一、用鸡胚检测鸡马立克氏病疫苗的免疫效果（论文文献综述）
许曾焜[1]（2020）在《表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价》文中提出重组活载体疫苗是一种以病毒或细菌为载体,将外源保护性抗原基因通过基因工程技术插入载体中并使之表达的疫苗。重组活载体疫苗具有诱导机体产生广泛、长期的免疫反应等优点,并且此类疫苗可同时表达多种抗原,具有成为多价或多联疫苗的潜力,是当下和未来疫苗研制的主要方向之一。马立克氏病病毒（MDV）属疱疹病毒科,其较大的基因组和多个可供外源基因插入的复制非必须区域使之成为构建重组活载体疫苗的良好载体,其中血清3型MDV为火鸡疱疹病毒（HVT）,做为疫苗来预防马立克氏病已有50余年,同时HVT也常被用做载体来表达外源基因。HVT作为载体有许多优势:可接种1日龄雏鸡,不受母源抗体抗扰;非人畜共患,使用安全;一次接种后可持续刺激抗体的产生,无需多次加强免疫;相对于其他全病毒疫苗,只表达保护性抗原成分,不存在毒力返强的风险,并且便于进行免疫监控。新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）强毒株引起的一种禽类烈性传染病,该病致死率极高。对禽类养殖业造成了不可估量的损失。近年来,非典型新城疫的发病率不断增加,呈不同程度的地方性流行,并且在免疫鸡群中也有发生。造成这种现象的原因主要为高水平母源抗体导致的传统疫苗效力降低和ND流行株与疫苗株基因型不匹配等。因此,研制新型有效的疫苗对于ND的防控具有重要意义。本研究旨在建立能够高效拯救病毒的HVT粘粒拯救系统,再将NDV流行株F基因的表达框架插入其中,构建重组病毒并评价其免疫效力,为有效防控新城疫和马立克氏病提供技术支持,具有重要的应用价值。本研究将HVT FC126株基因组分段插入Fosmid粘粒载体pCC1Fos中,构建了FC126株基因组粘粒文库;在此基础上,选取粘粒组合,共转染鸡胚成纤维细胞,建立了HVT FC126疫苗株多片段粘粒拯救系统。通过该拯救系统,将NDV基因VII型流行株LHLJ/01/06株F基因表达框架插入HVT基因组HVT065和HVT066基因之间,构建了重组病毒rHVT-NDV-F。PCR和测序鉴定表明,F基因表达框架成功插入FC126株基因组。间接免疫荧光试验表明,重组病毒rHVT-NDV-F能够表达F蛋白。rHVT-NDV-F重组病毒与其亲本病毒HVT FC126株在体外细胞上的复制能力无显着差异。经过连续传代后,重组病毒rHVT-NDV-F基因组中的F基因表达框架可稳定存在并表达F蛋白。对rHVT-NDV-F重组病毒进行攻毒免疫保护试验,重组病毒rHVT-NDV-F对NDV基因IX型强毒F48E9株的保护率为80%,对NDV基因VII型流行株LHLJ/01/06的保护率为70%。综上,本研究构建了HVT FC126株病毒拯救系统,及能够表达NDV基因VII型F蛋白的重组病毒rHVT-NDV-F;rHVT-NDV-F的体外复制能力与亲本株无显着影响且具有良好的遗传稳定性;该重组病毒能够对当前流行的基因VII型NDV攻毒提供较好的保护,具有作为ND重组HVT活载体疫苗的潜力。
黄金[2]（2020）在《松花粉多糖对胚胎感染ALV-J亚型的免疫调理作用》文中指出禽白血病（Avian Leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）和禽肉瘤病毒（Aviansarcomavirus,ASV）群中的病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分增生为主的肿瘤性传染病的统称。感染鸡生产性能下降,引起免疫抑制,产生肿瘤,给养禽业造成巨大的经济损失。该病主要通过垂直传播和水平传播,目前没有有效的免疫疫苗或治疗药物,只能通过种群净化控制。鸡胚接种最早应用于鸡胚免疫接种,有研究表明,适当的鸡胚接种不影响雏鸡孵化率,可以较早的产生免疫力,目前已广泛应用于孵化场。鸡胚接种技术在近几年已运用至接种各类营养物质、中药提取液及植物多糖,具有提高生产性能、抗病毒等作用。松花粉多糖（Pinus pollen polysaccharide,PPPS）是一种天然无毒的植物多糖,本实验室之前研究显示,松花粉多糖具有良好的抗病毒、增强机体免疫力等作用,同时对抗B亚群和J亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J）具有良好的活性,但是是否可以鸡胚接种松花粉多糖,接种后是否同样也具有抗胚胎感染J亚群禽白血病病毒、改善免疫抑制的作用,目前尚不清楚。本文主要研究松花粉多糖作为一种免疫增强剂,通过鸡胚接种的方法探索松花粉多糖对人工接种ALV-J的鸡胚及其出雏后雏鸡生长发育与免疫调理作用的影响。首先,人工建立胚胎感染ALV-J模拟垂直传播的模型,经鸡胚接种不同浓度的松花粉多糖溶液,对鸡胚内接种病毒量、多糖接种剂量进行探索。其次,对经鸡胚接种松花粉多糖的雏鸡的生长发育状况、抗病毒效果、免疫调理作用及对新城疫疫苗的免疫增强作用进行评估。本研究分为以下两个部分:1.胚胎感染ALV-J鸡胚模型的建立及鸡胚接种松花粉多糖剂量的筛选在试验中,选取SPF鸡胚孵化至第8天,人工接种不同稀释度的ALV-J病毒液(101、102、103、104 TCID50),72 h内对比存活率,选取近100%鸡胚存活率的最大病毒接种量,作为构建胚胎感染ALV-J鸡胚模型的病毒接种剂量(103 TCID50)。选取SPF鸡胚孵化至第9天尿囊腔接种不同浓度的松花粉多糖溶液0.2 mL（200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.125 mg/mL）,72 h内比较鸡胚存活率,筛选鸡胚存活率最高的3个松花粉多糖浓度（50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL）作为鸡胚接种的多糖剂量,从高到低分别为0.2 mL高剂量组（HPPPS）50 mg/mL、中剂量组（MPPPS）25 mg/mL、低剂量组（LPPPS）12.5 mg/mL。2.鸡胚接种松花粉多糖对胚胎感染ALV-J鸡的生长发育情况、抗病毒及免疫调理作用选取8日龄的SPF鸡胚,卵黄囊接种0.1 mL ALV-J病毒液(103TCID50),接种后继续孵化24 h,再经尿囊腔接种0.2 mL不同剂量的松花粉多糖溶液,继续孵化至出壳;孵化出壳的雏鸡,分别在第7、14、21、28、35、42、49天采集雏鸡组织器官、泄殖腔棉拭子、新鲜血液、血清等样品进行相关指标的检测。试验证明,鸡胚接种PPPS溶液对生长发育有良好的改善作用,HPPPS组对比胚胎感染ALV-J鸡胚表现出鸡胚发育良好、胚体无出血,出雏后生长发育正常、无免疫器官萎缩现象、未有肿瘤产生等。而MPPPS组、LPPPS组具有一定的改善作用,但与HPPPS组相比,作用不明显。说明PPPS作为一种免疫增强剂,可以通过鸡胚接种的方式改善胚胎感染ALV-J鸡的生长发育。试验证明,鸡胚接种PPPS溶液有良好的抗病毒和免疫调理的作用,HPPPS组对胚胎感染ALV-J鸡淋巴细胞的转换率、CD4分子、CD8分子、IL-2、IFN-γ在血清中的浓度都有明显的提升作用,改善免疫抑制,有效减少了感染鸡向外界环境排毒,并且延迟排毒时间接近一周;MPPPS组对出雏后短期内有较为明显的改善作用,后期虽有一定的免疫调理作用,但与ALV-J组相比,差异不明显;而LPPPS组的免疫调理作用不明显,与ALV-J组相比差别不大;MPPPS组和LPPPS组虽在一定程度上减少了排毒量,延迟了个别鸡的排毒,但抑制效果不显着。说明PPPS溶液可以降低胚胎感染ALV-J的致病作用,对出雏后的雏鸡具有抗病毒活性和免疫调理作用,同时通过鸡胚接种PPPS溶液,对于雏鸡免疫的新城疫N79株弱毒疫苗有提高抗体水平、延迟抗体消退等作用。综上所述,鸡胚接种PPPS溶液可有效控制ALV-J的垂直传播,可应用于抑制胚胎感染ALV-J鸡的胚内病毒感染和出雏后早期的控制,接种一定剂量的PPPS溶液具有显着的抗病毒和免疫调理作用。
杨帆[3]（2020）在《黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究》文中认为国内外一系列研究表明黄酮类化合物对诸多病毒有抗病毒活性,如疱疹病毒（herpes virus,HSV）、登革热病毒（dengue virus,DENV）、寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）等。但是在兽医领域尤其是抗马立克氏病的研究还鲜有报道。近年来随着马立克氏病病毒（marek’s disease virus,MDV）的毒力不断净化,在免疫后的鸡群也零星有MDV发病的报道。目前使用的MDV疫苗能防止肿瘤的发生和免疫抑制,但病毒仍然能在体内复制并向外排毒。因此筛选和研究MDV的抗病毒药物,尤其是中成药对于预防和控制临床中马立克氏病病毒传播有重要意义。本研究根据发表的研究结果,以及不同黄酮类化合物的化学结构选择了两大类黄酮类化合物进行单独和联合用药抗MDV复制的研究,以期为临床抗MDV药物研发与应用提供理论依据。1.黄酮类化合物白杨素（Chrysin）和染料木素（Genistein）对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。以往报道表明黄酮类化合物白杨素和染料木素具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗过敏等作用。为探索这两者对马立克氏病病毒复制的影响,从以下几个方面设计实验:药物是否对CEF细胞有毒性及其最大安全浓度;药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用;药物是否在病毒进入细胞前、病毒吸附细胞的过程、病毒吸附进入细胞后有抑制作用;药物是否能直接影响病毒的感染性甚至直接杀灭病毒。以上试验利用Real-time PCR、Western Blot及噬斑计数等方法分析马立克病毒在CEF细胞中的复制情况。结果表明染料木素能较好的抑制马立克病毒在CEF细胞中的复制,抑制作用具有时间和剂量依赖性,噬斑计数试验的结果表明病毒抑制率为87.5%,并且还能够直接影响病毒的感染性。另外,对MDV感染CEF细胞因子的表达进行了检测,结果显示与未加染料木素药物处理组相比,染料木素诱导病毒感染细胞中IRF-7显着,同时IFN-β表达也上调明显,两者呈现正相关关系。这表明染料木素可能通过诱导细胞产生IFN-β从而抑制MDV在CEF细胞中的复制。此外,染料木素药物处理显着增加炎症因子IL-6和IL-1β的表达,提示细胞的炎症反应也与MDV感染相关。与染料木素相比,白杨素几乎没有抑制MDV复制的作用,甚至还能促进MDV在CEF中的复制。2.黄芩苷（baicalin,BA）、表儿茶素没食子酸酯（（-）-Epicatechin gallate,ECG）和柚皮素（（±）-Naringenin）对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。首先检测了不同的药物对CEF细胞的毒性,接着探究药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用,以及具体在病毒复制哪个阶段发挥作用。同时也检测了这三种药物是否能直接影响MDV的感染性。另外对病毒感染CEF细胞中的细胞因子变化也进行了检测分析。实验结果表明黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯对MDV的复制有较强抑制作用,抑制率为90%和91.6%,而柚皮素效果一般,抑制率为41.6%。细胞因子检测结果表明,尽管BA和ECG处理细胞组IRF-7表达明显减少,但抗病毒因子IFN-β的表达没有影响,这一结果表明由MDV感染引起的IFN-β表达增加可能受到其他转录因子的调节。此外,MDV感染的CEF细胞中BA处理后,促炎因子IL-1β和IL-6的表达略有下降,但差异不显着,这可能与BA在不同细胞中具有不同的抗病毒机制相关。而ECG处理组IL-6的表达显着降低,表明ECG可以抑制炎性因子的表达。3.染料木素、黄岑苷和表儿茶素没食子酸酯联合应用对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。与单味中药相比,复方中药可能具有更好的抗病毒作用。将单一黄酮类化合物抑制MDV复制效果较好的黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和染料木素进行两两配伍,分成黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯,黄芩苷和染料木素,表儿茶素没食子酸酯和染料木素以及黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和染料木素三者配伍的这四个组。首先检测了这四组药物对CEF细胞的毒性,接着探究药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用。结果表明:这几组复合药物的抑制效率不如单一药物的高。
石梦雅[4]（2020）在《2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究》文中提出马立克氏病（Marek’s diseases,MD）由马立克氏病病毒（Marek’s diseases virus,MDV）引起的一种传染性T淋巴细胞增生性疾病。在过去的六十年,随着MD疫苗的成功研制及广泛应用,有效控制了疾病的发生。但近年来,特超强毒株的出现和野毒株毒力的增强成为疫苗免疫失败的主要原因,给养禽业带来新的威胁以及更大的经济损失。因此,有必要对鸡群中自然流行的MDV进行流行病学监控,对了解病毒的进化趋势以及现有MD疫苗保护力都具有重要意义。广西是我国优质鸡的生产大省,具有品种繁多和饲养周期长等特点,在生产中更容易发生MDV的感染。本课题对2017-2019年广西及其周边地区MDV进行分子流行病学调查,通过细胞培养进行病毒分离、IFA鉴定和致瘤基因meq的序列测定,共分离到23株MDV分离株。序列分析结果显示,23株分离株相似性较高,与中国广西早期分离株GX0101亲缘性较近;根据其氨基酸位点及系统进化树分析,均有中国超强或特超强毒株的特点;对分离株病例背景进行分析发现,均从免疫过MD疫苗的鸡群中所分离,且多以与其他两个肿瘤病病毒（禽白血病病毒和网状内皮组织增殖病病毒）混合感染（73.9%,17/23）。结合本课题所分离的23株MDV的meq基因和Gen Bank数据库里过去55年（1964-2019）已发表的149株MDV meq基因序列,分别构建三个数据集,通过贝叶斯系统动力学方法进行分析。系统发育树显示,全球172株MDV被分为2个clusters,Cluster 1有71株,包括温和型毒株、疫苗毒株和国外强毒株;Cluster 2有101株,主要以中国强毒分离株为主,本课题的23株分离株构成一个相对独立的进化簇;地理系统分析显示,揭示中国早期的MDV源自国外（美国、日本）,并呈现由北方到南方蔓延扩散的趋势;种群动态分析发现,自2005年起,中国分离株meq基因的遗传多样性呈现持续增长趋势,并分别在2007-2012和2015-2019呈现强的上升趋势。本课题对从免疫了MD疫苗的种鸡群中临床暴发MD病鸡中分离到的GX18NNM4分离株进行了致病性研究,内容包括人工感染试验和商品疫苗免疫保护试验,从临床肿瘤发生及其病理组织学观察、MDV病毒载量的动态检测、细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平检测、免疫保护指数（protection index,PI）等方面进行评价,探究分离株的致病性以及现有商品疫苗的保护效果。未免疫攻毒组鸡只出现垂翅、羽毛粗乱、消瘦、精神沉郁等临床症状,最早于攻毒后16天出现死亡,剖检发现在心脏、肝脏、脾脏和胰腺等器官有肿瘤;免疫CVI988和814疫苗攻毒组的鸡只最早出现死亡分别在攻毒后22天和18天,剖检发现部分鸡只心脏、胰腺等器官有肿瘤;未免疫攻毒组外周血淋巴细胞的病毒载量在攻毒后28天达到峰值103.7copies/106个细胞,而两个疫苗免疫攻毒组的病毒载量在各个检测时间点均低于未免疫攻毒组的;对MDV感染鸡的脾脏和盲肠扁桃体进行PD-1和PD-L1 m RNA表达水平检测,发现PD-1或PD-L1 m RNA脾脏的表达明显高于盲扁（P<0.05）,但总体趋势基本相同,值得注意的是,在未免疫攻毒组中表达水平显着高于免疫攻毒组（P<0.05）。未免疫攻毒组肿瘤发生率为70.7%（41/58）,CV1988疫苗攻毒组的肿瘤发生率为42.5%（17/40）,保护指数39.9%。免疫814疫苗攻毒组的肿瘤发生率为27.5%（11/40）,保护指数61.1%。本课题研究揭示了早期中国MDV的来源及其传入我国后的传播扩散方向以及中国分离株meq基因遗传多样性的变化规律,同时证明目前MD在南方优质鸡中仍呈地方性的流行并严重危害养鸡业,出现了目前的商品疫苗已不能提供完全保护的vv或vv+MDV的分离株。
樊三玲,李丽,罗青平,任助,王红琳,唐国毅,罗玲,张腾飞,商雨,张文婷,张蓉蓉,曾驰,邵华斌,温国元[5]（2018）在《鸡胚免疫疫苗的研究现状及展望》文中指出鸡胚免疫技术是指对孵化后期的鸡胚接种活疫苗,使雏鸡出壳时,或出壳几天内就可获得主动免疫力。与传统免疫方式相比,鸡胚免疫具有填补免疫空白期、免疫效果均一确实、高通量自动化接种、节省人力成本等优点。目前,鸡胚免疫的最适接种日龄和接种方式为对18日龄鸡胚采用羊膜腔途径接种。鸡胚免疫技术已经在30多个国家得到应用,在美国已有80%肉鸡采用鸡胚免疫预防马立克氏病。除马立克氏病和鸡传染性法氏囊疫苗外,其余禽病的鸡胚接种疫苗尚处研发阶段。本研究论述了影响鸡胚接种的因素、鸡胚免疫的优缺点及国内外鸡胚疫苗的研发进展等,展示了鸡胚免疫疫苗的良好应用前景。
楚电峰[6]（2018）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验》文中进行了进一步梳理H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）对鸡的致病性低,仅引起轻微的呼吸道症状和短时间产蛋下降,但混合感染或继发感染其他病原可导致较高的发病率和死亡率。H9亚型禽流感对养鸡业危害较大,免疫接种是防控该病的主要策略之一。目前生产上常用的H9亚型禽流感疫苗为全病毒灭活疫苗,这类疫苗仅能诱导产生高水平的循环抗体,而不能有效地激发细胞免疫和黏膜免疫应答。近年来,以火鸡疱疹病毒（herpesvirus of turkey,HVT）为载体的重组病毒活疫苗已经成为研究热点。一方面,HVT具有较多的复制非必需区可供外源基因插入;另一方面HVT是常用的家禽疫苗,可供1日龄雏鸡免疫或18日龄胚内注射免疫,能够更早地诱导免疫应答。本研究旨在以HVT为载体,构建能稳定表达H9亚型AIV血凝素（HA）的重组病毒活疫苗候选毒株,与现有灭活疫苗组合使用,以提供更加有效的免疫保护。1.rHVT-YBF003株的构建及其遗传稳定性与安全性评价重组病毒构建:对近年分离的21株H9亚型AIV进行HA基因测序和遗传进化分析,发现这些毒株处于h9.4.2.5分支,为目前H9亚型AIV的优势流行毒株。因此,本研究选取其中的YBF003株,用于重组病毒的构建。采用RT-PCR扩增H9亚型AIV YBF003株的HA基因,将HA基因插入到含HVT FC-126疫苗株同源臂和CMV启动子的载体,构建转移载体pFR-H9。将pFR-H9与表达绿色荧光蛋白（EGFP）的重组HVT（rHVT-EGFP）基因组共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,以同源重组的方式将rHVT-EGFP的EGFP基因替换为HA基因表达盒,获得重组病毒rHVT-YBF003株。在CEF单层上反复纯化rHVT-YBF003株,直至所有重组病毒空斑均不带绿色荧光。经PCR鉴定,HA基因表达盒正确插入到HVT基因组;进一步进行Western-blot和IFA鉴定,rHVT-YBF003株能够表达HA蛋白。分别用rHVT-YBF003株和HVTFC-126株感染CEF,两者的生长特性并无显着差异。将rHVT-YBF003株在CEF上连续传20代,再接种于CEF单层,待形成典型空斑后,通过PCR从随机挑选的20个空斑中均能检测到HA基因表达盒;将第20代rHVT-YBF003株接种于CEF单层,通过间接免疫荧光试验（IFA）证明rHVT-YBF003株能够稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。重组病毒的遗传稳定性:1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103 PFU/只;21日龄时,从血液中分离淋巴细胞,再接种于另一批次1日龄SPF鸡（3.0×106个淋巴细胞/羽份）。如此反复传代6次,经PCR检测传代后的rHVT-YBF003株中均存在HA基因,IFA证明传代后的重组病毒仍能稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103PFU/羽份;每隔7天采血分离淋巴细胞,再接种于CEF单层,进行病毒分离和计数。结果显示,rHVT-YBF003株在鸡体内的病毒载量不断提高,至9周龄时,病毒载量达到峰值,此后呈下降趋势,直到第20周龄时仍能检测到少量重组病毒存在,说明该重组病毒可在鸡体内维持较长时间。重组病毒的安全性:以5.0X 104PFU/羽份的rHVT-YBF003株接种1日龄SPF鸡,对鸡群进行连续8周的临床观察、生长状况监测,结果显示接种重组病毒的试验鸡精神、采食、饮水均正常,剖检和组织切片检查均未发现病理变化。以5.0×104PFU/头份的rHVT-YBF003株接种4周龄ICR小鼠,接种后ICR小鼠的采食、精神均正常;接种后14天,对小鼠内脏器官检查并称重,显示接种重组病毒对小鼠无不良影响。因此,重组病毒对易感动物和非易感动物均具有良好的安全性。2.rHVT-YBF003株的免疫效力评价对SPF鸡的免疫保护效力试验:试验分为4组,分别为胚内免疫组、1日龄免疫组、灭活疫苗组和空白对照组;分别对18日龄SPF鸡胚胚内注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、1日龄SPF雏鸡皮下注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、14日龄SPF雏鸡肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗（YBF003株）、1日龄SPF雏鸡皮下注射0.5 mLPBS/只。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒（静脉注射1.0X 1 07 5 EID50/羽份）。28日龄时,胚内免疫组和1日龄免疫组的HI抗体效价分别为4.7±0.60和4.5±0.30,胚内免疫组比1日龄免疫组的HI抗体最大提高0.3±0.62个滴度,两组均能提供一定的早期保护;灭活疫苗组的HI抗体效价为6.5±0.75,攻毒保护率为50%;空白对照组的抗体为1.3±0.12,攻毒保护率为0%。对商品鸡的免疫保护效力试验:对商品鸡的分组及处理方式同SPF鸡。另外,增加重组病毒与灭活疫苗联合免疫组,该组于1日龄时颈部皮下注射5.0×103PFU/羽份的rHVT-YBF003株,14日龄时经肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗（YBF003株）。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒（静脉注射1.0×107.5EID50/羽份）。28日龄时,胚内免疫组、1日龄免疫组和灭活疫苗免疫组的HI抗体效价分别为4.3±0.49、4.1 ±0.89和6.2±0.34,攻毒保护率均为50%以上,差异不显着;而联合免疫组的抗体效价为7.8±0.45,攻毒保护率为70%;空白对照组的抗体为1.0±0.74,攻毒保护率为10%。3.重组病毒种子批建立与大规模培养工艺研究培养工艺研究:为提高重组病毒的效价,同时获得规模化生产条件下的重组病毒培养技术参数。我们对采用细胞工厂进行大规模培养的方法进行了研究。结合该病毒的培养特性,分别从宿主细胞的接种密度、种毒接种剂量和收毒时间等方面对培养工艺进行摸索,最终制定了最优的病毒培养技术工艺:即采用十层细胞工厂（总面积为6335 cm2,培养液为1200mL）,CEF密度为2.5×106个/mL时,接种3.0×106PFU的重组病毒,培养72 h,收获感染细胞,按照每个细胞工厂分装50支冻存管的标准进行收获,每支冻存管分装量为1.8mL,其收获的病毒效价可达5.0×106PFU/支以上,即成品疫苗可达5000 PFU/羽份以上,远高于2000 PFU/羽份的国家标准。种子批建立:将所收获的重组病毒分为原始种子、基础种子和生产种子。原始种子包括重组病毒的F1～F6代,基础种子包括F7～F12代,生产种子包括F13～F17代。并在各级种子批中随机选取一个代次的种子进行无菌检验、支原体检验、鉴别检验、安全性检验、免疫原性检验和外源病毒检验。无菌检验和支原体检验中,三个代次种毒的检验结果均为阴性;鉴别检验中,对HVT鉴定部分采用间接免疫荧光试验,结果显示,三个代次种毒形成的病毒空斑均呈现绿色荧光,说明形成的病毒空斑为HVT,对HVT表达的HA蛋白鉴定采用Western-blot方法鉴定,结果显示,三个代次种毒均能表达HA蛋白;安全性检验中,三个代次的种毒接种1日龄SPF鸡,免疫剂量为3.0×104PFU/羽,免疫后观察90天,所有免疫鸡均未观察到临床症状;外源病毒检验中,分别于1日龄和21日龄时,采用滴鼻、点眼（剂量为3.0×104PFU/羽份）和肌肉注射（剂量为3.0×104PFU/羽份）三种途径同时接种重组病毒,42日龄时采集血清,均未检测到外源病毒的抗体。结果显示,三个代次的重组病毒均符合种毒质量标准。综上所述,本研究构建了一株表达H9亚型AIV HA蛋白的重组HVT（rHVT-YBF003株）。在体内和体外传代过程中,rHVT-YBF003株所插入的HA基因均能稳定表达。在安全性评价方面,该重组病毒对易感和非易感动物均不具有致病性。该重组病毒可用于1日龄雏鸡和18日龄鸡胚内的早期免疫,虽然HI抗体低于灭活疫苗,但对H9亚型AIV的保护率等同于灭活疫苗。重组病毒与灭活疫苗联合使用具有协同效应,对H9防控效果更好。本研究还建立了种子批,并制定了符合大规模生产的重组病毒培养工艺,为将来工厂化生产打下了基础。
李凯[7]（2018）在《表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组马立克氏病病毒活载体疫苗研究》文中指出鸡马立克氏病（Marek’s disease,MD）和鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）是危害我国养禽业健康发展的两种重要的免疫抑制病,其广泛流行给我国养禽业带来了巨大的经济损失。疫苗是控制MD和IBD的主要手段。目前MD主要通过血清1型弱毒疫苗预防。用于预防IBD的疫苗主要是传统活疫苗和灭活疫苗,但传统疫苗不仅易于受到母源抗体的干扰,而且IBD中等毒力活疫苗可以造成一定程度的法氏囊损伤和免疫抑制,因此迫切需要研制更加安全有效的新型IBD疫苗。本研究对我国IBDV超强毒（wIBDV）分离株的遗传变异、抗原性和致病性进行了分析。结果发现,我国wIBDV毒株正在发生持续性进化。与我国早期wIBDV分离株相比,我国2000年后分离的vvIBDV毒株的基因组A、B节段均有一定程度的变异发生;我国vvIBDV毒株与欧洲wIBDV参考毒株的抗原性无显着差异;目前wIBDV毒株的致病性有增强趋势。wIBDV HLJ0504毒株是目前我国的wIBDV流行毒株。鸡马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）弱毒疫苗株是构建重组活载体疫苗的理想载体。为了构建表达IBDV VP2基因的重组MDV活载体疫苗,本研究将MDV血清1型弱毒疫苗814株基因组DNA分段插入Fosmid粘粒,构建了 814株基因组粘粒文库;在此基础上,选取粘粒组合,建立了 MDV 814疫苗株多片段粘粒拯救系统。将eGFP基因表达盒分别插入MDV 814 株基因组不同位点,拯救获得5株稳定表达eGFP的重组病毒。经鉴定,5株重组病毒的复制特性与原疫苗株病毒基本一致;eGFP基因在UL区三个位点的表达水平无显着差异,高于US2位点,US10位点的表达水平最低。将wIBDV HLJ0504株的VP2基因分别插入MDV 814株基因组的UL41、US2、US10位点,获得3株表达VP2基因的重组MDV（r814UL41VP2、r814US2VP2 和 r814US10VP2）。其中,r814US2VP2免疫SPF鸡后,能够对wIBDV和wMDV的攻毒提供完全保护。通过r814US2VP2（命名为rMDV-VP2株）最小免疫剂量试验,确定了该疫苗的使用剂量为2000PFU/羽份。rMDV-VP2疫苗对wIBDV的保护效果与商品化Vaxxitek HVT-IBD疫苗相当,优于IBD中毒力活疫苗;rMDV-VP2疫苗对wMDV的保护效果与商品化MDV血清1型弱毒疫苗相当,显着优于Vaxxitek HVT-IBD疫苗。rMDV-VP2疫苗对不同的wIBDV分离株都能提供高效免疫保护,可以用于不同品种的商品蛋鸡和地方品种鸡。rMDV-VP2疫苗的免疫保护可以覆盖IBDV的易感期（3-8周龄）,并具有至少6个月的抗体持续期。rMDV-VP2疫苗对靶动物和非靶动物均是安全的;rMDV-VP2疫苗的水平传播能力极低,无垂直传播现象;疫苗株病毒免疫鸡后的排毒水平极低,在使用环境中不存在该疫苗株病毒及其病毒DNA的残留。综上所述,rMDV-VP2疫苗安全有效,可以作为一种IBD-MD重组二联活疫苗用于IBD和MD的预防。
洪艳芬[8]（2018）在《传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选》文中研究指明鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）引起的一类急性、高度接触性呼吸道疾病,由于鸡传染性支气管炎病毒容易发生变异,导致新的血清型和基因型毒株不断出现,目前使用的商品化活疫苗如H120、H52、Ma5等Mass型疫苗株对我国主要流行毒株的保护效果并不是很理想,因此通过调查当地IBV流行株的进化情况,培育筛选弱毒活疫苗,对预防和控制IB的发生和流行具有重要意义。本研究自20162017年期间从广东省各地区采集的疑似病料中分离到16株IBV分离株,生物学特性研究表明经传代培养后,16株病毒株均可以引起鸡胚发生矮小化,出现“侏儒胚”等现象;对所分离毒株的S1基因进行序列测定,结果表明16株分离株的S1基因发生了较多的基因突变及氨基酸的替代和插入现象,经与国内外毒株对比分析表明,16株分离株中有1株分离株与国内流行株2992/02和J2等分离株处于同一基因群,有5株分离株与目前国内主要流行的LX4型处于同一基因群,有10株分离株形成一个独立的基因群,该基因群是国内新报道的IBV基因型。从10株新基因型的分离毒株中挑选1株具有代表性的毒株GDTS13进行全基因组测序,并对S1、M和N基因等IBV的主要结构基因进行遗传进化分析,结果表明GDTS13与国内外流行的主要参考毒株全基因组同源性为84.5%99.6%,其中与LX4型参考毒株同源性为87.6%,GDTS13 S1、M和N基因序列与LX4型参考毒株的同源性分别为68.0%、87.0%和86.5%。采用固定病毒浓度、稀释血清的方法进行鸡胚中和试验,结果显示5株疫苗株4/91、H120、M41、Holte和Conn46的血清抗体均不能中和GDTS13,说明GDTS13与5个疫苗株很可能不属于同一血清型。将GDTS13在SPF鸡胚上传代致弱,并进行不同代次毒株对SPF鸡的致病性试验,结果表明F40代毒株能引起50%的SPF鸡发病并引起相应症状和病变,F60代毒株能引起20%的SPF鸡发病并引起相应症状和病变,F80和F100代次的毒株不引起SPF雏鸡发病,无相应症状和病变;对GDTS13 F1、F20、F40、F60、F80和F100这6个代次毒株的S1基因进行核苷酸测序并分析,结果表明核苷酸序列有4个位点突变,对应氨基酸的序列则有3个残基突变;F80和F100代次病毒的核苷酸和氨基酸序列的同源性为100%,表明病毒经鸡胚多次传代后具有了较好的遗传稳定性。将GDTS13 F100代的病毒接种2日龄的SPF雏鸡并且连续传5代,通过观察临床症状、病变及测定EID50研究病毒毒力是否返强,结果表明GDTS13 F100代次的病毒在SPF鸡传5个代次,每个代次的试验鸡只均没有出现相关的IBV临床症状和病变,EID50在10-5.63-10-5.73之间变化不大,说明GDTS13 F100代次病毒遗传稳定,没有毒力返强的现象。将致弱的GDTS13 F100代次病毒采用滴鼻、点眼的方式接种2日龄的SPF雏鸡,剂量为103.5 EID50/只,14天后分别用同源强毒和异源强毒进行攻毒,攻毒的剂量为105 EID50,试验结果显示GDTS13 F100弱毒对强毒有超过90%的保护率,表明GDTS13F100代次弱毒可以作为新基因型IB的活疫苗候选毒株。本研究通过调查广东地区IBV的流行情况,了解当前IBV主要流行毒株的基因型及变化趋势,通过鸡胚传代致弱方法成功培育出新基因型IB的弱毒活疫苗候选毒株。
马巍陵,蔺辉星,陈雷,邹莹,黄智[9]（2018）在《鸡马立克氏病疫苗鸡胚免疫技术的应用》文中进行了进一步梳理目的:通过不同的马立克氏病（Marek’s disease,MD）疫苗接种方法的比较,得出获得最佳免疫效果的免疫方法。方法:选取孵化示范基地,孵化5组试验鸡群,每组100羽,试验组分别采取出生1日龄免疫、18日龄鸡胚免疫、出生免疫+17日龄二免、鸡胚免疫+出生二免、空白对照,自60日龄起对试验鸡群抽样开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作。结果:与对照组相比,4个疫苗免疫组的血清抗体效价、IFN-γ、IL-4水平均显着升高,同时MD的发病率显着下降,其中,以18日龄鸡胚免疫和鸡胚免疫+出生免疫效果最为显着。结论:鸡胚免疫技术能有效提高鸡马立克氏病疫苗的免疫效果。
温良海[10]（2017）在《MDV悬浮培养技术工艺及免疫保护研究》文中进行了进一步梳理马立克氏病（Marek′s disease,MD）是由马立克氏病病毒（Marek′s disease virus,MDV）血清1型引起的鸡的一种免疫抑制性疾病,以淋巴组织增生为主要特征,具有高度传染性,给养鸡业造成严重的经济损失。目前,主要采用疫苗接种的方式来预防该病的发生。国内马立克氏病毒疫苗通常以鸡胚成纤维细胞作为制苗基质,采用滚瓶的方式进行生产。因使用SPF鸡胚成本高,原代细胞制备费时费力且易污染外源病毒等缺点,传统的疫苗制备方式已与当前利用动物细胞大规模悬浮培养病毒不相适应。为了研究更加高效的马立克氏病毒疫苗制备方法,本研究以DF-1细胞作为制苗基质来代替传统的原代鸡胚成纤维细胞,用微载体悬浮培养代替传统的玻璃滚瓶培养马立克氏病毒,从而为利用生物反应器大规模生产马立克氏病毒疫苗提供参考依据。为了确定DF-1细胞培养的最佳条件,本研究对DF-1细胞在细胞瓶中培养的复苏及冻存、细胞传代、培养基种类等条件进行了优化。结果表明,在37℃、pH7.2,使用含10%新生牛血清但不含HEPES缓冲液的DMEM/F12培养基时生长最好,在细胞传代时,按每平方厘米贴壁面积接种8×104-12×104个DF-1细胞更有利于细胞的培养。悬浮培养时,采用20r/min持续搅拌的起始搅拌方式,微载体浓度为3-7g/L、按每个微载体接种50个DF-1细胞能获得最佳的悬浮培养效果。通过细胞培养瓶中对马立克氏病毒在DF-1细胞中的培养条件进行优化,结果表明,MDV（CVI988/Rispens株）在DF-1细胞上能够良好的增殖。马立克氏病毒在DF-1细胞中最佳接毒方式为同步接毒,最佳MOI为0.02,维持液最佳换液时间为接毒后24h,最佳收毒时间为接毒后72h。微载体悬浮培养MDV（CVI988/Rispens株）的试验表明:采用同步接毒的方式,按每个微载体表面接种150-200个细胞,MOI为0.02时接种CVI988/Rispens病毒株能够取得最好的病毒培养效果。疫苗免疫保护试验表明,以DF-1细胞作为制备MDV（CVI988/Rispens株）疫苗的基质,采用微载体悬浮培养技术制备的MDV（CVI988/Rispens株）疫苗对SPF鸡进行免疫,免疫后5 d对鸡只进行MDV超强毒株Md5株攻毒。结果显示,以DF-1细胞悬浮培养制备的MDV疫苗能够取得与商品疫苗CVI988/Rispens株相当的保护效率,达到90%以上。疫苗免疫不会对鸡的生长状况、体重以及免疫器官造成明显的影响。本研究利用DF-1细胞代替原代鸡胚成纤维细胞,采用细胞搅拌瓶和微载体悬浮培养MDV,为MDV疫苗和其他生物制品的大规模生产开辟了一条新途径,而且更加符合现代生物制品行业发展的趋势,具有较大的理论意义和实用价值。
二、用鸡胚检测鸡马立克氏病疫苗的免疫效果（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用鸡胚检测鸡马立克氏病疫苗的免疫效果（论文提纲范文）
（1）表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡马立克氏病病毒 |
| 1.1.1 火鸡疱疹病毒 |
| 1.1.2 鸡马立克氏病病毒活载体疫苗研究进展 |
| 1.2 新城疫概述 |
| 1.2.1 新城疫病毒 |
| 1.2.2 新城疫病毒流行病学 |
| 1.2.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 第二章 HVT Fosmid粘粒拯救系统的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 疫苗株 |
| 2.1.2 鸡胚和细胞 |
| 2.1.3 主要试剂和实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 HVT扩大培养及基因组提取 |
| 2.2.2 基因组DNA平末端化修饰 |
| 2.2.3 连接和包装 |
| 2.2.4 重组粘粒的鉴定和测序 |
| 2.2.5 亲本株病毒的拯救 |
| 2.2.6 拯救亲本株病毒的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HVT基因组Fosmid文库的构建 |
| 2.3.2 用于病毒拯救的重组粘粒的选择 |
| 2.3.3 拯救病毒rHVT的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 rHVT-NDV-F疫苗株的构建及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 鸡胚和细胞 |
| 3.1.2 疫苗株和质粒 |
| 3.1.3 主要试剂和实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HVT粘粒拯救系统的改造 |
| 3.2.2 表达NDVF基因重组粘粒的构建 |
| 3.2.3 表达NDV F基因重组HVT疫苗株的构建 |
| 3.2.4 rHVT-NDV-F疫苗株PCR鉴定 |
| 3.2.5 rHVT-NDV-F疫苗株目的蛋白表达鉴定 |
| 3.2.6 rHVT-NDV-F疫苗株体外复制能力检测 |
| 3.2.7 重组病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 H4-Kan/ccdb粘粒构建鉴定 |
| 3.3.2 H4-F粘粒的构建鉴定 |
| 3.3.3 rHVT-NDV-F重组病毒的拯救 |
| 3.3.4 rHVT-NDV-F重组病毒PCR鉴定 |
| 3.3.5 rHVT-NDV-F重组病毒目的蛋白表达鉴定 |
| 3.3.6 重组病毒的体外复制动力学鉴定 |
| 3.3.7 重组病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 rHVT-NDV-F重组病毒的免疫保护效力初步评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 疫苗株和病毒 |
| 4.1.2 细胞和雏鸡 |
| 4.1.3 主要实验试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 rHVT-NDV-F重组病毒动物实验分组 |
| 4.2.2 rHVT-NDV-F重组病毒诱导ELISA抗体水平检测 |
| 4.2.3 动物实验攻毒发病情况和排毒检测实验测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 免疫rHVT-NDV-F重组病毒鸡产生抗体水平 |
| 4.3.2 rHVT-NDV-F重组病毒NDV强毒F48E9 株的免疫保护效力评价 |
| 4.3.3 rHVT-NDV-F重组病毒NDV流行株LHLJ/01/06 株的免疫保护效力评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）松花粉多糖对胚胎感染ALV-J亚型的免疫调理作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.2 禽白血病病原学特征 |
| 1.2.1 禽白血病的分类 |
| 1.2.2 禽白血病病毒的形态学 |
| 1.2.3 禽白血病病毒的理化特性 |
| 1.2.4 禽白血病的致病机理 |
| 1.3 禽白血病的流行病学 |
| 1.3.1 禽白血病的流行病学特征 |
| 1.3.2 禽白血病的临床症状和病理变化 |
| 1.4 禽白血病的检测 |
| 1.5 禽白血病的净化 |
| 1.6 松花粉多糖的生物学活性和研究进展 |
| 1.7 鸡胚接种 |
| 1.8 本研究的目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒的复苏与培养 |
| 2.2.2 病毒TCID50 测定 |
| 2.2.3 鸡胚接种病毒最大剂量的筛选 |
| 2.2.4 鸡胚接种PPPS最佳剂量的筛选 |
| 2.2.5 胚胎感染ALV-J鸡胚模型的建立 |
| 2.2.6 动物实验 |
| 2.2.7 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡的抗病毒作用 |
| 2.2.7.1 泄殖腔排毒动态检测 |
| 2.2.7.2 组织病理切片的制备及观察 |
| 2.2.8 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡的免疫调理作用 |
| 2.2.8.1 体重和免疫器官指数测定 |
| 2.2.8.2 外周血淋巴细胞转换率测定 |
| 2.2.8.3 外周血细胞 CD4+、CD8+、IL-2、IFN-γ的测定 |
| 2.2.8.4 血清ND抗体滴度测定 |
| 2.2.9 试验数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TCID_(50) 的测定结果 |
| 3.2 鸡胚接种病毒最大剂量 |
| 3.3 鸡胚接种PPPS最佳剂量范围 |
| 3.4 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡的抗病毒作用 |
| 3.4.1 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡泄殖腔排毒动态的影响 |
| 3.4.2 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡组织病理学的影响 |
| 3.5 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡的免疫调理作用 |
| 3.5.1 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡体重及免疫器官指数的影响 |
| 3.5.2 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡的免疫器官影响 |
| 3.5.3 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡外周血淋巴细胞转换率测定 |
| 3.5.4 鸡胚接种松花粉多糖对胚胎感染 ALV-J 鸡外周血 CD4+、CD8+浓度的影响 |
| 3.5.5 鸡胚接种PPPS对胚胎感染ALV-J鸡外周血IL-2、IFN-γ含量测定 |
| 3.5.6 鸡胚接种PPPS对 NDV-N79 株疫苗的免疫增强作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 个人简介 |
（3）黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号缩写 |
| 文献综述 |
| 1.马立克氏病的概述 |
| 1.1 流行病学 |
| 1.2 临床症状 |
| 2.马立克氏病病毒的概述 |
| 2.1 病毒分型 |
| 2.2 病毒形态和理化性质 |
| 2.3 基因组结构 |
| 2.4 基因组编码的蛋白及其功能 |
| 2.5 发病历程 |
| 3.中药抗病毒研究进展 |
| 3.1 抗病毒中药的分类 |
| 3.2 中药抗病毒作用机理 |
| 3.3 筛选抗病毒中药的研究方法 |
| 4.黄酮类化合物的概述 |
| 4.1 黄酮类化合物的结构和分类 |
| 4.2 黄酮类化合物的理化性质 |
| 4.3 黄酮类化合物的生理功能 |
| 5.研究目的和意义 |
| 研究内容一 白杨素和染料木素对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 原代CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 细胞毒性试验 |
| 2.6 白杨素和染料木素抗病毒活性检测试验 |
| 2.7 白杨素和染料木素影响MDV感染性试验 |
| 2.8 白杨素和染料木素抑制病毒复制作用环节的确定 |
| 2.9 细胞总RNA的提取 |
| 2.10 RNA反转录 |
| 2.11 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.12 间接免疫荧光试验 |
| 2.13 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 药物成分对CEF的细胞毒性和安全浓度 |
| 3.2 药物对MDV在CEF细胞中复制增殖的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 研究内容二 黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和柚皮素对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 药物最大安全浓度检测 |
| 2.6 药物抗病毒活性检测试验 |
| 2.7 黄酮类化合物影响MDV感染性试验 |
| 2.8 黄酮类化合物抑制病毒复制作用环节的确定 |
| 2.9 细胞总RNA的提取 |
| 2.10 RNA反转录 |
| 2.11 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.12 间接免疫荧光试验 |
| 2.13 细胞蛋白的提取 |
| 2.14 免疫蛋白印迹试验 |
| 2.15 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 药物成分对CEF的安全浓度和生长的影响 |
| 3.2 药物对MDV感染CEF细胞的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 研究内容三 染料木素、黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯联合应用对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 黄酮类复合药物的最大安全浓度检测 |
| 2.6 黄酮类复合药物抗病毒活性检测 |
| 2.7 细胞总RNA的提取 |
| 2.8 RNA反转录 |
| 2.9 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.10 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 不同复合药物成分对CEF的安全浓度和生长的影响 |
| 3.2 药物对MDV感染CEF细胞的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文所用缩写符号说明表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 MDV的分子生物学特性 |
| 1.1.1 病毒的形态、结构和分类 |
| 1.1.2 病毒的基因组特征 |
| 1.1.3 病毒的主要致瘤基因概述 |
| 1.2 MD的致病机制 |
| 1.2.1 病毒早期的溶细胞感染 |
| 1.2.2 病毒的潜伏感染 |
| 1.2.3 病毒的第二次溶细胞感染 |
| 1.2.4 病毒转化T细胞形成肿瘤阶段 |
| 1.3 MD的流行病学 |
| 1.3.1 病毒的流行情况 |
| 1.3.2 病毒的毒力进化特征及毒株致病型的界定 |
| 1.3.3 病毒的自然感染宿主 |
| 1.3.4 病毒感染的发病日龄 |
| 1.3.5 病毒的传播方式 |
| 1.3.6 病毒与其他肿瘤性疾病病毒的共感染 |
| 1.4 MDV的诊断 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 病毒分离 |
| 1.4.3 病毒抗原检测 |
| 1.4.4 聚合酶链反应(PCR)扩增技术 |
| 1.4.5 DNA探针技术 |
| 1.5 针对MDV的防控措施 |
| 1.5.1 疫苗接种方案 |
| 1.5.2 生物安全 |
| 1.6 开展本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 2017-2019广西及其周边地区马立克氏病病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验所需的主要材料 |
| 2.1.2 试验中所用到的主要仪器设备 |
| 2.1.3 临床样本信息及来源 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备与培养 |
| 2.2.2 病鸡外周血淋巴细胞(PBL)的分离 |
| 2.2.3 组织病料的处理 |
| 2.2.4 病毒的接种与分离 |
| 2.2.5 病毒的间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测 |
| 2.2.6 病料组织或细胞培养物基因组总DNA的抽提 |
| 2.2.7 肿瘤病病原PCR鉴定 |
| 2.2.8 MDV meq基因克隆及序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 送检病鸡的临床症状及剖检病变 |
| 2.3.2 肿瘤病病原鉴定及MDV病毒分离结果 |
| 2.3.3 间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测结果 |
| 2.3.4 MDV分离株meq基因序列的分析结果 |
| 2.3.5 基于meq基因的系统进化树分析 |
| 2.3.6 广西地区MDV毒力变化趋势 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 基于meq基因系统动力学分析揭示MDV在中国的起源和演变 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样本序列及信息来源 |
| 3.1.2 处理数据所用的软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 MDV meq基因序列数据集 |
| 3.2.2 最佳核苷酸替代模型分析 |
| 3.2.3 贝叶斯系统发育分析 |
| 3.2.3.1 构建全球最大似然树 |
| 3.2.3.2 构建全球MDV早期地理系统动力学分析 |
| 3.2.3.3 构建中国MDV强毒分离株地理系统动力学分析 |
| 3.2.3.4 中国MDV强毒分离株种群动态分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MDV meq基因序列最佳核苷酸替代模型的选择 |
| 3.3.2 MDV系统发育分析 |
| 3.3.3 MDV地理系统分析结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 分离株GX18NNM4的致病性及疫苗免疫保护试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 相关试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 毒株 |
| 4.1.4 实验动物和疫苗 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备及培养 |
| 4.2.2 GX18NNM4分离株的复苏和病毒增殖 |
| 4.2.3 GX18NNM4分离株纯化 |
| 4.2.4 GX18NNM4 分离株PFU测定 |
| 4.2.5 对试验鸡分组及疫苗免疫方案 |
| 4.2.6 对各试验组鸡生长增重情况的检测 |
| 4.2.7 对试验鸡免疫器官发育情况的检测 |
| 4.2.8 对试验鸡PBLs中病毒载量表达水平的动态检测 |
| 4.2.9 对鸡细胞因子PD-1、PD-L1的标准曲线的构建 |
| 4.2.9.1 PD-1和PD-L1引物合成及标准样品质粒的获得 |
| 4.2.9.2 PD-1、PD-L1 q-PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.9.3 敏感性和重复性试验 |
| 4.2.10 对试验鸡组织中细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平的检测 |
| 4.2.11 对试验鸡临床症状、鸡只剖检和病理组织学观察 |
| 4.2.12 对试验鸡发病情况及疫苗保护指数和毒力等级的测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GX18NNM4 分离株PFU的测定结果 |
| 4.3.2 试验鸡生长性能的测定结果 |
| 4.3.3 试验鸡免疫器官指数的测定结果 |
| 4.3.4 MDV感染后PBLs中病毒载量动态检测结果 |
| 4.3.5 鸡细胞因子PD-1和PD-L1的标准曲线 |
| 4.3.5.1 鸡细胞因子PD-1、PD-L1 基因的RT-PCR扩增及克隆结果 |
| 4.3.5.2 质粒浓度及拷贝数结果 |
| 4.3.5.3 实时荧光定量RT-PCR标准曲线的获得 |
| 4.3.5.4 灵敏度和重复性试验 |
| 4.3.6 MDV感染后试验鸡组织中PD-1、PD-L1 m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.7 试验鸡的临床症状、剖检病变及组织学观察结果 |
| 4.3.8 试验鸡发病情况及疫苗保护指数结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（5）鸡胚免疫疫苗的研究现状及展望（论文提纲范文）
| 1 前言 |
| 2 鸡胚免疫的理论基础 |
| 3 影响鸡胚免疫的主要因素 |
| 3.1 接种日龄 |
| 3.2 接种方式 |
| 3.3 接种疫苗种类 |
| 3.4 其他影响因素 |
| 4 鸡胚免疫的优缺点 |
| 4.1 填补免疫空白期 |
| 4.2 免疫效果均一确实 |
| 4.3 鸡胚免疫减少资源消耗 |
| 4.4 鸡胚免疫的局限性 |
| 5 鸡胚免疫技术在其他方面的应用 |
| 6 展望 |
（6）表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 H9亚型禽流感病毒遗传进化与疫苗研究进展 |
| 1 禽流感病毒的基因组特征 |
| 2 H9亚型AIV的基因演化与变异 |
| 3 H9亚型AIV疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 文献综述 以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体的重组疫苗研究进展 |
| 1 HVT的特点 |
| 2 HVT的基因结构 |
| 3 HVT载体构建的方法 |
| 4 HVT作为载体的应用 |
| 5 重组HVT疫苗存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组火鸡疱疹病毒构建和安全性评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 重组病毒的免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组病毒rHVT-YBF003培养工艺研究与种子批建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（7）表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组马立克氏病病毒活载体疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 我国vvIBDV的流行趋势 |
| 1.1.3 IBDV的基因组和编码蛋白 |
| 1.1.4 我国IBD防控情况 |
| 1.2 马立克氏病 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 MDV的毒力进化及流行情况 |
| 1.2.3 MDV的基因组结构 |
| 1.2.4 我国MD防控情况 |
| 1.3 重组MDV活载体疫苗研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 我国vvIBDV流行毒株的遗传变异、抗原性和致病性分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 IBDV分离株的遗传进化分析 |
| 2.1.4 IBDV分离株的抗原性分析 |
| 2.1.5 IBDV分离株的鸡胚半数感染量测定 |
| 2.1.6 IBDV分离株的致病性分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 我国vvIBDV分离株的遗传进化分析 |
| 2.2.2 我国vvIBDV分离株的抗原性分析 |
| 2.2.3 我国vvIBDV分离株的致病性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 MDV多片段Fosmid粘粒拯救系统的建立 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 病毒及细胞 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 MDV培养及病毒基因组的提取 |
| 3.1.4 MDV基因组DNA的末端修饰 |
| 3.1.5 连接和包装 |
| 3.1.6 重组粘粒的鉴定和测序 |
| 3.1.7 亲本疫苗株病毒的拯救 |
| 3.1.8 拯救病毒的鉴定 |
| 3.1.9 拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒生长曲线的测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 MDV病毒基因组Fosmid文库的构建 |
| 3.2.2 用于病毒拯救的重组粘粒的选择 |
| 3.2.3 拯救毒rMDV的鉴定 |
| 3.2.4 拯救毒rMDV与原MDV疫苗株病毒生长曲线的比较 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 MDV基因组外源基因插入位点的筛选 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 病毒及细胞 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 带有Kan-ccdB抗性基因表达框架的重组突变粘粒的构建 |
| 4.1.4 pENTR1-eGFP的构建 |
| 4.1.5 含有eGFP表达框架的重组突变粘粒的构建 |
| 4.1.6 重组病毒的拯救 |
| 4.1.7 重组病毒的鉴定 |
| 4.1.8 重组病毒的eGFP表达情况 |
| 4.1.9 重组病毒的生长曲线滴定 |
| 4.1.10 重组病毒的遗传稳定性检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组病毒的拯救 |
| 4.2.2 重组病毒的鉴定 |
| 4.2.3 重组病毒的eGFP表达水平的比较 |
| 4.2.4 重组病毒体外复制特性 |
| 4.2.5 重组病毒的遗传稳定性 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 表达IBDV VP2基因的重组MDV的构建及鉴定 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 病毒及细胞 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 |
| 5.1.3 pCAGGS-VP2表达质粒的构建 |
| 5.1.4 VP2入门质粒pENT1-VP2的构建 |
| 5.1.5 含有VP2表达框架的重组突变粘粒的构建 |
| 5.1.6 重组病毒的拯救 |
| 5.1.7 重组病毒的鉴定 |
| 5.1.8 重组病毒目的基因VP2表达情况 |
| 5.1.9 重组病毒的遗传稳定性 |
| 5.1.10 重组病毒的复制特性 |
| 5.1.11 重组病毒对vvIBDV的免疫保护试验 |
| 5.1.12 重组病毒对vvMDV的免疫保护试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 插入VP2基因的重组粘粒的构建 |
| 5.2.2 重组病毒的鉴定 |
| 5.2.3 目的基因VP2表达情况 |
| 5.2.4 重组病毒的遗传稳定性 |
| 5.2.5 重组病毒的复制特性 |
| 5.2.6 重组病毒免疫SPF鸡后IBDV抗体滴度的检测 |
| 5.2.7 重组病毒对vvIBDV攻毒的免疫保护效果 |
| 5.2.8 重组病毒对vvMDV攻毒的免疫保护效果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 表达IBDV VP2基因的重组MDV活载体疫苗的免疫效力评价 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 病毒及细胞 |
| 6.1.2 主要试剂及试验用鸡 |
| 6.1.3 rMDV-VP2疫苗最小免疫剂量的确定 |
| 6.1.4 rMDV-VP2疫苗的效力试验及与商品化疫苗的比较 |
| 6.1.5 rMDV-VP2疫苗对不同vvIBDV分离株的交叉保护试验 |
| 6.1.6 母源抗体对rMDV-VP2疫苗免疫效果的影响 |
| 6.1.7 rMDV-VP2疫苗免疫持续期试验 |
| 6.1.8 rMDV-VP2疫苗对不同品种商品蛋鸡的免疫效力试验 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 rMDV-VP2疫苗最小免疫剂量的确定 |
| 6.2.2 rMDV-VP2疫苗效力试验及与IBD商品化疫苗的比较 |
| 6.2.3 rMDV-VP2疫苗对不同vvIBDV分离株的交叉保护试验 |
| 6.2.4 rMDV-VP2疫苗的母源抗体干扰试验 |
| 6.2.5 rMDV-VP2疫苗免疫持续期试验 |
| 6.2.6 rMDV-VP2疫苗对不同品种商品蛋鸡的免疫效力试验 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 表达IBDV VP2基因的重组MDV活载体疫苗的安全性评价 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 病毒及细胞 |
| 7.1.2 实验动物 |
| 7.1.3 主要试剂 |
| 7.1.4 主要检测方法 |
| 7.1.5 rMDV-VP2疫苗单剂量接种的安全性试验 |
| 7.1.6 rMDV-VP2疫苗单剂量重复接种的安全性试验 |
| 7.1.7 rMDV-VP2疫苗大剂量接种的安全性试验 |
| 7.1.8 rMDV-VP2疫苗用于非靶动物后的临床反应 |
| 7.1.9 rMDV-VP2疫苗在黑龙江省的环境释放试验 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 rMDV-VP2疫苗单剂量接种的安全性试验 |
| 7.2.2 rMDV-VP2疫苗单剂量重复接种对鸡的安全性分析 |
| 7.2.3 rMDV-VP2疫苗大剂量接种对鸡的安全性分析 |
| 7.2.4 rMDV-VP2疫苗接种非靶动物小鼠后的临床反应 |
| 7.2.5 rMDV-VP2疫苗的水平传播能力 |
| 7.2.6 rMDV-VP2疫苗的垂直传播能力 |
| 7.2.7 rMDV-VP2疫苗在鸡体内的存留情况 |
| 7.2.8 rMDV-VP2疫苗免疫鸡后的排毒情况 |
| 7.2.9 rMDV-VP2疫苗在应用环境中的存活能力 |
| 7.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 博士后期间其他工作内容 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 博士后期间论文发表情况 |
（8）传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 传染性支气管炎概述 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒 |
| 1.2.1 IBV的形态学特点 |
| 1.2.2 IBV的结构蛋白 |
| 1.2.3 IBV的分子变异机理 |
| 1.2.4 IBV的生物学特性 |
| 1.3 传染性支气管炎的分型 |
| 1.3.1 临床分型 |
| 1.3.2 血清分型 |
| 1.3.3 基因分型 |
| 1.4 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 活疫苗 |
| 1.4.3 基因工程疫苗 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 SPF鸡与鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离 |
| 2.2.3 病料的RT-PCR鉴定 |
| 2.2.4 分离株RT-PCR反应产物的连接与转化 |
| 2.2.5 分离株重组质粒的提取及S1基因序列测定 |
| 2.2.6 分离株S1基因序列分析 |
| 2.2.7 分离株生物学特性研究 |
| 2.2.8 GDTS13纯净性检验 |
| 2.2.9 分离株与疫苗株鸡胚半数感染量(EID50)的测定 |
| 2.2.10 GDTS13的血清中和试验 |
| 2.2.11 血清型与基因型分析 |
| 2.2.12 GDTS13全基因组序列测定与分析 |
| 2.2.13 GDTS13的传代致弱 |
| 2.2.14 SDTS13不同代次的EID50及S1基因序列测定 |
| 2.2.15 GDTS13不同代次的致病性检测 |
| 2.2.16 GDTS13F100的纯净性检测 |
| 2.2.17 GDTS13F100的毒力稳定性试验 |
| 2.2.18 GDTS13F100的免疫效力的初步评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离株RT-PCR检测结果 |
| 3.1.1 分离株M基因的鉴定 |
| 3.1.2 分离株S1基因的鉴定 |
| 3.2 分离株S1基因序列分析结果 |
| 3.3 分离株生物学特性鉴定结果 |
| 3.3.1 红细胞凝集试验 |
| 3.3.2 致鸡胚病变特征 |
| 3.4 GDTS13的纯净性检测 |
| 3.5 分离株GDTS13和疫苗株EID50测定结果 |
| 3.6 血清中和试验 |
| 3.6.1 GDTS13和疫苗株的血清抗体检测结果 |
| 3.6.2 疫苗株对GDTS13分离株的血清中和试验结果 |
| 3.7 GDTS13的基因序列分析结果 |
| 3.7.1 GDTS13的全基因序列分析 |
| 3.7.2 GDTS13S1基因分析结果 |
| 3.7.3 GDTS13M基因分析结果 |
| 3.7.4 GDTS13N基因分析结果 |
| 3.8 GDTS13不同代次致病力鉴定结果 |
| 3.9 GDTS13 不同代次的 EID50及 S1 基因序列分析结果 |
| 3.9.1 GDTS136个不同代次的EID50测定结果 |
| 3.9.2 GDTS13不同代次S1基因序列分析 |
| 3.10 GDTS13F100的纯净性检测结果 |
| 3.11 GDTS13F100毒力稳定性评价结果 |
| 3.12 GDTS13F100免疫效力初步评价结果 |
| 3.12.1 攻毒试验 |
| 3.12.2 GDTSF100免疫保护效力评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 分离株的生物学特性 |
| 4.2 分离毒株的分子特点 |
| 4.3 GDTS13的分子特性 |
| 4.3.1 血清中和试验 |
| 4.3.2 GDTS13的全基因序列分析 |
| 4.3.3 GDTS13的S1基因序列分析 |
| 4.3.4 GDTS13的M基因序列分析 |
| 4.3.5 GDTS13的N基因序列分析 |
| 4.4 GDTS13不同代次的EID50结果和S1基因序列分析及致病力分析 |
| 4.5 GDTS13F100的毒力返强试验结果评价 |
| 4.6 GDTS13F100的弱毒疫苗免疫效力的初步评价 |
| 5 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）鸡马立克氏病疫苗鸡胚免疫技术的应用（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 种蛋 |
| 1.1.2 疫苗 |
| 1.2 鸡胚孵化 |
| 1.3 试验分组及免疫方法 |
| 1.3.1 第1组:出生1日龄免疫 |
| 1.3.2 第2组:18日龄鸡胚免疫 |
| 1.3.3 第3组:出生免疫+17日龄二免 |
| 1.3.4 第4组:鸡胚免疫+出生二免 |
| 1.3.5 第5组:未免疫的对照组 |
| 1.4 试验室检测 |
| 1.4.1 间接ELISA法检测鸡马立克氏病病毒血清抗体 |
| 1.4.2 各试验组鸡血清IFN-γ水平检测 |
| 1.4.3 各试验组鸡血清IL-4水平检测 |
| 1.4.4 各试验组鸡发病率统计 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 MDV血清抗体的检测 |
| 2.2 血清IFN-γ水平的检测结果 |
| 2.3 血清IL-4水平的检测结果 |
| 3.4鸡群MD发病率的结果统计 |
| 3讨论 |
（10）MDV悬浮培养技术工艺及免疫保护研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡马立克氏病概述 |
| 1.2 马立克氏病毒的流行病学 |
| 1.3 马立克氏病疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 常规致弱疫苗 |
| 1.3.2 新型基因工程疫苗 |
| 1.4 动物细胞及微载体悬浮培养技术 |
| 1.4.1 动物细胞培养常用细胞系 |
| 1.4.2 微载体悬浮培养技术的发展 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要仪器和材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 细胞、种毒与疫苗 |
| 2.1.4 SPF鸡胚和实验动物 |
| 2.2 DF-1 细胞的常规培养 |
| 2.2.1 细胞的复苏与冻存 |
| 2.2.2 DF-1 细胞的传代 |
| 2.2.3 培养条件的优化 |
| 2.3 DF-1 细胞的微载体培养 |
| 2.3.1 微载体及其处理 |
| 2.3.2 搅拌方式对细胞贴壁的影响 |
| 2.3.3 细胞接种密度对悬浮培养的影响 |
| 2.3.4 微载体浓度对悬浮培养的影响 |
| 2.3.5 细胞计数及生长曲线的确定 |
| 2.3.6 细胞代谢的测定 |
| 2.4 MDV在DF-1 细胞上的常规培养 |
| 2.4.1 MDV种毒的繁殖 |
| 2.4.2 MDV在DF-1 细胞上的适应 |
| 2.4.3 MDV在DF-1 细胞中的传代 |
| 2.4.4 维持液换液时间对MDV在DF-1 细胞中增殖的影响 |
| 2.4.5 细胞瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的优化 |
| 2.5 MDV在DF-1 细胞上的微载体悬浮培养 |
| 2.5.1 不同接毒方式对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 2.5.2 不同细胞接种量对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 2.5.3 spinner flask搅拌瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的优化 |
| 2.5.4 不同微载体浓度对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 2.5.5 不同培养系统培养马立克氏病毒的比较 |
| 2.6 MDV的蚀斑检测 |
| 2.7 悬浮培养马立克氏病毒的免疫效果评价 |
| 2.7.1 悬浮培养MDV安全性试验 |
| 2.7.2 悬浮培养MDV对SPF鸡的免疫保护试验 |
| 2.7.3 动物试验各组存活率曲线 |
| 2.7.4 疫苗免疫后感染Md5各组鸡的临床病变与剖检观察 |
| 2.7.5 疫苗免疫后感染Md5各组鸡的病理变化 |
| 2.7.6 动物实验各组鸡只体重的影响 |
| 2.7.7 免疫器官指数的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DF-1 细胞的常规培养 |
| 3.1.1 不同复苏方法对DF-1 细胞生长的研究 |
| 3.1.2 DF-1 细胞的传代 |
| 3.1.3 不同培养基对DF-1 细胞生长的比较 |
| 3.1.4 不同pH对DF-1 细胞生长的比较 |
| 3.1.5 DF-1 的细胞生长曲线 |
| 3.2 DF-1 细胞的微载体培养 |
| 3.2.1 搅拌方式对细胞贴壁的影响 |
| 3.2.2 细胞接种密度对悬浮培养的影响 |
| 3.2.3 微载体浓度对悬浮培养的影响 |
| 3.3 MDV在DF-1 细胞上的常规培养 |
| 3.3.1 MDV在DF-1 细胞中的适应及传代 |
| 3.3.2 维持液换液时间对MDV在DF-1 细胞中增殖的影响 |
| 3.3.3 细胞瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的优化 |
| 3.4 MDV在DF-1 细胞上的微载体悬浮培养 |
| 3.4.1 不同接毒方式对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 3.4.2 不同细胞接种量对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 3.4.3 spinner flask搅拌瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的优化 |
| 3.4.4 不同微载体浓度对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 3.4.5 不同培养系统培养马立克氏病毒的比较 |
| 3.5 悬浮培养马立克氏病毒的免疫效果评价 |
| 3.5.1 悬浮培养MDV的安全性 |
| 3.5.2 存活率曲线 |
| 3.5.3 疫苗免疫后感染Md5各组鸡的临床病变与剖检观察 |
| 3.5.4 疫苗免疫后感染Md5各组鸡的病理变化 |
| 3.5.5 疫苗的免疫保护指数（PI） |
| 3.5.6 动物试验各组鸡只体重比较 |
| 3.5.7 免疫器官指数的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DF-1 细胞的培养特性 |
| 4.1.1 DF-1 细胞的常规培养及条件优化 |
| 4.1.2 DF-1 细胞的微载体悬浮培养 |
| 4.2 MDV在DF-1 细胞中的增殖特性 |
| 4.2.1 MDV在DF-1 细胞上的常规培养 |
| 4.2.2 MDV在DF-1 细胞上的微载体悬浮培养 |
| 4.3 微载体悬浮培养MDV的免疫保护效果 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
四、用鸡胚检测鸡马立克氏病疫苗的免疫效果（论文参考文献）
- [1]表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价[D]. 许曾焜. 中国农业科学院, 2020
- [2]松花粉多糖对胚胎感染ALV-J亚型的免疫调理作用[D]. 黄金. 山东农业大学, 2020
- [3]黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究[D]. 杨帆. 扬州大学, 2020
- [4]2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究[D]. 石梦雅. 广西大学, 2020(02)
- [5]鸡胚免疫疫苗的研究现状及展望[J]. 樊三玲,李丽,罗青平,任助,王红琳,唐国毅,罗玲,张腾飞,商雨,张文婷,张蓉蓉,曾驰,邵华斌,温国元. 湖北农业科学, 2018(S2)
- [6]表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验[D]. 楚电峰. 扬州大学, 2018(05)
- [7]表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组马立克氏病病毒活载体疫苗研究[D]. 李凯. 中国农业科学院, 2018(05)
- [8]传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选[D]. 洪艳芬. 华南农业大学, 2018(08)
- [9]鸡马立克氏病疫苗鸡胚免疫技术的应用[J]. 马巍陵,蔺辉星,陈雷,邹莹,黄智. 农业与技术, 2018(07)
- [10]MDV悬浮培养技术工艺及免疫保护研究[D]. 温良海. 华南农业大学, 2017(08)