一、凝血酶分离纯化方法的研究进展（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中提出近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
谢倩[2]（2021）在《基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析》文中认为胰岛素样生长因子-1（Insulin like growth factor 1,IGF-1）是人体内一种多功能的稳态调控因子,具有促进机体生长发育、合成代谢等功能,在人体内发挥着重要的作用;IGF-1作为治疗原发性IGF-1缺乏综合征的唯一药物,我国的需求程度极高,在国外已有IGF-1相关的蛋白药物上市,而我国仍依赖于进口,给患者造成了极大的经济负担,从而导致生长发育迟缓的患者无法得到有效的治疗,因此开发进口替代药物具有十分重要的意义。本研究通过计算机模拟技术预测带有不同酶切位点的IGF-1融合蛋白结构来进行其与相应蛋白酶的分子对接,筛选出蛋白酶最适配的IGF-1融合蛋白,利用基因工程技术构建并鉴定了IGF-1融合蛋白原核表达载体,将重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Origami B（DE3）,氨苄青霉素抗性筛选重组子,异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,菌体破菌上清经亲和层析、脱盐、凝血酶酶切及酶切产物亲和层析得到目的蛋白,通过3T3细胞增殖法建立活性评价体系并对获得的IGF-1活性进行测定。结果显示在大肠杆菌Origami B（DE3）表达菌株中,0.05 mM IPTG,25℃下诱导16 h,融合蛋白为可溶性表达;在酶切缓冲液为20 mM Tris-HCl+0.15 M NaCl+10 mM CaCl2+1 mM二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol,DTT）,25℃、摇床酶切16 h,可实现1 U凝血酶切割100μg融合蛋白;通过酶切前后两次亲和层析可获得纯度大于90%的目的蛋白;利用3T3细胞增殖法建立了IGF-1体外活性评价体系,该体系检测条件为铺板细胞密度1×104/mL,初始、铺板及维持培养基血清浓度分别为4%、2%与1%,IGF-1样品初始浓度1000 ng/mL,3倍梯度稀释,在该活性评价体系下测得制备的IGF-1比活为2.47×105 U/mg,与市售标准品接近。本课题的研究可为IGF-1药物工业化生产提供实验依据。
张轩[3]（2021）在《产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用》文中认为枯草芽孢杆菌广泛存在于传统发酵食品内,可产生多种对人体有益的生物活性物质。枯草芽孢杆菌发酵的纳豆因其富含具有抗血栓功能的纳豆激酶（Nattokinase）,作为一种风味食品受到部分消费者的青睐。枯草芽孢杆菌液体发酵生产的纳豆激酶也已被用于抗血栓功能食品或药品的制备。另外,也有报道,口服枯草芽孢杆菌可调节机体肠道菌群和免疫功能,发挥抗炎、抗肿瘤以及延缓衰老等作用。目前,纳豆激酶口服产品的剂型单一,且耐胃酸和肠道缓释能力较差;枯草芽孢杆菌益生菌制剂主要为冻干菌粉,食用人群局限。上述产品的局限性,限制了其应用范围。本研究针对上述产品的不足,利用筛选的同时产生纳豆激酶和凝乳酶的枯草芽孢杆菌菌株,研制了一种新型的枯草芽孢杆菌功能发酵乳和一种纳豆激酶口服缓释制剂,对其制备工艺和相关功能进行了系统研究。主要研究内容和结果如下:首先,用从自然界采集的稻草作为发酵菌种的来源制作纳豆,从自制纳豆浸出液中分离、筛选出产双酶（纤维蛋白溶解酶和凝乳酶）的菌株。通过对菌株形态观察和生化特性检测,结合16S rDNA基因序列测定结果,确定此菌株为枯草芽孢杆菌,命名为B.subtilis JNFE0126。在优化后的培养条件下,该菌株产纳豆激酶活性最高达14512.4IU/mL,产凝乳酶活性最高达875.5 SU/mL,可以满足中性条件下制备凝固型发酵乳的要求。酶抑制剂试验结果表明,发酵液纤溶活性来源于丝氨酸蛋白酶,凝乳活性来源于金属蛋白酶。提取该菌株的DNA,根据基因库中已经报道的纳豆激酶和凝乳酶（金属蛋白酶M4）的基因序列设计引物进行PCR基因调取扩增后测序,结果表明该菌株具有上述两种酶的基因,其序列分别与已经报道的纳豆激酶和金属蛋白酶M4具有高度相似性（同源性分别为99.1%和97.6%）。其次,分别收集B.subtilis JNFE0126纳豆激酶和凝乳酶最高产酶期的发酵液,采用硫酸铵沉淀、离子交换色谱及凝胶过滤色谱分别对纳豆激酶和凝乳酶进行分离纯化,然后用SDS-PAGE检验样品纯度及测定其相对分子质量。结果表明,纯化的纳豆激酶和凝乳酶的相对分子质量分别为27 KD和42 KD左右。纳豆激酶最适温度为40℃,最适pH为7.0,pH 6.0-9.0条件下具有较高的酶活和较好的稳定性。凝乳酶的最适作用温度为55℃,最适pH值为6.5,在pH 6.0-8.0条件下具有较高的酶活,在pH 5-10条件下有较好的的稳定性。在此基础上,研究并优化了B.subtilis JNFE0126发酵鲜牛乳制作凝固型发酵乳的配方和发酵条件,评价了所得产品的品质特性和抗血栓功能。优化的配方和发酵条件为:鲜牛乳,大豆蛋白2%,蔗糖4%,羟丙基二淀粉磷酸酯1.5%,果胶0.1%,藻酸丙二醇酯（PGA）0.1%,发酵温度41℃,发酵时间8 h。得到发酵乳为软嫩的乳白色凝乳块,奶香浓郁,口感爽滑,无明显不良风味。扫描电镜观察表明,凝乳块内部呈现海绵状微观结构,酪蛋白胶束及亚胶束相互交联形成整体的三维结构,胶束间仍然存在大量微细孔隙,这些孔隙起着保持水分的作用。发酵乳的纤溶活性达215.1 U/mL,4℃储藏14天酶活性可保留66%,储藏60天活性仍保留43%;小鼠黑尾试验表明,口服该发酵乳具有显着的体内抗血栓效果。应用Dextran sulfate sodium salt（DSS）诱导性炎症性肠病动物模型评价了上述发酵乳对肠道菌群的调节作用和对炎症性肠病的防治效果,并探讨了其作用机制和实际应用前景。动物疾病症状观察和肠道组织病理分析结果表明,口服B.subtilis JNFE0126发酵乳可明显减轻DSS诱导性炎症性肠病动物的疾病严重程度,减轻动物的肠道粘膜的出血、炎症和溃疡等病理损伤;动物肠道菌群的检测分析和和肠粘膜内炎症相关因子和上皮再生相关蛋白表达水平的测定结果表明,口服B.subtilis JNFE0126菌株发酵乳可调节动物的肠道菌群,增加菌群的多样性,抑制有害菌生长;该发酵乳可抑制肠道粘膜内炎症因子表达水平,提高炎症抑制因子表达水平,因而减轻肠粘膜的炎症性损伤。与此同时,B.subtilis JNFE0126发酵乳可促进肠粘膜上皮干细胞的增殖分化,促进粘膜细胞的粘液蛋白和上皮连接蛋白的表达,加速肠粘膜屏障和上皮屏障的修复,从而抵御有害菌和炎症因子的侵入。最后,研制了一种具有双层壳-核结构（壳聚糖核-纳豆激酶-酪蛋白）的纳豆激酶口服缓释颗粒,并通过动物试验评价其在体内抗血栓作用。采用壳聚糖为核心,京尼平为壳聚糖核-纳豆激酶交联剂,牛乳酪蛋白为颗粒外层保护材料,TG酶为保护层的交联剂,按照分步交联的程序制备纳豆激酶缓释颗粒。用扫描电子显微镜对获得的缓释颗粒进行形态学分析,并使用纳米金交联的IgG作为模型药物验证了酪蛋白保护层的包埋效果,确定其形成了双层壳-核结构。通过体外模拟胃、肠液消化试验测定了该缓释颗粒的释放动力学特征,结果表明该颗粒在胃酸中能有效保护纳豆激酶活性,并在肠液中缓释达12小时。最终对该缓释颗粒进行动物口服试验,动态观察颗粒内纳豆激酶的体内缓释过程及其抗血栓效果。结果表明,上述纳豆激酶口服缓释颗粒具有很强的抗胃酸能力,并在肠道内可缓慢释放出纳豆激酶及其不同大小相对分子质量的具有纤维蛋白溶解活性的降解产物,缓释过程超过12小时。小鼠黑尾模型动物口服该颗粒,可明显抑制小鼠尾部血管内的血栓形成并促进血栓溶解,效果显着优于口服游离纳豆激酶。综上所述,本研究利用筛选的B.subtilis JNFE0126制备的发酵乳具有抗血栓和调节肠道功能的作用,有良好的应用前景。本研究开发的纳豆激酶口服缓释颗粒具有耐胃酸能力和肠道缓释功能,可提高纳豆激酶的口服利用度,有望作为功能食品添加剂用于研制抗血栓功能食品。
魏馨瑶[4]（2021）在《三七花蛋白的提取纯化、功能性质及其抗凝血活性研究》文中研究表明三七花作为药食两用,既有多种药理活性又有食用价值,已广泛引起了研究人员的关注。目前,关于三七花的研究主要集中于皂苷类成分及其生物活性研究,而对于三七花中蛋白质的组成、功能性质研究甚少。因此,本论文以三七花为原料,采用Osborne法提取不同种类的蛋白质;采用单因素实验对三七花清蛋白、球蛋白提取条件优化;应用超滤、离子交换层析及凝胶过滤层析对三七花清、球蛋白进行分离纯化;采用SDS-PAGE电泳和LC-MS/MS分析对其结构进行鉴定。采用傅里叶红外光谱（FTIR）等对三七花清、球蛋白的理化性质和功能性质进行了测定,并初步探讨了三七花不同种类蛋白的抗凝血活性,为三七花在食品产业中的应用提供理论基础。主要内容及结论如下:1.三七不同部位的蛋白含量分析三七不同部位主根、茎叶及花中粗蛋白含量分别为4.81%、11.18%、18.47%,其中三七花的蛋白含量最高。三七花蛋白中清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白含量依次为6.47%、3.04%、0.88%、1.46%,其中清、球蛋白含量较高。因此,以三七花中清、球蛋白含量为指标,进行三七花蛋白提取工艺研究。2.三七花清、球蛋白的提取工艺研究采用单因素实验得出三七花清蛋白提取的最优条件为:料液比1:40、提取温度30℃、提取时间90min,提取率为39.02%,纯度为87.41%。三七花球蛋白提取的最优条件为:液料比1:30、提取温度40℃、提取时间90min,提取率为4.61%,纯度为68.44%。3.三七花中清、球蛋白的分离、纯化及鉴定三七花清蛋白经DEAE离子交换层析分离纯化得到3个组分A1、A2、A3,并用SDS-PAGE检测组分分子量,分别在33k Da、37k Da、90k Da左右。采用Sephadex G-50凝胶层析对组分A1进一步纯化后,得到三七花蛋白PNFA-1,分子量在37k Da。三七花球蛋白经DEAE离子交换层析分离纯化得到2个组分B1、B2,并用SDS-PAGE检测B1、B2的分子量,分别在65k Da、37k Da左右。采用Sephadex G-50凝胶层析对洗脱峰B2进一步纯化后,得到三七花蛋白PNFA-2,分子量在65k Da。采用LC-MS/MS对三七花蛋白PNFA-1和PNFA-2进行分析,分别得到95个和61个肽段。4.三七花清、球蛋白的理化性质研究三七花清、球蛋白的等电点分别为3.8和4.7。三七花清、球蛋白的二级结构主要为β-折叠,其比例分别为51.2%和47.4%。三七花清、球蛋白的总疏基含量分别为9.83?mo L/g和9.34?mo L/g,其中游离疏基分别为5.91?mo L/g和7.62?mo L/g,二硫键分别为3.92?mo L/g和1.72?mo L/g。三七花清、球蛋白的表面疏水性分别为699.83±20.6和1613.9±19.8。三七花清、球蛋白的氨基酸总量分别为93.43 mg/g和155.423 mg/g,其中必需氨基酸含量分别为20.89 mg/g和51.82 mg/g。不同干燥方式对三七花清、球蛋白的理化性质均具有一定影响。冷冻干燥和热风80℃干燥处理的三七花清、球蛋白游离巯基含量略大,说明处理过程中具有二硫键的断裂与重排。在冷冻干燥下,三七花清、球蛋白表面疏水性最高,而在热风80℃干燥下,蛋白表面疏水性变小。进一步对三七花蛋白二级结构进行分析,发现随着温度增加,三七花清、球蛋白β-折叠结构含量显着增加。以上结果说明,三七花蛋白受热变性,破坏分子间氢键,引起蛋白结构显着变化。5.三七花清、球蛋白的功能性质研究三七花清、球蛋白的持水性分别为4.827g/g和3.795g/g,清蛋白较球蛋白溶于水的能力和吸水性更强。三七花清、球蛋白的起泡性分别为12.12%和6.25%,清蛋白的起泡能力强于球蛋白。三七花中清蛋白的乳化能力强于球蛋白,而球蛋白的乳化稳定性更好。不同干燥方式对三七花清、球蛋白的功能性质均具有一定影响。随着干燥温度的增加,三七花清、球蛋白的溶解度、乳化性及起泡性降低,而乳化稳定性和浊度增加。6.三七花不同种类蛋白的抗凝血活性研究三七不同部位主根、茎叶、花的粗蛋白均具有抗凝血作用,其中三七花粗蛋白的抗凝效果最显着。在浓度为10mg/m L时,三七花清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白可显着延长PT、TT及APTT时间,其中球蛋白抗凝血作用最好。
刘秉宜,王庆鹏,王正平,张瑞岩,韩军[5]（2021）在《蛇毒中生物活性酶的研究进展》文中提出蛇毒是一类包含蛋白质、多肽和金属离子等成份的混合物。蛇毒中的多种生物活性酶决定了其功能的多样性,例如凝血、溶栓、止痛和抗肿瘤作用等。然而,由于蛇粗毒免疫原性强和副作用多等缺点,其临床应用受到了一定的限制。随着新技术和分离纯化方法的发展,越来越多蛇毒产品的新功能被开发出来。针对蛇毒成分的分离纯化技术和分析鉴定方法,对研究较多的蛇毒中存在的活性酶及其生物学功能进行了总结,尤其阐述了蛇毒纤溶酶的种类及其在溶栓作用方面的机制,旨在对蛇毒中生物活性酶药用功能的技术开发进行全面和深入的了解。
卞春[6]（2020）在《黑木耳抗凝血多糖分离与结构表征及对血栓形成抑制机制》文中研究表明机体内存在着复杂而完善的止血、凝血、抗凝血和溶纤系统以及精细的平衡调控机制,正常的生理情况下,血液在血管中流动既不会出血也不会凝固形成血栓。静态工作劳动强度增加、作息时间不规律、吸烟和饮食不合理等不良生活习惯,以及极冷的生活环境等都会增加机体内血液的非正常凝固的风险。血液的非正常凝固是诱发机体心脑血管疾病的主因,而世界卫生组织（WHO）预测在近十几年内心脑血管类疾病将是引起人类死亡最高的疾病。目前市场上几种主流的抗凝血药物有各自的弊病,如给药方式的局限、溶血等严重的副作用,因此开发一种天然的、低毒副作用且抗凝效果适当的药物,可以从治疗以及治疗后维护两个方面,降低心血管疾病的发生和反复。本研究以东北地区野生的黑木耳（Auricularia auricula）为研究对象,采用碱溶醇沉超声辅助的方法从黑木耳中提取天然多糖,利用响应面设计法优化黑木耳多糖的提取工艺,并采用正交实验方法优化了黑木耳粗多糖的脱蛋白工艺;通过体外抗凝血活性的跟踪,采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）配合二乙胺基乙基纤维素（DEAE）离子交换层析和凝胶层析筛选出体外抗凝血活性最强的黑木耳多糖组分aAAPⅠ-b2,对其进行结构表征。此外,本课题通过建立小鼠血栓模型,系统地研究了黑木耳多糖的体内抗凝血、抑制血栓功能及其对血栓形成的抑制机制。采用Box-Behnken响应面优化法确定黑木耳多糖的最佳提取参数条件为:提取温度为70℃,提取时间25 min,液料比为100 m L/g,超声功率225 W,多糖得率为14.07±0.21 mg/g。通过正交实验确定Papain-Sevag脱蛋白的最佳条件为:粗多糖溶液在酶解温度55℃、酶解时间2.5 h和酶用量0.2%的条件下进行木瓜蛋白酶的辅助降解;酶解液与Sevag试剂按照体积比为3:1,试剂中氯仿和正丁醇体积比为4:1,上下振摇15 min,操作重复3次,蛋白去除率81.43%,多糖保留率80.23%。通过CTAB沉淀,配合DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、BRT105-104-102 Series HPGPC和Superdex-200琼脂糖-葡聚糖凝胶层析,分离纯化出体外抗凝血活性最强的组分aAAPⅠ-b2,分子量为9772Da,是由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和木糖组成,摩尔比为89.25:30.5:4.25:1的一种酸性杂多糖。通过FT-IR扫描、部分酸水解、高碘酸氧化和Smith降解、甲基化、GC-MS以及NMR等实验方法和手段确定aAAPⅠ-b2的分子结构其主链为α-D-Manp-（1→3）-α-D-Manp-（1→2,3）-α-D-Manp-（1→4）-β-D-Glc Ap-（1→,Man的2位C上连接侧链→4）-β-D-Glcp-(1→。以角叉菜胶诱导方式制造小鼠尾部血栓模型,以阿司匹林为阳性对照,通过活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原（FIB）四个实验,确定aAAPⅠ-b2在小鼠体内也具有较强的抑制内源、外源和共同性凝血途径的功能。通过对各组小鼠黑尾抑制率、出血时间、凝血时间和尾部血栓H.E.染色等的比较,也表明aAAPⅠ-b2有明显的体内抗凝血活性以及抑制血栓形成作用。在此基础上,对各组小鼠血液中血小板表面受体前列环素（PGI2）、血栓素B2（TXB2）、一氧化氮氧化酶（e NOs）和内皮素-1（ET-1）的表达水平做了进一步的研究,确定aAAPⅠ-b2可以通过抑制血小板激活的途径抑制血栓的形成;同样,通过对各组小鼠肝脏组织的抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）和蛋白C（PC）的比较,发现,aAAPⅠ-b2亦可通过提高AT-Ⅲ活性以及PC表达水平的方式,抑制凝血酶以及因子Ⅴ和Ⅷ的活性,即通过抗凝血途径抑制血栓的形成。aAAPⅠ-b2不能通过提高纤维酶原（PLG）含量的方式提高潜在的纤溶活性,从而达到抑制血栓形成的作用,但是其可以显着提高高分子量激肽原（HMWK）的表达,提高由因子Ⅻ的激活而起始的溶纤作用。本课题研究发现黑木耳多糖在体外和体内都表现出较强的抗凝血活性,并发其主要通过抑制血小板活性和抗凝血途径实现抑制血栓形成。本研究为抗凝血、抗血栓的天然多糖的开发和利用提供一定的理论基础,也对进一步的相关保健食品和药品的开发提供新思路。
吴娅丽[7]（2020）在《基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究》文中认为研究背景:血栓性疾病是人类死亡的主要原因之一,临床常用具抗血小板、抗凝和溶栓等作用的药物对其进行治疗,但多数药物伴随出血副作用;中医认为血栓疾病与血瘀证密切相关,通常使用活血化瘀类药物治疗血瘀证,其中动物药（如水蛭、地龙等）为中医活血化瘀的常用药;地龙及含地龙的成方制剂作为抗凝剂和纤溶药物已应用了几个世纪,且被认为无出血副作用;口服蚓激酶制剂在许多国家用于保护心血管,且在我国已作为二类新药上市。中药动物药的研究一直是个难题,威廉环毛蚓作为《中国药典》:收录地龙品种,其抗血栓关键物质基础、作用靶点及机制均尚不明确,故缺乏科学依据指导其临床应用,因此,研究威廉环毛蚓的抗血栓物质基础及作用机制有重大意义。由于地龙的抗血栓成分主要为蛋白质,本研究借助转录组学-蛋白组学相结合的模式,阐释威廉环毛蚓的抗血栓物质基础,并初步探究其作用机制。研究目的:基于多组学模式鉴定威廉环毛蚓中所含蛋白质,通过分离纯化初步定位其抗血栓活性部位并鉴定分析该部位蛋白质成分的序列、结构和性质;利用动物模型评价该部位预防血栓形成的作用、溶栓作用及血管保护作用;通过分子对接和体外模型探讨其抗血栓作用靶点和机制,及血管保护作用机制;借助蛋白组学技术从整体分析其抗血栓及血管保护作用涉及的生物过程及信号通路。研究方法与研究结果:研究一威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析采用基于Illumina高通量测序平台的无参考基因RNA测序技术构建威廉环毛蚓的无参考基因转录组,进而构建其蛋白序列库,为后续研究提供支持。通过测序,共得到超过2000万的clean reads,其中高质量reads超过97%;Trinity拼接后,得到超过10万个转录本和unigenes;翻译所拼接的转录组数据,构建威廉环毛蚓蛋白序列库。ESTScan软件共预测11259个编码序列,可作为引物设计数据库使用。通过与公共数据库比对,共注释 38.21%的 unigenes。研究二威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究采用转录组学-蛋白组学-活性研究整合关联分析方法,以“研究一”所构建的蛋白序列库为数据库,鉴定威廉环毛蚓总提物的蛋白质成分;建立纤维蛋白原-凝血酶时间法（Fib-TT）用于抗凝血活性的体外评价,并基于该方法考察总提物在不同孵育体系中的抗凝活性变化,进而评价其抗血栓性质;研究总提物在不同体系中的蛋白质谱图变化,推测其抗血栓活性成分。从威廉环毛蚓总提物中鉴定到31种蛋白质成分;所建立的Fib-TT 法线性范围较宽,仪器精密度、重复性均良好,可用于威廉环毛蚓抗凝活性的体外评价;总提物的抗凝活性在近中性条件下较为稳定,在30-50℃下活性稳定;通过考察总提物经不同体系孵育后蛋白质图谱的变化,推测其抗血栓活性成分为分子量在26kDa附近的蛋白质。研究三威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定通过“研究二”发现威廉环毛蚓总提物具有较强的抗血栓活性,本实验基于Fib-TT法,采用离子交换色谱分离纯化威廉环毛蚓的抗血栓活性成分,命名为DPf3,采用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS确定其分子量;通过转录组学-蛋白组学整合研究方式,鉴定DPf3主要成分DPf3 ID NO.1和DPf3 ID NO.2的蛋白质种类;采用从头测序技术确定DPf3主要成分的蛋白质序列,圆二色谱考察其二级结构,I-TASSER预测其三级结构,SAVES评价预测模型;并通过溶血实验考察DPf3的血液相容性。研究发现DPf3的主要成分DPf3 IDNO.1和NO.2的分子量分别为36121.745 Da和24485.004 Da,分别含有329和241个氨基酸;de novo测序获得二者的蛋白质全序列,通过与所构建的本地蛋白序列库比对,分别为>Ac44553g1i11和>Dc43026gli12,序列覆盖度达100%;DPf3的二级结构包含α-螺旋（19%）,β-折叠（30%）和无规则卷曲（51%）;DPf3的浓度低于4.21 mg·mL-1时具有较好的血液相容性。研究四DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究采用普纳替尼致血管损伤型斑马鱼血栓模型考察DPf3预防血栓形成的作用、溶栓作用和血管保护作用。发现DPf3（4.2-12.5 ng/尾）具较强的预防血栓形成的作用,其预防能力较阿司匹林（45 μg·mL-1）无显着差异。同时,DPf3（4.2ng/尾）具明显的溶栓作用,其溶栓能力较尿激酶（5ng/尾）无显着性差异。此外,DPf3具较强的血管保护作用。研究五DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究通过分子对接和体外实验相结合的方式考察DPf3的抗血栓作用及作用机制。首先采用分子对接评价DPf ID NO.1和NO.2与纤维蛋白（原）、纤溶酶原、凝血酶间的相互作用;继而通过酶谱法、光散射法、形态学研究、纤维蛋白平板法、体外血栓法及凝血四项评价研究DPf3的抗血栓活性及机制。通过分子对接发现DPf3 ID NO.1和NO.2对纤维蛋白（原）、纤溶酶原均有直接作用,体外实验发现DPf3对纤溶酶原作用很弱,对纤维蛋白（原）及体外血栓均有很强的水解作用;与生成的纤维蛋白栓块相比,纤维蛋白原可能是DPf3的初始作用靶点,且DPf3对纤维蛋白原的作用更强;通过凝血四项评价,发现DPf3能显着延长APTT、降低Fib的含量,且具有延长TT的作用趋势。研究六DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究选取HUVECs为研究对象,以（hi）ox-LDL为造模剂,通过研究经DPf3保护前后,损伤性HUVECs的细胞活力、细胞膜完整性、细胞内ROS水平、细胞迁移能力、粘附因子VCAM 1的表达及单核细胞的粘附、血管生成等的变化,来探讨DPf3的血管保护作用机制。研究发现,DPf3对血管具显着保护作用,DPf3能够提高损伤性HUVECs的细胞活力、保护其细胞膜的完整性,降低细胞内ROS的生成;降低粘附因子VCAM I的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;削弱损伤性细胞的迁移能力,并抑制其新生血管的生成。研究七基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响采用蛋白组学技术从整体水平研究DPf3抗血栓和血管保护作用所涉及的生物标志物、生物过程和信号通路。通过血栓模型组与正常对照组对比,共鉴定得到1149个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有582个和567个;通过DPf3给药组和模型组对比,共鉴定出66个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有46个和20个,具有显着回调作用的蛋白有23个。通过对差异蛋白标志物所涉及的生物过程和信号通路进行归纳与分析,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护活性的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。研究结论:本研究以“转录组学-蛋白组学”多组学结合的模式为基础,初步构建中药地龙威廉环毛蚓的本地蛋白序列库,通过分离纯化得到其抗血栓活性成分（DPf3）,对DPf3进行鉴定及机制研究。研究发现威廉环毛蚓总提物具良好的抗血栓活性,从中鉴定到31个蛋白质成分,其中分离所得DPf3具良好的预防血栓、溶栓及血管保护作用,且具较好的血液相容性,为威廉环毛蚓抗血栓的物质基础。DPf3的抗血栓机制为:（1）具有很强的纤维蛋白和纤维蛋白原水解活性,且能够激活纤溶酶原形成纤溶酶;（2）具有较强的直接溶栓作用;（3）通过影响内源性或/和共同凝血途径及第三种凝血途径产生抗血栓作用。DPf3对血管内皮的保护作用机制为:（1）提高损伤性血管内皮细胞的细胞活力,保护细胞膜的完整性,降低损伤性细胞内ROS的生成;（2）降低粘附因子VCAM 1的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;（3）削弱损伤性细胞的迁移能力,从而降低炎症细胞的扩散;（4）抑制新生血管的生成,进而抑制血管新生内膜的形成。通过蛋白组学技术从整体水平研究,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护作用的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。综上,本研究基本证实了中药地龙威廉环毛蚓的抗血栓关键物质基础,明确其作用靶点并初步确定其作用机制,为威廉环毛蚓的临床使用提供科学依据,为进一步研究其抗血栓活性成分的分子机制提供基础和依据,并为中药动物药的研究提供思路和方法。
张庆[8]（2020）在《核桃多肽抗凝血酶活性研究及应用》文中研究指明薄皮核桃经榨油后的副产物并没有得到充分利用,其核桃蛋白粕大多数被丢弃或者作为肥料从而造成了一定的资源浪费。相较于许多动物源活性物质,天然来源的植物源活性物质具有较高的营养价值与更好的安全性,具备潜在的运用前景。本文以四川薄皮核桃为原料,酶解得到多肽,进一步分离纯化研究其抗凝血酶活性,并将所得的高抗凝血酶多肽应用于产品中。主要结果如下:（1）以水解度和多肽含量为指标,酶解薄皮核桃粕,通过单因素试验,Box-Behnken中心结合分析找出最优酶解条件,其得到最优值时的工艺为:加酶量为2%、酶解p H=7、酶解时间4 h、酶解温度50℃。在此条件下提取的核桃多肽提取含量为2.55 mg/m L。（2）采用大孔吸附树脂脱盐法对核桃多肽液进行脱盐,超滤管对制备的薄皮核桃多肽粗品进行超滤分级,将其按照分子量范围分为A1（<3 k Da）,A2（3-10 k Da）,A3（>10 k Da）三个组分,对它们进行抗凝血酶活性与体外抗氧化活性测定,结果表明A1（<3 k Da）组分活性最强。将A1（<3 k Da）组分进一步通过Sephadex G-25凝胶纯化,得到A、B、C三组分。并且随着浓度增加,从1 mg/m L开始,A组分对于体外抗氧化活性与抗凝血酶活性明显大于B、C组分。实验表明核桃多肽的分子量越低,其抗氧化活性与抗凝血酶活性就越强。（3）将分离出来三组分中高抗凝血酶核桃多肽（也就是A组分）进行氨基酸分析,结果显示其含有的氨基酸种类及含量十分丰富,在这些氨基酸中,谷氨酸最多,其次为精氨酸和天门冬氨基酸,含量分别为17.9 g/100g、10.97 g/100g、8.44 g/100g。LC-MS-MS平行三次测定抗凝血酶核桃多肽,质谱分析Basepeak图谱出峰峰形清晰明确,结合核桃蛋白质库分析,得到34种多肽肽段,筛选出肽段得分高于20分的16条肽段进行下一步有效分析。对比GO库,得到16条肽段的主要来源蛋白质及其功能,并进行分析,发现其具有不同的结构与功能,并且也参加细胞中不同生理活动。（4）通过单因素试验,结合Box-Behnken中心组合分析,得出核桃多肽营养液复配最优工艺为:木糖醇使用量为9%、料液比为5%,核桃香精加入量为0.08%,柠檬酸加入量为0.12%,料液比为5%。在上述条件下,感官得分为89.42。在115℃、0.1Mpa条件下灭菌15min得到成品,检测其各项指标,均符合国家标准。此结果为高抗凝血酶活性多肽的工业化生产提供一定的理论依据。
王山立[9]（2020）在《高粱根抗凝血活性物质基础研究》文中指出高粱根为禾本科高粱属草本植物高粱（Sorghom vulgare Pers.）的根,其也是一味传统中草药,在治疗脑积水、骨科疾病、抗疲劳等方面有显着作用。本课题组前期研究发现高粱根醇提正丁醇萃取部位（BES）和水提醇沉上清液部位（WEAE）具有明显的扩张血小管和抗凝血作用。本文在前期研究基础上,进一步对高粱根活性提取物化学成分进行较为全面的分析,并结合活性追踪的方法对抗凝血作用的物质基础进行了研究,主要结果如下:1、各流分及提取物进行体外抗血小板聚集活性研究。实验结果为:WEAE、BES-MS流分、BES-M30%流分、WEAE-M30%流分、WEAE-D60%流分对ADP诱导的血小板聚集有显着抑制作用。WEAE-M30%流分在受试浓度范围内具有显着抑制胶原蛋白诱导血小板聚集作用,聚集抑制率较阳性对照组高。同样,中剂量组BES-M30%流分、高剂量BES-MS流分也具有显着抑制胶原蛋白诱导血小板聚集作用。采用凝血酶诱导血小板聚集时,低、中、高剂量组WEAE-M30%流分和BES-M30%流分都具有显着抑制血小板聚集活性,且高剂量组的WEAE也表现出显着抑制血小板聚集作用。2、采用HPLC检测WEAE-M30%与BES-M30%流分,比较分析高粱根中的化学成分。色谱条件为:进样量10μL;色谱柱Accurasil C18（250 mm×4.6 mm）;波长230 nm;温度35℃;流速1 m L/min;流动相（A）甲醇,（B）0.2%磷酸水溶液,梯度洗脱:时间0-5 min A:5%-7%,B:95%-93%;5-10 min A:7%-10%,B:93%-90%;10-15 min A:10%-15%,B:90%-85%;15-40 min A:15%-18%,B:85%-82%;40-45 min A:18%-20%,B:82%-80%;45-55 min A:20%-25%,B:80%-75%。从图谱分析可知,两洗脱流分化学成分差异较大,并且前者中的化学成分种类较多。3、利用LC/MS对血小板聚集有显着抑制活性部位（WEAE-M30%和BES-M30%）进行化学成分分析,主要包括黄酮苷类、酚酸类化合物,并且这两类物质含量均较多,据此推测,高粱根中抗凝药效物质为是黄酮苷类、酚酸类化合物。4、运用色谱技术,如硅胶柱色谱、MCI凝胶柱色谱和制备型HPLC等,从高粱根提取物中分离纯化得到12个化合物,并通过NMR和MS等波谱.技术鉴定它们的结构分别为:4-[（6’-O-β-D-吡喃葡萄糖）氧基]羟基苯乙酸环二聚内酯（1）、β-谷甾醇（2）、豆甾醇（3）、胡萝卜苷（4）、对甲氧基肉桂酸（5）、紫杉氰糖苷（6）、绿原酸（7）、对羟基苯甲醛（8）、琥珀酸（9）、反式对羟基肉桂酸（10）、obtusalin（11）、甘露醇（12）化合物。化合物4、5、9、10、11和12等6个化合物为首次从高粱根中分离获得,其中化合物1为新化合物,命名为Sorgholide A,该化合物是以对羟基苯乙酸酯葡萄糖苷反向聚合形成的拥有24环的二聚双内酯酚苷。5、利用血小板聚集仪检测5个单体化合物（Sorgholide A、紫杉氰糖苷、琥珀酸、反式对羟基肉桂酸、obtusalin）对体外血小板聚集影响,以二磷酸腺苷（ADP）、胶原蛋白以及凝血酶作为诱导剂。实验结果为:化合物Sorgholide A和紫杉氰糖苷对ADP、胶原蛋白及凝血酶诱导的血小板聚集均有抑制作用;反式对羟基肉桂酸对ADP诱导的血小板聚集有显着抑制活性;琥珀酸对ADP和凝血酶诱导的血小板聚集有显着抑制作用。
杜振兴[10]（2020）在《南海几种常见贝类肝素的提取分离、结构表征及抗血栓活性研究》文中研究说明肝素是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等交替组成的一种酸性粘多糖,具有较高含量的硫酸基,是已知负电荷密度最高的生物大分子,具有良好的抗凝血作用,是临床使用最广泛的抗凝血剂,近年来有研究还发现肝素具有降血脂、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抑制细菌黏附等作用,是重要的粘多糖类生化药物之一。目前,肝素主要以猪小肠黏膜、牛肺等组织为原料,经过提取分离得到,然而以家畜内脏为原料提取肝素存在污染高和安全质量风险等问题。此外,该来源肝素因抗凝作用过强,用药过程中容易出现出血效应等副作用,这限制了肝素非抗凝血活性的开发利用。从海洋生物中寻找提取肝素新的替代原材料越来越受到关注。前人研究已发现,一些海洋生物源肝素具有与传统肝素类似的药理活性,但抗凝血作用相对缓和,能够有效降低其用药出现的出血副作用。我们的前期研究发现一些海洋贝类富含酸性粘多糖。本研究从南海常见8种贝类中提取肝素,并比较其抗凝血活性,筛选出肝素效价较高的原料,对其结构进行解析,并评价其出血效应和抗血栓活性,以期为海洋生物源肝素的开发利用以及抗血栓活性多糖的研究提供参考。本课题主要研究内容及结果如下:（1）8种贝类肝素粗品的提取及抗凝血活性比较以南海常见8种贝类（海蚌、泥蚶、蛏子、文蛤、钝缀锦蛤、海湾扇贝、象拔蚌、菲律宾蛤蜊）为原料,采用双酶酶解、乙醇醇沉以及Sevag脱蛋白等方法制备肝素粗品,并对其理化性质和抗凝血活性进行比较分析。最终筛选出海蚌肝素和文蛤肝素为最优实验对象,其中肝素含量分别为239.2μg/mg和214.8μg/mg,硫酸基含量分别为6.2%和7.7%。两种贝类肝素主要含有Glc N、Glc A、Ido A和Glc等单糖,并且符合肝素的紫外和红外吸收特征,其抗凝血作用约为传统肝素的1/2。（2）海蚌、文蛤肝素的分离纯化及理化性质利用离子交换法和乙醇醇沉法对海蚌肝素和文蛤肝素进行分离纯化,并且对其理化性质进行分析,通过紫外光谱扫描分析其纯度,以及通过醋酸纤维电泳实验对其进行糖胺聚糖种类鉴定。结果表明,海蚌肝素和文蛤肝素经不同浓度Na Cl梯度洗脱分别获得三个组分（G1、G2、G2和M1、M2、M3）。其中,G2和M2为最优组分,其电泳迁移率与肝素最接近,提取率分别为1.17 mg/g和0.53 mg/g,肝素含量分别为88.1%和61.4%,效价分别为149.6 U/mg和122 U/mg,达到了商品化肝素的程度。（3）海蚌、文蛤肝素的结构表征采用高效液相凝胶色谱法测定G2和M2的分子量和纯度,采用刚果红实验分析其三股螺旋结构,利用同步热分析仪分析其结构热稳定性,采用红外光谱、单糖组成、二糖组成和核磁共振分析其糖链结构。结果表明,G2和M2分子量分别为30.99 k Da和22.58k Da,并且G2和M2均不具有三股螺旋结构,且结构热稳定良好。此外,G2和M2的糖链结构与肝素相似。G2主要的二糖重复单元为:→4)-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS3S6S-（1→（12.03%）、→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS6S-（1→（25.81%）、→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS6S-（1→（33.32%）、→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS-（1→（26.53%）、→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS-（1→（9.88%）和少量的→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NAc（1→（1.63%）。G2的四糖结构单元为:→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS3S6S-（1→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS6S（或Glc NAC）-（1→.和→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS6S-（1→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS6S（或Glc NAC）-（1→。M2的二糖重复片段为:→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS6S-（1→（31.19%）、→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NAc（1→（23.21%）、→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS（1→（13.87%）,→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS（1→（8.95%）,→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NAc6S（1→（7.39%）和→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS6S(1→（7.63%）。（4）海蚌、文蛤肝素抗血栓活性通过分析海蚌肝素和文蛤肝素的抗凝血活性和纤溶活性评价抗血栓活性。其中,通过测定凝血三项指标（APTT、PT、TT）分析其抗凝血活性,通过琼脂糖纤维蛋白平板法分析其体外纤溶活性,通过测定t-PA、u-PA和PAI-1分析其体内纤溶活性,通过小鼠断尾实验评价其出血效应。结果表明,G2和M2均具有良好的抗凝血活性,其中G2主要通过外源凝血途径、内源凝血途径和阻止纤维蛋白的形成而发挥抗凝血作用;M2主要通过外源凝血途径和内源凝血途径发挥抗凝血作用。此外,琼脂糖纤维蛋白平板法测得G2和M2的纤溶活性分别为1.96±0.11 U/mg和1.41±0.10 U/mg。G2能通过促进t-PA和u-PA的释放,同时抑制PAI-1的释放,从而发挥体内纤溶活性;M2通过促进t-PA和u-PA的释放而发挥纤溶活性。M2的纤溶能力与传统肝素相近,而在6～12mg/kg剂量范围内,G15的体内纤溶活性是传统肝素的2.2～3.8倍。此外,小鼠断尾实验表明G2和M2的出血副作用低于传统肝素,强度降低为传统肝素的1/3～1/2。
二、凝血酶分离纯化方法的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凝血酶分离纯化方法的研究进展（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.1.1 胰岛素样生长因子-1的研究进展 |
| 1.1.2 胰岛素样生长因子-1国内外生产现状 |
| 1.2 小结 |
| 1.3 本研究的主要内容、目标与方法 |
| 1.3.1 主要研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 1.3.3 技术路线 |
| 第2 章 融合蛋白与相应蛋白酶的虚拟筛选 |
| 2.1 预测服务器 |
| 2.2 预测方法 |
| 2.2.1 融合蛋白氨基酸序列的获取 |
| 2.2.2 融合蛋白二级结构预测 |
| 2.2.3 融合蛋白三级结构预测 |
| 2.2.4 融合蛋白与蛋白酶分子对接 |
| 2.3 预测结果 |
| 2.3.1 融合蛋白结构预测结果 |
| 2.3.2 融合蛋白与蛋白酶分子对接结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3 章 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的载体构建 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 菌株、质粒 |
| 3.1.2 工具酶 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胰岛素样生长因子-1原核表达载体的构建及重组子的筛选 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 3.3.2 抽提质粒结果 |
| 3.3.3 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.3.4 双酶切鉴定结果 |
| 3.3.5 胰岛素样生长因子-1序列测定及比对结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4 章 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的诱导表达及优化 |
| 4.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的诱导表达 |
| 4.2.2 融合蛋白的Western Blot鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 表达菌株对蛋白表达的影响 |
| 4.3.2 诱导温度对蛋白表达的影响 |
| 4.3.3 诱导时间对蛋白表达的影响 |
| 4.3.4 IPTG浓度对蛋白表达的影响 |
| 4.3.5 融合蛋白的Western Blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第5 章 胰岛素样生长因子-1的分离纯化及酶切优化 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 融合蛋白的分离纯化及酶切优化 |
| 5.2.2 反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯度鉴定 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 融合蛋白亲和层析结果 |
| 5.3.2 酶量及酶切方式对酶切结果的影响 |
| 5.3.3 温度及Ca~(2+)浓度对酶切结果的影响 |
| 5.3.4 酶切时间对酶切结果的影响 |
| 5.3.5 DTT对酶切结果的影响 |
| 5.3.6 酶切产物亲和层析结果 |
| 5.3.7 RP-HPLC纯度鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第6 章 利用3T3细胞检测胰岛素样生长因子-1的活性 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 培养液的配制 |
| 6.2.2 3T3细胞的冻存 |
| 6.2.3 3T3细胞的复苏 |
| 6.2.4 胰岛素样生长因子-1活性测定方法的建立 |
| 6.2.5 融合蛋白及胰岛素样生长因子-1样品活性检测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 铺板细胞密度优化结果 |
| 6.3.2 胰岛素样生长因子-1作用时间优化结果 |
| 6.3.3 铺板及维持培养血清优化结果 |
| 6.3.4 初始培养血清优化结果 |
| 6.3.5 胰岛素样生长因子-1初始浓度及稀释倍数结果 |
| 6.3.6 胰岛素样生长因子-1样品及融合蛋白活性检测结果 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果 |
（3）产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 简写对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 枯草芽孢杆菌简介 |
| 1.2 纳豆激酶的研究进展 |
| 1.2.1 纳豆激酶的酶学性质 |
| 1.2.2 纳豆激酶的功能及其应用前景 |
| 1.2.3 纳豆激酶与其它溶栓药物的比较及其溶栓优势 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌凝乳酶的研究进展 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌在发酵食品及益生菌制剂中的应用 |
| 1.5 枯草芽孢杆菌对肠道菌群的调节作用和在医药保健领域的应用 |
| 1.5.1 肠道菌群及肠道菌群失调相关疾病 |
| 1.5.2 炎症性肠病的发病机制及治疗方法的研究进展 |
| 1.6 立题背景和研究意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌菌株的分离、筛选及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 主要试剂与材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基配方 |
| 2.3.2 纤维蛋白溶解酶纤溶活力测定方法 |
| 2.3.3 凝乳酶活力测定方法 |
| 2.3.4 产纳豆激酶和凝乳酶双酶菌株的筛选及鉴定 |
| 2.3.5 产双酶菌株菌株的鉴定 |
| 2.3.6 B.subtilis JNFE0126 菌株的生长特征检测 |
| 2.3.7 B.subtilis JNFE0126 株菌发酵液凝乳酶和纤溶酶活性的动态检测 |
| 2.3.8 B.subtilis JNFE0126 菌株产双酶能力的遗传稳定性测定 |
| 2.3.9 B.subtilis JNFE0126 菌株保藏 |
| 2.3.10 酶抑制剂抑制试验分析纤溶酶和凝乳酶的类型 |
| 2.3.11 B.subtilis JNFE0126 菌株的两种酶基因的PCR扩增和测序 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 产双酶(纳豆激酶和凝乳酶)菌株的筛选 |
| 2.4.2 B.subtilis nk1 菌株的鉴定 |
| 2.4.3 B.subtilis JNFE0126 菌株的生长和产酶特性 |
| 2.4.4 蛋白酶抑制剂实验分析纤溶酶和凝乳酶类型 |
| 2.4.5 B.subtilisJNFE0126 的纳豆激酶和M4 金属蛋白酶基因PCR扩增和测序结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 枯草芽孢杆菌产发酵液中纳豆激酶和凝乳酶的分离纯化及酶学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 主要试剂与材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基 |
| 3.3.2 B.subtilis JNFE0126 菌株的活化 |
| 3.3.3 纳豆激酶、凝乳酶粗酶液的制备 |
| 3.3.4 蛋白质浓度的测定—Bradford检测法 |
| 3.3.5 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.3.6 凝乳酶的分离纯化 |
| 3.3.7 纳豆激酶的酶学性质研究 |
| 3.3.8 凝乳酶的酶学性质研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.4.2 凝乳酶的分离纯化 |
| 3.4.3 纯化酶的SDS-PAGE电泳检测结果 |
| 3.4.4 纳豆激酶的酶学性质 |
| 3.4.5 凝乳酶的酶学性质研究 |
| 3.4.6 纯化凝乳酶的凝乳效果及其潜在应用价值 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌发酵乳的研制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 主要试剂与材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 发酵乳制备方法 |
| 4.3.2 单因素实验和正交试验 |
| 4.3.3 发酵乳理化指标测定 |
| 4.3.4 发酵乳感官评定 |
| 4.3.5 发酵乳储藏过程中的品质变化观察 |
| 4.3.6 发酵乳的微观结构观察 |
| 4.3.7 发酵乳动物体内抗血栓作用 |
| 4.3.8 试验数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 单因素试验优化发酵乳配方和发酵条件 |
| 4.4.2 采用正交试验确定发酵乳最适发酵条件 |
| 4.4.3 正交试验确定稳定剂配方 |
| 4.4.4 发酵过程中菌量、p H和酶活的变化 |
| 4.4.5 发酵乳总蛋白和总糖含量 |
| 4.4.6 发酵乳感官评定结果 |
| 4.4.7 发酵乳的流变学特性 |
| 4.4.8 发酵乳的持水力和质构测定结果 |
| 4.4.9 发酵乳的微观凝胶结构 |
| 4.4.10 发酵乳储藏过程中的品质变化: |
| 4.4.11 小鼠黑尾模型验证发酵乳体内抗血栓效果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 枯草芽孢杆菌发酵乳预防和治疗炎症性肠病 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 主要试剂与材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 枯草芽孢杆菌发酵乳的制备及其CFU计数和革兰氏染色 |
| 5.3.2 DSS诱导性炎症性肠病动物模型的建立和动物分组 |
| 5.3.3 模型小鼠疾病活动指数(DAI)的测定 |
| 5.3.4 小肠和结肠的组织学切片观察和组织学评分 |
| 5.3.5 免疫组织化学染色 |
| 5.3.6 Western blotting检测蛋白表达水平 |
| 5.3.7 肠道菌群分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 枯草芽孢杆菌发酵乳的外观、CFU计数及其Gram’s染色 |
| 5.4.2 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对DSS诱导性炎症性肠病动物DAI的影响 |
| 5.4.3 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对小肠和结肠病理变化的影响 |
| 5.4.4 枯草芽孢杆菌发酵乳对白细胞浸润和炎症因子、抗炎因子表达的影响 |
| 5.4.5 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对Lgr-5,CDX-2,Mucin-2 表达水平的影响 |
| 5.4.6 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对ZO1和Villin表达水平的影响 |
| 5.4.7 口服发酵乳对DSS诱导的IBD模型小鼠肠道菌群的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 纳豆激酶缓释颗粒的研制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和设备 |
| 6.2.1 主要试剂与材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 缓释颗粒原材料的各种反应体系内纳豆激酶纤溶活性测定 |
| 6.3.2 双层壳-核结构的纳豆激酶缓释颗粒的设计和构建 |
| 6.3.3 纳豆激酶缓释颗粒的粒径和zeta电位测定 |
| 6.3.4 装载纳豆激酶和模型药物的缓释颗粒微观结构的显微镜观察 |
| 6.3.5 纳豆激酶缓释颗粒在储藏过程中的纤溶活性的动态测定 |
| 6.3.6 模拟消化液对缓释颗粒纤溶活性的影响 |
| 6.3.7 模拟消化液对缓释颗粒粒径、ζ-电位和表面结构的影响 |
| 6.3.8 荧光标记模拟药物(Ig G)缓释颗粒口服后在小鼠消化道内分布情况分析 |
| 6.3.9 口服纳豆激酶缓释颗粒后小鼠肠道内的活性酶的释放和吸收试验 |
| 6.3.10 口服纳豆激酶缓释颗粒对模型小鼠血栓治疗效果的评价 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 纳豆激酶缓释颗粒的设计与构建 |
| 6.4.2 颗粒双层壳-核结构的鉴定与验证 |
| 6.4.3 纳豆激酶缓释颗粒保藏过程中酶活的变化 |
| 6.4.4 缓释颗粒中纳豆激酶的体外释放特性 |
| 6.4.5 双层壳-核结构缓释颗粒所装载模型药物口服后在体内的释放 |
| 6.4.6 口服纳豆激酶缓释颗粒对黑尾模型小鼠的血栓治疗效果 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（4）三七花蛋白的提取纯化、功能性质及其抗凝血活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 三七花的研究进展 |
| 1.1.1 三七花的营养成分研究 |
| 1.1.2 三七花的化学成分研究 |
| 1.1.3 三七花的药理活性研究 |
| 1.2 植物蛋白的研究与应用 |
| 1.2.1 植物蛋白的种类 |
| 1.2.2 植物蛋白的提取方法 |
| 1.2.3 植物蛋白的纯化方法 |
| 1.2.4 植物蛋白的功能性质研究 |
| 1.2.5 植物蛋白的生物活性研究 |
| 1.3 三七蛋白的研究进展 |
| 1.4 立题背景及意义 |
| 1.5 本课题研究内容及技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 创新性 |
| 1.5.3 研究技术路线 |
| 第二章 三七花分级蛋白的提取工艺研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 三七不同部位粗蛋白的提取 |
| 2.3.2 三七花分级蛋白的提取工艺 |
| 2.3.3 料液比、时间、温度对三七花清蛋白提取工艺的影响 |
| 2.3.4 料液比、时间、温度、盐浓度对三七花球蛋白提取工艺的影响 |
| 2.3.5 数据分析 |
| 2.4 实验结果及分析 |
| 2.4.1 三七不同部位的蛋白含量分析 |
| 2.4.2 不同单因素对三七花清蛋白提取工艺的影响 |
| 2.4.3 不同单因素对三七花球蛋白提取工艺的影响 |
| 2.4.4 三七花分级蛋白的最优提取工艺确定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 三七花分级蛋白的分离纯化及鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 三七花清、球蛋白分离纯化 |
| 3.3.2 三七花清、球蛋白的鉴定 |
| 3.4 实验结果及分析 |
| 3.4.1 三七花清、球蛋白的分离纯化 |
| 3.4.2 三七花清、球蛋白的鉴定 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 三七花分级蛋白的理化性质研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 三七花清、球蛋白等电点的测定 |
| 4.3.2 三七花清、球蛋白巯基含量的测定 |
| 4.3.3 三七花清、球蛋白表面疏水性的测定 |
| 4.3.4 三七花清、球蛋白氨基酸组成的测定 |
| 4.3.5 三七花清、球蛋白傅里叶变换红外光谱扫描的测定 |
| 4.3.6 不同干燥方式对三七花清、球蛋白理化性质的影响 |
| 4.3.7 数据分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 三七花清、球蛋白等电点结果分析 |
| 4.4.2 三七花清、球蛋白巯基含量结果分析 |
| 4.4.3 三七花清、球蛋白表面疏水性结果分析 |
| 4.4.4 三七花清、球蛋白氨基酸组成结果分析 |
| 4.4.5 三七花清、球蛋白红外光谱的结果分析 |
| 4.4.6 不同干燥方式对三七花清、球蛋白的理化性质影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 三七花分级蛋白的功能性质研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂与材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 三七花清、球蛋白溶解性的测定 |
| 5.3.2 三七花清、球蛋白持水性及持油性的测定 |
| 5.3.3 三七花清、球蛋白乳化性的测定 |
| 5.3.4 三七花清、球蛋白起泡性的测定 |
| 5.3.5 不同干燥方式对三七花清、球蛋白功能性质的影响 |
| 5.3.6 数据分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 三七花清、球蛋白的溶解性结果分析 |
| 5.4.2 三七花清、球蛋白的持水性及持油性结果分析 |
| 5.4.3 三七花清、球蛋白的乳化性结果分析 |
| 5.4.4 三七花清、球蛋白的起泡性结果分析 |
| 5.4.5 不同干燥方式对三七花清、球蛋白的功能性质影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 三七花蛋白的抗凝血活性研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验试剂与材料 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 三七不同部位蛋白的体外抗凝血活性研究 |
| 6.3.2 数据分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 三七不同部位粗蛋白的抗凝血活性 |
| 6.4.2 三七不同部位分级蛋白的抗凝血活性 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 硕士期间发表论文目录 |
（5）蛇毒中生物活性酶的研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 蛇毒生物活性酶的分离纯化方法 |
| 2 蛇毒生物活性酶的分析鉴定方法 |
| 3 蛇毒中生物活性成分的分类及功能 |
| 3.1 蛇毒蛋白酶的凝血功能 |
| 3.2 蛇毒蛋白酶的抗栓溶栓功能 |
| 3.3 蛇毒蛋白的降血压功能 |
| 3.4 蛇毒神经毒素的止痛功能 |
| 3.4.1 突触前神经毒素。 |
| 3.4.2 突触后神经毒素。 |
| 3.5 蛇毒蛋白细胞毒素的功能 |
| 3.6 蛇毒蛋白抗肿瘤的功能 |
| 4 已上市的蛇毒类药物及存在的问题 |
| 5 结论和展望 |
（6）黑木耳抗凝血多糖分离与结构表征及对血栓形成抑制机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究目的和意义 |
| 1.2 抗凝血与抑制血栓机制的研究进展 |
| 1.2.1 凝血与抗凝血的研究进展 |
| 1.2.2 体内抑制血栓形成的途径 |
| 1.2.3 多糖抗凝血机制的研究进展 |
| 1.3 多糖的研究进展 |
| 1.3.1 多糖的提取 |
| 1.3.2 多糖的分离 |
| 1.3.3 多糖提取物的除杂 |
| 1.3.4 多糖的纯化 |
| 1.3.5 多糖的结构表征 |
| 1.4 黑木耳多糖生理功能研究进展 |
| 1.4.1 黑木耳多糖的抗氧化活性 |
| 1.4.2 黑木耳多糖的降血脂和胆固醇活性 |
| 1.4.3 黑木耳多糖的抗肿瘤和抗癌活性 |
| 1.4.4 黑木耳多糖消炎抗菌活性 |
| 1.4.5 黑木耳多糖对辐射诱导的防护作用 |
| 1.4.6 黑木耳多糖抗凝血活性 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验试剂及药品 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 黑木耳抗凝血多糖的制备 |
| 2.2.1 原材料预处理 |
| 2.2.2 黑木耳抗凝血多糖提取工艺优化 |
| 2.2.3 黑木耳抗凝血多糖Papain-Sevag脱蛋白工艺的优化 |
| 2.3 黑木耳抗凝血多糖的纯化 |
| 2.3.1 CTAB沉淀黑木耳酸性多糖 |
| 2.3.2 DEAE Sepharose Fast Flow分离纯化黑木耳抗凝血多糖 |
| 2.3.3 Superdex-200 凝胶层析纯化黑木耳抗凝血多糖 |
| 2.4 黑木耳多糖抗凝血活性跟踪 |
| 2.5 黑木耳抗凝血多糖的结构表征 |
| 2.5.1 相对分子质量及纯度分析 |
| 2.5.2 单糖组成分析 |
| 2.5.3 傅立叶红外光谱分析 |
| 2.5.4 β-消去反应 |
| 2.5.5 部分酸水解分析 |
| 2.5.6 高碘酸氧化和Smith降解 |
| 2.5.7 甲基化分析 |
| 2.5.8 核磁共振分析 |
| 2.6 黑木耳抗凝血多糖的形貌特征 |
| 2.6.1 原子力显微镜分析 |
| 2.6.2 刚果红实验 |
| 2.7 黑木耳多糖体内抗凝血活性分析 |
| 2.7.1 小鼠血栓模型的建立 |
| 2.7.2 小鼠血常规指标的检测 |
| 2.7.3 小鼠尾部血栓相对长度和血栓抑制率实验 |
| 2.7.4 小鼠尾出血时间实验 |
| 2.7.5 小鼠尾部血栓苏木精-伊红染色实验 |
| 2.8 aAAPⅠ-b2 小鼠体内抗血栓途径的研究 |
| 2.8.1 aAAPⅠ-b2 抑制血小板活化途径 |
| 2.8.2 aAAPⅠ-b2 抗凝血活性途径 |
| 2.8.3 aAAPⅠ-b2 促进纤溶活性途径 |
| 2.9 数据统计与分析 |
| 第3章 黑木耳抗凝血多糖筛选及分离纯化工艺参数优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 黑木耳多糖的提取工艺优化 |
| 3.2.1 单因素条件的确定 |
| 3.2.2 响应面法优化黑木耳多糖提取工艺 |
| 3.3 Papain-Sevag联合脱蛋白 |
| 3.3.1 Sevag脱蛋白 |
| 3.3.2 Papain-Sevag法脱蛋白 |
| 3.3.3 脱蛋白处理对黑木耳多糖抗凝血活性的影响 |
| 3.4 黑木耳抗凝血多糖的分离纯化 |
| 3.4.1 黑木耳酸性多糖的CTAB沉淀 |
| 3.4.2 黑木耳酸性多糖的DEAE离子交换层析分级 |
| 3.5 黑木耳多糖组分的体外抗凝血活性分析 |
| 3.5.1 FIB含量分析 |
| 3.5.2 APTT凝血时间分析 |
| 3.5.3 PT凝血时间分析 |
| 3.5.4 TT凝血时间分析 |
| 3.6 黑木耳抗凝血多糖aAAPⅠ-b的纯化 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 黑木耳抗凝血多糖aAAPⅠ-b2 的结构表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 aAAPⅠ-b2 的形貌特征 |
| 4.2.1 aAAPⅠ-b2 的原子力显微镜分析 |
| 4.2.2 aAAPⅠ-b2 的刚果红实验分析 |
| 4.3 aAAPⅠ-b2 分子量及单糖组成 |
| 4.3.1 aAAPⅠ-b2 的纯度及分子量 |
| 4.3.2 aAAPⅠ-b2 的成分及单糖组成分析 |
| 4.4 aAAPⅠ-b2 的结构解析 |
| 4.4.1 aAAPⅠ-b2 的官能团分析 |
| 4.4.2 aAAPⅠ-b2 糖肽键的分析 |
| 4.4.3 aAAPⅠ-b2 的部分酸水解 |
| 4.4.4 aAAPⅠ-b2 的高碘酸氧化和Smith降解 |
| 4.4.5 aAAPⅠ-b2 的甲基化分析 |
| 4.4.6 aAAPⅠ-b2 的核磁共振分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 aAAPⅠ-b2 对角叉菜胶诱导小鼠血栓的抑制作用及抑制途径 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 aAAPⅠ-b2 对小鼠体质的影响 |
| 5.2.1 aAAPⅠ-b2 对小鼠体重的影响 |
| 5.2.2 aAAPⅠ-b2 对小鼠血常规的影响 |
| 5.3 aAAPⅠ-b2 对小鼠血栓的抑制作用 |
| 5.3.1 aAAPⅠ-b2 对小鼠黑尾抑制率的影响 |
| 5.3.2 aAAPⅠ-b2 对小鼠出血时间的影响 |
| 5.3.3 aAAPⅠ-b2 对小鼠凝血时间的影响 |
| 5.3.4 aAAPⅠ-b2 对小鼠尾部血栓的影响 |
| 5.4 aAAPⅠ-b2 抑制小鼠血栓途径研究 |
| 5.4.1 aAAPⅠ-b2 对抑制血小板活性的影响 |
| 5.4.2 aAAPⅠ-b2 对抗凝血活性的影响 |
| 5.4.3 aAAPⅠ-b2 对促纤溶酶系统活性的影响 |
| 5.5 aAAPⅠ-b2 的抑制血栓形成机制 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 血栓的研究进展概述 |
| 1 概述 |
| 2 血栓的形成过程 |
| 3 血栓性疾病的临床治疗用药 |
| 4 血栓性疾病研究模型的构建 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药地龙抗血栓活性成分研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 地龙抗血栓活性物质 |
| 3 地龙抗血栓活性蛋白的研究 |
| 4 作用机制与毒副作用 |
| 5 临床应用 |
| 6 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 RNA提取、测序及转录本拼接 |
| 3 基因序列分析 |
| 4 基因功能注释和表达水平分析 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓总提物的鉴定 |
| 3 威廉环毛蚓总提物的蛋白含量测定及抗血栓活性体外评价 |
| 4 威廉环毛蚓总提物的抗血栓性质研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓抗血栓活性成分的分离纯化 |
| 3 抗血栓活性成分(DPf3)的鉴定 |
| 4 DPf3 ID NO.1和N0.2的结构预测及模型评价 |
| 5 DPf3的血液相容性评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 普纳替尼诱导斑马鱼血栓模型的建立及DPf3最大检测剂量的确定 |
| 3 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓形成的预防作用评价 |
| 4 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓的治疗作用评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 DPf3 ID NO.1和N0.2的分子对接研究 |
| 3 DPf3的纤维蛋白(原)水解活性评价 |
| 4 DPf3的纤溶酶原激活作用研究 |
| 5 DPf3血栓溶解活性的体外研究 |
| 6 DPf3对凝血四项影响的体外研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 HUVECs细胞培养方法的建立及DPf3对细胞活力/毒性的影响 |
| 3 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs的保护作用研究 |
| 4 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs活性氧产生的影响 |
| 5 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs粘附作用的影响 |
| 6 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs迁移能力和血管生成的影响 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 斑马鱼样本的质量控制及评估 |
| 3 普纳替尼所致血管损伤型血栓形成的蛋白标志物分析 |
| 4 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型影响的蛋白质组学研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）核桃多肽抗凝血酶活性研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 核桃概述 |
| 1.1.1 核桃 |
| 1.1.2 核桃营养成分 |
| 1.2 多肽及其活性肽简介 |
| 1.2.1 抗氧化肽 |
| 1.2.2 抗菌肽 |
| 1.2.3 降血压肽 |
| 1.3 抗凝血酶多肽的研究 |
| 1.3.1 抗凝血酶多肽的概念 |
| 1.3.2 血栓形成机理 |
| 1.3.3 测定抗凝血酶活性 |
| 1.3.4 国内外抗凝血酶活性肽研究进展 |
| 1.4 本课题研究的目的、意义和内容 |
| 1.4.1 本课题研究的目的、意义 |
| 1.4.2 本课题研究的内容 |
| 2 核桃蛋白制备核桃多肽及工艺优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 核桃蛋白的制备工艺 |
| 2.3.2 核桃蛋白酶解液制备及预处理 |
| 2.3.3 水解度的测定 |
| 2.3.4 多肽含量的测定 |
| 2.3.5 单因素试验设计 |
| 2.3.6 响应面优化酶解工艺 |
| 2.3.7 数据处理 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 预处理测定结果 |
| 2.4.2 酶法提取核桃多肽含量单因素试验结果 |
| 2.4.3 响应面优化核桃多肽工艺 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 3 核桃多肽的分离纯化及活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验试剂及仪器 |
| 3.2.1 试验试剂 |
| 3.2.2 试验设备与仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 大孔吸附树脂法处理 |
| 3.3.2 超滤 |
| 3.3.3 葡聚糖凝胶色谱法 |
| 3.3.4 抗凝血酶活性测定 |
| 3.3.5 总抗氧化活性测定 |
| 3.4 高活性多肽氨基酸含量及序列测定 |
| 3.4.1 氨基酸分析 |
| 3.4.2 肽段分析 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 葡聚糖凝胶色谱分析 |
| 3.5.2 体外抗氧化活性分析 |
| 3.5.3 抗凝血酶活性 |
| 3.5.4 核桃多肽游离氨基酸含量测定及序列分析 |
| 3.5.5 核桃多肽肽段分析 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 4 核桃多肽营养液制备及分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验试剂及仪器 |
| 4.2.1 试验试剂 |
| 4.2.2 试验仪器及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 单因素试验设计 |
| 4.3.2 感官评价标准 |
| 4.3.3 响应面优化感官试验 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 单因素试验结果 |
| 4.4.2 响应面优化感官试验的结果 |
| 4.5 装瓶、杀菌 |
| 4.6 指标测定 |
| 4.6.1 试验测定指标 |
| 4.6.2 测定结果 |
| 4.7 小结与讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及科研成果 |
| 致谢 |
（9）高粱根抗凝血活性物质基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 血栓性疾病的药物治疗研究进展 |
| 1.2 血小板参与血栓形成的过程 |
| 1.3 中药在抗血小板聚集中的应用 |
| 1.3.1 影响血小板内含颗粒释放信号物 |
| 1.3.2 增加血小板内环磷酸鸟苷(c GMP)和环磷酸腺苷(c AMP)含量 |
| 1.3.3 影响血小板膜受体(GP)活性药物 |
| 1.3.4 抑制花生四烯酸活性 |
| 1.4 高粱化学成分 |
| 1.4.1 高粱籽实、秸秆和根中的多酚类化合物 |
| 1.4.2 植物甾醇 |
| 1.4.3 高粱籽实营养成分 |
| 1.4.4 高粱籽实中的高粱红色素 |
| 1.4.5 高粱的籽实、秸秆、根中的单宁 |
| 1.5 高粱药理活性 |
| 1.5.1 抗氧化活性 |
| 1.5.2 抗心血管疾病 |
| 1.5.3 高粱籽实抗肿瘤 |
| 1.5.4 止咳、祛痰、扩张气管作用 |
| 1.5.5 高粱根抗凝血作用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 1.7 本文主要研究内容 |
| 第二章 高粱根活性部位不同分段流分的抗凝血活性筛选 |
| 2.1 仪器与材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 高梁根活性部位样品的制备 |
| 2.2.2 高粱根活性部位的分段 |
| 2.2.3 各流分抗凝血活性筛选 |
| 2.2.4 各流分对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的影响 |
| 2.2.5 各流分对胶原蛋白诱导的血小板聚集的影响 |
| 2.2.6 各流分对凝血酶诱导的血小板聚集影响 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 高粱根各流分对ADP诱导血小板聚集影响 |
| 2.3.2 高粱根不同浓度各流分对胶原蛋白诱导血小板聚集影响 |
| 2.3.3 高粱根不同浓度各流分对凝血酶诱导血小板聚集影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 HPLC比较高粱根抗凝活性流分化学成分 |
| 3.1 仪器与材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 供试品溶液配置 |
| 3.2.2 色谱条件条件的优化 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 波长的筛选结果 |
| 3.3.2 柱温和进样量的考察结果 |
| 3.3.3 色谱柱考察结果 |
| 3.3.4 流动相考察结果 |
| 3.3.5 WEAE-M30%和BES-M30%中化学成分分析结果 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 高粱根抗凝血活性流分化学成分LC-MS定性分析 |
| 4.1 仪器与材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 溶液的配置 |
| 4.2.2 色谱条件优化 |
| 4.2.3 仪器条件 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 WEAE-M30%流分中的主要化学成分 |
| 4.3.2 BES-M30%流分中的主要化学成分 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 高梁根抗凝血活性流分化学成分研究 |
| 5.1 实验仪器与材料 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 实验材料与试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 分离纯化 |
| 5.2.2 分离流程图 |
| 5.2.3 化合物抗凝血活性筛选 |
| 5.2.4 样品溶液的制备 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 结构鉴定 |
| 5.3.2 化合物对凝血酶诱导血小板聚集影响 |
| 5.3.3 化合物对胶原蛋诱导血小板聚集影响结果 |
| 5.3.4 化合物对二磷酸腺苷(ADP)诱导血小板聚集影响结果 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 总结 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 实验不足之处 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
（10）南海几种常见贝类肝素的提取分离、结构表征及抗血栓活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 海洋生物源肝素概述 |
| 1.1.1 海洋生物源肝素的提取 |
| 1.1.2 海洋生物源肝素的分离纯化 |
| 1.1.3 海洋生物源肝素分析测定方法 |
| 1.1.4 海洋生物源肝素的生物活性 |
| 1.2 海洋贝类资源概述 |
| 1.3 抗血栓概述 |
| 1.3.1 血栓形成因素 |
| 1.3.2 抗血栓作用途径 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 研究内容与技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 研究技术路线 |
| 2 南海8种贝类肝素粗品的提取及抗凝血活性比较 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 贝类肝素粗品的提取 |
| 2.2.2 贝类肝素粗品理化性质分析 |
| 2.2.3 贝类肝素粗品紫外光谱分析 |
| 2.2.4 贝类肝素粗品红外光谱分析 |
| 2.2.5 贝类肝素粗品单糖组成分析 |
| 2.2.6 贝类肝素粗品抗凝血活性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 贝类肝素粗品的理化性质分析 |
| 2.3.2 贝类肝素粗品紫外光谱扫描 |
| 2.3.3 贝类肝素粗品红外光谱分析 |
| 2.3.4 贝类肝素粗品单糖组成分析 |
| 2.3.5 贝类肝素粗品抗凝血活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 海蚌、文蛤肝素的分离纯化及理化性质分析 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 海蚌、文蛤肝素的提取与分离 |
| 3.2.2 海蚌、文蛤肝素的理化性质分析 |
| 3.2.3 海蚌、文蛤肝素的紫外光谱扫描 |
| 3.2.4 海蚌、文蛤肝素的醋酸纤维电泳 |
| 3.2.5 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 海蚌、文蛤肝素分离纯化 |
| 3.3.2 海蚌、文蛤肝素理化性质分析 |
| 3.3.3 海蚌、文蛤肝素紫外光谱扫描 |
| 3.3.4 海蚌、文蛤肝素醋酸纤维电泳 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 海蚌、文蛤肝素的结构表征 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.2 实验仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 海蚌、文蛤肝素的分子量测定 |
| 4.2.2 海蚌、文蛤肝素的三股螺旋构象分析 |
| 4.2.3 海蚌、文蛤肝素的热稳定性分析 |
| 4.2.4 海蚌、文蛤肝素的官能团分析 |
| 4.2.5 海蚌、文蛤肝素的单糖组成分析 |
| 4.2.6 海蚌、文蛤肝素的二糖组成分析 |
| 4.2.7 海蚌、文蛤肝素的核磁光谱分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 海蚌、文蛤肝素的分子量测定 |
| 4.3.2 海蚌、文蛤肝素的刚果红实验分析 |
| 4.3.3 海蚌、文蛤肝素的热稳定性分析 |
| 4.3.4 海蚌、文蛤肝素的官能团分析 |
| 4.3.5 海蚌、文蛤肝素的单糖组成分析 |
| 4.3.6 海蚌、文蛤肝素的二糖组成分析 |
| 4.3.7 海蚌、文蛤肝素的核磁共振分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 海蚌、文蛤肝素的抗血栓活性分析 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.2 实验仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 海蚌、文蛤肝素出血效应分析 |
| 5.2.2 海蚌、文蛤肝素血凝块溶解实验 |
| 5.2.3 海蚌、文蛤肝素抗凝血活性分析 |
| 5.2.4 海蚌、文蛤肝素体外纤溶活性分析 |
| 5.2.5 海蚌、文蛤肝素体内纤溶活性分析 |
| 5.2.6 数据统计与分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 海蚌、文蛤肝素出血效应分析 |
| 5.3.2 海蚌、文蛤肝素血凝块溶解能力分析 |
| 5.3.3. 海蚌、文蛤肝素抗凝血活性分析 |
| 5.3.4 海蚌、文蛤肝素体外纤溶活性分析 |
| 5.3.5 海蚌、文蛤肝素体内纤溶活性分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
四、凝血酶分离纯化方法的研究进展（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析[D]. 谢倩. 江汉大学, 2021(01)
- [3]产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用[D]. 张轩. 江南大学, 2021(01)
- [4]三七花蛋白的提取纯化、功能性质及其抗凝血活性研究[D]. 魏馨瑶. 昆明理工大学, 2021
- [5]蛇毒中生物活性酶的研究进展[J]. 刘秉宜,王庆鹏,王正平,张瑞岩,韩军. 聊城大学学报(自然科学版), 2021(02)
- [6]黑木耳抗凝血多糖分离与结构表征及对血栓形成抑制机制[D]. 卞春. 哈尔滨工业大学, 2020(02)
- [7]基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究[D]. 吴娅丽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]核桃多肽抗凝血酶活性研究及应用[D]. 张庆. 西华大学, 2020(12)
- [9]高粱根抗凝血活性物质基础研究[D]. 王山立. 贵州大学, 2020(02)
- [10]南海几种常见贝类肝素的提取分离、结构表征及抗血栓活性研究[D]. 杜振兴. 广东海洋大学, 2020