一、番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析（论文文献综述）
姚忠慧[1]（2021）在《鸡源呼肠孤病毒变异株的分离鉴定及感染性克隆的构建》文中进行了进一步梳理鸡病毒性关节炎是由禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）引起的一种传染病,该病可侵害不同日龄及不同品种的鸡,尤其是商品肉鸡,造成鸡的跗关节肿胀甚至瘫痪,饮水量和采食量下降并伴有死亡。近年来鸡病毒性关节炎的发病率不断增加,严重危害着我国养鸡业的健康发展。本研究从山东烟台地区疑似ARV感染的患鸡肌腱中分离出一株ARV,命名为SDYT,并对SDYT株进行全基因组序列分析及致病性研究,同时以实验室已分离的LY383株为基础构建了ARV感染性克隆,为ARV的深入研究提供了理论依据,也为从分子水平上深入开展ARV的致病机理、传播机制和免疫防制等研究提供技术平台。主要研究内容如下:1、本研究对山东烟台地区疑似ARV感染的患鸡肌腱进行病毒的分离,病料接种鸡胚肝细胞后出现合胞体的细胞病变,RT-PCR检测及ARV S1基因测序结果表明该病毒为ARV,将其命名为SDYT,并进行全基因组序列分析。同源性分析结果显示,SDYT株与传统标准毒株S1133和1733的核苷酸同源性较低,分别为54.4%～93.2%和54.7%～93.1%,氨基酸同源性也较低,分别为49.2%～99.0%和49.8%～99.0%;将SDYT株与其他参考株进行核苷酸和氨基酸的同源性分析,其S1和S2基因与17203-M-06株同源性最高,分别为68.9%～93.4%和70.9%～99.0%;S3、M3、L2基因与LY383株同源性最高,分别为89.9%～97.8%和96.5%～99.5%;S4基因与878-Bi-05株同源性最高,分别为92.3%和99.2%;M1和L1基因与2408株同源性最高,分别为90.7%～93.2%和98.6%～99.2%;M2基因与D1104株同源性最高,分别为93.0%和97.9%;L3基因与138株同源性最高,分别为90.5%和96.8%。遗传进化分析结果显示,SDYT株与鸡源呼肠孤病毒亲缘关系较近;根据σC基因遗传进化分析,SDYT株属于基因4型ARV,传统标准毒株S1133和1733属于基因1型ARV;根据其他基因遗传进化分析,SDYT株与传统标准毒株S1133和1733除S3编码的σB、M1、L1和L2基因处于同一个分支外,其他6个基因片段均处于不同分支。综上,SDYT株是由不同鸡源ARV经片段重组进化而来的ARV变异株。2、120只1日龄健康罗斯308肉鸡随机分为4组,每组30只,A组为静脉攻毒组,B组为脚垫攻毒组,C组为口服攻毒组,D组为对照组。攻毒组每只接种0.4 m L(TCID50为10-5.401/0.1 m L)病毒液,对照组每只接种0.4 m L生理盐水,每日观察临床症状。于攻毒后3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d,21 d每组随机选取3只肉鸡,称重后采集泄殖腔棉拭子、采血并分离血清,剖检后收取各组织器官并对采集的样品进行检测。临床症状和剖检结果显示,SDYT株各攻毒组肉鸡均出现关节肿胀、卧地不起的症状,剖检可见跗关节皮下淤血,腱鞘内有黄色胶状黏液,十二指肠充血,脾脏肿大,肾脏肿大及胸腺充血,以A组和B组症状最严重;增重结果显示,各攻毒组体重增长缓慢,以B组最显着;抗体检测结果显示,各攻毒组抗体水平较对照组稍高;泄殖腔排毒检测结果显示,各攻毒组早期排毒量较高,随后降低;病毒血症检测结果显示,SDYT株可引起肉鸡病毒血症,攻毒后3 d即可在血液中检出病毒,6 dpi～9 dpi达到高峰,15 dpi后开始下降;各组织器管病毒载量检测结果显示,攻毒组各组织器官均能检测到病毒的存在,肌腱中的病毒载量较高,法氏囊和气管的病毒载量较低。以上试验表明,人工感染SDYT株可引起肉鸡病毒性关节炎、生长抑制及病毒血症。3、利用全长c DNA扩增及同源重组的方法对LY383株进行反向遗传操作。用高保真酶扩增出LY383株全基因组10个片段,对M1片段进行点突变以作为分子标签。改造p Blue Script II SK（+）载体（p BSK载体）,使其带有T7启动子和T7终止子,目的片段用同源重组的方法连接到载体的启动子和终止子之间。10个p BSK重组质粒在提取后按不同浓度共转染到BSR-T7细胞,培养72 h后收取细胞冻融3次,离心后将上清液无菌接种到SPF鸡胚盲传3代。收集鸡胚尿囊液进行鉴定,RT-PCR结果显示,盲传3代后仍能检测到拯救病毒S1基因的存在;分子标签检测结果显示已成功引入分子标签;对接种3代后的鸡胚进行观察,拯救毒与亲本毒鸡胚都出现卵黄破裂和胚体充血的现象。本研究成功克隆出鸡呼肠孤病毒LY383株全基因组10个重组质粒,优化了10个质粒共转染时的最佳配比,构建了ARV感染性克隆,为深入开展ARV的致病机理和免疫防制等研究提供了技术平台。
刘臻臻[2]（2021）在《死胚和弱雏中新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定》文中研究表明新型鸭呼肠孤病毒（novel duck reovirus,NDRV）病是我国养鸭业近几年较为常见的一种以肝脾不规则状坏死、出血为主要特点的疾病。雏鸭感染后出现精神萎靡,被毛粗乱,采食量饮水量下降等症状,并伴有死亡现象。NDRV是可垂直传播的免疫抑制性病原,感染后可造成机体的免疫力下降,易引发混合感染及继发感染,导致鸭群的死亡和淘汰,给我国养鸭业造成了严重的经济损失。本研究从泰安新希望六合孵化场定期采集新鲜病料,利用PCR技术检测NDRV的感染率,并在此基础上对采集病料中的10株NDRV的σC基因序列进行测序分析,选取一株致鸭胚病变明显且无其他病原感染的NDRV分离株进行致病性试验,以期为新型鸭呼肠孤病毒病的科学防控、疫苗研发提供可靠的理论依据。为了解该病在山东多地的流行情况,本研究分9个批次采集了497份新鲜病料,包括死胚332份,弱雏110份,未受精蛋55份,进行PCR检测,结果表明NDRV的总感染率为52.7%,其中死胚中的检出率为53.9%,弱雏中的检出率为26.3%,未受精蛋中的检出率最高,为98.2%。为确定新分离毒株与呼肠孤病毒已有毒株的亲缘性关系,本研究扩增了10株NDRV分离株的σC基因序列,并利用MEGA 7.0和Meg Align软件进行进化树的构建及同源性分析。分析结果显示NDRV、番鸭呼肠孤病毒（muscovy duck reovirus,MDRV）、禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）分别处于不同的进化分支,NDRV与MDRV同属于水禽源呼肠孤病毒。分离株中SD-22、SD-11、SD-62相互彼此靠近,与TH11毒株亲缘关系最近,其余7株彼此接近。10株分离株之间的同源性为94.1%～99.9%,与NDRV参考株的同源性为93.5%～97.4%,与ARV的同源性最低,仅为38.8%～43.2%。本研究从10株NDRV分离株中,选取致鸭胚病变明显且无其他病原感染的SD-32毒株,接种DF1细胞后可产生明显的细胞病变（cytopathic effect,CPE）,观察记录病变并测定其TCID50为10-6.052/0.1m L。将70只健康的1日龄樱桃谷鸭雏鸭随机分为两组,每组35只。感染组腿部肌肉注射0.2m L的病毒液,对照组注射等量的无菌生理盐水。监测其临床症状、剖检病变及体重变化,并在1DPI、3DPI、5DPI、7DPI、14DPI及21DPI,每组随机选取4只鸭子剖杀。检测免疫器官指数,各组织器官病毒载量,血清中IL-4、IL-6、IFN-ɑ、IFN-γ的含量等变化。结果表明,1日龄雏鸭感染后无自然死亡,出现精神不振、白色稀粪症状。剖检可见心、肝、脾不同程度的出血及坏死,胸腺肿大,针尖状出血,体重增长受到抑制。免疫器官指数结果表明,5DPI胸腺指数显着低于对照组,7DPI脾脏指数显着低于对照组,14DPI胸腺、法氏囊指数显着低于对照组。血清中在1DPI就能检测到病毒存在,3DPI出现第一个排毒高峰,21DPI出现第二个小高峰。各组织病毒载量结果显示,1DPI各组织均能检测到病毒的存在,脾中的病毒含量最高,各组织器官的病毒载量变化趋势与血清病毒载量变化趋势基本吻合。血清中细胞因子变化结果显示,IL-4、IL-6含量在5DPI极显着上调,IFN-ɑ、IFN-γ含量在5DPI显着上调,细胞因子表达形式多样。
田昂[3]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用》文中研究表明近年来,我国出现了一种以鸭脾脏坏死为特征的传染病,病鸭精神沉郁,出现软脚症状。该病发病日龄较小,病情发展迅速,引起脾脏坏死从而导致免疫力下降,容易造成其他病原微生物的继发感染,因此死亡率较高。新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck Reovirus,NDRV）被认为是引起该病的病原。目前,确诊该病一般采用RT-PCR、荧光定量PCR等方法进行该病病原的快速检测,而间接酶联免疫吸附试验（Indirect Enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA）则可用于该病的大规模血清学调查。NDRV的σC蛋白是它的主要保护性抗原蛋白,本研究将原核表达的NDRVσC蛋白作为包被抗原,建立了检测NDRV血清抗体的iELISA方法,并对其进行了初步应用。本文研究内容分为以下两部分:第一部分:检测NDRV抗体iELISA方法的建立从脾脏坏死的鸭中分离得到一株NDRV,命名为SD19。设计引物,利用RT-PCR技术扩增编码σC蛋白的全基因,将扩增产物连接至p ET-32a（+）载体并在大肠杆菌BL21中表达。Western bolt分析后,将所表达的蛋白作为包被抗原建立检测鸭血清中NDRV抗体的iELISA方法。优化的最佳条件为:包被σC蛋白浓度5μg/m L 100μL/孔、包被时间4℃12h、37℃1.5h封闭、被检血清1:80稀释、血清孵育37℃1.5h、底物反应15min、临界值为0.34。用建立的iELISA检测方法对GPV、NGPV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3的单因子血清及NDRV阴阳性血清进行检测,结果发现除NDRV阳性血清以外其他血清检测数值均小于0.34,说明建立的检测NDRV血清抗体的iELISA方法特异性高,确定的临界值是合适的。对100份鸭血清分别用iELISA和Dot blot方法进行检测,结果发现两者的结果符合率为93%,说明建立的iELISA检测方法用来进行NDRV抗体的血清学调查是可行的。第二部分:运用建立的iELISA检测方法进行血清学调查运用建立的iELISA检测方法对来自山东和江苏两省20个场的1000份1-40日龄樱桃谷肉鸭血清进行NDRV抗体检测,结果表明,NRDV群阳性率为100%（20/20）,个体阳性率为53.3%（533/1000）;其中山东肉鸭个体阳性率为54%（270/500）,江苏肉鸭个体阳性率为52.6%（263/500）。1-10日龄、10-20日龄、20-30日龄和30-40日龄肉鸭个体阳性率分别为58%（145/250）、55%（165/300）、50.5%（101/200）和48.8%（122/250）。运用iELISA方法对来自山东和江苏两省10个场的500份14-61周龄父母代樱桃谷种母鸭的血清进行检测,结果表明,NRDV群阳性率为100%（10/10）,个体阳性率为60%（300/500）;其中山东父母代种母鸭个体阳性率为65.2%（163/250）,江苏父母代种母鸭个体阳性率为54.8%（137/250）。14-25周龄、26-35周龄、36-45周龄、46-61周龄父母代种母鸭个体阳性率分别为61%（122/200）、53%（53/100）、65%（65/100）、60%（60/100）。对江苏省某个祖代种鸭场种公鸭的检出阳性率为96%（48/50）。以上对樱桃谷鸭祖代种公鸭、父母代种母鸭和商品代肉鸭进行的血清学检测表明,NDRV在山东、江苏两省的鸭群中已普遍存在,对其感染必须引起高度重视。
晁锦[4]（2020）在《新型鸭呼肠孤病毒SY株分离鉴定及p18蛋白单克隆抗体的制备》文中提出新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）病是近几年新出现的一种鸭的传染病,典型特征为肝脏出血和脾脏坏死。该病无明显季节性,各品种鸭均能感染,可通过引起垂直传播和水平传播。自然条件下,该病引起的死亡率通常较低,并发感染时的发病率和死亡率升高,还可引起免疫抑制和生长发育障碍。由于尚无可以使用的疫苗进行预防,新型鸭呼肠孤病毒病现已成为危害水禽养殖的重要传染病之一。因此,开发有效的疫苗和可靠的诊断方法对新型鸭呼肠孤病毒病的防控至关重要。本研究从临床发病鸭组织病料中分离鉴定获得一株NDRV（SY株）,并对SY株的细胞培养特性进行研究,制备出抗NDRV p18蛋白的单克隆抗体,为NDRV致病机制、疫苗及诊断试剂的研究奠定了基础。本文内容包括以下两部分:1.新型鸭呼肠孤病毒分离鉴定及培养特性研究以肝脏出血和脾坏死为特征的发病鸭肝和脾组织接种SPF鸡胚进行病毒分离,结果鸡胚在接种后96～120 h内全部死亡,成功从鸡胚尿囊液中分离到一株病毒。通过RCR和RT-PCR对分离毒进行常见鸭病毒性传染病的病原检测,除新型鸭呼肠孤病毒检测为阳性外,其余检测结果均为阴性。将收获的尿囊液接种3日龄麻鸭,可以复制出与自然感染病例相似的症状与病理变化。上述试验结果表明该分离病毒为新型鸭呼肠孤病毒,并命名为NDRV SY株。为进一步了解该分离毒株的生物学特性,对SY株进行血凝性试验和有机溶剂敏感试验,明确该病毒不凝集鸡血红细胞,无囊膜。通过电镜观察发现该病毒粒子为直径约70 nm的球形。本研究参考NDRV 091株S1基因的序列设计一对引物,通过对分离病毒S1基因测序和系统进化树分析,表明该分离毒与NDRV亲缘关系最近,同源性高达95.2%～97.6%。将NDRV SY株在Vero细胞进行传代培养,结果表明其在Vero细胞上增殖良好,并产生明显细胞病变,为NDRV的疫苗和致病机制研究奠定了基础。2.p18单克隆抗体的制备用纯化的NDRV（SY株）免疫8周龄BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞系融合。通过间接ELISA方法筛选阳性克隆株,获得1株可分泌抗NDRV p18蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为1D3,诱生腹水的抗体效价为106。间接免疫荧光试验证明,1D3与NDRV发生特异性反应;免疫印迹（Western blot）分析,1D3能与p18蛋白产生特异性蛋白条带,表明筛选的单抗特异性和反应原性较好。
王茹[5]（2019）在《禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析》文中提出禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）是引起禽类常见传染病鸡病毒性关节炎的主要病原。近年来该病在我国呈上升趋势发展,毒株变异性大,传统疫苗株对其保护效果不理想,影响了我国养禽业的发展。本试验对2017年下半年至2018年上半年期间自山东、河南、河北、辽宁等地家禽养殖场采集的疑似呼肠孤感染鸡的组织病料进行病原分离,经RT-PCR、FA、EM等方法对所分离到的ARV毒株进行生物学特性研究,探究了 ARV分离株的血凝性及其致病性,通过动物回归试验,比较各分离毒株毒力强弱和攻毒后排毒期,通过免疫保护试验验证传统疫苗株对新分离毒株保护效果,试验验证各分离株的理化特性。综合试验结果从分离株中筛选疫苗株,经CEF细胞增殖病毒液,制备油乳灭活疫苗。将筛选的疫苗株与传统疫苗株对比,采用SPF鸡进行免疫攻毒保护试验,从免疫后抗体水平、攻毒保护试验结果对2株病毒的免疫原性进行了分析评价。1 ARV的分离鉴定及生物学特性研究从组织病料中成功分离出6株ARV,试验结果显示,各毒株均无血凝性,EM观察病毒粒子大小约为70～80 nm左右;分离毒株与ARV单抗反应均呈现强阳性信号;各分离毒株在LMH、CEF细胞上均可增殖,但LMH细胞对其更为敏感;动物回归试验中,各分离株攻毒后均可引起受试鸡出现发病症状,但呈现出的毒力强弱不同;通过采集泄殖腔拭子检测部分分离株攻毒后排毒情况,结果显示,在攻毒24h后即可从粪便中检测到感染性病毒粒子,攻毒后首周是病毒粒子脱落的高峰期,第2周粪便排毒量明显减少,部分毒株粪便排毒期可持续2周以上:理化检测结果显示,各毒株对氯仿不敏感,对胰酶轻度敏感,耐热性较好,50℃处理1h对各毒株病毒滴度无显着影响,各项理化特征符合ARV特性;免疫保护试验结果显示,传统疫苗对6株ARV分离株均无法产生完全保护。同时,相较于其它毒株,分离毒株RPVA1306和RPVA1307免疫组与对照组发病情况差异较小且发病情况更为严重更具研究和应用价值。该结果验证了分离株的致病性,丰富了 ARV毒种库,证实了传统疫苗对新分离毒株无法起到理想的保护作用,为ARV新疫苗的研发提供了理论依据。2 ARV灭活疫苗的制备及免疫原性分析目前,国内外市场上已有多种ARV疫苗应用于ARV的预防,但临床上病毒性关节炎的发生率仍居高不下。本试验通过测定ARV各分离毒株的TCID50和ELD50,结合动物回归及免疫保护试验结果,筛选出2株毒力较强毒株RPVA1306和RPVA1307,经细胞增殖,制备油乳灭活疫苗。与传统疫苗株对比,采用自制疫苗进行免疫攻毒保护试验,免疫后从抗体水平、攻毒保护试验结果对2株病毒的免疫原性进行分析评价。试验结果表明,2株分离株对原毒株保护效果最佳,其中RPVA1306对2种分离株保护率均能达到80%以上,免疫效果较为理想。
郑玲红[6]（2017）在《番鸭呼肠孤病毒σA蛋白对干扰素信号通路的调控研究》文中研究说明番鸭呼肠孤病毒（MDRV）感染是由MDRV引起番鸭和半番鸭高发病率和高死亡率的急性传染病,给番鸭养殖业造成严重的经济损失。MDRV与鸡源禽呼肠孤病毒（ARV）同属于正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）第 Ⅱ亚群的禽正呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus）,但二者基因组构成及致病特性又有所差异,特别是S组蛋白变异性较大,且它们与病毒致病性密切相关。已有报道指出MDRV与ARV均可以刺激干扰素产生,而ARV σA蛋白具有抵抗宿主干扰素（IFN）效应的功能,且其与MDRV σA蛋白基因同源性为76.5%,因此,可以推测MDRV σA蛋白在调控干扰素表达中扮演重要角色。鉴于此,本研究探索了 MDRV σA蛋白对干扰素信号通路的调控作用,主要内容及结果如下:1.为了初步确定MDRVσA蛋白能否像ARV σA蛋白一样有抑制干扰素IFN-α和IFN-β的功能,将含有MDRV σA基因的重组表达质粒转染DF-1细胞,培养24h后进行MDRV感染,通过ELISA方法检测σA蛋白对干扰素的影响。结果显示,MDRV感染组IFN-α和IFN-β表达水平均极显着高于空白对照组（P<0.01）,说明MDRV可以刺激细胞干扰素的产生;空载体对照组（EV）组和σA组干扰素含量差异不显着（P>0.05）,说明单独转染σA蛋白并不能显着刺激细胞干扰素的表达;EV+MDRV组的干扰素表达量显着（P<0.05）低于MDRV组和EV组,可能是由于EV组的刺激产生一定量的干扰素,使MDRV反而下调细胞干扰素的表达,这与ARV具有双向调节功能报道一致;而σA+MDRV组的干扰素表达量极显着高于EV+MDRV组（P<0.01）,说明σA可能具有上调MDRV诱导的干扰素表达的功能,这与已经报道的ARV σA蛋白研究的结果不一致。为了进一步验证上述结果,我们通过Real-time PCR进一步检测σA蛋白对病毒诱导干扰素及其信号通路相关因子mRNA水平的影响,结果为:（1）干扰素检测结果显示,与空白对照组相比,MDRV组的IFN-α和IFN-β mRNA水平显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）升高;EV组和σA组干扰素含量差异不显着（P>0.05）;EV+MDRV组的干扰素表达量显着（P<0.05）低于MDRV组和EV组;而σA+MDRV组的干扰素表达量极显着高于EV+MDRV组（P<0.01）,这些结果均与ELISA检测结果基本一致。（2）干扰素信号通路相关因子的检测结果显示:与空白对照组相比,MDRV组的转录因子IRF7显着（P<0.05）升高,其模式受体（MDA5,TLR3和TLR7）以及抗病毒因子（Mx、ISG12和IFIT5）的mRNA水平均极显着（P<0.01）升高;EV+MDRV组的各因子的mRNA水平均显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）低于MDRV组,同时低于或显着（P<0.05）低于EV组;σA+MDRV组各因子的mRNA水平均极显着（P<0.01）高于EV+MDRV,以上这些因子的检测结果均与干扰素表达结果基本一致。综上结果表明,MDRV σA蛋白可以上调MDRV诱导的干扰素及其信号通路相关因子的表达。2.由于试验中发现EV+MDRV组的干扰素及其通路相关因子的表达量均较EV组和MDRV组明显降低,猜测可能由MDRV具有双向调节干扰素的功能所致,为了排除这个因素的影响,进一步验证σA蛋白的功能,我们选用只有正向调控作用的激活剂poly（I:C）替代MDRV,并采用同样的试验方法,检测σA蛋白对激活剂poly（I:C）诱导的干扰素及其信号通路相关因子的影响。结果为:（1）Real-time PCR结果显示:与空白对照组相比,poly（I:C）组除IFIT5与ISG12的表达水平显着（P<0.05）升高外,其 IFN-β、MDA5、TLR3、IRF7 和 Mx的表达水平均极显着（P<0.01）升高,说明poly（I:C）可以有效激活干扰素信号通路的以上各因子mRNA的表达;EV+poly（I:C）组的mRNA表达显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于poly（I:C）组和EV组,对比前面的实验结果,可以间接说明MDRV具有双向调节干扰素表达的功能;σA+poly（I:C）组的各因子的mRNA表达水平均极显着（P<0.01）高于EV+poly（I:C）组及其他各组;表明σA蛋白能增强poly（I:C）诱导的干扰素及其通路相关因子的mRNA表达。（2）ELISA检测结果显示,以上各个因子表达量变化均与Real-time PCR的检测结果基本一致。综上表明,σA蛋白能增强poly（I:C）诱导的干扰素及其信号通路相关因子的表达。3.为了确定MDRV σA蛋白的第155和273位氨基酸残基是否是该蛋白发挥调控干扰素功能的关键位点。我们首先构建了MDRV-YB σA基因的三个突变体体（155Ala点突变,273Ala点突变以及155Ala+273Ala双突变）,并在DF-1、Vero细胞系中成功表达;随后将野生型σA及其突变体分别转染DF-1细胞,培养24 h后转染poly（I:C）,通过Real-time PCR和ELISA的方法检测其对干扰素及干扰素信号通路相关因子的影响。结果为:（1）Real-time PCR结果显示,σA155突变组和σA273突变组的IFN-β3和干扰素信号通路相关因子 MDA5、TLR3、IRF7、IFIT5、ISG12 和 Mx 的 mRNA 表达水平均显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于EV组,但各因子（除TLR3外）的mRNA表达水平均显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）低于野生型σA组,说明单突变均能显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）抑制σA蛋白增强poly（I:C）诱导的干扰素及其信号通路蛋白的表达的功能,但不会使σA蛋白失去该功能;σA155,273双突变体组各因子的mRNA表达量均极显着（P<0.01）低于野生型σA组,且除TLR3和MDA5外,其余各因子均与EV组差异不显着（P>0.05）,说明双突变能极显着抑制或使σA失去增强poly（I:C）诱导的干扰素及其相关通路蛋白的表达功能;此外,σA155突变组与σA273突变组的各因子（除ISG12外）mRNA表达水平均差异不显着（P>0.05）,且除TLR3,Mx,MDA5外,均极显着（P<0.01）高于σA155,273双突变体组。（2）ELISA结果与Real-time PCR结果基本一致。以上结果表明,155Arg和273Arg是σA蛋白的关键位点,突变会显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）的抑制该蛋白增强poly（I:C）诱导的干扰素及其相关通路蛋白的表达,且证实双位点突变比单位点突变的抑制效果更为显着（P<0.05）,甚至使该蛋白失去增强poly（I:C）诱导的干扰素及其相关通路蛋白的表达。综上,MDRV σA增强MDRV、poly（I:C）诱导的干扰素及其信号通路相关因子的表达,发挥调控干扰素关键位点为155Arg和273Arg。本研究从细胞信号转导角度揭示了 MDRV σA对宿主天然免疫影响的分子机制,为更深一步探讨该蛋白的功能机理提供基础,也为防治MDRV感染提供了新的思路。
王丹[7]（2016）在《鸭源呼肠孤病毒的表型和分子特征分析及基因2型毒株编码的新蛋白的鉴定》文中提出根据宿主和病变,鸭呼肠孤病毒病分为3种主要类型,即,番鸭“白点病”、番鸭“新肝病”和北京鸭“脾坏死病”,其病原分别为番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus, MDRV）、新致病型番鸭呼肠孤病毒（New pathotype of Muscovy duck reovirus, N-MDRV）和鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus, DRV）。MDRV于1972年首次发现于法国,目前被归为禽呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus,ARV）的番鸭源分离株（ARV-Md）, N-MDRV和DRV是我国研究者分别于2009年和2011年报道的新毒株。迄今为止,不同鸭源呼肠孤病毒毒株之间的准确分类关系还有待于阐明。以ARV-Md/815-12、N-MDRV/J18和DRV/091为材料,对不同鸭源呼肠孤病毒的表型特征进行比较。结果显示,N-MDRV和DRV在实验室感染宿主范围、在细胞质内排列方式、致细胞融合活性、沉淀反应抗原、对北京鸭的致病性和组织嗜性等表型特征上表现出相似性。与N-MDRV和DRV相比,ARV-Md在表型特征上存在明显差异。3株病毒均对番鸭有致病性,但所引起的病变和组织嗜性有所不同。为明确三类鸭源呼肠孤病毒的基因组结构特点及其与其它水禽源毒株和鸡源ARV的遗传演化关系,用SDS-PAGE分析了3株病毒的核酸电泳型,用RT-PCR和5RACE测定了ARV-Md/815-12的基因组序列以及N-MDRV/J18和DRV/091的S1基因节段序列,由此获得了3株鸭源呼肠孤病毒的基因组序列。SDS-PAGE结果显示,N-MDRV和DRV具有相同的基因组核酸电泳型。与N-MDRV和DRV相比,ARV-Md S组的核酸电泳型表现出显着的差异。序列分析结果显示,所测3株病毒均具有ARV的基因组结构特点,但在多顺反子基因节段的长度和基因结构上,N-MDRV和DRV等新毒株与ARV-Md存在显着差异,即,J-MDRV和DRV的多顺反子节段位于S1,含3个ORF,分别编码p10、p18和σC蛋白；而ARV-Md的多顺反子基因节段位于S4,仅含2个ORF,分别编码p10和σC蛋白。N-MDRV和DRV的p10蛋白与ARV-Md的p10蛋白缺乏序列同源性。进化分析结果显示,水禽源和鸡源毒株的9个基因节段（除M2）均按宿主聚为两个明显不同的分支；在M2节段,相对于ARV-Md, N-MDRV和DRV等水禽源新毒株与鸡源毒株具有更近的遗传演化关系。综合分析,可将水禽源毒株鉴定为ARV的成员,但现有的序列同源性分类标准需要调整。根据外衣壳蛋白序列的进化分析结果,可将水禽源呼肠孤病毒区分为2个不同的基因型,ARV-Md属于基因1型,N-MDRV和DRV属于基因2型。相对于基因1型毒株,N-MDRV和DRV等基因2型毒株最显着的基因组结构特点是其多顺反子节段含有3个ORF,但在复制过程中,预测的ORF1和ORF2是否会表达成熟的p10和p18蛋白,尚不清楚。为回答这一问题,开展了下述研究。用Western Blot进行检测,结果显示,DRV/091的免疫血清可与p18重组蛋白发生反应,而p18重组蛋白的免疫血清亦可从DRV/091感染的Vero细胞中识别出18 kDa的蛋白；用MALDI-TOF/TOF法进行分析,从DRV/091感染的Vero细胞中鉴定出p18蛋白的氨基酸序列：由此可见,p18是DRV S1基因节段编码的一种新蛋白。序列分析显示,在p18蛋白的118-135位可能存在一个核定位信号（Nuclear localization signal, NLS）序列（118KRRR121-X10-132KRRR135）,提示该蛋白可能具有入核活性。为验证这一观点,用激光共聚焦显微镜观察了p18蛋白的亚细胞定位,结果显示,在感染细胞和转染细胞的细胞核内,见有p18蛋白聚集。突变分析显示,p18蛋白的入核活性由NLS决定,而位于NLS N-端的’18KRRR121序列是引导p18蛋白入核的关键基序。经检测,p18蛋白在Vero细胞中过表达能够引起细胞凋亡。将DRV/091感染Vero细胞,用p10蛋白的单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,从感染细胞内检测到荧光信号,以此证实p10蛋白是病毒复制所产生的成熟蛋白。N-MDRV和DRV的p10蛋白含有融合蛋白基序,提示该蛋白具有致细胞融合活性。为验证这一观点,用表达p10蛋白的真核表达质粒转染Vero细胞,在转染后24 h可见细胞融合现象。然而,用表达病毒其它蛋白的真核表达质粒转染Vero细胞,均未见细胞融合现象。由此可见,p10蛋白是决定DRV等基因2型毒株致细胞融合活性的关键因素。上述研究证实,DRV等基因2型毒株的S1基因节段为三顺反子。为初步了解该基因节段的转录和翻译策略,用DRV/091感染、Aero细胞,在感染后不同时间提取细胞内总RNA,并用识别S1基因节段的核酸探针进行Northern Blot检测,在感染后2-8 h可检测到单-mRNA条带,长度与S1基因节段长度（1568 bp）相符。由此可见,在DRV的复制过程中,其S1基因节段可转录出全长mRNA。结果提示,ORF2和ORF3可能是从多顺反子mRNA的中途起始翻译的。
崔国杰[8]（2015）在《番鸭呼肠孤病毒强弱毒株S基因分子特征分析及感染性克隆载体构建》文中进行了进一步梳理番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）引起的番鸭以软脚,肝、脾出现大量灰白色坏死点为主要特征的病毒性传染病,对我国番鸭饲养业造成巨大经济损失。番鸭呼肠孤病毒病活疫苗（CA株）可有效预防本病,但MDRV致病和致弱的分子机理尚不清楚。本研究以MDRV强毒株（MW9710株）和疫苗株（CA株）为材料,分别构建了 MDRV强毒株和弱毒株S组基因的感染性克隆载体,结果如下:1、MDRV强弱毒株S组基因cDNA分子克隆构建:提取病毒核酸,设计针对S组基因的特异性引物进行RT-PCR,克隆测序获得了病毒S组基因序列。结果显示:MDRV两株对应基因长度相同,其中S1基因1324 bp,S2基因1201 bp,S3基因1191 bp,S4基因1124 bp;两株核苷酸序列与MDRV参考毒株同源性均大于98%,证实扩增获得了 MDRV强毒株和弱毒株的S组基因。2、MDRV S组基因编码的氨基酸差异及蛋白理化性质分析:利用MegAlign和Protean软件对强毒MW9710株和弱毒CA株S组基因编码氨基酸及蛋白进行比较。结果显示:σA蛋白为2个同极性疏水氨基酸替换:301aa（A→V）,409aa（A→V）;σB蛋白为12个氨基酸替换,多为亲水性氨基酸替换:5aa（V→A）,21aa（W→R）,40aa（S→P）,65aa（M→T）,85aa（P->S）,96aa（I→T）,113aa（Y→H）,120aa（S→F）,218aa（S→P）,244aa（D→G）,265aa（G→S）,347aa（A→T）;σNS 蛋白为1个同极性亲水性氨基酸替换:273aa（S→T）;p10蛋白为3个疏水性氨基酸替换,46aa（A→V）,70aa（H→Y）,73aa（H→Y）;σC蛋白为8个氨基酸替换,多为疏水性氨基酸替换:162aa（H→Y）,167aa（F→I）,168aa（T→I）,172aa（S→F）,197aa（P→S）,198aa（T→M）,206aa（P→F）,264aa（L→F）。在分子量和等电点两方面比较中均有明显差异的为σB蛋白和σC蛋白,其中σB蛋白分子量下降,等电点升高,而σC蛋白分子量升高,等电点下降。3、MDRV S组基因感染性克隆载体构建:根据MRV感染性克隆构建的思路,获取含,SapⅠ酶切位点的p-MDRV病毒载体,利用引物设计扩增获得同样含Sap1酶切位点的S组基因片段,扩增片段经SapI酶切后连接至病毒载体,获得感染性克隆质粒载体。鉴定结果显示插入p-MDRV病毒载体中的S组基因未发生突变,位置、方向正确,表明成功构建了 MDRVS组基因感染性克隆载体。结论:本研究明确了 MDRV强毒和弱毒S组基因及其编码蛋白的差异,并成功构建了 MDRV S组基因感染性克隆载体。研究结果为继续克隆构建MDRV L及M组基因、建立MDRV反向遗传系统提供了技术平台,也为深入开展MDRV致病和致弱的分子机理研究奠定良好基础。
朱二鹏[9]（2015）在《番鸭呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的表达及其多克隆抗体的制备》文中指出番鸭呼肠孤病毒（MDRV）主要侵害4～45日龄的番鸭,死亡率很高,临床上以软脚,腹泻等为主要症状,以肝、脾肿大及灰白色坏死点等为主要病变,耐过番鸭常出现明显的生长停滞。该病能够引发免疫机能抑制,削弱机体免疫力,很容易继发其它病原的复合感染,从而加重病情,已经成为严重危害番鸭养殖业的主要传染病之一。鸡源呼肠孤病毒（CRV）σNS非结构蛋白作为一种可以聚集于病毒复制工厂内的RNA结合蛋白,可能在病毒RNA组装以及复制周期中发挥重要作用。而目前MDRV的相关功能性研究还未有报道,对MDRV YB株σNS基因及氨基酸序列的Blast分析表明,MDRV与CRV σNS蛋白可能具有类似的功能。本试验首次完成了 MDRV YB株σNS基因的可溶性原核表达和真核表达,并制备了特异性良好的兔多克隆抗体,这将有助于进一步研究该蛋白功能以及获悉MDRV的基因组复制机理和致病机理,最终为有效防治MDRV感染提供参考。为制备MDRV YB株σNS蛋白的多克隆抗体,本试验首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列（CDS）,连接到原核表达载体pET-32a中,经过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定,表明成功构建了原核重组质粒pET-YB-σNS;将其转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析结果显示成功高效表达出分子量约为58 ku的融合蛋白（p-σNS）,Bandscan5.0分析可知p-σNS蛋白的表达量高达菌体总蛋白量的68%;可溶性分析显示该蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在;对p-σNS蛋白的诱导条件进行优化,结果显示IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为4h,1 mmol/L和37℃;随后对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和（或）Ni2+柱亲和层析纯化,均能得到高纯度蛋白;分别对纯化前后的p-σNS蛋白进行Western-blot分析,结果显示,二者均能特异性识别MDRV阳性血清,表明其具备良好的反应原性;最后用纯化后的可溶性p-σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价大于1:32 000,且特异性良好。此外,后续试验表明,该多克隆抗体亦可以与MDRV全病毒复制产生的v-σNS发生特异性识别。为实现MDRV YB株σNS蛋白的真核表达,首先经PCR扩增了σNS基因完整CDS区,连接到携带flag标签的真核表达载体pCI-neo-flag,双酶切鉴定及测序鉴定表明成功构建了真核重组质粒pCI-flag-σNS;使用ViaFect转染试剂将其转染至DF-1细胞,采用半定量RT-PCR法检测σNS基因的转录水平,Western-blot分析真核表达蛋白（e-σNS）的表达水平。RT-PCR结果显示,σNS mRNA水平在转染后0～36 h逐渐递增,48 h时出现下降;Western-blot鉴定结果显示,e-σNS蛋白与flag鼠单克隆抗体和MDRV-σNS兔多克隆抗体均能发生特异性反应,且转染后36～48 h蛋白表达量最大。以上结果均表明MDRV-YB σNS基因在DF-1细胞中得到了正确的表达,为后续蛋白功能的深入研究奠定了基础。
何建文[10]（2012）在《禽呼肠孤病毒S2、S4基因的克隆与序列分析》文中研究表明参考GenBank中禽呼肠孤病毒176株（ARV176） S2和S4基因分别设计两对引物,对禽呼肠孤病毒内蒙古地区分离株C-98和天津地区分离株T-98分别进行总RNA的提取,以其为模板,应用RT-PCR方法扩增病毒S2和S4基因的cDNA片段,将纯化的S2和S4基因的cDNA片段克隆到pEASY-T1载体,转化DH5a感受态细胞,应用蓝白斑法筛选阳性重组质粒,通过PCR法鉴定重组质粒,然后将PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测定基因序列。测序结果表明：S2基因全长为1324bp,含有一个完整的开放阅读框,位于16bp～1266bp,编码416个氨基酸组成的oA蛋白。S4基因全长为1192bp,含有1个完整的开放性阅读框,位于24bp-1127bp,编码由367个氨基酸组成的o NS蛋白。并已将测得的序列成功登录GenBank, ARV C-98S2基因登录号JN641886；S4基因JN641885); ARV T-98S2基因登录号JN641887; S4基因JN641884。基因序列及其推导的氨基酸序列同源性分析表明：ARV C-98和ARV T-98分离株的S2基因与参考毒株ARV176、ARV918、ARV919、ARV1733、ARV GX2010、 ARV S1133和DRV YJL S2基因的核酸同源性最高,在99.2%-99.8%之间；推导的氨基酸的同源性在98.1%-99.8%之间；与参考毒株MRV3、MRV3-jin-1和MRV3-T3D S2基因的核苷酸同源性在2.4%-5.5%之间；推导的氨基酸序列同源性却在29.1%-29.3%之间。ARV C-98和ARV T-98分离株的S4基因与参考毒株ARV176、ARV601SI、ARV919、ARV1733、ARV GX2010、ARV S1133和DRV YJL S4基因的核苷酸同源性较高,在99.0%-99.8%之间,推导的氨基酸的同源性在98.9%-100.0%之间；而与参考毒株MRV3、MRV3-jin-1和MRV3-T3D S4基因的核苷酸同源性都为2.4%；推导的氨基酸序列同源性在3.6%-9.0%之间。遗传进化树分析显示：17株禽源呼肠孤病毒分离株的S2基因可分出3个不同的谱系,S4基因可分出4个不同的谱系,并且ARV C-98和ARV T-98与禽呼肠孤病毒株ARV176、ARV S1133、ARV1733、ARV919、ARV GX2010和DRV YJL的S2基因S4基因始终在遗传进化树的同一个谱系中,且ARV C-98和ARV T-98与禽呼肠孤病毒株ARV176、ARV S1133、ARV1733、ARV919、ARV GX2010和DRV YJL遗传关系最近。证明了各谱系这间和同一个谱系之间的各个毒株的亲缘关系与致病性、毒力强弱和分离地区,分离时间没有相关性。
二、番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析（论文提纲范文）
（1）鸡源呼肠孤病毒变异株的分离鉴定及感染性克隆的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒病原学概述 |
| 1.1.1 分类及形态学 |
| 1.1.2 理化特性及培养特性 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 临床症状及病理变化 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 ARV基因组特性 |
| 1.2.2 ARV主要蛋白 |
| 1.3 感染性克隆研究进展 |
| 1.3.1 感染性克隆研究背景 |
| 1.3.2 正链RNA病毒感染性克隆构建方法 |
| 1.3.3 负链RNA病毒感染性克隆构建方法 |
| 1.4 呼肠孤病毒感染性克隆研究研究进展 |
| 1.4.1 MRV感染性克隆的构建 |
| 1.4.2 BTV感染性克隆的构建 |
| 1.4.3 其他呼肠孤病毒感染性克隆的构建 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料、细胞和动物 |
| 2.1.2 载体、鸡胚和毒株 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 分离株对肉鸡的致病性研究 |
| 2.2.3 鸡呼肠孤病毒感染性克隆的构建 |
| 3.结果 |
| 3.1 ARV的分离鉴定 |
| 3.1.1 ARV的分离结果 |
| 3.1.2 SDYT株全基因组序列分析结果 |
| 3.1.3 SDYT株遗传进化分析 |
| 3.2 鸡呼肠孤病毒的致病性研究 |
| 3.2.1 病毒TCID50 的测定 |
| 3.2.2 人工感染肉鸡后临床症状 |
| 3.2.3 人工感染肉鸡后剖检变化 |
| 3.2.4 人工感染肉鸡后病理组织学变化 |
| 3.2.5 人工感染肉鸡后体重变化 |
| 3.2.6 人工感染肉鸡后各组织中ARV载量的测定 |
| 3.2.7 人工感染肉鸡后病毒血症及排毒规律 |
| 3.2.8 人工感染肉鸡后血清中ARV抗体水平变化 |
| 3.2.9 人工感染肉鸡后血清中细胞因子水平变化 |
| 3.3 鸡呼肠孤病毒感染性克隆的构建 |
| 3.3.1 ARV全基因组RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组质粒构建结果 |
| 3.3.3 病毒的拯救 |
| 3.3.4 拯救病毒的RT-PCR检测 |
| 3.3.5 拯救病毒分子标签的鉴定 |
| 讨论 |
| 4.1 鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定分析 |
| 4.2 鸡呼肠孤病毒变异株对肉鸡致病性的研究 |
| 4.3 ARV感染性克隆的构建 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）死胚和弱雏中新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒的病原学概述 |
| 1.2.1 呼肠孤病毒的历史及分类 |
| 1.2.2 形态学和理化特征 |
| 1.2.3 培养特性 |
| 1.2.4 分子生物学特征 |
| 1.2.5 病毒的复制周期 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学特征 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.3.3 剖检病变及病理组织学变化 |
| 1.4 NDRV的致病机理 |
| 1.5 NDRV的诊断方法 |
| 1.5.1 血清学诊断 |
| 1.5.2 分子生物学诊断 |
| 1.6 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.6.1 实时荧光定量PCR的原理 |
| 1.6.2 实时荧光定量PCR的分类 |
| 1.6.3 实时荧光定量PCR的定量方法及应用 |
| 1.7 细胞因子的检测 |
| 1.7.1 细胞因子的检测方法 |
| 1.7.2 部分细胞因子功能 |
| 1.8 NDRV的防治 |
| 1.9 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌(毒)株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 相关试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 样品的检测 |
| 2.2.1.1 病料的采集处理 |
| 2.2.1.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.1.3 RNA反转录 |
| 2.2.1.4 引物的设计与合成 |
| 2.2.1.5 PCR检测 |
| 2.2.1.6 电泳检测 |
| 2.2.1.7 病毒的分离与增殖 |
| 2.2.2 σC基因序列测定及分析 |
| 2.2.2.1 PCR扩增 |
| 2.2.2.2 PCR产物凝胶电泳 |
| 2.2.2.3 目的片段胶回收 |
| 2.2.2.4 胶回收产物T载体连接 |
| 2.2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.2.6 重组质粒的提取鉴定 |
| 2.2.2.7 阳性质粒的序列测定及分析 |
| 2.2.3 SD-32 毒株的致病性试验 |
| 2.2.3.1 毒株的选择 |
| 2.2.3.2 荧光定量引物的设计与合成 |
| 2.2.3.3 细胞致病性试验 |
| 2.2.3.4 TCID_(50)的测定 |
| 2.2.3.5 动物试验的建立 |
| 2.2.3.6 攻毒后临床症状监测 |
| 2.2.3.7 攻毒后剖检病变观察及免疫器官指数检测 |
| 2.2.3.8 攻毒后病理组织学观察 |
| 2.2.3.9 攻毒后病毒血症检测 |
| 2.2.3.10 攻毒后病毒载量检测 |
| 2.2.3.11 攻毒后细胞因子检测 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 NDRV的流行病学调查结果及分析 |
| 3.1.1 PCR检测结果 |
| 3.1.2 PCR结果分析 |
| 3.2 NDRV的分离鉴定结果及分析 |
| 3.2.1 NDRV的鸭胚分离结果 |
| 3.2.2 σC基因扩增结果 |
| 3.2.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.4 σC基因序列分析 |
| 3.3 SD-32 毒株的致病性分析 |
| 3.3.1 纯净度检测结果 |
| 3.3.2 细胞致病性 |
| 3.3.2.1 细胞病变 |
| 3.3.2.2 TCID_(50)测定结果 |
| 3.3.3 动物攻毒试验结果 |
| 3.3.3.1 临床症状 |
| 3.3.3.2 剖检病变 |
| 3.3.3.3 病理组织学变化 |
| 3.3.3.4 体重及免疫器官指数 |
| 3.3.3.5 标准曲线的建立 |
| 3.3.3.6 血清病毒载量 |
| 3.3.3.7 组织病毒载量 |
| 3.3.3.8 细胞因子变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NDRV的流行病学调查 |
| 4.2 NDRV的分离鉴定 |
| 4.3 SD-32毒株致病性研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒的研究进展与国内外现状 |
| 1.2 病原学特征与分子生物学特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床特征 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 致病机理 |
| 1.7 诊断与防治 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒及血清 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 菌株、质粒及抗生素 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 引物设计及序列分析 |
| 2.1.7 试剂及溶液的配制 |
| 2.7.1.1 琼脂糖凝胶及TAE电泳液的配制 |
| 2.1.7.2 LB培养基的配制及固体平板的制备 |
| 2.1.7.3 IPTG诱导剂的配制 |
| 2.1.7.4 氨苄青霉素溶液的配制及Ca Cl2 的配制 |
| 2.1.7.5 包涵体分离纯化试剂 |
| 2.1.7.6 Western Blot及 SDS-PAGE试剂配制 |
| 2.1.8 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒培养增殖 |
| 2.2.2 NDRV在 DF1 细胞上的增值及IFA(间接免疫荧光)实验 |
| 2.2.3 新型鸭呼肠孤病毒RNA的提取及反转录 |
| 2.2.4 新型鸭呼肠孤病毒σC片段的扩增 |
| 2.2.5 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 PCR产物(σC片段)的回收与p MD18-T载体的连接 |
| 2.2.7 质粒的转化与阳性克隆的筛选 |
| 2.2.8 重组质粒DNA(pMD18-T-σC)的提取与酶切验证 |
| 2.2.9 测序 |
| 2.2.10 双酶切 |
| 2.2.11 连接 |
| 2.2.12 BL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.2.13 转化 |
| 2.2.14 重组表达载体的酶切鉴定 |
| 2.2.15 蛋白表达、提取及包涵体纯化 |
| 2.2.16 SDS-PAGE电泳及免疫印记Western-Blot |
| 2.2.17 iELISA检测方法的初步建立 |
| 2.2.17.1 最佳蛋白包被浓度的确立 |
| 2.2.17.2 最佳包被时间的确立 |
| 2.2.17.3 最佳封闭时间的确立 |
| 2.2.17.4 最佳血清稀释倍数的确立 |
| 2.2.17.5 最佳血清孵育时间的确立 |
| 2.2.17.6 底物最佳反应时间的确立 |
| 2.2.17.7 临界值的确定 |
| 2.2.17.8 特异性试验 |
| 2.2.18 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.19 iELISA检测方法的测评 |
| 2.2.20 血清学调查 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 NDRV在 DF1 细胞上的增殖及IFA |
| 3.2 RT-PCR的结果分析及测序分析 |
| 3.3 重组质粒pMD18-T-σC酶切验证 |
| 3.4 重组表达载体p ET32a(+) -σC酶切验证 |
| 3.5 SDS-PAGE电泳及免疫印记Western-Blot的结果分析 |
| 3.6 iELISA检测方法建立及条件优化结果分析 |
| 3.6.1 最佳蛋白包被浓度的确立 |
| 3.6.2 最佳包被时间的确立 |
| 3.6.3 最佳封闭时间的确立 |
| 3.6.4 最佳血清稀释倍数的确立 |
| 3.6.5 最佳血清孵育时间的确立 |
| 3.6.6 底物最佳反应时间的确立 |
| 3.6.7 临界值的确定 |
| 3.6.8 特异性试验 |
| 3.7 iELISA检测方法测评结果分析 |
| 3.8 血清学调查 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）新型鸭呼肠孤病毒SY株分离鉴定及p18蛋白单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写和符号清单 |
| 文献综述 |
| 1.鸭呼肠孤病毒病概述 |
| 2.新型鸭呼肠孤病毒病研究现状 |
| 3.新型鸭呼肠孤病毒的病原学特性 |
| 4.新型鸭呼肠孤病毒基因组结构及编码蛋白 |
| 4.1 新型鸭呼肠孤病毒基因组结构 |
| 4.2 新型鸭呼肠孤病毒基因组编码蛋白 |
| 5.新型鸭呼肠孤病毒培养特性 |
| 6.新型鸭呼肠孤病毒诊断 |
| 6.1 血清学检测 |
| 6.2 分子生物学检测 |
| 7.单克隆抗体技术 |
| 7.1 单克隆抗体技术概念 |
| 7.2 单克隆抗体技术在呼肠孤病毒上的应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 新型鸭呼肠孤病毒分离与生物学鉴定 |
| 3.2 NDRV SY在 Vero细胞系上的培养 |
| 3.3 p18蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新型鸭呼肠孤病毒SY株的分离鉴定及培养特性 |
| 3.2 抗p18蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 ARV的形态结构 |
| 1.2 ARV的理化特性 |
| 1.3 ARV的培养特性 |
| 2 分子生物学特性 |
| 2.1 ARV的基因组 |
| 2.2 编码的蛋白与功能 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 致病性 |
| 3.2 临床症状及病理变化 |
| 3.3 流行概况 |
| 4 实验室诊断 |
| 4.1 病毒分离鉴定 |
| 4.2 血清学诊断方法 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 |
| 5 防治 |
| 5.1 弱毒疫苗 |
| 5.2 灭活疫苗 |
| 5.3 基因工程苗 |
| 6 本课题研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 ARV的分离鉴定及生物特性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 RT-PCR鉴定 |
| 2.3 序列分析 |
| 2.4 直接免疫荧光(FA)鉴定结果 |
| 2.5 形态学鉴定结果 |
| 2.6 ARV的部分生物学特性 |
| 2.7 部分理化特性研究 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 ARV灭活疫苗的制备及免疫原性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒液检验 |
| 2.2 疫苗质量检验 |
| 2.3 疫苗安全性检验结果 |
| 2.4 疫苗效力检验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（6）番鸭呼肠孤病毒σA蛋白对干扰素信号通路的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 番鸭呼肠孤病毒的研究进展 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 基因组及其编码蛋白 |
| 1.4 σA蛋白的研究进展 |
| 2 干扰素介导的天然免疫 |
| 2.1 干扰素的研究进展 |
| 2.2 干扰素介导的天然免疫 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 番鸭呼肠孤病毒σA蛋白对干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒株、质粒和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 番鸭呼肠孤病毒的扩增 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 质粒瞬时转染细胞系 |
| 1.2.4 细胞分组与处理 |
| 1.2.5 Real-time PCR检测干扰素信号通路相关基因mRNA的相对表达水平 |
| 1.2.6 ELISA检测干扰素信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 1.2.7 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 σA蛋白对病毒诱导的干扰素表达的影响 |
| 2.2 σA蛋白对病毒诱导的干扰素信号通路相关基因的mRNA表达的影响 |
| 2.2.1 总RNA质量检测 |
| 2.2.2 Real-time PCR扩增效率检测 |
| 2.2.3 干扰素信号通路相关基因mRNA水平的检测 |
| 2.3 σA蛋白对poly(I: C)激活的干扰素信号通路相关基因mRNA表达水平的影响 |
| 2.4 σA蛋白对poly(I: C)激活的干扰素信号通路相关因子的蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 番鸭呼肠孤病毒σA蛋白定点突变对干扰素信号通路的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒(菌)株、载体和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 σA定点突变及鉴定 |
| 1.2.3 σA突变体在不同的细胞中表达 |
| 1.2.4 Real-time PCR法检测干扰素信号通路相关基因mRNA的表达水平 |
| 1.2.5 ELISA检测干扰素信号通路相关因子的蛋白表达水平 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pCI-flag-σA 155 Ala突变载体的构建结果 |
| 2.1.1 pCI-flag-σA 155 Ala与pCI-flag-σA 273 Ala突变载体的构建结果 |
| 2.1.2 pCI-flag-σA 155,273 Ala双突变载体的构建结果 |
| 2.3 突变σA蛋白的Western-blot分析 |
| 2.4 σA突变体对poly(I: C)激活干扰素通路相关基因表达的影响 |
| 2.4.1 σA突变体对poly(I: C)激活的干扰素信号通路相关基因的mRNA表达的影响 |
| 2.4.2 σA突变体对poly(I:C)激活的干扰素信号通路相关因子的蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 科研情况 |
| 致谢 |
（7）鸭源呼肠孤病毒的表型和分子特征分析及基因2型毒株编码的新蛋白的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸭呼肠孤病毒病概述 |
| 1.2 鹅呼肠孤病毒病概述 |
| 1.3 呼肠孤病毒的分类 |
| 1.4 水禽源呼肠孤病毒的基因组结构研究进展 |
| 1.5 鸭源呼肠孤病毒的生物学特性 |
| 1.6 核定位信号的研究进展 |
| 1.7 融合相关小跨膜蛋白 |
| 1.8 多顺反子的特殊翻译方式-渗漏扫描 |
| 1.9 研究目的和意义 |
| 第二章 三类鸭源呼肠孤病毒的表型特征比较 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 鸭源呼肠孤病毒的基因组结构研究和遗传演化分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 DRV S1基因节段 ORF2 编码蛋白的鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 DRV S1基因节段转录方式及ORF1编码蛋白的鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.3 方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）番鸭呼肠孤病毒强弱毒株S基因分子特征分析及感染性克隆载体构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 番鸭呼肠孤病毒病概况 |
| 1.1 病原分类地位 |
| 1.2 病毒理化生物学特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 诊断 |
| 1.7 防治 |
| 2 MDRV分子生物学研究进展 |
| 2.1 基因组特征 |
| 2.2 蛋白质组成 |
| 2.3 禽源呼肠孤病毒的复制 |
| 3 RNA病毒感染性克隆操作研究进展 |
| 3.1 RNA病毒感染性克隆构建的发展历程 |
| 3.2 RNA病毒感染性克隆构建的基础 |
| 3.3 反向遗传学的应用 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 MDRV强弱毒株S组基因cDNA分子克隆构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒(菌)株及载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒增殖与浓缩 |
| 2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.3 病毒S组基因引物设计及合成 |
| 2.4 病毒S组基因RT-PCR扩增 |
| 2.5 PCR产物的纯化 |
| 2.6 纯化产物与载体的连接、转化 |
| 2.7 重组质粒的抽提 |
| 2.8 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.9 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 2.10 目的基因的测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RT-PCR结果 |
| 3.2 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒双酶切鉴定结果 |
| 3.4 重组质粒测序结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 MDRV强弱毒株S组基因分子特征分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 核苷酸序列同源性分析 |
| 3.1.1 5'非编码(5'UTR)分析 |
| 3.1.2 编码框(ORF)分析 |
| 3.1.3 3'非编码(3'UTR)分析 |
| 3.2 氨基酸序列同源性分析 |
| 3.2.1 σA蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.2 σB蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.3 σNS蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.4 p10蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.5 σC蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3 蛋白理化性质分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 MDRV强弱毒株S组基因感染性克隆载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 质粒的提取 |
| 2.3 PCR扩增及产物纯化 |
| 2.4 感染性克隆载体的构建 |
| 2.5 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.6 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.7 目的基因的测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒测序结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五部分 总结 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 基金项目 |
| 发表论文情况 |
（9）番鸭呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的表达及其多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩略词表 |
| 第一章 综述及研究目的与意义 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 研究概况 |
| 1.2 MDRV的分类地位 |
| 1.3 MDRV的病原学特征 |
| 1.4 MDRV流行病学 |
| 1.5 MDRV的基因组特征及其编码蛋白 |
| 1.6 MDRV的检测及防治 |
| 1.7 蛋白表达系统简介 |
| 2 本研究的目的与意义 |
| 第二章 MDRV σNS蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒(菌)株、载体及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 MDRV-YB σNS基因的扩增 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.4 MDRV-YB σNS基因的序列分析 |
| 1.2.5 重组质粒在E.coli BL21 (DE3)中的诱导表达 |
| 1.2.6 p-σNS蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.7 p-σNS蛋白诱导表达条件的优化 |
| 1.2.8 重组蛋白的纯化及浓度测定 |
| 1.2.9 p-σNS的Western-blot分析 |
| 1.2.10 兔多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MDRV-YB σNS基因的RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 重组表达载体的鉴定结果 |
| 2.3 测序结果及序列分析 |
| 2.3.1 核苷酸序列分析结果 |
| 2.3.2 蛋白序列分析结果 |
| 2.4 p-σNS蛋白的SDS-PAGE分析结果 |
| 2.5 p-σNS蛋白诱导表达条件的优化结果 |
| 2.5.1 IPTG最佳诱导时间的优化 |
| 2.5.2 IPTG最佳诱导浓度的优化 |
| 2.5.3 IPTG最佳诱导温度的优化 |
| 2.5.4 IPTG诱导可溶性表达的优化 |
| 2.6 p-σNS蛋白的纯化结果 |
| 2.6.1 包涵体的纯化 |
| 2.6.2 可溶性蛋白的Ni~(2+)柱纯化 |
| 2.7 p-σNS蛋白的Western-blot鉴定结果 |
| 2.8 兔多克隆抗血清效价的检测结果 |
| 2.9 兔多克隆抗体的Western-blot鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 MDRV σNS基因真核表达载体的构建及其在DF-1细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒,载体和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 MDRV-YB σNS基因的扩增 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.4 DF-1细胞的复苏与传代培养 |
| 1.2.5 pCI-flag-σNS瞬时转染DF-1细胞 |
| 1.2.6 MDRV-YB σNS mRNA水平的检测 |
| 1.2.7 e-σNS蛋白的Western-blot分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MDRV-YB σNS基因的扩增结果 |
| 2.2 真核重组表达质粒pCI-flag-σNS的鉴定 |
| 2.3 MDRV-YB σNS mRNA水平的检测结果 |
| 2.4 e-σNS蛋白的Western-blot分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 科研情况 |
（10）禽呼肠孤病毒S2、S4基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 1 引言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒概述 |
| 1.1.1 历史 |
| 1.1.2 分类 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 病原形态与特征 |
| 1.2.2 病毒的化学组成 |
| 1.2.3 禽呼肠孤病毒基因组 |
| 1.2.4 禽呼肠孤病毒基因组编码蛋白及其功能 |
| 1.2.5 抗原性 |
| 1.2.6 抵抗力 |
| 1.2.7 培养特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.3.1 易感动物 |
| 1.3.2 传染源 |
| 1.3.3 传播途径 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 诊断 |
| 1.6.1 临床诊断 |
| 1.6.2 病理剖检 |
| 1.6.3 实验室诊断 |
| 1.7 防治 |
| 1.8 疫苗 |
| 1.9 研究意义 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 禽呼肠孤病毒毒株 |
| 2.1.2 参考基因序列及登录号 |
| 2.1.3 克隆菌株与载体 |
| 2.1.4 生物试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 实验所用溶液及配制 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 禽呼肠孤病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 ARV S2、S4基因一步法RT-PCR扩增 |
| 2.2.4 PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 目的基因与质粒载体的连接转化 |
| 2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 质粒DNA的测序 |
| 2.2.9 基因序列的拼接 |
| 2.2.10 基因序列的比较分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒目的基因一步法RT-PCR扩增结果 |
| 3.1.1 ARV S2基因的一步法RT-PCR扩增结果 |
| 3.1.2 ARV S4基因的一步法RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 3.2.1 ARV S2基因的重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 3.2.2 ARV S4基因的重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 3.3 基因序列测定结果 |
| 3.3.1 ARV S2基因序列测定结果 |
| 3.3.2 ARV S4基因序列测定结果 |
| 3.4 序列比较分析 |
| 3.4.1 ARV S2序列比较分析 |
| 3.4.2 ARV S4序列比较分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析（论文参考文献）
- [1]鸡源呼肠孤病毒变异株的分离鉴定及感染性克隆的构建[D]. 姚忠慧. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]死胚和弱雏中新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定[D]. 刘臻臻. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用[D]. 田昂. 山东农业大学, 2021
- [4]新型鸭呼肠孤病毒SY株分离鉴定及p18蛋白单克隆抗体的制备[D]. 晁锦. 安徽农业大学, 2020(03)
- [5]禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析[D]. 王茹. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]番鸭呼肠孤病毒σA蛋白对干扰素信号通路的调控研究[D]. 郑玲红. 福建农林大学, 2017(01)
- [7]鸭源呼肠孤病毒的表型和分子特征分析及基因2型毒株编码的新蛋白的鉴定[D]. 王丹. 中国农业大学, 2016(08)
- [8]番鸭呼肠孤病毒强弱毒株S基因分子特征分析及感染性克隆载体构建[D]. 崔国杰. 福建农林大学, 2015(01)
- [9]番鸭呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的表达及其多克隆抗体的制备[D]. 朱二鹏. 福建农林大学, 2015(01)
- [10]禽呼肠孤病毒S2、S4基因的克隆与序列分析[D]. 何建文. 内蒙古农业大学, 2012(08)