lenti-Bim-shRNA共培养足细胞中表达显着降低（P<0.05）,与芯片结果趋势一致。（3）进一步调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1后检测MICAL2表达,Western blot结果表明干预肾小管中Bim表达,足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1表达上调,MICAL2表达显着减少（P<0.05）;而在下调肾小管中Bim表达的基础上,继续下调足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,MICAL2表达则恢复上调（P<0.05）。6.体外进一步调控足细胞中MICAL2表达,RT-PCR及Western blot检测调控效果。向与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞转染上调MICAL2表达质粒及阴性对照质粒,RT-PCR及Western blot检测调控效果。结果显示:与阴性对照质粒组相比,转染MICAL2过表达质粒后成功上调足细胞中MICAL2 mRNA与蛋白表达（P<0.05）。7.体外再次构建共培养模型,免疫荧光染色验证MICAL2参与肾小管Bim介导的足细胞骨架损伤。（1）免疫荧光染色骨架微丝排列结果显示:在干预肾小管Bim后上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架微丝排列紊乱。（2）免疫荧光染色骨架蛋白表达结果显示:在干预肾小管Bim后上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架蛋白表达显着下调,提示足细胞MICAL2参与介导肾小管Bim诱导的足细胞骨架功能障碍。8.Western blot验证MICAL2参与肾小管Bim介导的足细胞骨架蛋白表达异常。Western blot结果与免疫荧光染色骨架蛋白结果一致。表明:在与Lenti-Bim-shRNA共培养的基础上继续上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架蛋白表达再次减少（P<0.05）。9.免疫组化结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾小球中MICAL2阳性染色显着增多。UNX与Sham组小鼠肾脏中MICAL2阳性染色情况无显着差异。研究结论1.LncRNANONHSAT179542.1是参与肾小管Bim诱导的足细胞骨架损伤的关键性 lncRNA。2.LncRNA NONHSAT179542.1通过调控下游因子MICAL2参与肾小管Bim诱导的足细胞骨架损伤作用。3.本研究从表观遗传学角度揭示管球交流介导早期足细胞骨架损伤作用,深入阐明了“管球交流”来源的lncRNANONHSAT179542.1介导早期足细胞损伤的致病机理,为从效应蛋白MICAL2入手抑制足细胞损伤的治疗奠定基础,为明确DN发生机制提供新视角与新发现。
侯雅静[3]（2021）在《基于miR-29b抑制海马神经元凋亡探究逍遥散及芍药苷抗抑郁作用机制》文中研究说明一、研究目的本课题旨在观察逍遥散及主要成分芍药苷基于miR-29b抑制海马神经元凋亡通路探究逍遥散抗抑郁的作用机制。应激引发抑郁样情绪可以诱导人类大脑或是哺乳动物大脑海马神经元细胞凋亡,这种凋亡同样会反向诱发抑郁样行为。MicroRNA（microRNA）是小的非编码RNA分子,会影响目标信使RNA的稳定性或降低其翻译效率,在哺乳动物体内超过一半的关键蛋白活性都可以受到MicroRNA的调控。miR-29b可以抑制BH3家族蛋白的翻译,从而防止凋亡刺激下的细胞死亡。仅含有Bcl-2同源结构域3分子（Bcl-2 Homology Domain 3 Only,BH3only）属于细胞凋亡的关键调节剂,主要功能涉及诱导线粒体释放细胞色素c,miR-29b通过靶向抑制BH3促凋亡基因家族的多个成员来介导抗凋亡功能。芍药苷是中医复方逍遥散的质控成分,是近年来发现具有抗抑郁潜质的天然分子,越来越多研究证实芍药苷具有抗炎、抗氧化和神经保护作用,可以预防甚至阻断由脂多糖（LPS）诱导的海马神经元细胞凋亡。本课题通过慢性不可预知温和应激法（Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS）复制抑郁症肝郁脾虚型大鼠模型,LPS诱导小鼠海马神经元细胞HT22细胞系凋亡,联用HPLC,中药小分子单抗,免疫荧光,qPCR等技术在体内外研究逍遥散基于miR-29b抑制海马神经元凋亡发挥抗抑郁作用机制,而芍药苷为关键药效成分。对于揭示逍遥散与肝郁脾虚证方证物质基础,明确成分芍药苷与调控靶点对应有重要意义。二、研究方法（1）体内实验共用75只SPF级雄性健康SD大鼠,体重范围200～240g,于清洁级动物房适应性饲养7天,饲养环境及条件:将5只大鼠放入一笼共同饲养,给予大鼠常规饲料及去离子水,室温控制在22±2℃,湿度保持在30%～40%,光照保持正常昼夜节律同时保证饲养环境安静。采用CUMS方法制作抑郁症大鼠模型。通过大鼠宏观表征、摄食量、体重、糖水偏好实验、旷场实验等对动物模型进行评价。冰上取海马,显微切割分区CA3,CA1及DG区,Western Blot和实时荧光定量PCR检测miR-29b,BIM,BID,BAX,Casp-9,Casp-3的基因及蛋白表达水平,其中四只大鼠灌注后取全脑,进行脱水包埋制备石蜡切片,通过TUNEL染色实验,观察抑郁症肝郁脾虚大鼠海马神经元凋亡情况。（2）体外实验采用中药小分子单抗连用HPLC技术制备逍遥散芍药苷敲除液,与逍遥散一同制成含药血清。在LPS诱导的小鼠海马神经元细胞HT22细胞系凋亡模型中,验证芍药苷是逍遥散发挥抗凋亡神经保护作用的关键药效成分。用2.5%,10%逍遥散含药血清,单抗药液含药血清和含100,300,500μmol浓度芍药苷药物培养基干预HT22细胞系24小时后,用4μg/ml浓度LPS诱导HT22细胞凋亡,CCK8法筛选出最佳给药浓度,运用细胞流式技术检测凋亡比率,运用RT-qPCR及Western Blot方法检测miR-29b,BIM,BAX,Casp-9,Casp-3表达,运用免疫荧光技术检测BIM在凋亡神经元细胞中的阳性表达。（3）运用2.5%,10%逍遥散含药血清,10%单抗药液含药血清和10,100,300μmol浓度芍药苷药物培养基干预HT22细胞系24小时后,用4μg/ml浓度LPS诱导HT22细胞凋亡,运用细胞流式技术检测凋亡比率,运用Western Blot方法检测BIM表达,运用免疫荧光技术检测BIM在凋亡神经元细胞中表达,观察不同药物浓度与BIM抑制关系。（4）基于慢病毒转染技术,通过300μmol浓度芍药苷药物培养基干预HT22细胞系24小时后,用4μg/ml浓度LPS诱导HT22细胞凋亡,运用细胞流式技术检测凋亡比率,运用qPCR方法检测BIM表达,运用免疫荧光技术检测BIM在凋亡神经元细胞中表达。三、研究结果（1）六周CUMS成功复制抑郁症动物模型,并伴有肝郁脾虚证候表征,采用TUNEL染色方法检测各组海马凋亡情况,发现抑郁症肝郁脾虚模型大鼠海马区发生神经元凋亡,尤以CA3区最为显着。实时荧光定量PCR检测各组大鼠海马CA3区miR-29b及相关凋亡通路基因表达水平。与正常组相比,模型组miR-29b表达下调,BID,BIM,BAX,Casp-9,Casp-3表达升高逍遥散均可以逆转这一趋势,芍药苷不能下调BIM表达水平。Western Blot检测线粒体凋亡通路相关分子蛋白水平实验结果:与正常组相比,模型组大鼠海马 CA3 区 BIM,BID,BAX,Cleaved-Casp-9,Cleaved-Casp-3相对表达量明显升高,逍遥散、芍药苷及氟西汀可以抑制其高表达。（2）体外实验,通过中药小分子单抗技术联合HPLC检测,逍遥散中芍药苷有效敲除率为95%。通过CCK8法筛选出逍遥散及芍药苷最佳给药浓度分别为10%和300μmol。细胞流式结果表明4μg/ml LPS诱导细胞凋亡,逍遥散,逍遥散芍药苷敲除液,芍药苷皆可以抑制凋亡。实时荧光定量PCR结果,miR-29b在LPS诱导的凋亡模型组中mRNA表达水平明显下降,各药物组对其均具有上调作用,差异具有统计学意义。Mab-PF及芍药苷组（PF）上调miR-29b mRNA表达水平较逍遥散含药血清低,差异具有统计学意义。BIM,BAX,Casp-9,Casp-3在凋亡细胞模型组中mRNA表达水平明显高于正常组细胞,逍遥散及Mab-PF含药血清对其均具有下调作用,芍药苷仅对BIM mRNA表达水平无调节作用。（3）逍遥散含药血清在10%浓度具有抑制LPS诱导的凋亡作用,芍药苷在100μmol以上浓度具有抗凋亡作用。逍遥散和芍药苷对BIM的抑制作用存在药物浓度依赖关系,随着药物浓度的升高,BIM蛋白相对表达量下降。（4）敲低miR-29bmRNA表达水平,BIM蛋白表达量升高,促进了细胞自发性凋亡。芍药苷可以靶向调控miR-29b,抑制BIM蛋白翻译,抗神经元凋亡。四、结论:（1）体内实验表明六周CUMS抑郁症大鼠模型存在海马神经元凋亡,且CA3区最为显着。（2）miR-29b在CUMS模型中存在基因水平表达下调,且逍遥散和芍药苷可以上调其表达,miR-29b是逍遥散发挥神经保护作用的关键靶点。（3）体外实验表明逍遥散调控miR-29b抑制BIM的药效优于逍遥散芍药苷敲除组,表明在该机制作用中芍药苷发挥重要作用。（4）芍药苷可以靶向调控miR-29b,抑制BIM蛋白翻译,抗神经元凋亡。
张苏洁[4]（2021）在《益气活血方调控Sirt4/FOXO3a信号通路改善急性心肌梗死炎性损伤和心肌细胞凋亡的作用研究》文中认为一、研究目的急性心肌梗死患病率高,在现代医学标准治疗的情况下,仍有可能出现心力衰竭、心脏破裂等恶性事件。炎性损伤、氧化应激是心肌梗死重要的发病机制,但目前并未有针对性药物。细胞凋亡是心肌细胞坏死的重要形式,也是心肌重构的启动因素。因此早期延缓或抑制心肌细胞凋亡显得尤为重要。中药治疗心肌梗死机制有待揭示,本课题研究目的在于证实益气活血方治疗心肌梗死临床疗效,基础试验探讨其治疗机制。二.研究方法1.临床研究。选择符合急性心肌梗死西医诊断标准及中医辨证为气虚血瘀证型患者60例,分为西药标准治疗组（对照组）,益气活血方+西药标准治疗组（治疗组）,观察两组疗效等级、有效率、中医证候积分;心脏超声检测LVEF,E/Ea,室壁运动积分指数、以及收缩期心内膜向心运动幅度;患者血清NT-proBNP、H-CRP表达;ELISA技术检验治疗组 IL1β、TNF-a、IL-6、ROS、p-FOXO3a 表达水平。2.基础实验（1）益气活血方对H2O2诱导的心肌细胞中炎性因子的影响。首先构建心肌细胞氧化应激模型,采用CCK-8检测双氧水构建模型的最佳浓度。然后采用CCK-8检测益气活血方对细胞活性无影响的最大剂量。ELISA检测益气活血方对心肌细胞培养液中炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6浓度的影响,实验分组正常组,模型组,模型+益气活血低剂量组,模型+益气活血中剂量组,模型+益气活血高剂量组。（2）益气活血方对H2O2诱导的心肌细胞中氧化应激水平的影响。分别采用DHE检测、ROS试剂盒检测益气活血方对细胞ROS水平的影响。采用CAT、MDA、SOD试剂盒检测益气活血方对CAT,MDA和SOD的影响。（3）益气活血方对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响。细胞流式试验检测益气活血方对心肌细胞凋亡水平的影响。Western-blot检测益气活血方对凋亡通路蛋白水平的影响。（4）Sirt4和p-FOXO3a在H2O2诱导心肌细胞中的表达。Western-blot检测Sirt4和p-FOXO3a在H2O2诱导的新生大鼠心肌细胞中的表达,益气活血方对Sirt4和p-FOXO3a的表达,FOXO3a乙酰化水平的表达影响。（5）益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号途径对炎性因子的影响。首先构建Sirt4的干扰质粒,采用RT-qPCR技术检测Sirt4的干扰质粒水平。实验分组为正常组,模型组,模型+益气活血方高剂量组,模型+益气活血方高剂量+Sirt4敲减阴性对照组,模型+益气活血方高剂量+Sirt4敲减组,ELISA检测各组炎性因子的表达。（6）益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号途径对氧化应激水平的影响。实验分组同（5）,DHE检测、ROS试剂盒检测各组ROS水平。CAT、MDA、SOD试剂盒检测各组CAT,MDA和SOD的水平。（7）益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号途径对细胞凋亡的影响。实验分组同（5）,流式技术检验各组凋亡水平,同时采用蛋白印迹技术检验凋亡蛋白Bcl-2,Bax,BIM,cleaved caspase3的表达。Western Blot检测细胞Sirt4和p-FOXO3a的表达,FOXO3a乙酰化水平的表达。三.研究结果1.临床研究。中医证候疗效分析结果示:治疗组治疗疗效等级及有效率高于对照组,总体积分改善优于对照组,治疗组胸痛、胸闷、心悸、乏力症状改善优于对照组,气短症状两组无统计学差异;心超结果治疗组可显着提高LVEF;E/Ea治疗组、对照组无差异;治疗组可降低NT-ProBNP、室壁运动积分、收缩期心内膜向心运动幅度,优于对照组;两组中H-CRP无统计学差异;ELISA结果总结:益气活血方可以明显降低心肌梗死患者氧化应激水平、升高FOXO3a磷酸化水平,降低IL-1β表达,对TNF-α IL-6无影响。2.基础实验。（1）CCK-8试验结果示25uM的双氧水可以显着抑制心肌细胞的活性,增加心肌细胞的氧化应激损伤,所以选择25uM的双氧水浓度诱导大鼠心肌细胞损伤。益气活血方100ul/ml的给药剂量为最大无毒剂量,所以选择此低剂量为25ul/ml,中剂量为50ul/ml,高剂量为100ul/ml用于后续实验。模型组较正常组炎性因子表达升高,伴随益气活血剂量的增加炎性因子表达逐渐下降。（2）DHE、ROS检测结果示:模型组ROS水平较正常组增高,随着益气活血方剂量的增加ROS的表达水平逐渐下降;模型组MDA的表达水平较正常组增加,并且随着益气活血方剂量的增加MDA的表达水平逐渐下降;模型组SOD,CAT的表达水平较正常组降低,并且随着益气活血方剂量的增加SOD,CAT的表达水平逐渐增加。（3）流式细胞检测结果示:与正常组对比,模型组细胞凋亡的水平增加,随着益气活血方剂量的增加细胞凋亡的水平逐渐下降;模型组Bax,BIM,cleavedcaspas3的表达水平增加,随着益气活血方剂量的增加Bax,BIM,cleaved caspas3的表达水平逐渐下降;模型组Bcl-2的表达水平下降,随着益气活血方剂量的增加Bcl-2的表达水平逐渐增加。（4）WB结果示与正常组相比,模型组中Sirt4、p-FOXO3a的表达下降,FOXO3a乙酰化水平增加;随着益气活血方剂量的增加,Sirt4、p-FOXO3a的表达水平逐渐增加,FOXO3a乙酰化水平逐渐下降。（5）RT-qPCR结果示,质粒干扰可有效降低Sirt4的表达。ELISA检测结果与正常相比,模型组炎性因子TNF-α,IL-1β,IL-6表达增加。与模型组相比,模型+高剂量组炎性因子表达下降。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减阴性对照组炎性因子表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组炎性因子表达回升但是低于模型组。（6）DHE、ROS检测结果与正常相比,模型组ROS表达增加。与模型组相比,模型+高剂量组ROS表达下降。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减阴性对照组ROS表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组ROS表达回升但是低于模型组。CAT、SOD、MDA检测结果:与正常组相比,模型组SOD,CAT表达下降,MDA升高。与模型组相比,模型+高剂量组中SOD,CAT表达增加,MDA下降。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减组SOD,CAT、MDA表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组SOD,CAT表达下降但是高于模型组,MDA表达上升但低于模型组。（7）细胞流式检测结果:与正常组相比,模型组凋亡细胞表达增加。与模型组相比,模型+高剂量组中凋亡细胞表达下降。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减阴性对照组凋亡细胞表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组凋亡细胞表达回升但是低于模型组。WB结果示与正常组相比,模型组Bax,BIM,cleaved caspas3表达增加,Bcl-2表达下降。与模型组相比,模型+高剂量组中Bax,BIM,cleaved caspas3表达下降,Bcl-2表达增加。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减阴性对照组Bax,BIM,cleaved caspas3,Bcl-2表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组Bax,BIM,cleaved caspas3表达回升但是低于模型组,Bcl-2表达下降但是高于模型组。四.研究结论益气活血方可抑制心肌梗死患者炎性损伤以及氧化应激。细胞实验表明益气活血方通过Sirt4/FOXO3a通路保护心肌细胞免于氧化应激的损伤,改善炎症因子水平、并能抑制细胞凋亡。
邹兆伟[5]（2021）在《抑制Cx43通过减轻氧化应激对脓毒症肠损伤的保护作用研究》文中指出脓毒症是一种危及生命的综合症,其常引起多器官功能受损或衰竭,是重症监护病房最为常见的死亡原因。而胃肠道是脓毒症最常累及的器官,目前脓毒症所致的肠损伤在人体的作用机制尚不明确,因此我们对其潜在的机制进行研究并制定新的治疗策略,以改善脓毒症患者的预后。间隙连接（gap junction,GJ）功能在损伤放大和组织恶化过程中起到重要作用,且研究表明,活性氧（reactive oxygen species,ROS）的胞内累积会诱导脓毒症肠黏膜细胞损伤。在本次研究中我们重点探讨了 GJ功能调节蛋白缝隙连接蛋白43（connexin43,Cx43）与脓毒症肠损伤的相关性以及Cx43通过转移活性氧,ROS)在脓毒症所致肠损伤中的具体作用机制。目的:1.探讨脓毒症肠损伤的可能机制,明确Cx43、ROS以及JNK1/Sirt1/FOXO3a信号通路介导的细胞凋亡在脓毒症肠损伤发生发展中的作用。2.验证以下研究假说是否成立:即在脓毒症肠损伤过程中,Cx43通道是否介导ROS转移调节JNK1/Sirt1/FoxO3a信号通路活性,进而导致促凋亡蛋白Bim和Puma的转录翻译以及脓毒症所致肠损伤的加重。方法:1.盲肠结扎穿刺法（CLP）构造脓毒症大鼠模型,收集小肠组织及血清,检测不同时间点中小肠组织Cx43蛋白表达水平,同时测定对应大鼠小肠组织的损伤病理评分以及肠道损伤指标LDH、DAO和IFABP的水平,探索Cx43表达水平与脓毒症肠损伤之间的相关性;2.选择IEC-6细胞,以脂多糖LPS预处理建立脓毒症细胞模型,使用小干扰RNA对IEC-6进行转染,观察Cx43表达水平与细胞模型中肠损伤指标LDH、DAO和IFABP水平的相关性;3.分别使用Cx43抑制剂（18-α-GA）、抗氧化剂（NAC）对体内外模型进行干预,测定肠损伤指标LDH、DAO和IFABP水平,观察Cx43与ROS对肠损伤的影响。4.分别使用抗氧化剂（NAC）、Fox03a抑制剂、Sirt1抑制剂（烟酰酸）对体内模型进行干预,Western Blot检测JNK1/Sirt1/FoxO3a信号通路关键因子表达水平;5.在脓毒症细胞模型中分别使用双荧光素酶和染色质免疫共沉淀ChIP检测FoxO3a对促凋亡蛋白Bim和Puma的调控作用。结果:1.在体内脓毒症大鼠模型中,Cx43的表达水平与肠道损伤严重程度呈现正相关,且在术后24小时左右达到峰值,且与LDH、DAO、IFABP水平变化相协调。2.在体内外脓毒症模型中,Cx43可以促进ROS的转移及胞内累积,从而激活JNK1/Sirt1/FoxO3a信号通路导致脓毒症肠损伤。3.双荧光素酶及染色质共沉淀实验表明了 Cx43的下游调控因子FoxO3a可以直接结合凋亡相关蛋白Bim和Puma从而诱导细胞凋亡导致脓毒血症肠损伤。结论:CX43可以促进ROS转移及胞内累积,从而激活JNK1/Sirt1/FoxO3a信号通路进而诱导细胞凋亡加重脓毒症所致的肠损伤。
汪佳佳[6]（2021）在《小檗碱对糖尿病肾病足细胞保护作用及对长链非编码RNA的初步调节作用研究》文中研究指明糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要并发症之一,是慢性肾病最常见的病因,占终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）的40%以上。足细胞参与肾小球滤过屏障的组成,具有复杂的细胞形态,可保证肾小球基底膜（glomerular basement membrane,GBM）结构和功能正常,防止蛋白质的过分流失,对维持肾小球功能十分重要,其损伤和丢失将进一步加重肾小球损伤和滤过障碍。小檗碱（berberine,BBR）是黄连治疗消渴的物质基础,具有多种药理作用,能够在一定程度上改善胰岛素抵抗,发挥降血糖作用,还有降血脂、降血压、抗炎和抗氧化应激等功效,并且有利于延缓肾脏损伤进程,对DN有一定的治疗作用。长链非编码RNA（long noncodingRNA,LncRNA）是一类没有蛋白编码功能的转录产物,虽然不能直接影响基因表达,但能通过多种方式参与基因表达的调控。研究证据表明LncRNA可能参与足细胞损伤,在DN发病过程中发挥重要作用。生长因子在DN进程发挥不可替代的作用,其中上皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）广泛存在于颌下腺、胰岛和肾脏组织,它们通过与EGF受体结合来影响细胞的增殖、凋亡和氧化应激等作用,EGF作为EGF受体的激动剂,在DN时与足细胞功能的调控有关。本课题研究发现LncRNA LOC102549726在DN肾脏组织和足细胞中均发生异常上调,生物信息学预测其靶蛋白为EGF,该蛋白与细胞功能密切相关,但LncRNA LOC102549726与EGF之间如何作用并调节足细胞功能的具体机制仍不清楚。本研究通过体内外实验阐明DN的发病机理、明确DN相关的LncRNA和BBR的作用机制,探讨LncRNA LOC102549726是否在DN大鼠肾脏组织以及高糖诱导的足细胞中异常表达,并试图通过对LncRNA及其靶蛋白的调控研究阐明BBR对DN的防治机理。目的:建立SD大鼠DN模型,筛选差异表达LncRNA。结合肾脏组织和足细胞中差异表达的LncRNA,明确本课题研究的足细胞功能相关LncRNA为LncRNA LOC102549726。明确LncRNA LOC102549726参与足细胞损伤过程,探究LncRNA LOC102549726通过靶向EGF调控DN足细胞损伤。初步探究BBR通过抑制DN足细胞中LncRNA LOC102549726的异常上调缓解足细胞损伤。初步探究BBR通过对LncRNA LOC102549726及其靶蛋白的调控发挥缓解肾脏损伤的作用。方法:腹腔注射STZ合并高糖高脂饲料建造SD大鼠DN模型,检测空腹血糖、尿蛋白确认DN模型建造成功,苏木精和曙红（hematoxylin and eosin,HE）染色染色确定肾小球损伤情况,Western Blot检测足细胞相关蛋白（包括足细胞标志蛋白Podocin、WT-1和足细胞损伤标志蛋白Desmin）表达情况。高糖（high glucose,HG）环境培养足细胞建立DN体外模型,Western Blot检测正常组和高糖组足细胞相关蛋白表达情况,流式细胞术检测每组足细胞的凋亡率,确定足细胞体外DN模型建造是否成功。全转录组测序结合qRT-PCR筛选出DN大鼠肾脏组织以及足细胞中均异常表达的DN相关LncRNA。筛选出上调差异最大的LncRNA为LncRNA LOC102549726并检测其亚细胞定位,结合生物信息学预测其与EGF蛋白存在潜在作用位点。设计并转染LncRNA LOC102549726小干扰RNA（small infereningRNA,siRNA）和过表达质粒,qRT-PCR检测每组EGF的基因表达情况、Western Blot分别检测Podocin、WT-1、Desmin以及细胞凋亡蛋白Bim的表达情况。转染EGF siRNA,qRT-PCR验证是否成功干扰EGF表达,Western Blot分别检测每组Podocin、WT-1、Desmin、Bim蛋白的表达情况,为进一步验证足细胞损伤情况,流式细胞术检测每组足细胞的凋亡率、Transwell检测每组的足细胞粘附能力。将HG刺激的足细胞再分别给予5个浓度梯度的BBR,qRT-PCR检测每组LncRNA LOC102549726的表达情况,流式细胞术检测每组足细胞的凋亡率,筛选出改善LncRNA LOC102549726异常表达以及抑制足细胞凋亡的BBR最适给药浓度。分别转染LncRNA LOC102549726 siRNA或过表达质粒合并给予最适浓度BBR,qRT-PCR分别检测EGF的基因表达情况、Western Blot检测Podocin、WT-1、Desmin、Bim蛋白表达情况、免疫荧光检测WT-1的表达情况、流式细胞术检测每组足细胞的凋亡率变化、Transwell检测每组足细胞的粘附能力。结果:1.SD大鼠DN模型的建立以及足细胞体外模型的确立HE结果显示正常组大鼠肾小球结构无明显病变,模型组肾小球基底膜增厚,细胞外基质沉积,部分肾小球硬化;免疫荧光显示模型组肾脏组织WT-1表达水平降低;组织Western Blot结果显示,相较于正常组,模型组的肾脏组织中足细胞标志蛋白WT-1、Podocin表达明显下降,而足细胞损伤标志蛋白Desmin表达升高,模型组大鼠肾脏组织中足细胞损伤。Western Blot结果显示,相较于正常组,高糖组足细胞中WT-1、Podocin表达明显下降,而Desmin表达升高;流式细胞术结果显示,与正常组相比,高糖组足细胞凋亡率上升。表示高糖刺激可导致足细胞损伤。2.差异表达LncRNA的筛选高通量测序检测差异表达LncRNA,结果显示正常组与模型组肾脏组织有大量LncRNA存在显着差异,分别选择20个上调倍数最大,和下调倍数最大的LncRNA,确定了9个与DN相关的LncRNA;qRT-PCR检测肾脏组织和足细胞中这9个LncRNA的表达情况,其中足细胞与肾脏组织中差异表达一致且显着上升的为LncRNA ENSRNOT00000087471（即LncRNA LOC102549726）,qRT-PCR检测主要定位于细胞核中。3.LncRNA LOC102549726靶标的预测和验证生物信息学技术预测LncRNA LOC102549726的靶蛋白为EGF,qRT-PCR结果显示,转染LncRNA LOC102549726 siRNA后EGF表达下降,而过表达LncRNA LOC102549726后EGF表达上升。LncRNA LOC102549726的靶蛋白为EGF。4.LncRNA LOC102549726与足细胞损伤相关转染LncRNA LOC102549726 siRNA或过表达质粒,Western Blot结果显示,与正常组相比,高糖组和过表达组足细胞中Desmin和Bim蛋白表达异常上升,WT-1、Podocin表达下降,而转染LncRNA LOC102549726 siRNA可逆转这些蛋白的异常表达;免疫荧光结果显示,过表达LncRNA LOC102549726时WT-1表达降低,转染LncRNA LOC102549726 siRNA时WT-1表达升高。提示LncRNA LOC102549726与足细胞损伤相关。5.LncRNA LOC102549726靶蛋白EGF与足细胞损伤相关转染EGF siRNA时Western Blot结果显示,与正常组相比,高糖组足细胞中Desmin和Bim蛋白表达异常上升,WT-1、Podocin表达下降,而转染EGF siRNA可逆转这些蛋白的异常表达;流式细胞术结果显示,高糖组足细胞凋亡率升高,EGF siRNA组凋亡率下降;Transwell结果显示高糖组足细胞黏附能力下降,转染EGF siRNA时足细胞黏附能力增强,LncRNA LOC102549726可靶向EGF影响足细胞损伤。转染LncRNA LOC102549726过表达质粒时Bim、Desmin异常上升,WT-1、Podocin表达降低,转染LncRNA LOC102549726 siRNA可逆转这些蛋白的异常表达;免疫荧光结果显示高糖组WT-1表达下降,LncRNA LOC102549726siRNA组WT-1表达上升。LncRNA LOC102549726可靶向EGF影响足细胞损伤。6.BBR改善足细胞损伤作用可能与其影响LncRNA LOC102549726异常表达相关qRT-PCR结果显示不同浓度的BBR均可改善LncRNA LOC102549726的异常表达,其中90μM的BBR的改善效果最好;流式细胞术结果表明高糖刺激引起的足细胞凋亡能被这5个浓度梯度的BBR抑制,且90μM BBR抑制足细胞凋亡的效果最佳。qRT-PCR结果显示,过表达LncRNA LOC102549726时,EGF也异常上升,转染LncRNA LOC102549726 siRNA或BBR给药均可逆转其异常表达;Western Blot结果显示,过表达LncRNA LOC102549726时,Desmin、Bim异常上升,Podocin、WT-1表达下降,转染LncRNA LOC102549726 siRNA或BBR给药均可逆转这些蛋白的异常表达;免疫荧光结果显示,过表达LncRNA LOC102549726时WT-1表达降低,转染LncRNA LOC102549726 siRNA或BBR给药时WT-1表达升高;流式细胞术结果显示,高糖组和LncRNA LOC102549726过表达组足细胞凋亡率升高,LncRNA LOC102549726 siRNA组以及给药组凋亡率下降;Transwell结果显示高糖组和LncRNA LOC102549726过表达组足细胞黏附能力降低,LncRNA LOC102549726 siRNA组以及给药组足细胞黏附能力增强。BBR可能调控LncRNA LOC102549726改善足细胞功能。结论:1.LncRNA LOC102549726在DN大鼠肾脏组织和HG诱导的足细胞中均异常上升。2.LncRNA LOC102549726通过靶向EGF调控DN足细胞损伤。3.BBR可能通过影响LncRNA LOC102549726异常表达及调节相关靶蛋白发挥对足细胞的保护作用。
王家坚[7]（2020）在《基于多组学大数据的妇科和乳腺癌BCL2家族分子变化模式及其分子网络研究》文中研究指明在过去的三十年中,由于BCL2（B-Cell CLL/Lymphoma 2）家族蛋白在细胞凋亡、肿瘤发生和抗癌治疗中的重要作用,BCL2家族蛋白已被广泛研究。然而,BCL2基因家族在妇科肿瘤中多组学分子模式的相似性和差异性尚未得到很好的认识和探究,因此本研究利用TCGA、GEO等多个数据库的不同组学水平的数据,研究妇科和乳腺癌中BCL2家族突变频率、基因表达、染色质可及性和预后、免疫组化之间的相关性来探究BCL2基因家族在妇科肿瘤中的共性和差异的分子特征,以期系统全面揭示BCL2家族在妇科肿瘤的可能作用及调控网络,为妇科肿瘤治疗提供理论依据和可能的治疗靶标。本论文主要内容和结果如下:第一,利用大量的样本对BCL2家族成员的遗传变化、m RNA表达水平、预后和免疫染色水平进行研究。抗凋亡成员在妇科肿瘤中表达并不广泛,在一些患者样本中也观察到抗凋亡成员的低表达水平和深度缺失,如BCL2、BCL2L2（Bcl-2-Like Protein 2）和MCL1（Myeloid Cell Leukemia 1）都出现了扩增和m RNA表达上调,但相对于正常样本它们的表达是下调的;同时也发现了关键的成员如BCL2L1（Bcl-2-Like Protein 1）,是妇科肿瘤抗凋亡成员中唯一上调的成员。但是这些成员的表达模式和BCL2凋亡调控模型是相吻合的,与其他BCL2家族成员相比,BCL2L1和MCL1显示出更高的表达水平,这与基因扩增频率的结果一致。而促凋亡成员中的效应者BAK1（BCL2 Antagonist/Killer1）和BAX（BCL2 Associated X）出现显着差异的上调表达,这也是肿瘤细胞需要快速持续的维持其稳态的需要;还有起始者（PMAIP1（Phorbol-12-Myristate-13-Acetate-Induced Protein 1）、BIK（BCL2 Interacting Killer）和BID（BH3 Interacting Domain Death Agonist））也相对于正常样本出现了过表达。预后结果显示BAD（BCL2 Associated Agonist Of Cell Death）、BIK和BAK1在妇科肿瘤具有显着的预后效果。免疫组化分析发现,除BOK（BCL2 Related Ovarian Killer）、BMF（Bcl2Modifying Factor）、HRK（Harakiri,BCL2 Interacting Protein）外,这些BCL2家族基因均有免疫组化染色,且多分布于患者样本的细胞质和细胞膜区域。相比之下,正常组织中广泛的脂肪细胞、腺细胞和肌上皮细胞通常有低水平或未检测到的染色。在特定的正常组织中,包括鳞状上皮细胞、子宫内膜基质中的细胞、卵巢基质细胞、卵泡细胞,也观察到类似的低水平染色。正常组织与肿瘤样本之间表现出不同的染色,映射出BCL2家族不同的蛋白调控模式。第二,利用染色质的开放区域研究BCL2家族成员的表观调控,涉及DNA的甲基化、组蛋白修饰和远端调控。我们的研究首次对BCL2家族的远距离调控（活跃峰-启动子区域）进行了系统研究。远端非编码区与的染色质活跃区域具有性别和组织的特异性。同时我们还发现一类活跃的峰在靠近转录起始位点附近的区域始终没有性别和组织的特异性,这些区域在不同妇科肿瘤中基本都是活跃状态的,不管是抗凋亡成员还是促凋亡成员都遵循这个规律:启动子区域及其邻近区域的活跃峰是普遍存在的。同时我们还发现超过一半以上的BCL2家族成员都具有远端调控信号,这些成员转录活性普遍高于正常样本。基因组的染色质活跃程度与m RNA表达水平正相关。TCGA单个样本水平的活跃染色质和单个样本的m RNA水平进行比较,结果发现活跃峰的数量越多,m RNA的表达水平就越高;反过来,活跃峰的数量越少,m RNA的表达水平则越低。第三,利用整合前面的多组学数据（包括BCL2家族基因突变、表达等）以及PPI网络、转录调控等分析了BCL2家族在妇科肿瘤中的调控网络,探究BCL2家族调控网络在妇科肿瘤中存在哪些共同或不同的特点,发现TP53和PIK3CA与BCL2L1的共突变标志是特异的,在以前的妇科肿瘤研究中没有发现。TP53和PIK3CA的共突变是MOMP的抗凋亡蛋白抑制的主要媒介,可能可以导致乳腺癌出现更差的预后表型。这些蛋白质通过共突变标志连接起来。MCL1和BCL2L1的m RNA表达水平较高,与基因周围区域的染色质可及性一致,尤其可能是由于远端染色质可及性信号较强,增强了其转录表达。因此,我们推测TP53（Transformation-Related Protein 53）和PIK3CA（Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase 110 KDa Catalytic Subunit Alpha）的共突变信号作用于刺激BCL2L1基因位点染色质环的形成,以加强其转录活性。在妇科肿瘤中,BCL2L1作为唯一上调的抗凋亡成员和保护者,可以防止促凋亡成员的激活和寡聚,维持线粒体膜电位的平衡,从而防止细胞色素c的释放,抑制caspase。因此,将BCL2L1、TP53/TP63（Transformation-Related Protein 63）和PIK3CA作为可能的潜在预后标志物可能是妇科癌诊断和治疗的有效方法。另外,调控网络的特异之处:BRCA中YWHAZ（Tyrosine 3-Monooxygenase/Tryptophan 5-Monooxygenase Activation Protein Zeta）扩增、CESC中PIK3CB（Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate 3-Kinase 110 KDa Catalytic Subunit Beta）扩增、UCEC中PIK3R1（Phosphoinositide-3-Kinase Regulatory Subunit 1）突变以及OV中XRCC6（X-Ray Repair Cross Complementing 6）、NMT1（N-Myristoyltransferase 1）和CASP3（Caspase 3）下调等方面存在特异性差异,这表明BCL2家族蛋白网络可用于鉴别不同类型的妇科肿瘤,为靶向药物的设计提供新的思路。总之,本研究利用多组学技术对BCL2家族在妇科肿瘤中的DNA突变、表达、活跃染色质和调控网络进行了整合分析,全面系统地揭示BCL2家族在妇科肿瘤的分子变化模式及可能的作用和分子网络,为妇科肿瘤治疗提供理论依据和可能的治疗靶标,也为其他泛肿瘤、多组学研究提供了可借鉴的整合分析思路和经验。
孙天宇[8]（2020）在《PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究》文中进行了进一步梳理目的1.探索转录辅助因子4（positive cofactor 4,PC4）在调控肺腺癌的生物学功能中的作用;2.阐释PC4对FOXO1和FOXO3a的调控作用以及PC4通过FOXO1和FOXO3a调控肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制;3.探究叉头框转录因子O1（forkhead O transcription factor 1,FOXO1）和叉头框转录因子O3a（forkhead O transcription factor3a,FOXO3a）在介导肺腺癌对顺铂的药物敏感性中的作用及机制,以及它们介导PI3K/Akt通路抑制剂LY294002协同增强顺铂细胞毒作用的机制。方法以肺腺癌A549、PC-9、H1299细胞为研究对象,采用慢病毒感染构建PC4、FOXO1、FOXO3a干扰或过表达的稳定细胞株,流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期,CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞侵袭,Western Blot检测相关蛋白表达,通过裸鼠皮下植瘤构建动物模型。结果在本研究中,我们发现干扰PC4表达后,PC-9细胞侵袭与自噬均减弱,经顺铂处理后细胞凋亡多于对照组,存活率低于对照组;过表达PC4后,H1299细胞侵袭能力与自噬均增强,经顺铂处理后细胞凋亡少于对照组,存活率高于对照组。动物实验发现过表达PC4后肿瘤对顺铂敏感性降低。此外,干扰PC4增加了肺癌细胞内FOXO1和FOXO3a蛋白表达,也增加了FOXO1和FOXO3a蛋白在细胞核内的分布;过表达PC4抑制了FOXO1和FOXO3a蛋白水平,也减少了细胞核内FOXO1和FOXO3a含量。FOXO蛋白抑制剂AS1842856削减了PC4干扰诱导的细胞对顺铂药物敏感性增加。PI3K/Akt通路抑制剂LY29402、蛋白酶体抑制剂硼替佐米、CBP/p300抑制剂A-485未能逆转PC4对FOXO1和FOXO3a的调控作用。免疫共沉淀结果显示PC4与FOXO3a蛋白质间有相互作用。另一方面,顺铂在早期增加了肺腺癌细胞中FOXO1和FOXO3a的表达和细胞核内含量。干扰FOXO1和FOXO3a表达在体外和体内均显着降低了细胞对顺铂的敏感性。FOXO1和FOXO3a调控顺铂诱导的细胞凋亡的机制不依赖于其下游促凋亡蛋白Bim。此外,LY294002通过增加FOXO1和FOXO3a的表达和细胞核内的分布,协同增加了顺铂的细胞毒性作用。干扰FOXO1和FOXO3a表达明显减弱了LY294002对顺铂细胞毒性作用的协同增强作用。结论1.PC4能增强肺腺癌细胞侵袭能力,促进自噬,并降低肺腺癌细胞对顺铂的药物敏感性。2.PC4通过抑制FOXO1和FOXO3a降低了肺腺癌对顺铂的药物敏感性,且PC4对FOXO1和FOXO3a蛋白的抑制作用不依赖于PI3K/Akt通路、蛋白酶体降解、CBP/p300乙酰化修饰。3.FOXO1和FOXO3a增加了肺腺癌对顺铂的敏感性,并介导了LY294002对顺铂的协同增强作用。
陈俭清[9]（2020）在《镉暴露通过miR-103靶向FoxO调控鲤鱼脾细胞凋亡和自噬的研究》文中认为镉（cadmium,Cd）是一种具有毒性的重金属,人类活动造成镉污染不断加剧。因此,镉污染成为人们关注和研究的热点。各种形式的镉污染都会随着降水和地表径流汇聚到天然水体中,水体中富集的镉会在水生动物体内累积,造成动物机体的损伤,并通过食物链,最终影响人类健康。鲤鱼是世界上分布最广的鱼类之一,可以作为环境污染的生物标志物。Micro RNA（miRNA）是一种非编码RNA,参与动物基因的转录后调控。近年来研究发现,miRNA参与一些环境污染物中毒的调控,被认为可以作为环境污染的潜在分子标记。然而,miRNA在调控镉暴露引起鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬发生中的机制报道较少,因此,本项目通过体内试验和体外试验,研究镉暴露诱导miRNA调节鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬的机制。将162尾健康鲤鱼分为2组（对照组和镉处理组）,鲤鱼镉中毒模型水中镉浓度为0.26mg/L Cd(96 h LC50的1/25)。分别在鲤鱼镉暴露的10 d、20 d和30 d采集脾组织样品。采用显微结构和超微结构观察,转录组学测序,生物信息学技术分析,预测miR-103与FoxO的靶向关系并参与鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬的调控;进一步通过TUNEL检测,氧化应激和炎症指标测定,实时荧光定量PCR（RT-q PCR）和免疫印迹（western blot,WB）等方法检查鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬相关通路基因和蛋白表达,以研究鲤鱼镉暴露引起的脾组织细胞凋亡和自噬的机制;通过体外试验,对鲤鱼上皮（EPC）细胞镉暴露CCK-8试验确定镉浓度,双荧光素酶报告基因试验验证miR-103与FoxO的靶向关系,通过EPC细胞镉暴露1 h、6 h和12 h进行氧化应激和炎症指标测定,miR-103的敲低和过表达试验,AO/EB染色,流式细胞术,MDC/EB染色,RT-q PCR和WB等方法检测凋亡和自噬及相关通路基因和蛋白的表达,以研究鲤鱼EPC细胞凋亡和自噬的机制。主要研究结果如下:（1）通过观察鲤鱼镉中毒模型,发现镉处理组鲤鱼体表颜色变浅,在水中游泳路线杂乱无规律,精神沉郁,采食量下降,镉暴露显着抑制鲤鱼生长。病理组织切片观察发现,对照组健康鲤鱼脾组织红髓面积大于白髓面积,红髓和白髓的边界不明显,脾组织着色均匀。在鲤鱼镉处理10 d,脾组织红髓面积减小,白髓面积变大,出现淋巴细胞聚集和血管内皮细胞纤维素样肿胀。在镉处理20 d和30 d,除上述病理变化外,同时出现了出血和血铁黄素。而且在镉处理30 d,鲤鱼脾组织出现了空泡。通过电子显微镜观察发现,鲤鱼镉处理10 d、20d和30 d,部分细胞的细胞核形态不规则,发生皱缩,细胞浆致密,染色质边集,部分细胞内容物被膜包裹形成凋亡小体。同时部分脾细胞形态不规则,细胞内出现了大量的自噬体和自噬溶酶体。这些结果表明,鲤鱼镉暴露能够引起脾组织炎性损伤,脾组织细胞凋亡和自噬。（2）鲤鱼镉暴露30 d,对脾组织进行转录组测序。miRNA测序,发现23个miRNA差异表达,其中17个miRNA显着上调和6个miRNA显着下调。m RNA测序发现3794个m RNA差异表达,其中1848个m RNA显着上调和1946个m RNA显着下调。通过生物信息学技术,预测23个miRNA靶向调控2022个差异表达的m RNA,其中1113个m RNA下调和909个m RNA上调。通过GO和KEGG分析发现镉通过miRNA调控基因参与了鲤鱼脾组织功能的调控。（3）通过生物信息学预测发现FoxO可能是miR-103的靶基因。通过双荧光素酶基因报告试验证实miR-103靶向调控FoxO。进一步通过敲低和过表达miR-103后靶基因FoxO的m RNA和蛋白表达进行验证,证实FoxO是miR-103的靶基因。（4）鲤鱼镉暴露10 d、20 d和30 d和鲤鱼EPC细胞镉暴露6 h和12 h,脾组织和EPC细胞的GSH含量和CAT、GSH-Px、GST、SOD和T-AOC活性降低;H2O2、MDA和NO含量及i NOS活性升高,氧化应激和炎症与镉暴露时间呈正相关。通过RT-q PCR试验发现鲤鱼脾组织细胞CAT、GSH-Px和HO-1a的m RNA表达显着下调;CYP26B1、COX-2和PTGE的m RNA表达显着上调。表明镉暴露引起氧化应激和炎症反应。（5）鲤鱼镉暴露10 d、20 d和30 d和鲤鱼EPC细胞镉暴露6 h和12 h,通过RT-q PCR试验发现脾组织和EPC细胞Fox P3、TGF-β、T-Bet和IFN-γ的m RNA表达显着下调;GATA3和IL4/13A的m RNA表达显着上调,表明发生了免疫抑制。（6）通过敲低EPC细胞的miR-103,并用凋亡抑制剂z-VAD-FMK处理细胞,结果显示敲低miR-103细胞凋亡率明显升高,可被凋亡抑制剂z-VAD-FMK抑制。过表达miR-103能够降低镉处理EPC细胞引起的细胞凋亡。以上试验结果表明镉暴露引起miR-103表达下调,减弱了对FoxO的负调控,进一步通过RT-q PCR和WB试验发现凋亡相关通路基因和蛋白Bim、Cyt c、caspase9和caspase3表达上调,表明miR-103靶向FoxO引起线粒体氧化应激,导致EPC细胞凋亡。鲤鱼镉中毒脾组织RT-q PCR和WB试验发现凋亡通路相关基因和蛋白FoxO、Bim、Cyt c、caspase9和caspase3表达上调,表明镉能够引起鲤鱼脾组织细胞凋亡。（7）通过敲低EPC细胞的miR-103,并用自噬抑制剂3-MA处理细胞,结果显示敲低miR-103细胞自噬率明显升高,并可被自噬抑制剂3-MA抑制。过表达miR-103能够降低镉处理细胞引起的细胞自噬率。进一步通过RT-q PCR和WB试验发现自噬通路相关基因和蛋白FoxO、Beclin1、LC3-I和LC3-II的表达上调,表明miR-103靶向FoxO引起鲤鱼EPC细胞自噬。鲤鱼镉中毒脾组织RT-q PCR和WB试验发现自噬通路相关基因和蛋白FoxO、Beclin1、LC3-I和LC3-II表达上调,表明镉能够引起鲤鱼脾组织细胞自噬。综上,鲤鱼镉暴露抑制鲤鱼生长。通过形态学发现镉能够引起鲤鱼脾组织细胞的凋亡和自噬。采用转录组学测序发现镉暴露引起脾组织miRNA和m RNA发生差异表达,通过生物信息学分析发现miR-103可能靶向FoxO调控脾组织细胞的凋亡和自噬。通过鲤鱼EPC细胞双荧光素酶基因报告试验证明miR-103和FoxO靶向关系成立。进一步试验证明脾组织和EPC细胞镉暴露能够诱导氧化应激、炎性、免疫反应、凋亡和自噬。其中凋亡和自噬相关通路基因和蛋白Bim、Cyt c、caspase9、caspase3、Beclin1、LC3-I和LC3-II表达上调。本研究证明镉暴露通过miR-103靶向调控FoxO引起脾组织细胞的凋亡和自噬。
王雪[10]（2020）在《O-GlcNAc糖基化调控乳腺癌细胞硼替佐米耐药机制研究》文中进行了进一步梳理乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,也是女性恶性肿瘤死亡首要病因。虽然综合治理改善了患者的预后,然而临床耐药的产生严重制约了乳腺癌患者的治疗效果,也是乳腺癌临床治疗的主要瓶颈之一。揭示乳腺癌耐药的发生发展机制不仅为研究耐药逆转策略提供理论基础,而且对乳腺癌治疗具有实际意义。耐药是肿瘤细胞为适应环境变化所建立的一系列调节方式,除了 P-糖蛋白药物外排转运体的过表达,导致的细胞适应性增强,细胞凋亡功能失调等也会造成耐药。其中,翻译后修饰调控的信号通路改变也是耐药产生的重要原因之一。蛋白质的O-β-N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰是一种简单的、动态的翻译后修饰,参与众多生理和病理过程的调节,O-GlcNAc转移酶（OGT）和O-GlcNAc糖苷酶（OGA）负责底物蛋白的糖基化添加与消除过程。已有的研究表明,包括药物刺激在内的多种应激反应均有O-GlcNAc修饰蛋白的参与。然而,O-GlcNAc修饰肿瘤细胞耐药的分子机制仍待阐明。硼替佐米（BTZ）是一种用于临床治疗的靶向抗肿瘤药,可诱导细胞凋亡。虽然BTZ在临床上表现出对部分血液肿瘤的治疗效果,但对于其他实体瘤,特别是乳腺癌则疗效不佳。本论文通过蛋白质免疫印迹、RT-qPCR、蛋白质免疫共沉淀等实验手段,分析了乳腺癌细胞在BTZ刺激下,胞内O-GlcNAc修饰的变化,探究了 O-GlcNAc修饰调控乳腺癌细胞BTZ耐药的作用机制。首先,本文研究了内源性BTZ抗性乳腺癌细胞MCF-7、T47D和BTZ敏感的MDA-MB-231细胞中O-GlcNAc修饰的水平。相比BTZ敏感的乳腺癌细胞,内源性耐药MCF-7和T47D细胞中O-GlcNAc修饰在BTZ刺激下动态增加。同时,在BTZ获得性抗性的MDA-MB-231衍生细胞MDA-BR1-3中,随着BTZ抗性越强,O-GlcNAc修饰水平出现升高,提示O-GlcNAc修饰参与了乳腺癌细胞BTZ耐药过程。接下来本文进一步探究了 O-GlcNAc修饰影响BTZ诱导细胞凋亡的分子机制。本文以内源性抗性MCF-7细胞和获得性抗性MDA-BR3细胞为研究对象,发现BTZ诱导的O-GlcNAc修饰上调降低了乳腺癌相关的转录因子FOXA1蛋白质稳定性,进而抑制了乳腺癌细胞的凋亡。在线序列分析结果表明,细胞凋亡重要调控因子Bim启动子区存在FOXA1的结合位点。在BTZ耐药细胞中,FOXA1的O-GlcNAc修饰增强,使FOXA1的蛋白水平和稳定性降低,进而导致下游Bim转录减少,最终阻止细胞凋亡的发生。这些结果证明FOXA1蛋白水平与乳腺癌细胞BTZ抗性及O-GlcNAc修饰呈负相关,O-GlcNAc糖基化调控了 FOXA1依赖的促凋亡蛋白Bim表达。最后,本文使用O-GlcNAc修饰抑制剂L01与BTZ作用于耐药细胞,观察到L01显着增强了 BTZ诱导的细胞凋亡,进一步证明了 O-GlcNAc修饰在乳腺癌细胞耐药产生过程中发挥重要作用。本文的研究结果将O-GlcNAc修饰升高与乳腺癌BTZ耐药性相关联,证明了 O-GlcNAc调控的乳腺癌相关转录因子FOXA1在乳腺癌细胞凋亡失调中发挥功能性作用。BTZ联合O-GlcNAc抑制剂可以克服乳腺癌BTZ耐药,为开发新的乳腺癌治疗策略提供了新思路。
二、凋亡调节蛋白BIM的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凋亡调节蛋白BIM的研究进展（论文提纲范文）
（1）利用有机小分子研究Bim调控Hsp70分子伴侣功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 Hsp70 家族蛋白对蛋白质稳态的调控 |
| 1.2 Bcl-2 家族蛋白对细胞凋亡的调控 |
| 1.3 Bim是 Hsp70 的辅伴侣蛋白 |
| 1.4 Hsp70/Bim抑制剂 |
| 1.5 酵母中Hsp70 的研究进展 |
| 1.6 定量蛋白质组学技术的研究进展 |
| 1.7 本研究的选题思想和研究内容 |
| 2 Bim在体外正调控Hsp70 分子伴侣功能 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组蛋白Hsc70 的表达与纯化 |
| 2.3.2 重组蛋白J domain的表达与纯化 |
| 2.3.3 Bim正向调控Hsp70 的分子伴侣功能 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 外源表达的Bim在酵母细胞中促进Hsp70 功能的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 外源蛋白Bim EL在酵母中的诱导表达 |
| 3.3.2 Bim促进酵母的生长 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 定量蛋白质组学研究Bim调控酵母中Hsp70 的互作蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 样本的液相色谱分离 |
| 4.3.2 差异蛋白定量分析 |
| 4.3.3 Bim调控酵母中Hsp70 互作蛋白分析 |
| 4.3.4 S1g-6 处理对Hsp70 互作蛋白影响的分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（2）肾小管上皮细胞Bim蛋白介导管球交流致足细胞骨架损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 一、“管球交流”中肾小管上皮细胞Bim/NFAT通路介导足细胞骨架损伤的机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 二、受Bim调控的lncRNA NONHSAT179542.1在“管球交流”致足细胞骨架损伤中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（3）基于miR-29b抑制海马神经元凋亡探究逍遥散及芍药苷抗抑郁作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一、Micro RNA、海马损伤与抑郁症发病机制现代研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二、中西药及天然分子化合物抗抑郁研究进展 |
| 参考文献 |
| 实验一、逍遥散及芍药苷抗抑郁症大鼠海马神经元凋亡机制研究 |
| 前言 |
| 1. 抑郁症肝郁脾虚证大鼠模型建立与评价 |
| 2. 抑郁症大鼠海马CA3区miR-29b和神经元凋亡通路基因表达变化及逍遥散、芍药苷调节作用 |
| 3. 抑郁症大鼠海马CA3区神经元凋亡通路蛋白表达变化及逍遥散、芍药苷调节作用 |
| 参考文献 |
| 实验二、基于miR-29b抑制凋亡途径探究LPS诱导HT22细胞凋亡模型中芍药苷在逍遥散中的关键作用 |
| 前言 |
| 1. HT22细胞系凋亡模型的建立与评价及逍遥散含药血清、逍遥散芍药苷敲除液(Mab-PF)含药血清和芍药苷最佳给药浓度筛选 |
| 2. LPS诱导HT22细胞系凋亡模型miR-29b,线粒体凋亡通路基因表达水平及逍遥散,Mab-PF,芍药苷调节作用 |
| 3. HT22细胞系凋亡模型线粒体凋亡通路蛋白表达水平及逍遥散,Mab-PF,芍药苷的调节作用 |
| 参考文献 |
| 实验三、梯度浓度逍遥散、芍药苷对miR-29b靶向基因BIM蛋白抑制作用研究 |
| 前言 |
| 1. 细胞流式检测LPS诱导HT22细胞系凋亡比率及各浓度药物组干预作用 |
| 2. 梯度逍遥散、芍药苷对miR-29b靶向基因BIM蛋白抑制作用研究 |
| 参考文献 |
| 实验四、基于慢病毒转染技术研究芍药苷靶向调控miR-29b抑制BIM蛋白表达作用 |
| 前言 |
| 基于慢病毒转染研究研究芍药苷靶向调控miR-29b抑制BIM蛋白表达作用 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）益气活血方调控Sirt4/FOXO3a信号通路改善急性心肌梗死炎性损伤和心肌细胞凋亡的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 冠心病流行病学调查 |
| 2. 心肌梗死危险因素和病理生理机制 |
| 2.1 心肌梗死危险因素 |
| 2.2 基本机制 |
| 2.3 炎症反应 |
| 2.4 氧化应激 |
| 2.5 细胞凋亡 |
| 3. Sirt与炎症、细胞凋亡的关系 |
| 3.1 Sirt与炎症、氧化应激的关系 |
| 3.2 Sirt与细胞凋亡的关系 |
| 4. FOXO与炎症、细胞凋亡的关系 |
| 4.1 FOXO与炎症、氧化应激的关系 |
| 4.2 FOXO与细胞凋亡的关系 |
| 5. Sirt4/FOX03a信号通路 |
| 6. 心肌梗死的西医治疗 |
| 7. 冠心病的中医认识 |
| 第二部分 临床研究 益气活血方改善急性心肌梗死炎性损伤和心肌细胞凋亡的临床研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 试验设计和研究内容 |
| 3. 受试者的选择 |
| 3.1 西医诊断标准 |
| 3.2 中医辨证标准 |
| 3.3 纳入标准 |
| 3.4 排除标准 |
| 3.5 中止试验的标准 |
| 4.治疗方案 |
| 4.1 试验药品 |
| 4.2 给药方法 |
| 4.3 疗程:2周 |
| 5. 观察指标 |
| 5.1 安全性指标:肝功能(ALT、AST、ALP、TBiL、γ-GT)、肾功能(BUN、Scr、UA) |
| 5.2 疗效指标 |
| 6. ELISA操作方法 |
| 6.1 试剂与仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 统计分析 |
| 7. 研究结果 |
| 7.1 中医证候疗效分析 |
| 7.2 心脏彩超指标 |
| 7.3 室壁运动积分指数、收缩期心内膜向心运动幅度 |
| 7.4 NT-ProBNP、H-CRP |
| 7.5 ELISA实验结果 |
| 8. 研究讨论 |
| 第三部分 实验研究 益气活血方减轻急性心肌缺血时的炎性损伤及通过Sirt4/FOXO3a减少体外心肌缺血时炎性损伤和凋亡的作用研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 SD大鼠乳鼠心肌细胞分离、培养及含药血清制备 |
| 2.2 采用CCK8检测细胞活性 |
| 2.3 采用ELISA检测炎性因子的表达 |
| 2.4 采用DHE染色检测ROS的表达水平 |
| 2.5 采用ROS试剂盒检测ROS的水平 |
| 2.6 采用CAT试剂盒和MDA试剂盒及SOD试剂盒检测MDA和SOD及CAT的表达水平 |
| 2.7 流式检测细胞凋亡水平 |
| 2.8 Western blot检测细胞相关蛋白表达水平 |
| 2.9 RT-qPCR技术检测 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 益气活血方减轻了H_2O_2诱导的心肌细胞中炎性因子的表达 |
| 3.2 益气活血方减轻了H_2O_2诱导的心肌细胞中氧化应激水平的表达 |
| 3.3 益气活血方减轻了H_2O_2诱导的心肌细胞的凋亡 |
| 3.4 Sirt4和p-FOXO3a在H_2O_2诱导的新生大鼠心肌细胞中的表达 |
| 3.5 益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号通路抑制炎性因子的表达 |
| 3.6 益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号途径抑制氧化应激的表达 |
| 3.7 益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号途径对细胞凋亡 |
| 3.8 实验讨论 |
| 总结 |
| 1. 结论 |
| 2. 创新 |
| 3. 不足 |
| 综述 Sirt4/FOXO3a在急性心肌梗死病变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 一、在读期间参与的科研课题 |
| 二、在读期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）抑制Cx43通过减轻氧化应激对脓毒症肠损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 Cx43与脓毒症肠损伤的相关性及其对脓毒症肠损伤影响的研究 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 Cx43在脓毒症肠损伤中的具体作用机制研究 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）小檗碱对糖尿病肾病足细胞保护作用及对长链非编码RNA的初步调节作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物与饲料 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 药物与试剂 |
| 2.4 仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 SD大鼠DN模型的建立 |
| 3.1.1 HE染色检测肾脏组织病理变化 |
| 3.1.2 Western Blot检测肾脏组织足细胞相关蛋白表达的变化 |
| 3.1.3 免疫荧光检测肾脏组织中WT-1 表达的变化 |
| 3.2 足细胞体外模型的确立 |
| 3.2.1 Western Blot检测足细胞相关蛋白表达的变化 |
| 3.2.2 流式细胞术检测足细胞凋亡率的变化 |
| 3.3 目标LncRNA的筛选 |
| 3.3.1 大鼠肾脏组织高通量测序 |
| 3.3.2 大鼠肾脏组织的qRT-PCR检测 |
| 3.3.2.1 总RNA的提取 |
| 3.3.2.2 qRT-PCR操作步骤 |
| 3.3.3 qRT-PCR检测足细胞中LncRNA表达的变化 |
| 3.3.4 qRT-PCR检测足细胞中LncRNALOC102549726 的亚细胞定位 |
| 3.4 转染LncRNA LOC102549726 siRNA或过表达质粒对靶蛋白EGF的影响 |
| 3.4.1 LncRNA LOC102549726 siRNA的筛选 |
| 3.4.2 LncRNA LOC102549726 过表达质粒的抽提 |
| 3.4.3 预测并验证LncRNA LOC102549726的靶蛋白 |
| 3.5 LncRNA LOC102549726 对相关蛋白表达的影响 |
| 3.5.1 Western Blot检测转染LncRNA LOC102549726 siRNA或过表达质粒对相关蛋白表达的影响 |
| 3.5.2 免疫荧光检测转染LncRNA LOC102549726 siRNA或过表达质粒对WT-1表达的影响 |
| 3.6 转染EGF siRNA对足细胞功能的影响 |
| 3.6.1 Western Blot检测转染EGF siRNA对相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.2 流式细胞术检测转染EGF siRNA对足细胞凋亡率的影响 |
| 3.6.3 Transwell检测转染EGF siRNA对足细胞粘附能力的影响 |
| 3.7 BBR最适浓度的选择 |
| 3.7.1 qRT-PCR检测BBR对LncRNA LOC102549726的影响 |
| 3.7.2 流式细胞术检测BBR对足细胞凋亡率的影响 |
| 3.8 BBR对LncRNA LOC102549726及足细胞功能的影响 |
| 3.8.1 BBR对 LncRNA LOC102549726及EGF的影响 |
| 3.8.2 BBR对相关蛋白表达的影响 |
| 3.8.3 BBR对足细胞凋亡率的影响 |
| 3.8.4 BBR对足细胞黏附能力的影响 |
| 3.9 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 SD大鼠DN模型的建立 |
| 4.1.1 DN大鼠肾脏组织病理变化 |
| 4.1.2 DN大鼠肾脏中足细胞相关蛋白表达情况 |
| 4.2 高糖诱导的足细胞体外模型中足细胞相关蛋白表达情况以及足细胞凋亡率变化 |
| 4.2.1 高糖诱导的足细胞体外模型中足细胞相关蛋白表达情况 |
| 4.2.2 高糖诱导的足细胞体外模型中足细胞凋亡率变化 |
| 4.3 LncRNA LOC102549726 的筛选 |
| 4.3.1 DN大鼠肾脏组织中的差异表达LncRNA |
| 4.3.2 肾脏组织和足细胞中LncRNA表达情况 |
| 4.3.3 足细胞中LncRNA LOC102549726的亚细胞定位 |
| 4.4 LncRNA LOC102549726 靶蛋白的预测和验证 |
| 4.4.1 生物信息学技术预测LncRNA LOC102549726的靶蛋白 |
| 4.4.2 干扰效果最佳的siRNA的选择 |
| 4.4.3 靶蛋白EGF的验证 |
| 4.5 转染LncRNA LOC102549726 siRNA或过表达质粒对相关蛋白表达的影响 |
| 4.5.1 转染LncRNA LOC102549726 siRNA或过表达质粒对足细胞相关蛋白表达的影响 |
| 4.5.2 转染LncRNA LOC102549726 siRNA或过表达质粒对细胞凋亡蛋白表达的影响 |
| 4.6 转染EGF siRNA对足细胞功能的影响 |
| 4.6.1 转染EGF siRNA对足细胞相关蛋白表达的影响 |
| 4.6.2 转染EGF siRNA对细胞凋亡蛋白表达的影响 |
| 4.6.3 转染EGF siRNA对足细胞凋亡率的影响 |
| 4.6.4 转染EGF siRNA对足细胞黏附能力的影响 |
| 4.7 BBR对LncRNA LOC102549726的调节作用及最适浓度BBR的选择 |
| 4.8 BBR对足细胞功能的影响 |
| 4.8.1 BBR对 EGF表达的影响 |
| 4.8.2 BBR对足细胞相关蛋白表达的影响 |
| 4.8.3 BBR对细胞凋亡蛋白表达的影响 |
| 4.8.4 BBR对足细胞凋亡率的影响 |
| 4.8.5 BBR对足细胞粘附能力的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 DN发展过程中足细胞损伤与LncRNA OC102549726的异常上调相关 |
| 5.2 LncRNA LOC102549726能够靶向EGF影响足细胞功能 |
| 5.3 BBR可能下调LncRNA LOC102549726发挥足细胞保护作用 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 非编码RNA在糖尿病肾病中的作用 |
| 参考文献 |
（7）基于多组学大数据的妇科和乳腺癌BCL2家族分子变化模式及其分子网络研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细胞凋亡及其涉及的代谢通路 |
| 1.1.1 细胞凋亡及其主要凋亡途径 |
| 1.1.2 细胞凋亡涉及的细胞代谢 |
| 1.2 BCL2家族研究进展 |
| 1.2.1 BCL2家族第一个成员的发现及其保守的特点 |
| 1.2.2 BCL2家族成员的扩增 |
| 1.2.3 BCL2家族成员之间结构基础及其互作关系 |
| 1.2.4 效应者BAX和 BAK1 对线粒体外膜的作用 |
| 1.2.5 细胞凋亡在人体系统稳态维持方面发挥重要作用 |
| 1.2.6 BCL2家族蛋白在肿瘤中扮演的角色 |
| 1.3 泛肿瘤研究 |
| 1.3.1 泛肿瘤研究趋势 |
| 1.3.2 泛妇科肿瘤的分子特征研究 |
| 1.4 本论文研究方法 |
| 1.4.1 使用c Bio Portal分析多种分子特征 |
| 1.4.2 使用GEPIA分析m RNA表达 |
| 1.4.3 调控网络分析方法 |
| 1.5 本论文研究的主要内容、目的和意义 |
| 第二章 BCL2 家族在妇科肿瘤中的突变、m RNA表达、免疫组化及其预后分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 BCL2家族成员之间的系统发育关系分析 |
| 2.2.2 BCL2 家族成员在妇科肿瘤中的突变频率及肿瘤样本间m RNA表达水平分析 |
| 2.2.3 BCL2 家族在妇科肿瘤中相对于正常样本的m RNA表达水平分析 |
| 2.2.4 预后分析 |
| 2.2.5 免疫组化分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 BCL2家族成员名称的规范和统一 |
| 2.3.2 BCL2家族成员之间的系统发育关系 |
| 2.3.3 BCL2家族成员在妇科肿瘤中的突变频率 |
| 2.3.3.1 乳腺癌样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3.2 宫颈癌样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3.3 子宫肉瘤样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3.3 子宫内膜癌样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3.4 卵巢癌样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.4 BCL2 家族在妇科肿瘤中相对于正常样本的m RNA表达水平 |
| 2.3.5 BCL2家族在妇科肿瘤中的预后分析 |
| 2.3.6 BCL2家族在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.1 BCL2L1蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.2 BAD蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.3 PMAIP1蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.4 BAK1蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.5 BIK蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.6 BID蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 BCL2家族在妇科肿瘤中的表观调控规律 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 BCL2 家族启动子甲基化和m RNA相关关系分析 |
| 3.2.2 活跃染色质和组蛋白修饰信号的数据收集 |
| 3.2.3 Ch IP-seq数据分析流程 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 BCL2 家族m RNA的表达和启动子区域的甲基化程度呈负相关 |
| 3.3.2 基因组的染色质活跃程度与组织特异性 |
| 3.3.3 基因组的染色质活跃程度与mRNA表达水平正相关 |
| 3.3.4 染色质开放区域和组蛋白修饰信号的重叠 |
| 3.3.5 BCL2家族成员的增强子信号及其特点 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 BCL2家族在妇科肿瘤中的调控网络研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BCL2家族在乳腺癌中的调控网络 |
| 4.3.2 BCL2家族在宫颈内膜腺癌中的调控网络 |
| 4.3.3 BCL2家族在子宫内膜癌中的调控网络 |
| 4.3.4 BCL2家族在子宫肉瘤的调控网络 |
| 4.3.5 BCL2家族在卵巢癌的调控网络 |
| 4.3.6 BCL2家族在妇科肿瘤的调控网络中出现共突变信号 |
| 4.3.7 BCL2家族在妇科肿瘤中预测的调控模型 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 本论文主要结论 |
| 本论文创新点 |
| 本论文的局限与展望 |
| 参考文献 |
| 附录:ChIP-seq数据分析脚本编写 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 略缩词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 转录辅助因子4对肺腺癌的恶性表型和顺铂敏感性的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 FOXO1和FOXO3a在肺腺癌细胞对顺铂药物敏感性中的调控作用及机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 PC4 通过FOXO1和FOXO3a调控肺腺癌细胞对顺铂药物敏感性的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 重新评估FOXO蛋白在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（9）镉暴露通过miR-103靶向FoxO调控鲤鱼脾细胞凋亡和自噬的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 镉污染的来源 |
| 1.1.1 工业造成的镉污染 |
| 1.1.2 农业造成的镉污染 |
| 1.2 镉危害的研究进展 |
| 1.2.1 镉暴露对人类的危害 |
| 1.2.2 镉暴露对生态环境和鱼类的危害 |
| 1.3 镉毒性机制的研究进展 |
| 1.3.1 镉暴露引起氧化应激的研究进展 |
| 1.3.2 镉暴露对免疫反应影响的研究进展 |
| 1.3.3 镉暴露引起炎症反应的研究进展 |
| 1.4 环境污染物中毒与细胞凋亡和自噬的研究进展 |
| 1.4.1 环境污染物中毒与细胞凋亡的研究进展 |
| 1.4.2 环境污染物中毒与细胞自噬的研究进展 |
| 1.5 环境污染物与miRNA的研究进展 |
| 1.6 转录组学技术在毒理学中的研究进展 |
| 1.6.1 转录组学在环境污染物研究中的应用 |
| 1.6.2 转录组学在鱼类中的应用 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器,试剂和软件 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验动物处理 |
| 2.2.2 鲤鱼脾组织形态学观察 |
| 2.2.3 鲤鱼脾组织转录组测序方法 |
| 2.2.4 转录组数据联合分析方法 |
| 2.2.5 鲤鱼EPC细胞的培养和细胞活力测定的方法 |
| 2.2.6 鲤鱼脾组织和鲤鱼EPC细胞氧化应激和炎症指标的检测方法 |
| 2.2.7 鲤鱼EPC细胞miR-103 敲低/过表达模型的构建方法 |
| 2.2.8 miR-103与FoxO靶向关系的双荧光素酶基因报告试验方法 |
| 2.2.9 鲤鱼脾组织和EPC细胞m RNA和miRNA的 RT-q PCR |
| 2.2.10 蛋白提取与免疫印迹的检测方法 |
| 2.2.11 AO/EB和 MDC/EB染色 |
| 2.2.12 流式细胞术检测细胞死亡的方法 |
| 2.3 试验数据的统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 镉暴露对鲤鱼生长影响的结果 |
| 3.2 镉暴露对鲤鱼脾组织形态学影响的观察结果 |
| 3.2.1 镉暴露对鲤鱼脾组织显微结构影响的观察结果 |
| 3.2.2 镉暴露对鲤鱼脾组织细胞超微结构影响的观察结果 |
| 3.3 转录组测序及数据分析结果 |
| 3.3.1 miRNA的测序结果 |
| 3.3.2 RT-q PCR验证miRNA测序的结果 |
| 3.3.3 镉暴露对鲤鱼脾组织中mRNA的测序结果 |
| 3.3.4 RT-q PCR验证m RNA测序的结果 |
| 3.3.5 miRNA测序结果与m RNA测序结果的联合分析 |
| 3.4 miR-103与FoxO靶向关系预测的结果 |
| 3.5 镉暴露对鲤鱼EPC细胞活性影响的检测结果 |
| 3.6 miR-103与FoxO靶向关系的双荧光素酶基因报告试验结果 |
| 3.7 敲低和过表达miR-103 靶基因FoxO表达的检测结果 |
| 3.8 镉暴露对鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬相关指标的检测结果 |
| 3.8.1 镉暴露对鲤鱼脾组织细胞凋亡的检测结果 |
| 3.8.2 镉暴露对鲤鱼脾组织氧化应激指标影响的检测结果 |
| 3.8.3 镉暴露对鲤鱼脾组织炎症反应指标影响的检测结果 |
| 3.8.4 镉暴露对鲤鱼脾组织免疫相关mRNA表达的检测结果 |
| 3.8.5 镉暴露对鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬相关基因和蛋白表达影响的检测结果 |
| 3.9 镉暴露对鲤鱼EPC细胞凋亡和自噬相关指标的检测结果 |
| 3.9.1 镉暴露对鲤鱼EPC细胞氧化应激指标影响的检测结果 |
| 3.9.2 镉暴露对鲤鱼EPC细胞炎症指标影响的检测结果 |
| 3.9.3 镉暴露对鲤鱼EPC细胞免疫相关m RNA表达的影响 |
| 3.9.4 镉暴露对鲤鱼EPC细胞影响的检测结果 |
| 3.9.5 敲低miR-103 对鲤鱼EPC细胞凋亡和自噬影响的检测结果 |
| 3.9.6 过表达miR-103 调节鲤鱼EPC细胞凋亡和自噬的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 镉暴露对鲤鱼生长的影响 |
| 4.2 镉暴露引起氧化应激造成鲤鱼脾组织细胞和鲤鱼EPC细胞凋亡和自噬 |
| 4.3 镉暴露引起炎症损伤造成鲤鱼脾组织细胞和鲤鱼EPC细胞凋亡和自噬 |
| 4.4 转录组学在镉中毒机制研究中的应用 |
| 4.5 镉通过FoxO对细胞凋亡和自噬的影响 |
| 4.6 镉暴露引起鲤鱼脾组织细胞自噬和凋亡对免疫功能的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）O-GlcNAc糖基化调控乳腺癌细胞硼替佐米耐药机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肿瘤耐药性 |
| 1.2 肿瘤耐药机制研究进展 |
| 1.2.1 MDR与P-糖蛋白 |
| 1.2.2 MDR与药物作用靶点的改变 |
| 1.2.3 MDR与DNA损伤修复 |
| 1.2.4 MDR与细胞凋亡 |
| 1.3 O-GlcNAc糖基化修饰研究进展 |
| 1.3.1 O-GlcNAc糖基化概述 |
| 1.3.2 O-GlcNAc糖基化与癌症 |
| 1.3.3 O-GlcNAc糖基化与细胞应激 |
| 1.4 抗肿瘤药硼替佐米研究进展 |
| 1.4.1 硼替佐米概述 |
| 1.4.2 硼替佐米与乳腺癌 |
| 1.5 研究内容与研究意义 |
| 2 O-GlcNAc修饰增强乳腺癌细胞BTZ耐药性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞、菌株和质粒 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 蛋白质免疫印迹分析 |
| 2.3.3 细胞凋亡实验 |
| 2.3.4 细胞转染 |
| 2.3.5 MTS活力测定 |
| 2.3.6 Caspase-3/9活性测定 |
| 2.3.7 蛋白酶体活性测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 乳腺癌细胞内源性BTZ抗性与O-GlcNAc修饰呈正相关 |
| 2.4.2 乳腺癌细胞获得性BTZ抗性与O-GlcNAc修饰呈正相关 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 O-GlcNAc修饰降低乳腺癌细胞中FOXA1蛋白稳定性和Bim转录 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞、菌株和质粒 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 实验溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白质免疫共沉淀 |
| 3.3.2 RT-qPCR |
| 3.3.3 PCR扩增 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 BTZ抗性细胞中FOXA1的蛋白稳定性降低 |
| 3.4.2 FOXA1降低引起Bim转录下调,阻止BTZ诱导的细胞凋亡 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 O-GlcNAc修饰抑制剂与BTZ联用逆转乳腺癌细胞耐药 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 实验溶液 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MTS活力测定 |
| 4.3.2 蛋白质免疫印迹分析 |
| 4.3.3 细胞凋亡 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 L01与BTZ联用降低乳腺癌细胞耐药性 |
| 4.4.2 L01与BTZ联用上调FOXA1蛋白稳定性和Bim转录 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
四、凋亡调节蛋白BIM的研究进展（论文参考文献）
- [1]利用有机小分子研究Bim调控Hsp70分子伴侣功能[D]. 潘皓. 大连理工大学, 2021(01)
- [2]肾小管上皮细胞Bim蛋白介导管球交流致足细胞骨架损伤的机制研究[D]. 许春梅. 山东大学, 2021(11)
- [3]基于miR-29b抑制海马神经元凋亡探究逍遥散及芍药苷抗抑郁作用机制[D]. 侯雅静. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]益气活血方调控Sirt4/FOXO3a信号通路改善急性心肌梗死炎性损伤和心肌细胞凋亡的作用研究[D]. 张苏洁. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]抑制Cx43通过减轻氧化应激对脓毒症肠损伤的保护作用研究[D]. 邹兆伟. 南方医科大学, 2021
- [6]小檗碱对糖尿病肾病足细胞保护作用及对长链非编码RNA的初步调节作用研究[D]. 汪佳佳. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]基于多组学大数据的妇科和乳腺癌BCL2家族分子变化模式及其分子网络研究[D]. 王家坚. 华南理工大学, 2020(05)
- [8]PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究[D]. 孙天宇. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [9]镉暴露通过miR-103靶向FoxO调控鲤鱼脾细胞凋亡和自噬的研究[D]. 陈俭清. 东北农业大学, 2020
- [10]O-GlcNAc糖基化调控乳腺癌细胞硼替佐米耐药机制研究[D]. 王雪. 大连理工大学, 2020(02)