一、Protective Effectof GSH on PD Model Induced by 6-OHDA In Vitro（论文文献综述）
潘东[1]（2021）在《激活大麻素2型受体对6-OHDA单侧损毁大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用研究》文中认为帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种中老年人常见的、缓慢进展的神经退行性疾病。PD常见运动症状包括运动功能受损,运动缓慢,静止性震颤以及平衡障碍。PD的神经病理学特征是黑质（substantia nigra,SN）区多巴胺（dopamine,DA）能神经元的进行性丢失和纹状体内DA的耗竭。PD的发病机制与年龄老化、环境毒素、氧化应激和神经炎症等因素有关,但到目前为止PD发病过程中,SN区DA能神经元变性死亡的机制仍未明确。近年来,越来越多的证据表明PD患者和PD模型动物的中脑SN区铁含量升高,中脑SN区异常铁聚积会对DA能神经元造成损伤。大麻素2型受体（cannabinoid 2 receptor,CB2受体）在人和啮齿类动物的脑中都有表达。研究表明,激活胶质细胞中的CB2受体可以通过发挥抗炎作用对DA能神经元进行保护。最新研究发现,人和小鼠的SN区有酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）阳性神经元和CB2受体的共定位,但SN区DA能神经元上的CB2受体是否参与PD的发病过程不清。为探讨CB2受体参与PD发病的机制,本实验以6-OHDA单侧损毁的PD模型大鼠为研究对象,应用行为学、免疫荧光、免疫蛋白印迹（Western bolts）、铁染色等方法,观察CB2受体激动剂JWH133对PD模型大鼠的保护作用及可能机制。实验结果如下:1.免疫荧光双染观察到大鼠SN区TH阳性细胞和CB2受体阳性细胞共定位。2.与对照组相比,6-OHDA单侧损毁大鼠7d、14d、21d、28d后,颈部皮下注射盐酸阿扑吗啡（apomorphine,APO）,大鼠出现明显的对侧旋转行为（P<0.001）;与6-OHDA处理组相比,CB2受体激动剂JWH133共处理组,6-OHDA单侧损毁大鼠对侧旋转行为明显改善,28d旋转圈数降低最为显着（P<0.001）。3.与对照组相比,6-OHDA单侧损毁大鼠28d后,损毁侧SN区TH阳性神经元的数量明显降低（P<0.001）;与6-OHDA处理组相比,JWH133共处理组的6-OHDA单侧损毁大鼠损毁侧SN区TH阳性神经元明显增多（P<0.01）。4.与对照组相比,6-OHDA单侧损毁大鼠7d、14d、21d、28d的损毁侧SN区TH蛋白表达水平显着降低（P<0.001）;与6-OHDA处理组相比,JWH133共处理7d、14d、21d、28d的6-OHDA单侧损毁大鼠损毁侧SN区TH蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义;6-OHDA大鼠SN区TH蛋白表达水平随时间明显降低,JWH133共处理组与6-OHDA处理组TH蛋白表达的比值随时间明显升高。5.与对照组相比,6-OHDA单侧损毁大鼠28d损毁侧SN区铁染色阳性细胞数明显增多（P<0.001）;与6-OHDA处理组相比,JWH133共处理28d大鼠损毁侧SN区铁染色阳性细胞数明显减少（P<0.001）。6.与对照组相比,6-OHDA单侧损毁大鼠28d损毁侧SN区铁转出蛋白（ferroportin1,FPN1）蛋白表达水平降低（P<0.05）;与6-OHDA处理组相比,JWH133共处理组大鼠损毁侧SN区FPN1蛋白表达明显升高（P<0.05）。7.与对照组相比,6-OHDA单侧损毁大鼠28d损毁侧SN区环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）蛋白表达升高（P<0.05）;与6-OHDA处理组相比,JWH133共处理组大鼠损毁侧SN区COX-2蛋白表达降低（P<0.05）。上述结果表明:应用CB2受体激动剂JWH133能够改善APO诱导的6-OHDA单侧损毁PD模型大鼠的旋转行为,抑制6-OHDA单侧损毁大鼠损毁侧SN区DA能神经元的损伤,发挥神经保护作用。其机制可能与拮抗6-OHDA引起的FPN1表达下调和COX-2表达上调,抑制铁聚积,从而发挥抗炎作用或减轻铁中毒相关。本研究为了解CB2受体的生物学功能以及对PD的药物治疗提供了新的实验资料。
李艳荣[2]（2020）在《五子衍宗丸对帕金森病模型小鼠的防治作用及机制研究》文中研究表明目的:本研究应用五子衍宗丸（WYP）干预MPTP诱导的帕金森病（PD）小鼠模型,观察WYP对PD的治疗效果及其可能的作用机制,为今后应用WYP治疗PD提供科学的理论依据。方法:C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组和WYP治疗组。腹腔注射MPTP（d1:15mg/kg,d2:20mg/kg,d3-d7:30mg/kg）一周诱导建立经典小鼠PD模型。同时,正常组和模型组给予生理盐水50mL/kg/d灌胃,WYP治疗组给予WYP药液16g/kg/d灌胃,2次/d,持续两周。于每次注射MPTP后观察各组动物的一般行为学表现。实验周期第15天,采用步态实验、爬杆实验、胶布移除实验和旷场实验评价动物的运动功能、探索行为及焦虑情绪。通过免疫组化观察中脑黑质TH神经元,计数TH阳性细胞数。微量酶标法检测脑组织GSH、MDA含量。蛋白印迹检测脑组织中SOD和CAT的表达量;检测UPR信号传导通路相关蛋白p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1α、XBP1、ATF6的变化以及ERS介导的凋亡途径相关蛋白CHOP、ASK1、p-JNK、Caspase-12、Caspase-9、Caspase-3的表达水平。结果:1.WYP对PD小鼠一般体征及行为学表现的影响1.1 WYP对PD小鼠一般体征的影响首次注射MPTP 10-20min,小鼠即出现不同程度的肢体震颤、竖毛、弓背、竖尾等急性反应,上述症状约持续30-60min后逐渐减轻,伴随有轻度活动减少、反应迟缓等表现。随着给药剂量和给药次数的增加,急性反应渐趋稳定,但模型组较WYP治疗组运动减少、步态不稳、动作迟缓等症状突出。正常动物未出现上述行为学变化。1.2 WYP对PD小鼠行为学表现的影响步态实验结果显示,与正常组比较,模型组脚爪面积显着增多、后爪间距显着增大（P<0.01）,RH、LH角度明显增大（P<0.05）,LF角度明显缩小（P<0.05）,RF角度差异无统计学意（P>0.05）;与模型组比较,WYP治疗组脚爪面积减少（P<0.05）,后爪间距显着减小（P<0.01）,LF角度增大（P<0.05）,RF、RH和LH角度变化无统计学差异（P>0.05）。爬杆测试结果显示,与正常组比较,模型组转向和爬杆时间均显着延长（P<0.01）;与模型组比较,WYP治疗组用时均明显减少（P<0.05）。胶布移除实验结果显示,与正常组比较,模型组移除时间显着增加（P<0.001）;与模型组比较,WYP治疗组用时明显缩短（P<0.01）。旷场测验结果显示,正常小鼠活动路线复杂多变,轨迹遍布整个箱底;模型组行动路线简单且多沿敞箱底部四周贴壁运动,中央区运动相对较少,焦虑情绪明显;WYP治疗后活动量增加,轨迹分布较为均匀,中央区的行为明显增多,焦虑情绪缓解。与正常组比较,模型组穿格次数减少,平均速度减慢,休息时间延长（均P<0.05）,移动总距离缩短（P<0.01）;与模型组比较,WYP治疗组穿格次数增多,平均速度提高,休息时间缩短（均P<0.05）,移动总距离增加（P<0.01）。2.WYP对PD小鼠中脑黑质TH表达的影响免疫组化实验显示,正常脑组织黑质区TH阳性神经元排列紧密,胞质染色较深,颜色均一,模型组神经元呈散在排列,胞质颜色深浅不一,WYP有效改善了这一现象。与正常组比较,模型组TH阳性细胞数显着减少（P<0.001）;与模型组比较,WYP治疗组TH阳性细胞数明显增多（P<0.01）。3.WYP对PD小鼠脑内氧化应激的影响与正常组比较,模型组脑组织GSH含量显着降低（P<0.001）,MDA含量显着增加（P<0.001）,CAT、SOD蛋白表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较,WYP治疗组脑组织GSH含量显着升高（P<0.001）,MDA含量显着减少（P<0.001）,脑内SOD、CAT表达均显着升高（P<0.01）。4.WYP对PD小鼠引起的内质网应激的影响4.1 WYP对PD小鼠引起的UPR介导的信号传导通路的影响模型组BIP蛋白表达量较正常组显着增多（P<0.001）,WYP治疗组BIP较模型组明显减少（P<0.01）。与正常组比较,模型组p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1α及XBP1蛋白水平显着上调（P<0.001、P<0.01）;与模型组比较,WYP治疗组明显减低了p-PERK、p-eIF2α、XBP1（P<0.01）和ATF4、p-IRE1α（P<0.05）的相对表达量。三组动物脑内ATF6含量没有显着变化（P>0.05）。4.2 WYP对PD小鼠引起的ERS介导的凋亡途径的影响相比正常组,模型组凋亡因子CHOP蛋白表达量显着增多（P<0.01）,WYP治疗明显降低了这一趋势（P<0.05）。与正常组比较,模型组ASK1、Caspase-12蛋白水平升高（P<0.01）,Caspase-9和Caspase-3含量增多（P<0.05）;与模型组比较,WYP治疗组Caspase-12、Caspase-9水平下调（P<0.05）,ASK1、Caspase-3表达减少,但差异无统计学意义（P>0.05）。三组中p-JNK的蛋白表达水平没有显着变化（P>0.05）。结论:1.WYP可有效改善PD小鼠的一般表现和运动功能,缓解焦虑心理,并减少/延缓中脑黑质DA能神经元的丢失,具有神经保护作用。2.WYP能够上调SOD和CAT的表达,增加GSH的含量,减少MDA的产生,从而缓解脑内氧化应激状态。3.WYP能够调控ERS介导的UPR信号传导通路,包括PREK/eIF2α/ATF4信号通路以及IRE1α/XBP1信号通路,抑制跨膜蛋白的磷酸化和二聚化,减少下游转录因子的表达,从而减轻ERS反应,缓解细胞损伤。4.WYP可以调节ERS介导的凋亡途径,抑制凋亡因子CHOP的转录表达、下调特有凋亡途径中Caspase-12、Caspase-3及Caspase-9的水平,进而减少神经元的凋亡。
郑晓彤[3]（2020）在《Salsolinol合成酶及其产物导致多巴胺能神经细胞死亡的机制研究》文中研究说明帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是人类最常见的第二大神经系统退行性疾病,多发于中老年人群。其主要临床症状为静止性震颤、肌僵直、行动迟缓和姿势异常等。PD的主要病理特征是路易小体的出现和黑质致密部多巴胺能神经元的退行性病变和死亡。PD的具体发病机制尚未明确。病因学研究显示,PD的发病是年龄老化、环境毒素、遗传等因素综合作用的结果,其中环境毒素在PD的后天发展中占据主导地位。自从神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）被发现能够诱导机体出现帕金森病类似的症状以来,其结构类似物儿茶酚异喹啉类化合物（CTIQs）与PD的相关性引起了学者的广泛关注。CTIQs属于内源性神经毒素,由脑内氧化应激导致的脂质过氧化反应生成的活性醛与多巴胺经生物酶催化生成;CTIQs经过氮甲基化和氧化后生成的产物能够与线粒体复合物I结合,造成能量代谢障碍的同时也加剧了细胞内的氧化应激水平,形成恶性循环,最终导致多巴胺能神经元的变性死亡。在此恶性循环过程中,催化CTIQs生成的生物酶是目前研究的重点和难点,由于含量少、纯化困难等因素,使得内源性神经毒素导致PD发病的机制研究停滞不前。Salsolinol合成酶（Sal合成酶）是CTIQs合成和代谢过程中的首个关键酶,它能够催化多巴胺（DA）和乙醛生成Sal,并加剧后续相关产物的生成和代谢,与PD的致病机制关系密切。迄今为止,国际上关于该酶的研究报道较少,本课题组长期致力于该酶的研究工作,前期已经从鼠脑中对其进行分离、纯化和鉴定,并进行了初步的酶学性质研究,然而该酶的确切生物学功能仍然未知。Sal合成酶生物学功能的实现依赖其催化产物Sal,近年来关于Sal的神经毒性存在争议,其导致多巴胺能神经细胞死亡的机制尚未完全阐明,因此本课题主要围绕Sal合成酶及其产物展开相关研究,具体包括以下几方面:1、采用6-羟基多巴胺（6-OHDA）构建PD细胞模型和动物模型,探究PD模型中Sal合成酶的活性、分布及产物等的生成情况。结果显示Sal合成酶在细胞和大鼠纹状体、中脑、海马、皮层中均有活性分布,且在细胞模型组和动物模型组纹状体中酶的活性升高。成功检测了大鼠脑区中Sal的含量,且模型组中脑区Sal的含量升高。2、构建Sal合成酶过表达的细胞模型和Sal合成酶转基因小鼠,从细胞水平和活体水平揭示Sal合成酶对多巴胺能神经细胞的影响。细胞水平的研究显示,Sal合成酶是一种胞浆蛋白,主要分布于细胞质中。Sal合成酶在细胞内过表达48 h后活性增强,CTIQs类神经毒素Sal和NM-Sal的含量显着上升。流式细胞仪检测发现Sal合成酶过表达后线粒体膜电位下降,提示细胞进入凋亡早期阶段,细胞凋亡情况的检测结果与之相符。对相关细胞凋亡因子的研究显示,Sal合成酶能够抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达并促进促凋亡蛋白Bax的表达,并且这一结果在Sal体外诱导实验中得到验证。在活体水平方面,繁育了Sal合成酶的FVB转基因小鼠,从行为学和病理学检测Sal合成酶的过表达与PD的关系。结果显示,13月龄的Sal合成酶转基因小鼠在爬杆实验中出现运动迟缓的症状,然而黑质致密部的免疫组化染色中没有发现显着差异,由此推测,Sal合成酶在活体中导致的神经毒性需要时间的累积,该酶单独作用不足以直接导致动物机体中PD症状的发生,符合PD发病因素复杂的特点。3、在Sal合成酶导致细胞凋亡发生的进程中,其催化产物Sal发挥了关键作用。为了阐明Sal导致多巴胺能神经细胞死亡的分子机制,本研究利用全转录组测序技术（RNA-seq）筛选出了Sal诱导后发生显着变化的相关基因和信号通路。测序结果发现,与RNA甲基化（FTO/Mettl3/Mettl23）、凋亡（Bad）和转录因子（Foxa3）等相关基因在内的740个基因表达上调,与自噬（Atp264/Atg1611）、DNA甲基化（Dnmt3a/Dnmt1）和转录因子（FoxO1）等相关基因在内的1665个基因表达下调。GO分析结果显示差异表达基因主要定位在线粒体内膜、溶酶体腔、高尔基体等细胞组分中,改变离子结合能力和酶的催化活性等功能。miRNA的调控、自噬和细胞极性的调节等生物过程受到影响。KEGG富集结果显示Sal影响Akt、TOR和FoxO等信号通路,为后续的Sal毒性机制研究提供了依据和靶点。4、基于RNA-seq分析结果,从Akt-mTOR信号通路和自噬的角度揭示Sal诱导多巴胺能神经细胞发生凋亡的分子机制。Sal诱导降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,细胞发生凋亡。通路研究显示,Sal诱导使Akt和mTOR磷酸化水平升高,LC3Ⅱ/Ⅰ下降,说明Sal通过激活Akt-mTOR信号通路抑制细胞内的自噬水平。Sal诱导也降低了细胞内Ca2+浓度、钙通道相关蛋白NMDAR1和多巴胺受体基因Drd3的表达水平,表明Sal诱导后细胞膜上和内部信号传导能力变弱。细胞内去甲基化酶FTO的表达水平在Sal诱导后也降低,导致RNA甲基化修饰6-甲基腺嘌呤（m6A）的水平升高。除此之外,Sal还能够部分逆转6-OHDA引起的FTO和NMDAR1表达的升高,是一种潜在的去甲基化酶和NMDAR1受体拮抗剂,具备一定的临床应用价值。通过上述研究,本课题明确了Sal合成酶及其产物在多巴胺能神经细胞凋亡过程中发挥了重要毒性作用。Sal合成酶通过催化Sal的生成损害线粒体,促进凋亡,最终导致多巴胺能神经细胞死亡。体外诱导试验表明Sal通过激活Akt-mTOR信号通路抑制细胞内自噬流,最终引起细胞的死亡。在该过程中,NMDAR1-Ca2+信号传导途径和RNA甲基化修饰发挥了调节。综上所述,Sal合成酶和Sal是导致多巴胺能神经细胞死亡的关键因子。
李义[4]（2020）在《帕金森氏病发病过程中多巴胺反应性氧化产物的蛋白修饰作用研究》文中认为目的:探索神经递质多巴胺（dopamine,DA）异常代谢生成的反应性氧化产物（Reactive oxidative products of dopamine,ROPD）共价修饰蛋白质在帕金森氏病（Pakinson’s disease,PD）发病进程中的作用。方法:首先将DA与加入了谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）及半胱氨酸（Cysteine,Cys）等亲核捕获剂、酪氨酸酶的0.1 M PBS或脑组织匀浆液中共孵育,通过高分辨质谱UPLC-Q/Orbitra MS监测ROPD-捕获剂共价结合物,筛查DA在体外研究体系中可形成的ROPD。然后,建立和优化蛋白酶解法及定量分析方法,将ROPD-蛋白结合物酶解为ROPD-氨基酸残基结合物,以筛查可共价修饰蛋白质的ROPD及定量其共价修饰能力。利用6-羟基多巴（6-hydroxydopa,6-OHDA）和鱼藤酮（Rotenone,ROT）制备PD模型大鼠,并通过Western blot和免疫荧光技术检测中脑黑质酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）的表达,结合转棒实验验证PD大鼠模型的建立。采用蛋白酶解法处理PD模型大鼠脑组织样本,表征PD模型大鼠脑中的ROPD,并通过ROPD与合成肽段孵育验证ROPD表征结果。最后,在PD发生过程中的系列时间点收集PD模型大鼠纹状体和中脑黑质组织样本,通过LC-MS定量分析ROPD-氨基酸残基结合物水平以考察ROPD修饰纹状体和黑质区蛋白的经时过程。侧脑室注射ROPD,考察其共价修饰蛋白和对多巴胺能神经元的损伤作用。结果:在体外研究体系中,DA氧化生成的ROPD与捕获剂共价结合,发现4-S-NAC-5,6-di OH-indole,7-S-GSH-animochrome,2-S-Cys-DA等11个ROPD共价结合物,表明DA在体外体系氧化生成多巴胺邻醌（dopamine o-quinone,DAQ）、5,6-吲哚醌（5,6-indolequinone,DAQ）、氨基色素（aminochrome,AC）以及3,4-二羟基苯乙醛（3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde,DOPAL）等ROPD。然后,本研究以京尼平（Genipin,GP）为工具化合物,建立和优化了蛋白酶解法。通过加入随行蛋白内标,提高定量方法准确性。在PD模型大鼠脑匀浆液中,发现DOPAL-Cys、7-S-Cys-aminochrome和7-S-GSH-aminochrome等游离结合物。通过蛋白酶解法处理PD模型大鼠脑组织,发现DOPAL-Lys、DOPAL-Lys（Cyclizing）、DOPAL-Gln、DOPAL-His以及7-N-Lys-aminochrome等5个氨基酸残基结合物。该结果表明在PD模型大鼠中,DA可氧化生成DOPAL和AC,这两个ROPD可与蛋白质含伯胺的氨基酸侧链通过席夫碱反应或亲核加成反应的方式共价修饰蛋白质伯胺。通过DOPAL分别与含Lys或Cys的合成肽段共孵育验证DOPAL蛋白结合能力及结构。在给予6-OHDA或ROT后的约10 min内,均发现DOPAL和AC可与PD模型大鼠脑内黑质和纹状体区域蛋白质发生共价结合,约在6 h达到峰值,与零点（Control）相比,各蛋白结合物的含量增加了约3-40倍。ROPD共价结合蛋白质远早于多巴胺能神经元的大面积丢失（12或24 h）,因此ROPD共价修饰蛋白这一极早期事件可能是PD的公共事件。侧脑室立体定位注射DOPAL,可产生剂量依赖性的DOPAL-氨基酸残基结合物,注射给予DOPAL 24 h后多巴胺能神经元显着性丢失,表明DOPAL共价修饰蛋白可致多巴胺能神经元变性丢失。结论:在PD发病过程中,DA异常氧化产物DOPAL和AC通过席夫碱反应或亲核加成反应共价修饰黑质和纹状体部位含伯胺基团氨基酸侧链的蛋白质,该早期事件可能对PD发病进程发挥重要作用。本研究为PD发病机制及相关药物靶点研究提供了理论依据。
吕颖[5]（2020）在《LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究》文中认为目的（1）建立hiPSCs向多巴胺（dopamine,DA）能神经元的诱导分化体系,系统分析诱导分化过程中lncRNAs的表达和功能变化,进一步筛选并探究关键lncRNA MIAT在hiPSCs及诱导分化中的作用。（2）探讨6-OHDA大鼠帕金森（Parkinson’s disease,PD）模型不同脑区基因表达的改变并筛选PD关键基因与通路,为研究PD的分子机制和防治提供新思路。（3）系统比较并评价神经干细胞、间充质干细胞及其诱导细胞、hiPSCs诱导分化细胞移植治疗PD的效果,为移植细胞的选择和时间点的确定提供实验基础。方法（1）单层贴壁培养法建立hiPSCs向DA能神经元的诱导分化体系,RT-qPCR和免疫荧光染色检测神经相关标记物划分细胞所处阶段。将诱导分化中不同阶段细胞进行lncRNAs转录组测序和生物信息学分析,包括基因表达分析、差异基因分析、lncRNAs靶基因预测和功能富集分析。筛选关键lncRNA MIAT进行RT-qPCR表达验证,Cas9转录激活慢病毒构建MIAT过表达稳转细胞系,RT-qPCR、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色检测MIAT在hiPSCs及其向DA能神经元诱导分化中相关标记物的表达。（2）脑立体定位手术构建6-OHDA大鼠PD模型,阿扑吗啡诱导旋转测试筛选成功PD模型,免疫组化检测黑质DA能神经元的含量,高效液相色谱检测纹状体 DA、二羟苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid,DOPAC）和高香草酸（homovanillic acid,HVA）的含量。分离5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）进行转录组测序、生物信息学分析和RT-qPCR验证。透射电镜观察超微结构改变。（3）移植细胞分组包括:神经干细胞（neural stem cells,NSCs）、绒毛膜间充质干细胞（human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells,hpcMSCs）、脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cell,CB-MNC）、脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）及其诱导6天、12天、24天的细胞、hiPSCs诱导分化11天、18天和25天的细胞。新型氧化铁纳米颗粒（molday ion rhodamine B,MIRB）标记干细胞并通过脑立体定位手术进行细胞移植。阿扑吗啡诱导旋转测试、旷场试验和抓力测试对动物进行行为学评价。核磁观察细胞在活体脑内的情况,免疫荧光染色观察移植细胞的迁移、增殖、分化以及星形胶质细胞的改变。透射电镜观察脑组织超微结构变化。结果（1）建立了 hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系。细胞诱导分化至5-7天处于NSCs阶段,至第1 1天开始进入DA能神经元前体细胞阶段,至第25天TH+神经元的比例约为40%左右。诱导分化体系中存在普遍的lncRNAs差异表达和功能调控。在转录本水平和基因水平存在大量的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。差异lncRNAs靶基因和差异mRNAs功能富集结果总体相一致,主要参与轴突导向、（Wnt/TGF-β/Hedgehog/MAPK/p53）信号通路、神经退行性疾病（PD/AD/HD）、代谢途径和细胞周期等。iPSCd0 vs iPSCd7前20项显着富集的功能还包括神经元分化调节、中枢神经系统发育、Wnt信号和凋亡等,与诱导分化密切相关。MIAT及其靶基因MAPK10在iPSCd7组的表达量高于iPSCd0组（p<0.05）,与测序结果相一致。hiPSC-MIAT细胞呈克隆状增殖生长,多能性基因的表达水平与hiPSCs无统计学差异,碱性磷酸酶染色阳性且大量表达OCT4阳性细胞。hiPSC-MIAT诱导至第5天即可见大量细胞向外伸展生长呈分化状态,OCT4、EN1、NURR1基因表达水平高于对照组（p＜0.05）,SOX1和PAX6基因表达水平低于对照组（p<0.05）。（2）成功构建了 6-OHDA大鼠PD模型,黑质TH+神经元减少约90%以上,纹状体DA、DOPAC和HVA的含量分别为对照组的4.28%、8.40%、4.96%。模型大鼠5个脑区均发生了基因改变,GO和KEGG功能富集分析显示DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。韦恩分析5个脑区共有DEGs为Ephx2和Faml11a。PPI分析纹状体主要节点基因为Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh。DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的共有级联结构,即以Gi/o为中心的Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK。PD模型5个脑区均存在不同程度的线粒体形态异常。（3）阿扑吗啡诱导旋转测试显示,ADSCd12、iPSCd18和iPSCd25有效比例较高且有效时长到达观察终点32周,其中iPCSd18组有效比例最高。与对照组相比,干细胞移植各组大鼠肌力均有所提升（p<0.05）,移植各组之间无统计学差异。与对照组相比,移植大鼠的总活动路程和总运动时间均显着升高（p<0.05）,各移植组之间无统计学差异。与对照组相比,移植组大鼠的跨区域次数增加,其中ADSCd12组高于iPSCd25组（p<0.05）。MIRB标记的移植细胞能够在脑内生长,细胞移植后能够发生迁移,迁移方式包括局部迁移、向胼胝体迁移和跨脑区的远程迁移。细胞移植后8周,部分移植细胞PCNA染色阳性,移植后32周PCNA+细胞较少。iPSCd18组细胞移植后32周,部分分化为DA能神经元表达TH阳性。细胞移植后8周针道周围大量星形胶质细胞被激活,呈纤维束网状或胞体增大增厚,移植后32周表达减少。细胞移植后8周,大鼠5个脑区的线粒体形态异常均有不同程度的改善。结论（1）hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系中,细胞诱导5-7天处于NSCs阶段,11天进入DA能神经元前体细胞阶段,25天TH+细胞比例约为40%。（2）hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中存在广泛的lncRNAs表达和功能变化,部分功能调节与诱导分化关系密切。（3）LncRNA MIAT及其靶基因MAPK10在诱导第7天细胞中表达升高。过表达MIAT不影响hiPSCs的多能性,但在诱导分化过程中促进hiPSCs向中脑DA能神经元前体细胞分化。（4）6-OHDA大鼠PD模型在病理生化和基因水平都能够很好地模拟人类PD,5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）均发生了基因改变,DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。（5）5个脑区的共有DEGs（Ephx2和Faml11a）和纹状体的主要节点基因（Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh）可能是PD分子机制和治疗的关键靶点。（6）DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的以Gi/o为中心的共有级联结构（Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK）,可能是PD突触损伤的关键分子机制。（7）各类干细胞及其诱导细胞移植治疗PD大鼠均能在一定程度上改善动物行为障碍（转数、肌力、自主活动能力）,ADSCd12组、iPSCd18组和iPSCd25组的治疗效果相对较好且维持时间较长,其中iPSCd18组的行为学评价有效比例最高。（8）移植细胞能够在脑内生长并以不同方式迁移,初期具有增殖能力,促进大量星形胶质细胞的表达,后期有所降低,能够分化为DA能神经元,对脑区内线粒体超微结构损伤有一定的改善作用。干细胞功能的年龄依赖性下降在衰老中起着重要作用,但其分子机制尚不清楚。PTRF（polymerase I and transcript release factor）是胞膜窖形成和发挥功能的重要成分,参与调节细胞增殖、内吞作用、信号转导和衰老等生物学功能。本研究旨在通过PTRF转基因小鼠分析PTRF在造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）衰老中的作用。采用流式细胞术检测免疫细胞和造血干/祖细胞的比例;测定HSCs的细胞周期、衰老和ROS表型。采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测衰老相关基因和蛋白的表达水平。结果表明,PTRF转基因小鼠骨髓中HSCs数量明显增多,并表现出G1期细胞周期停滞、SA-β-Gal阳性率增加和活性氧水平升高的衰老表型。PTRF过表达的HSCs在体内、体外的自我更新和造血重建能力也显着降低。PTRF通过 ROS-p38-p16 和 caveolin-1-p53-p21 途径诱导 HSCs 衰老。
刘钰爽[6]（2020）在《活性多肽对MPTP/MPP+诱导帕金森病模型的神经保护及机制探究》文中指出目的:帕金森病（parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经退行性疾病,多发于中老年。中脑黑质多巴胺（dopamine,DA）能神经元的变性死亡以及残存神经元胞质内嗜酸性包涵体,即路易小体（Lewy body）的出现是PD突出的病理改变。患者的临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、肌强直等一系列运动障碍。随着如今社会老龄化,PD的发病率逐年上升,给患者和社会造成极大的负担。然而目前常用的治疗药物效果较为有限,因此研究和开发防治PD药物具有非常重要的意义。本研究拟用MPP+（1-Methyl-4-Phenylpyridinium,1-甲基-4苯基吡啶离子）诱导SH-SY5Y细胞损伤模型以及MPTP（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）诱导小鼠帕金森病模型,探讨一种活性多肽对PD的神经保护作用及具体的作用机制,为PD的治疗提供理论依据。方法:本研究以MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤建立PD细胞模型,以C57BL雄性小鼠腹腔注射MPTP建立PD动物模型,阐明活性多肽对PD的神经保护作用及相关机制。细胞实验:用不同浓度多肽预处理SH-SY5Y细胞24 h,然后加入MPP+（4 mmol/L）损伤细胞24 h。MTT法检测细胞的存活率;Hoechst33258荧光染色观察细胞核形态的变化;流式细胞术和DCFH-DA染色检测细胞内活性氧的生成;Annexin-V/PI双染检测细胞的凋亡率;JC-1染色检测线粒体膜电位的变化;试剂盒检测MDA、SOD、GR、GSH-Px的水平。动物实验:将C57BL雄性小鼠随机分为对照组,MPTP（30 mg/kg）模型组,多肽组（25、50 mg/kg）。通过悬挂实验、爬杆实验、旷场实验进行行为学检测;采用ELISA检测各组小鼠中脑组织及血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;试剂盒检测小鼠中脑组织中MDA、SOD、GR、GSH-Px的水平;免疫组化法和Western blot检测中脑黑质区酪氨酸羟化酶（TH）的表达;Western blot检测小胶质细胞激活的标志物-离子钙接头蛋白分子1（Iba-1）;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、PARP、Cyto-c的表达;NF-κB介导的炎症相关蛋白iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β的表达以及Nrf2抗氧化通路相关蛋白HO-1、NQO1的表达。结果:细胞实验:MTT检测结果显示多肽PP-1预处理24 h后,在浓度为50、100μmol/L时,可以明显抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的存活率的降低;Hoechst 33258染色结果显示MPP+处理后细胞核呈致密浓染,核碎裂,而多肽预处理可以明显改善细胞核的凋亡状态;流式细胞术和DCFH-DA染色结果显示多肽可以降低MPP+诱导的ROS的过度生成;Annexin-V/PI双染结果显示MPP+损伤后,细胞凋亡率增加,而多肽预处理组可以降低细胞凋亡率;线粒体膜电位检测结果显示多肽可以抑制MPP+导致的线粒体膜电位的降低;MPP+处理后导致MDA含量增加,SOD、GR、GSH-Px活性降低,而多肽预处理能明显改善这些指标,从而减弱MPP+造成的氧化应激损伤。动物实验:动物行为学检测结果显示多肽PP-1能够改善PD样小鼠的运动障碍,具体表现为在悬挂实验中可提高小鼠的抓握能力,爬杆实验中减少小鼠完成爬杆所需时间,旷场实验中总路程以及进入中央区域次数都有一定的增加;ELISA检测结果表明多肽可以抑制PD样小鼠炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的增加;氧化应激相关指标结果显示多肽减弱MPTP诱导的PD小鼠MDA水平的增加,增加了SOD、GR,GSH-Px的活性;免疫组化检测结果表明,与模型组相比,多肽处理组TH阳性细胞数增加,表明多肽能抑制MPTP诱导的PD小鼠多巴胺能神经元的损伤;Western blot结果显示模型组Iba-1表达上升,而多肽可以抑制Iba-1蛋白的表达,提示多肽可以抑制小胶质细胞的激活;Western blot检测相关蛋白结果显示多肽处理组可抑制凋亡蛋白的表达,激活Nrf2途径,抑制NF-κB炎症通路。结论:细胞实验表明多肽可以抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤,改善氧化应激、抑制细胞凋亡、稳定线粒体膜电位。动物实验表明多肽可以改善MPTP诱导的PD小鼠行为学障碍,保护PD小鼠多巴胺神经元。其机制具体表现为抑制PD小鼠中脑黑质区TH阳性细胞的减少;减少细胞凋亡,抑制促凋亡蛋白Bax的表达,促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达;改善中脑氧化应激水平,激活Nrf2途径,促进下游抗氧化蛋白的表达;抑制中脑组织和血清中炎症因子的表达,抑制NF-κB活化,进而抑制其下游促炎因子和促炎蛋白酶的表达。综上所述,多肽对MPTP/MPP+诱导的PD模型具有神经保护作用,其机制与抗凋亡、改善氧化应激、抑制炎症反应有关。
张硕[7]（2020）在《ε-viniferin通过增强SIRT3对FOXO3去乙酰化功能在帕金森病模型中作用及机制研究》文中研究表明目的:帕金森病（Parkinson‘s disease）业已成为仅次于阿尔茨海默病的第二大神经系统变性疾病。帕金森病的患病率和发病率均呈逐年上升趋势。黑质致密部、蓝斑和中缝核等处的多巴胺能神经元渐进性变性损伤,神经元凋亡为帕金森病的主要病理特征,多巴胺神经元突触投射到相应的纹状体,最终导致纹状体中多巴胺水平下降,导致脑内神经递质稳态的失衡,患者产生相应运动及非运动症状。目前,尚无完全治愈帕金森病的药物或疗法,临床的药物主要以非疾病修饰治疗为主的。帕金森病的确切发病原因尚不十分清楚,其病理机制改变为交互式,多重级联反应最终导致病理改变,在这一过程中,氧化应激,线粒体功能缺陷,α-突触核蛋白等毒性蛋白聚集,内质网应激障碍,钙离子稳态失衡,单胺氧化酶B活性下降,神经炎症,谷氨酸兴奋性神经毒性损伤等机制均可能参与了帕金森病病理生理过程,且其中可能涉及内在遗传背景和外界环境因素。顺式-（-）-ε-维尼非林（Trans-（-）-ε-viniferin,ε-viniferin）是一种具有五元氧环的白藜芦醇的脱氢二聚体。尽管白藜芦醇在临床上没有被证实对特定疾病有治疗作用,但是,这两种化合物可以通过不同的信号通路调节多种神经生物学效应。在抗氧化和抗炎方面,ε-viniferin的生物学活性比其单体白藜芦醇更高效。ε-viniferin被证实可以促进Aβ聚合体解离,并有抑制神经炎症作用。ε-viniferin可通过激活SIRT3/LKB1/AMPK信号通路,促进自噬流,在亨廷顿舞蹈病中起到神经保护作用,上述研究证实ε-viniferin对神经变性疾病具有潜在多靶点治疗价值。SIRT3（sirtuin 3）是一个重要的线粒体去乙酰化修饰酶,具有去乙酰化酶特性,能够调控线粒体中多种酶及分子的活性,可通过调节线粒体相关的信号传导途径来降低氧化应激损伤,调控线粒体功能进而维持细胞正常的生物学功能。作为重要的SIRT3作用底物,叉头框蛋白O3（Forkhead box O3,FOXO3）是一种转录因子,可以通过激活多种基因,介导多种信号通路,涉及能量代谢,氧化应激,蛋白稳态,细胞凋亡,细胞发育,分化代谢过程,自噬和长寿。FOXO3在神经变性性疾病中也起着至关重要的作用,并参与帕金森病的发展。FOXO3是多巴胺能神经元存活的关键因素之一,能够介导相关信号通路,增强神经元对异常聚合α-突触核蛋白消除。我们推测ε-viniferin可能对帕金森病有潜在的治疗价值。本研究拟将6-OHDA作为多巴胺能神经元毒剂,建立SD大鼠的帕金森病模型,阐明ε-viniferin在帕金森病大鼠模型中是否具有神经保护作用,并初步评估其保护作用是否通过抗氧化应激及促进自噬实现;确定ε-viniferin具有潜在治疗作用后,通过鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞毒性损伤建立帕金森病细胞模型,并初步探讨ε-viniferin是否通过增强SIRT3去乙酰化FOXO3作用,促进FOXO3活化并向核内转移,继而调控下游蛋白表达,促进线粒体稳态（线粒体生物发生,分裂融合,线粒体自噬）,维持线粒体膜电位,抑制凋亡,抗氧化应激保护神经。研究方法:第一部分,评估ε-viniferin抑制6-OHDA介导的大鼠黑质多巴胺能神经元损伤,建立6-OHDA介导的SD大鼠帕金森病模型并分组。治疗组通过腹腔给药予以不同浓度的ε-viniferin模拟治疗,术后4周予以阿扑吗啡诱导大鼠发生帕金森病行为学改变。免疫荧光TUNEL法评估黑质多巴胺神经元凋亡情况,Western blot评估SOD,BAX,BCL-2,P62蛋白表达情况,免疫荧光评估LC3分布及表达。第二部分,我们进一步评估ε-viniferin通过对SIRT3对FOXO3去乙酰化作用在鱼藤酮介导的帕金森病细胞模型神经保护作用。以SH-SY5Y细胞为研究对象,建立鱼藤酮介导的帕金森病细胞模型,采用shRNA抑制SIRT3及FOXO3的表达,Western blot检测SIRT3及FOXO3沉默情况。将ε-viniferin作为治疗药物,实验确定鱼藤酮和ε-viniferin的最佳处理浓度和时间,设计6个不同的处理组。分组后,采用MTT检测细胞生存活力;流式细胞仪检测细胞内活性氧;荧光及流式细胞仪检测线粒体膜电位差异,测定细胞内ATP水平,流式细胞仪通过Annexin V-FITC检测细胞凋亡水平。Western blot检测SIRT3、FOXO3、PGC-1α、TFAM、Drp1、Fis1、Mfn2、Parkin、Nix、Bnip3、P62表达水平。免疫沉淀评估SIRT3对FOXO3去乙酰化作用。提取亚细胞蛋白组分,Western blot检测FOXO3在细胞核,细胞浆及线粒体表达情况。免疫荧光评估SIRT3表达情况。透射电子显微镜观察各组线粒体形态改变及线粒体自噬存在情况。结果:第一部分,ε-viniferin可以改善6-OHDA介导的帕金森病SD大鼠模型的行为学改变。与模型组相比,TUNEL染色提示ε-viniferin可抑制6-OHDA介导的黑质多巴胺能神经元凋亡,促进抗氧化物SOD2表达,同时下调促凋亡蛋白BAX的表达,上调抑制凋亡蛋白BCL-2的表达,同时ε-viniferin可增强自噬相关标志物表达LC3B/A及P62的表达（P<0.05）,提示ε-viniferin对6-OHDA介导的黑质多巴胺能神经元保护作用主要是通过抗氧化应激和促进自噬实现。第二部分,MTT实验证实用ε-viniferin处理24小时后可显着提高帕金森病细胞模型的生存率,与模型细胞组相比,可提高40.0±1.8%的细胞活力。但是,当用shRNA预先转染细胞后,干扰SIRT3或FOXO3的表达,ε-viniferin对SH-SY5Y细胞的神经保护作用明显减弱（P<0.05）,提示ε-viniferin是通过SIRT3/FOXO3途径保护SH-SY5Y细胞免受鱼藤酮诱导的神经毒性损伤。ε-viniferin能够减轻鱼藤酮诱导的线粒体去极化,降低鱼藤酮诱导的氧化应激,促进ATP的生成,减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡（P<0.05）。但是,干扰SIRT3/FOXO3表达后,上述神经保护效应减弱。我们进一步证实ε-viniferin能够上调SIRT3的表达,促进SIRT3对FOXO3的去乙酰化和FOXO3向核内转移定位。相对于单纯鱼藤酮暴露组,ε-viniferin通过SIRT3促进FOXO3的去乙酰化作用调控线粒体稳态相关蛋白的表达,ε-viniferin能够显着上调促进线粒体生物学发生蛋白（PGC-1α和TFAM表达上升）,促进线粒体融合分裂蛋白（Drp1,Fis1及Mfn2表达上升）和调控线粒体自噬相关蛋白（Nix,Bnip3,Parkin表达上升,P62表达下降）。透射电镜检测观察ε-viniferin治疗组形成自噬小体,出现自噬区室,线粒体明显伸长（提示分裂或融合）,而在模型组中,细胞的线粒体的内膜面极增大,线粒体嵴增粗,明显渗透性肿胀,提示线粒体凋亡前期表现。结论:我们的研究证实ε-viniferin对帕金森病具有潜在的有神经保护作用,其主要生物学功能是通过增强SIRT3表达,促进SIRT3对FOXO3去乙酰化及调控下游维持线粒体稳态的相关蛋白,主要包括通过促进TFAM和PGC-1α表达,调节线粒体的生物发生;促进Mfn2,Fis1和Drp1以维持线粒体的分裂及融合平衡;上调Parkin,Bnip3和Nix表达诱导线粒体自噬的发生,通过上述途径,ε-viniferin抑制鱼藤酮及6-OHDA诱导的神经毒性,减弱氧化应激损伤,维持线粒体功能,其具有潜在的神经保护作用,为帕金森病的药物治疗开辟新的思路。
周囡囡[8]（2019）在《神经干细胞和嗅鞘细胞联合移植促进PD大鼠神经功能修复及机制研究》文中研究表明帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种多发于老年人的神经退行性疾病,其常见的运动症状有静止性震颤、运动迟缓、肌僵直、姿势反射障碍等,非运动症状有焦虑、睡眠障碍、认知障碍等。近年来,干细胞研究所取得的成就为PD治疗带来了新的希望。PD的主要病理特征为中脑黑质（substantia nigra,SN）多巴胺（dopamine,DA）能神经元的选择性缺失。PD的发病机制目前尚不清楚,但大量研究表明神经炎症在DA能神经元变性丢失过程中起着重要作用。研究表明神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植在改善PD神经炎症微环境中具有重要的作用。嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）因其出色的神经营养功能经常被应用于细胞的联合移植中,被称为移植细胞的“营养泵”。近年来越来越多的证据表明OECs在改善移植细胞炎症微环境中起到重要作用。为研究NSCs与OECs联合移植对PD大鼠神经功能修复作用及其机制,本实验将E1112 d胎鼠中脑来源的NSCs进行体外培养、诱导分化和免疫荧光鉴定,将13d新生鼠嗅球来源的OECs体外培养并进行免疫荧光鉴定。移植前用GFP-HIV转染NSCs以标记NSCs,用Hoechst 33342标记OECs。在成年雄性Wistar大鼠右侧内侧前脑束和黑质两点注射6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）制备PD模型,造模4 w后选择造模成功的PD大鼠进行纹状体（striatum,Str）内细胞移植。移植手术7 d后通过荧光观察细胞移植情况;通过旷场试验（open field test,OFT）、平衡木实验和握力测试检测PD大鼠的自发运动能力、焦虑程度、运动协调能力和肌僵直程度;通过蛋白质免疫印迹（western blot,WB）检测PD大鼠Str及SN脑区中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）蛋白的表达变化和PD大鼠右侧Str脑区中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）和白介素-4（interleukin 4,IL-4）蛋白的表达变化。结果如下:1.NSCs体外培养3代后可见形状规则的神经球,神经球经免疫荧光鉴定呈Nestin阳性,分化后的NSCs免疫荧光鉴定为TH阳性和GFAP阳性。体外培养的OECs呈现双极和多极的细胞形态,且大部分细胞免疫荧光鉴定呈P75NTR阳性。2.利用GFP-HIV转染NSCs标记NSCs,利用Hoechst 33342标记OECs,细胞绝大多数被成功标记。移植手术7 d后,对大鼠脑切片进行荧光观察,对照组和6-OHDA组均未观察到荧光,而各细胞移植组可见与细胞标记物相应的荧光,说明细胞移植成功。3.行为学实验结果显示,与对照组相比,6-OHDA组旷场运动距离较短（P<0.01,n=9-11）,说明6-OHDA组大鼠自发运动能力下降;相比6-OHDA组,联合移植组旷场运动距离较长（P<0.05,n=9-11）,但NSCs或OECs单独移植组旷场运动距离有所增加但无统计学差异,说明NSCs与OECs联合移植组大鼠自发运动能力短期内得到改善。相比对照组,6-OHDA组平衡木得分降低（P<0.001,n=9-11）,说明6-OHDA组大鼠运动协调能力下降;相比6-OHDA组,单独移植组或联合移植组的平衡木得分均略有上升,但差异无统计学意义（P>0.05）,说明单独移植组或联合移植组大鼠运动协调能力短期内无改善。相比对照组,6-OHDA组悬挂持续时间增加,说明6-OHDA组大鼠肌僵直程度增加（P<0.05,n=9-11）;相比6-OHDA组,单独移植组或联合移植组悬挂持续时间均略有下降,但差异无统计学意义（P>0.05）,说明单独移植组或联合移植组大鼠肌僵直症状短期内无明显缓解。4.OFT结果显示,与对照组相比,6-OHDA组的旷场外周与中央活动时间比值（Pt/Ct）变大,说明6-OHDA组大鼠焦虑程度较高（P<0.05,n=9-11）,与6-OHDA组相比,OECs移植组和联合移植组的Pt/Ct变小,说明OECs移植组和NSCs与OECs联合移植组的焦虑程度较低（P<0.05,n=9-11）。5.PD大鼠左侧Str和SN的TH蛋白表达均无变化（P>0.05）。右侧Str的TH蛋白表达变化明显,与对照组相比,6-OHDA组、NSCs移植组、OECs移植组和联合移植组的TH表达量均减少（P<0.001,n=5-7）,而与6-OHDA组相比,NSCs移植组和联合移植组的TH表达量略有增加,但无统计学意义（P>0.05）;右侧SN的TH表达变化明显,与对照组相比,其余四组TH表达量均减少（P<0.001,n=5-7）,与6-OHDA组相比,联合移植组的TH表达量略有增加,但无统计学意义（P>0.05）。6.PD大鼠右侧Str的炎性因子表达变化明显。与对照组相比,6-OHDA组的TNF-α、IL-1β和IL-4表达量均增加（P<0.05,n=5-7）。与6-OHDA组相比,联合移植组的TNF-α和IL-1β表达量减少（P<0.05,n=5-7）,IL-4的表达量略有增加,但无统计学差异（P>0.05）;单独移植组的IL-1β表达量减少（P<0.05,n=5-7）,且TNF-α与IL-4表达量减少,但均无统计学差异（P>0.05,n=5-7）。以上结果表明,NSCs和OECs联合移植7d后PD大鼠的自发运动能力增强,焦虑程度降低;促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量减少,说明联合移植短期内能促进PD大鼠神经功能部分修复,其修复机制可能与促炎因子的表达量减少有关。本研究结果将为今后应用NSCs和OECs联合移植治疗PD供新的实验和理论依据。
邰胜燕[9]（2019）在《α-硫辛酸通过FBXL5-IRP2通路干预帕金森病模型铁代谢的分子机制研究》文中进行了进一步梳理目的:观察α-硫辛酸（α-LA）对帕金森病（PD）模型大鼠中脑黑质（SN）和PD细胞模型的铁含量、氧化应激水平、以及FBXL5、铁调节蛋白2（IRP2）、膜铁转运蛋白1（FP1）表达的变化,探讨α-LA干预PD铁代谢的分子机制。方法:（1）动物实验:将健康雄性SD大鼠随机分为假手术组（n=15）、PD模型组（n=15）和α-LA治疗组（n=15）;利用APO诱导的旋转试验和圆筒试验检测PD大鼠的行为学变化评估α-LA疗效;采用免疫组化检测PD大鼠中脑右侧SN酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况;采用普鲁士蓝铁染色法和双吡啶法检测大鼠中脑右侧SN铁含量;采用分光光度法和WST-1法分别检测大鼠中脑右侧SN谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力;采用Western blot检测各组大鼠右侧SN区域FBXL5、IRP2和FP1的表达情况。（2）细胞实验:采用6-OHDA诱导PC12细胞建立帕金森病细胞模型,噻唑蓝（MTT）法检测细胞活性筛选最佳6-OHDA建模浓度和α-LA干预治疗浓度,细胞实验分为3个组,即正常对照组、模型组（200μmol/L 6-OHDA）和α-LA干预组（10μmol/Lα-LA+200μmol/L6-OHDA）;采用双吡啶法检测细胞内铁含量;采用比色法检测细胞内丙二醛（MDA）含量,荧光探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色法检测细胞内活性氧（ROS）含量;采用Western blot检测各组PC12细胞内FBXL5、IRP2和FP1的表达情况。结果:（1）动物实验结果:与假手术组大鼠相比,PD模型组大鼠经APO诱导后的旋转速度显着增加（P<0.01）,圆筒试验检测的左上肢使用率显着下降（P<0.01）,PD模型组大鼠中脑右侧SN的TH表达显着减少（P<0.01）,铁染色阳性细胞数量和总铁含量均显着增加（P<0.01,P<0.01）,FBXL5表达明显减少（P<0.01）,IRP2表达明显增多（P<0.01）,FP1表达明显减少（P<0.01）,GSH含量和SOD活力显着降低（P<0.01,P<0.01）;与PD模型组大鼠相比,α-LA治疗组大鼠经APO诱导后的旋转速度明显下降（P<0.01）,左上肢使用率明显升高（P<0.01）,α-LA治疗组大鼠中脑右侧SN的TH表达明显回升（P<0.01）,铁染色阳性细胞数量和总铁含量均明显减少（P<0.01,P<0.01）,FBXL5表达明显增多（P<0.05）,IRP2表达明显减少（P<0.01）,FP1表达明显增多（P<0.05）,GSH含量和SOD活力明显增加（P<0.05,P<0.01）。（2）细胞实验结果:200μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞24 h后细胞活力下降至65.05±5.61%,作为PD模型细胞处理;而经10μmol/Lα-LA预处理1 h后再加入200μmol/L 6-OHDA共孵育24 h,PC12细胞的细胞活力升至87.79±3.76%,此作为α-LA干预组细胞处理。与正常对照组PC12细胞相比,模型组PC12细胞活力显着降低（P<0.01）,铁含量明显增多（P<0.01）,FBXL5表达明显减少（P<0.01）,IRP2表达明显增多（P<0.01）,FP1表达明显减少（P<0.01）,MDA和ROS含量显着增加（P<0.01,P<0.01）;与模型组PC12细胞相比,α-LA干预组细胞活力明显回升（P<0.01）,铁含量明显减少（P<0.01）,FBXL5表达明显增多（P<0.01）,IRP2表达明显减少（P<0.05）,FP1表达明显增多（P<0.05）,MDA和ROS含量明显降低（P<0.01,P<0.01）。结论:（1）α-LA可能通过FBXL5-IRP2通路上调FP1增加铁转出,抑制PD模型铁沉积。（2）α-LA通过抗氧化作用上调PD模型FBXL5蛋白表达水平。
樊逸云[10]（2019）在《虫草素对PD模型多巴胺能神经元的保护作用及其对MAPK和PI3K/Akt-Nrf2通路的影响》文中研究表明目的:以MPTP构建PD小鼠模型,MPP+构建PD细胞模型,探讨虫草素（Cor）对PD模型多巴胺能神经元的保护作用,并从MAPK信号通路、Nrf2信号通路以及PI3K/Akt信号通路来探讨其可能的作用机制。方法:1.体内实验:将C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组（30mg/kg MPTP）和虫草素组（2.5、5.0、10.0mg/kg Cor）。采用旷场、转棒和爬杆实验检测小鼠的运动能力。应用HPLC-ECD法测定纹状体内多巴胺（DA）、二羟苯乙酸（DOPAC）以及高香草酸（HVA）的含量。免疫组织化学法检测黑质致密部TH免疫阳性细胞数。TUNEL法检测黑质区凋亡细胞数。分光光度法测定MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。Western blotting法检测黑质区Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2 和 p-JNK1/2 蛋白的表达。2.体外实验:将PCI2细胞分为对照组、模型组（500μMMPP+）和虫草素组（0.5×10-6、2.0×10-6、8.0×10-6μMCor）。MTT法测定细胞存活率,Hoechst33258核染色检测细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞凋亡率。DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量。Western blotting法测定细胞内 Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、p53、HO-1、Akt、p-Akt 蛋白的表达,以及胞浆和胞核Nrf2的蛋白表达。为进一步探究PI3K/Akt信号通路和Nrf2信号通路的关系,在加入PI3K抑制剂（LY294002）后,同上法测定细胞存活率、ROS含量以及HO-1、Akt、p-Akt、胞浆和胞核Nrf2蛋白的表达。结果:1.Cor对MPTP-PD小鼠DA能神经元凋亡的保护作用及对MAPK信号通路的影响（1）Cor对PD小鼠DA能神经元的保护作用:Cor能显着提高PD小鼠的自发活动能力、肌张力以及身体协调性,提高纹状体内DA、DOPAC和HVA含量,减少PD小鼠黑质致密部TH免疫阳性神经元的丢失。（2）Cor抑制PD小鼠DA能神经元凋亡:Cor能够明显减少PD小鼠黑质区凋亡细胞数,并且能明显下调黑质区促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表达,显着增加抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达并提高Bcl-2/Bax的比值。（3）Cor提高PD小鼠黑质区抗氧化能力:Cor能够减少PD小鼠黑质MDA的产生,并提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性。（4）Cor抑制MAPK信号通路的激活:不同剂量Cor均能下调PD小鼠黑质区p-p38、p-ERK1/2和p-JNK1/2蛋白的表达,而各组p38、ERK1/2和JNK1/2蛋白表达无明显差异。2.Cor通过激活PI3K/Akt-Nrf2通路抑制MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤（1）Cor抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡:Cor能改善PD模型细胞形态,使出现细胞核凝聚和碎裂等凋亡特征的细胞明显减少,降低总凋亡率。并能显着抑制Bax、p53以及Cleaved Caspase-3的表达,上调Bcl-2表达,并提高Bcl-2/Bax比值。（2）Cor对氧化应激相关的Nrf2通路以及PI3K/Akt通路的影响:Cor能显着提高PD细胞存活率,并能减少细胞内ROS的积聚。Cor能激活Nrf2通路,促进Nrf2从细胞浆进入到细胞核,并能使Nrf2诱导的HO-1蛋白水平显着增加,同时还能使Akt磷酸化水平明显升高,激活PI3K/Akt信号通路。（3）Cor激活Nrf2通路依赖于PI3K/Akt通路的激活:加入PI3K抑制剂（LY294002）后,Cor对MPP+诱导的细胞损伤的保护作用以及抑制细胞内ROS枳聚的作用被明显减弱。并且LY294002可显着抑制Cor诱导的p-Akt、HO-1蛋白表达的上调以及Nrf2的核转位。结论:Cor对MPTP/MPP+诱导的PD模型具有神经保护作用,其作用机制可能与激活PI3K/Akt-Nrf2 信号通路和抑制MAPK信号通路的激活,来减少氧化应激损伤,从而抑制DA能神经元凋亡有关。
二、Protective Effectof GSH on PD Model Induced by 6-OHDA In Vitro（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Protective Effectof GSH on PD Model Induced by 6-OHDA In Vitro（论文提纲范文）
（1）激活大麻素2型受体对6-OHDA单侧损毁大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.动物准备 |
| 2.实验材料 |
| 3.行为学检测 |
| 4.免疫荧光染色观察大鼠SN区TH阳性神经元与CB2受体表达 |
| 5.Perl’s铁染色检测SN区铁染色阳性细胞 |
| 6.Western bolts法检测SN区 TH、FPN1、COX-2蛋白的表达 |
| 7.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.大鼠SN区TH阳性神经元和CB2受体共表达 |
| 2.JWH133抑制APO诱导的6-OHDA模型大鼠的旋转行为 |
| 3.JWH133抑制6-OHDA模型大鼠损毁侧SN区TH阳性神经元数目下降 |
| 4.JWH133抑制6-OHDA模型大鼠损毁侧SN区TH蛋白表达下降 |
| 5.JWH133抑制6-OHDA模型大鼠损毁侧SN区铁染色阳性细胞数增高 |
| 6.JWH133抑制6-OHDA模型大鼠损毁侧SN区FPN1蛋白表达下降 |
| 7.JWH133抑制6-OHDA模型大鼠损毁侧SN区COX-2蛋白表达升高 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 大麻素2型受体与帕金森病 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）五子衍宗丸对帕金森病模型小鼠的防治作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 五子衍宗丸对帕金森病模型小鼠的神经保护作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 造模及给药 |
| 2.3 行为学检测 |
| 2.4 样品采集与制备 |
| 2.5 指标检测 |
| 2.6 实验试剂配制 |
| 2.7 数据处理方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 WYP对PD模型小鼠行为学表现的影响 |
| 3.2 WYP对PD模型小鼠中脑黑质TH表达的影响 |
| 4 结论 |
| 第二章 五子衍宗丸对帕金森病模型小鼠氧化应激的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 造模及给药 |
| 2.3 样品采集与制备 |
| 2.4 指标检测 |
| 2.5 实验试剂配制 |
| 2.6 数据处理方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 WYP对PD模型小鼠OS中GSH、MDA表达的影响 |
| 3.2 WYP对PD模型小鼠OS中SOD、CAT表达的影响 |
| 4 结论 |
| 第三章 五子衍宗丸对帕金森病模型小鼠内质网应激的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 造模及给药 |
| 2.3 样品采集与制备 |
| 2.4 指标检测 |
| 2.5 数据处理方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 WYP对PD模型小鼠UPR介导的信号传导通路的影响 |
| 3.2 WYP对PD模型小鼠ERS介导的凋亡途径的影响 |
| 4 结论 |
| 讨论 |
| 1.WYP对MPTP诱导的PD模型小鼠具有良好的治疗效果 |
| 2.WYP改善PD模型小鼠脑内OS状态 |
| 3.WYP调节PD模型小鼠ERS启动标志物的表达 |
| 4.WYP调控PD模型小鼠UPR介导的信号传导通路 |
| 5.WYP抑制PD模型小鼠ERS介导的凋亡途径 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）Salsolinol合成酶及其产物导致多巴胺能神经细胞死亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 帕金森病概述 |
| 1.1.1 PD的临床和病理特征 |
| 1.1.2 PD的病因 |
| 1.1.3 PD的治疗策略 |
| 1.1.4 PD的致病机制 |
| 1.1.5 PD的氧化应激促进儿茶酚异喹啉类神经毒素的生成假说 |
| 1.2 Sal的合成与功能 |
| 1.2.1 Sal的来源和合成 |
| 1.2.2 Sal的生物学功能 |
| 1.2.3 Sal的两面性 |
| 1.3 Sal合成酶的研究进展 |
| 1.3.1 Sal合成酶的发现 |
| 1.3.2 Sal合成酶的研究现状 |
| 1.4 本课题的研究内容及意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 第2章 PD模型中Sal合成酶活性及其产物含量的检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物和细胞 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂与材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 药品和试剂的配制 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细胞存活率的检测 |
| 2.3.4 大鼠脑立体定位手术 |
| 2.3.5 阿扑吗啡诱导的旋转行为检测 |
| 2.3.6 鼠脑冰冻切片的制备 |
| 2.3.7 黑质区酪氨酸羟化酶的免疫组织化学实验 |
| 2.3.8 HPLC-MS/MS法检测PD模型中Sal的含量 |
| 2.3.9 PD模型中Sal合成酶活性检测 |
| 2.3.10 数据统计说明 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 PD模型的构建 |
| 2.4.2 PD模型中Sal合成酶活性的检测 |
| 2.4.3 PD模型中Sal含量的检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 Sal合成酶对多巴胺能神经细胞的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验细胞和动物 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂和材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 药品和试剂的配制 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 Sal合成酶重组质粒的构建 |
| 3.3.4 细胞转染 |
| 3.3.5 HPLC-MS/MS法检测Sal的含量和Sal合成酶的活性 |
| 3.3.6 流式法检测细胞凋亡 |
| 3.3.7 流式法检测线粒体膜电位变化 |
| 3.3.8 蛋白的提取和浓度测定 |
| 3.3.9 免疫印迹 |
| 3.3.10 Sal合成酶转基因小鼠的繁殖与基因型鉴定 |
| 3.3.11 Sal合成酶转基因小鼠的行为学测定 |
| 3.3.12 Sal合成酶转基因小鼠脑冰冻切片的制备 |
| 3.3.13 Sal合成酶转基因小鼠黑质致密部免疫组化 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Sal合成酶载体的构建 |
| 3.4.2 Sal合成酶的胞内定位 |
| 3.4.3 Sal合成酶过表达后细胞内Sal合成酶的活性变化 |
| 3.4.4 Sal合成酶代谢产物Sal和 NM-Sal的生成情况 |
| 3.4.5 Sal合成酶对细胞凋亡的影响 |
| 3.4.6 Sal合成酶对线粒体的损伤情况 |
| 3.4.7 Sal合成酶产物对细胞凋亡的影响 |
| 3.4.8 Sal合成酶转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 3.4.9 Sal合成酶转基因小鼠的行为学检测 |
| 3.4.10 Sal合成酶转基因小鼠的TH染色结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 Sal诱导的转录组学变化分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养和药物处理 |
| 4.3.2 Trizol法提取总RNA |
| 4.3.3 mRNA的提取 |
| 4.3.4 转录组测序技术 |
| 4.3.5 转录组测序质量控制和数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 RNA和测序文库质量控制 |
| 4.4.2 表达差异基因筛选结果 |
| 4.4.3 差异表达基因的GO分析 |
| 4.4.4 差异基因的KEGG富集结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 Sal诱导多巴胺能神经细胞凋亡的分子机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验细胞 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂与材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 RNA的提取 |
| 5.3.2 RNA的反转录 |
| 5.3.3 定量PCR实验 |
| 5.3.4 点杂交(Dot Blot)实验 |
| 5.3.5 钙离子浓度检测 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 Sal诱导后PC12细胞的形态变化 |
| 5.4.2 Sal对细胞内Akt/mTOR信号通路的影响 |
| 5.4.3 Sal对自噬的影响 |
| 5.4.4 Sal对细胞内Ca~(2+)浓度和NMDAR1 表达的影响 |
| 5.4.5 Sal对细胞内m6A的含量和去甲基化酶FTO表达的影响 |
| 5.4.6 Sal的相对保护作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）帕金森氏病发病过程中多巴胺反应性氧化产物的蛋白修饰作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠模型的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化中lncRNAs的差异表达及lncRNA MIAT的调节作用 |
| 前言 |
| 第一节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化体系的建立 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. hiPSCs的细胞培养与多能性鉴定 |
| 2. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程和细胞形态 |
| 3. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关基因表达 |
| 4. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关标志物的免疫荧光染色 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化过程中lncRNAs的表达变化和功能分析 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 测序样本总RNA的质量检测 |
| 2. LncRNAs测序数据质量评估 |
| 3. 比对分析结果 |
| 4. 表达量分析结果 |
| 5. 差异基因表达与验证 |
| 6. 差异基因聚类 |
| 7. 差异表达mRNAs的富集分析结果 |
| 8. LncRNAs co-expression靶基因预测与功能分析 |
| 9. LncRNAs co-location靶基因预测与功能分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三节 LncRNA MIAT调节hiPSCs的神经分化 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. LncRNA MIAT与共表达靶基因KEGG通路分析与验证 |
| 2. 成功构建转录激活过表达lncRNA MIAT的hiPSCs细胞系 |
| 3. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs多能性的影响 |
| 4. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs向DA能神经元诱导分化的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 6-OHDA大鼠帕金森模型的建立和不同脑区的转录组分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 6-OHDA大鼠PD模型的损伤程度 |
| 2. 测序样本总RNAs的质量检测 |
| 3. mRNAs测序数据质量评估 |
| 4. 比对分析结果 |
| 5. 5个脑区的表达量分析结果 |
| 6. 5个脑区的差异表达基因(DEGs)与验证 |
| 7. 5个脑区的差异基因聚类分析与韦恩分析 |
| 8. 5个脑区的差异基因富集分析 |
| 9. 5个脑区的PPI分析与验证 |
| 10. KEGG分析关键信号通路的验证 |
| 11. 6-OHDA大鼠PD模型5个脑区的线粒体超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 干细胞移植治疗6-OHDA大鼠帕金森模型的效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 干细胞鉴定 |
| 2. APO诱导旋转测试不同类型干细胞移植治疗的行为学效果评价 |
| 3. 旷场试验和抓力测试 |
| 4. 移植细胞在脑内的存活、迁移、增殖和分化 |
| 5. 细胞移植后星形胶质细胞的表达 |
| 6. 细胞移植后超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第二部分 PTRF转基因小鼠中造血干细胞的功能受损 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. PTRF的表达随年龄增长而增加并促进髓系分化 |
| 2. PTRF过表达耗损HSCs |
| 3. PTRF过表达损伤HSCs的功能 |
| 4. PTRF诱导HSCs衰老 |
| 5. PTRF通过Cav-1激活了HSCs的衰老通路 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 长链非编码RNA在神经发育和帕金森病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 hiPSCs质检报告(赛贝公司) |
| 附件2 表5-1 iPSCd0组与iPSCd7组转录本水平差异显着的lncRNAs |
| 附件3 表5-2 iPSCd0组与iPSCd7组基因水平差异显着的mRNAs |
| 附件4 表5-3模型组与对照组在OB区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件5 表5-4模型组与对照组在SVZ区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件6 表5-5模型组与对照组在Str区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件7 表5-6模型组与对照组在SN区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件8 表5-7模型组与对照组在Hippo区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）活性多肽对MPTP/MPP+诱导帕金森病模型的神经保护及机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 帕金森的概述 |
| 2.2 帕金森的发病机制 |
| 2.2.1 遗传因素 |
| 2.2.2 环境因素 |
| 2.2.3 氧化应激 |
| 2.2.4 炎症反应 |
| 2.2.5 蛋白质错误折叠及聚集 |
| 2.3 PD的治疗 |
| 2.3.1 左旋多巴 |
| 2.3.2 多巴胺受体激动剂 |
| 2.3.3 儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂 |
| 2.3.4 单胺氧化酶抑制剂 |
| 2.3.5 促多巴胺释放药 |
| 2.3.6 抗胆碱能药 |
| 2.3.7 其他治疗 |
| 2.4 PD模型的建立 |
| 2.4.1 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP) |
| 2.4.2 6-羟基多巴胺(6-OHDA) |
| 2.4.3 鱼藤酮 |
| 2.4.4 化学药物模型 |
| 2.4.5 遗传基因模型 |
| 2.5 本课题研究目的和意义 |
| 第三章 活性多肽对MPP~+诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 实验试剂与耗材 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 MPP~+诱导SH-SY5Y细胞损伤模型的建立 |
| 3.2.3 活性多肽对SH-SY5Y细胞存活率的影响 |
| 3.2.4 活性多肽对MPP~+诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 |
| 3.2.5 Hoechst33258 染色法检测细胞凋亡 |
| 3.2.6 Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡 |
| 3.2.7 DCFH-DA荧光染色检测活性氧 |
| 3.2.8 流式细胞仪检测活性氧 |
| 3.2.9 JC-1染色检测线粒体膜电位 |
| 3.2.10 脂质氧化(MDA)检测 |
| 3.2.11 超氧化物歧化酶(SOD)检测 |
| 3.2.12 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测 |
| 3.2.13 谷胱甘肽还原酶(GR)检测 |
| 3.2.14 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 MTT法检测活性多肽对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 |
| 3.3.2 活性多肽对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响 |
| 3.3.3 活性多肽对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.3.4 活性多肽对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 活性多肽对MPTP诱导的帕金森小鼠模型的保护作用及机制探究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂及耗材 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验分组及给药方法 |
| 4.2.2 小鼠体重变化 |
| 4.2.3 小鼠行为学测试 |
| 4.2.4 组织取材 |
| 4.2.5 石蜡切片的制作 |
| 4.2.6 ELISA检测血清中及中脑组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量 |
| 4.2.7 中脑组织MDA的测定 |
| 4.2.8 中脑组织SOD、GSH-Px、GR测定 |
| 4.2.9 免疫组化 |
| 4.2.10 Western blot |
| 4.2.11 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 活性多肽对MPTP诱导的PD小鼠体重的影响 |
| 4.3.2 活性多肽对MPTP诱导的PD小鼠行为障碍的影响 |
| 4.3.3 活性多肽对MPTP诱导的PD小鼠黑质多巴胺神经元损伤的影响 |
| 4.3.4 活性多肽对MPTP诱导的PD小鼠细胞凋亡的影响 |
| 4.3.5 活性多肽对MPTP诱导的PD小鼠氧化应激的影响 |
| 4.3.6 活性多肽对MPTP诱导的PD小鼠炎症反应的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:英文缩写语中文对照 |
| 致谢 |
| 成果 |
（7）ε-viniferin通过增强SIRT3对FOXO3去乙酰化功能在帕金森病模型中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :ε-viniferin抑制6-OHDA介导的大鼠黑质多巴胺能神经元损伤 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及生产公司 |
| 2.2 主要配制试剂及其配制方法 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验动物 |
| 2.4.26 -OHDA大鼠帕金森病模型的建立 |
| 2.4.3 实验分组 |
| 2.4.4 大鼠帕金森病行为学检测 |
| 2.4.5 取材及石蜡切片制备 |
| 2.4.6免疫荧光检测LC3 |
| 2.4.7 TUNEL染色检测多巴胺能神经元凋亡 |
| 2.4.8 Western blot检测凋亡及自噬蛋白表达 |
| 2.4.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ε-viniferin对帕金森病大鼠行为学异常的缓解作用 |
| 3.2 ε-viniferin抑制黑质多巴胺能神经元凋亡,促进抗氧化物表达 |
| 3.3 ε-viniferin增强自噬相关标志物表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :ε-viniferin通过对SIRT3 对FOXO3 去乙酰化作用在鱼藤酮介导的帕金森病细胞模型神经保护作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及生产公司 |
| 2.2 主要配制试剂及其配制方法 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 SH-SY5Y细胞培养与处理 |
| 2.4.2 鱼藤酮介导的帕金森病细胞模型建立 |
| 2.4.3 SH-SY5Y细胞转染SIRT3和FOXO3 sh RNA |
| 2.4.4 实验分组 |
| 2.4.5 MTT检测细胞生存活力 |
| 2.4.6 细胞内活性氧检测 |
| 2.4.7 线粒体膜电位检测 |
| 2.4.8 细胞内ATP水平测定 |
| 2.4.9 细胞凋亡水平测定 |
| 2.4.10 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.4.11 FOXO3免疫共沉淀 |
| 2.4.12 FOXO3的亚细胞定位 |
| 2.4.13 免疫荧光检测SIRT3的表达 |
| 2.4.14 透射电子显微镜观察线粒体形态 |
| 2.4.15 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ε-viniferin通过SIRT3-FOXO3 途径保护细胞缓解神经元损伤 |
| 3.2 ε-viniferin减轻鱼藤酮诱导的线粒体去极化 |
| 3.3 ε-viniferin降低鱼藤酮诱导的氧化应激损伤 |
| 3.4 ε-viniferin增加ATP的生成 |
| 3.5 ε-viniferin减轻鱼藤酮诱导的细胞凋亡 |
| 3.6 ε-viniferin促进FOXO3 的去乙酰化 |
| 3.7 ε-viniferin上调SIRT3 表达并促进FOXO3 核定位 |
| 3.8 ε-viniferin 促进线粒体稳态相关蛋白的表达 |
| 3.9 ε-viniferin促进线粒体维持正常形态 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）神经干细胞和嗅鞘细胞联合移植促进PD大鼠神经功能修复及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 动物准备 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 实验试剂及实验仪器 |
| 1.3 大鼠PD模型制备 |
| 2 细胞培养及鉴定 |
| 2.1 细胞实验试剂及实验仪器 |
| 2.2 NSCs的培养、鉴定与分化 |
| 2.3 OECs的培养与鉴定 |
| 3 细胞移植 |
| 3.1 实验试剂来源 |
| 3.2 细胞准备 |
| 3.3 移植手术 |
| 4 大鼠行为学及焦虑程度测试 |
| 4.1 实验仪器 |
| 4.2 旷场试验 |
| 4.3 平衡木测试 |
| 4.4 握力测试 |
| 5 移植后NSCs和 OECs的检测 |
| 5.1 实验试剂及实验仪器 |
| 5.2 组织样品预处理及荧光观察 |
| 6 大鼠Str和 SN中 TH和 Str中炎性因子TNF-α,IL-1β及 IL-4 的表达变化 |
| 6.1 实验试剂及实验仪器 |
| 6.2 组织蛋白提取与Western blot |
| 7 技术路线图 |
| 8 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 细胞体外培养及鉴定 |
| 1.1 NSCs体外培养及分化 |
| 1.2 OECs体外培养 |
| 1.3 NSCs鉴定与分化 |
| 1.4 OECs的鉴定 |
| 2 移植前细胞标记及移植后检测 |
| 2.1 移植前细胞标记 |
| 2.2 移植后检测 |
| 3 大鼠运动行为学实验结果 |
| 3.1 旷场试验结果 |
| 3.2 平衡木测试结果 |
| 3.3 握力测试结果 |
| 4 大鼠焦虑程度 |
| 5 大鼠Str及 SN中 TH的表达变化 |
| 6 大鼠Str中炎性因子TNF-α,IL-1β及 IL-4 的表达变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）α-硫辛酸通过FBXL5-IRP2通路干预帕金森病模型铁代谢的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（10）虫草素对PD模型多巴胺能神经元的保护作用及其对MAPK和PI3K/Akt-Nrf2通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 动物 |
| 2.2 细胞系 |
| 2.3 药品和试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 药品和试剂的配制 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 动物实验 |
| 3.1.1 动物分组及给药 |
| 3.1.2 行为学检测 |
| 3.1.3 高效液相-电化学(HPLC-ECD)法检测Str内DA及其代谢产物含量 |
| 3.1.4 脑组织石蜡切片制备 |
| 3.1.5 免疫组织化学法检测TH免疫阳性细胞 |
| 3.1.6 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 3.1.7 测定小鼠SN区MDA含量、SOD和GSH-Px活性 |
| 3.1.8 Western blotting法检测Cleaved Caspase-3、Bax、 Bcl-2、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白的表达 |
| 3.2 细胞实验 |
| 3.2.1 MPP+制备PD细胞模型 |
| 3.2.2 细胞分组 |
| 3.2.3 MTT法测定细胞存活率 |
| 3.2.4 Hoechst 33258核染色观察细胞凋亡数量 |
| 3.2.5 流式细胞仪分析PC12细胞凋亡率 |
| 3.2.6 DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量 |
| 3.2.7 Western blotting法测定Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、p53、Nrf2、HO-1、Akt和p-Akt蛋白的表达 |
| 3.2.8 加入PI3K抑制剂实验中的细胞分组及检测指标 |
| 3.3 统计学处理 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 Cor对MPTP-PD小鼠DA能神经元凋亡的保护作用及对MAPK信号通路的影响 |
| 4.1.1 Cor对PD小鼠DA能神经元的保护作用 |
| 4.1.2 Cor抑制PD小鼠DA能神经元凋亡 |
| 4.1.3 Cor提高PD小鼠SN区抗氧化能力 |
| 4.1.4 Cor抑制MAPK信号通路的激活 |
| 4.2 Cor通过激活PI3K/Akt-Nrf2通路抑制MPP~+诱导的PC12细胞氧化应激损伤 |
| 4.2.1 PD细胞模型的制备 |
| 4.2.2 Cor提高PD细胞存活率 |
| 4.2.3 Cor抑制MPP~+诱导的PC12细胞凋亡 |
| 4.2.4 Cor对氧化应激相关的Nrf2通路以及PI3K/Akt通路的影响 |
| 4.2.5 加入P13K抑制剂后Cor对PD细胞模型的影响 |
| 结果小结 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 丝裂原活化蛋白激酶信号通路与帕金森病关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、Protective Effectof GSH on PD Model Induced by 6-OHDA In Vitro（论文参考文献）
- [1]激活大麻素2型受体对6-OHDA单侧损毁大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用研究[D]. 潘东. 青岛大学, 2021(02)
- [2]五子衍宗丸对帕金森病模型小鼠的防治作用及机制研究[D]. 李艳荣. 山西中医药大学, 2020(07)
- [3]Salsolinol合成酶及其产物导致多巴胺能神经细胞死亡的机制研究[D]. 郑晓彤. 北京工业大学, 2020(06)
- [4]帕金森氏病发病过程中多巴胺反应性氧化产物的蛋白修饰作用研究[D]. 李义. 遵义医科大学, 2020(12)
- [5]LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究[D]. 吕颖. 北京协和医学院, 2020(05)
- [6]活性多肽对MPTP/MPP+诱导帕金森病模型的神经保护及机制探究[D]. 刘钰爽. 广东药科大学, 2020(01)
- [7]ε-viniferin通过增强SIRT3对FOXO3去乙酰化功能在帕金森病模型中作用及机制研究[D]. 张硕. 中国医科大学, 2020(01)
- [8]神经干细胞和嗅鞘细胞联合移植促进PD大鼠神经功能修复及机制研究[D]. 周囡囡. 青岛大学, 2019(03)
- [9]α-硫辛酸通过FBXL5-IRP2通路干预帕金森病模型铁代谢的分子机制研究[D]. 邰胜燕. 贵州医科大学, 2019(07)
- [10]虫草素对PD模型多巴胺能神经元的保护作用及其对MAPK和PI3K/Akt-Nrf2通路的影响[D]. 樊逸云. 扬州大学, 2019