一、粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白的增效作用（论文文献综述）
张雅昆[1]（2018）在《美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究》文中研究表明美国白蛾Hyphantria cunea（Drury）属鳞翅目（Lepidoptera）灯蛾科（Arctiidae）昆虫,是一种重要的世界性检疫害虫,也是我国重大入侵害虫之一。由于其寄主范围广、繁殖能力强和传播速度快等特点,对我国森林资源、农林业生产和生态建设造成了严重损失。据国家林业局2018年第3、4号公告显示,我国美国白蛾疫区已涉及全国11个省（区、市）的572个县级行政区。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前研究最成熟、应用最广泛的杀虫微生物,具有特异性强、环境友好和使用便捷等诸多优点,已经成功用于多种重要农林业害虫的防治,但用于美国白蛾防治的报道却相对较少。本研究对本实验室保存的15株Bt野生菌株进行生物活性测定,筛选出5株对美国白蛾具有高效杀虫活性的Bt菌株,分别为G31、GS24、GS31、GS36和GS70。该5株Bt菌株对美国白蛾一龄3 d幼虫的LC50（50%Lethal concentration）值为0.0840.268 mg/mL胞晶混合物,其中GS36菌株杀虫活性最高,LC50值为0.084 mg/mL胞晶混合物;表达晶体蛋白形态主要为大菱形、小菱形和圆球形等。5株菌株均含有多种cry基因且都含有cry1A和cry2A类基因,主要表达约130 kDa和60 kDa蛋白。从Bt菌株GS36中克隆了cry1Ab35基因（GenBank登录号KT692985）,开放阅读框（Openreadingframe,ORF）为3495bp,推测编码1181个氨基酸,编码蛋白分子量为133.6 kDa,等电点为4.74。构建了Bt工程菌HD1Ab35表达Cry1Ab35蛋白,分子量为140 kDa,晶体形态为小菱形。Cry1Ab35蛋白经胰蛋白酶消化,获得60 kDa的活化片段。Cry1Ab35蛋白对美国白蛾一龄3 d幼虫具有高效杀虫活性,LC50值为4.34μg/mL;对棉铃虫及甜菜夜蛾初孵幼虫杀虫活性较高,LC50值分别为24.31μg/mL和41.87μg/mL。克隆表达了Bt菌株GS36中enhancin-like基因（GenBank登录号MG012232）,开放阅读框为2202 bp,推测编码733个氨基酸,编码蛋白分子量为84 kDa,等电点为6.35,在重组大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达84 kDa蛋白。提取并纯化了粉纹夜蛾颗粒体病毒（Trichoplusia nigranulovirus,TnGV）中约90 kDa的Enhancin蛋白。生物活性测定显示,分别加入20μg/mLEnhancin蛋白和100μg/mL Enhancin-like蛋白可使Cry1Ab35蛋白对美国白蛾一龄3 d幼虫的杀虫活性分别提高4.93倍及4.21倍;加入1.0×105 PIBs/mL美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cuneanuclearpolyhedrosisvirus,HcNPV）可使Cry1Ab35蛋白对美国白蛾三龄2 d幼虫的杀虫活性提高11.16倍,单独Enhancin蛋白、Enhancin-like蛋白和1.0×105 PIBs/mL HcNPV对美国白蛾一龄3 d幼虫和三龄2 d幼虫均无杀虫活性。因此,TnGV中Enhancin蛋白、GS36菌株编码Enhancin-like蛋白、HcNPV三种增效因子可显着增加Cry1Ab35蛋白对美国白蛾的杀虫活性。通过配体杂交（Ligandblot）及质谱（Mass spectrometry,LC-MS/MS）分析技术,分离鉴定了美国白蛾幼虫中肠BBMV（Brush border membrane vesicle）上Cry1Ab35蛋白主要结合蛋白氨肽酶N（Aminopeptidase N,APNs）。结合美国白蛾中肠转录组数据,克隆鉴定了5个hcapn基因,分别为hcapn2（KY949254）、hcapn3（KY949256）、hcapn5（KY949257）、hcapn6（KY949258）和hcapn8（KY949259）。5个hcapn基因的开放阅读框分别为2811、3072、2817、2877和2796 bp,分别编码936、999、938、958和930个氨基酸,预测蛋白分子量分别为105、114、106、110和106 kDa。HcAPNs蛋白与已公布的HcAPN1（KP053647）和HcAPN4（KJ013598）蛋白具有相似的结构特征,即N端信号肽序列,谷氨酸锌化氨肽酶GAMEN基序及锌指结合基序HEXXH（X）18E,除HcAPN1和HcAPN6蛋白外,HcAPNs蛋白均具有C端糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl inositol,GPI）锚定位点,均含有多个O-糖基化位点及N-糖基化位点。7个hcapns基因均在美国白蛾幼虫中肠和后肠组织表达量高,美国白蛾幼虫饲喂Cry1Ab35蛋白后,hcapns基因均表现为1224 h表达水平显着上升。利用Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统表达了重组HcAPN1、HcAPN2、HcAPN3、HcAPN4、HcAPN5、HcAPN6和HcAPN8蛋白,分子量分别为130、110、120、115、120、130和120kDa。配体杂交显示HcAPNs蛋白均能与Cry1Ab35蛋白活化片段结合。利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术探索了HcAPNs蛋白在Cry1Ab35蛋白在美国白蛾杀虫机制中的功能。分别用dsRNA-hcapn1/-hcapn2/-hcapn3/-hcapn4/-hcapn5/-hcapn6/-hcapn8注射美国白蛾三龄2d幼虫,3 d后靶标hcapns基因表达水平分别下降了91.9%、72.0%、87.2%、64.0%、68.3%、64.0%和67.1%。将注射ddH2O和dsRNA-egfp/-hcapns的幼虫用含有Cry1Ab35蛋白的饲料饲养5 d后,幼虫校正死亡率分别为70.8%、74.5%、51.4%、41.7%、49.6%、61.1%、50.3%、62.5%和63.9%。注射dsRNA-hcapn1/-hcapn2/-hcapn3/-hcapn5的幼虫校正死亡率显着低于注射ddH2O及dsRNA-egfp/-hcapn4/-hcapn6/-hcapn8的幼虫校正死亡率。因此,推测美国白蛾中肠HcAPN1、HcAPN2、HcAPN3和HcAPN5蛋白为Cry1Ab35蛋白潜在的功能受体。
龚莉君,柳傲,刘大成,杨中侠[2]（2016）在《Bt杀虫晶体蛋白增效物质的研究进展》文中指出Bt杀虫晶体蛋白对靶标害虫具高度的专一性,是目前世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂。现已广泛应用于微生物制剂和转基因植物,利用其增效物质提高杀虫晶体蛋白的杀虫活性,对高效Bt工程菌的构建及cry基因在转基因植物中的应用具有非常重要的意义,本文对目前已确定的几种增效物质进行综合论述,以供研究者了解相关动态。
张林娜,陈文峰,尹新明,李文明,刘向阳,张忠信[3]（2016）在《杆状病毒增效因子及其增效机理》文中研究表明杆状病毒是一类双链环状DNA病毒,具有宿主特异性强和环境兼容性好等特点。作为微生物杀虫剂,杆状病毒在农业可持续发展中应将发挥更加重要的作用。但是,杆状病毒杀虫剂自身的不足,如杀虫活性低和杀虫速度慢等,严重制约了其推广应用。一些增效因子能够改善杆状病毒的杀虫活性或杀虫速度。本文综述了杆状病毒增效蛋白、昆虫痘病毒纺锤体蛋白和荧光增白剂等7种对杆状病毒具有增效活性的增效因子的特性,并对其增效机理进行了逐个分析,旨在为高效病毒杀虫剂的研发以及病毒杀虫剂的推广应用提供借鉴和帮助。
韩光杰,刘琴,徐贝贝,王建军,祁建杭,李传明,徐健[4]（2016）在《粘虫颗粒体病毒增效蛋白基因片段优化及功能》文中研究说明【目的】研究转宿主粘虫颗粒体病毒（Pseudaletia unipuncta granulovirus,Pu GV-Ps）增效蛋白基因截短片段优化及其增效作用,探索增效蛋白基因的合理利用途径。【方法】生物信息学分析增效蛋白结构域,构建增效蛋白基因截短片段原核表达载体,分析目的基因片段表达产物的表达水平、围食膜蛋白降解效能和增强活性,进一步明确Pu GV-Ps增效蛋白基因的功能区域。【结果】Pu GV-Ps增效蛋白含有M60-like结构域、锌离子催化域和糖蛋白结合域,并包含13个潜在的糖基化位点。以此为依据设计P69（短截M60-like结构域）和P77（短截糖蛋白结合域）2个截短片段,构建了表达载体p ET15b-P69和p ET15bP77,原核表达量明显高于全长基因P104。表达产物纯化蛋白围食膜降解活性表明,P69对斜纹夜蛾围食膜大分子蛋白降解程度高于P77,但两者均低于P104。病毒增强苏云金杆菌（Bt）实验表明,截短片段的表达产物提高了Bt对小菜蛾的毒力,但增强活性显着低于P104。【结论】研究结果表明,Pu GV-Ps增效蛋白基因N端M60-like结构域和C端糖蛋白结合域对其增效作用的发挥都具有一定功能,这些结构对维持增效蛋白的构象也发挥了一定的作用,截短片段P69有利于保持Pu GV-Ps增效蛋白的活性、提高表达水平。该研究结果对增效蛋白的工业化生产具有一定的指导意义。
韩光杰,赵松,刘琴,李传明,徐健[5]（2015）在《PuGV-Ps增效蛋白质基因特征及其整合载体的构建》文中指出为了明确增效蛋白质基因特性,获得重组增效苏云金杆菌,本试验通过生物信息学方法分析了转宿主东方粘虫颗粒体病毒（Pu GV-Ps）增效蛋白质基因（En）的特征及二级结构,利用In-fusion技术构建了整合载体。基于Pu GV-Ps增效蛋白质基因进化树显示,颗粒体病毒与多角体病毒为2个明显的分支,美洲粘虫颗粒体病毒（Pu GV）与转宿主东方粘虫颗粒体病毒的增效蛋白质基因遗传距离极小。6种颗粒体病毒增效蛋白质氨基酸序列比对结果显示,增效蛋白质N端相似性较高,均含有锌离子结构域（244位）与催化域（526565位）;增效蛋白质基因二级结构中α螺旋和无规则卷曲占整个片段的73%,且N端以不规则卷曲为主;利用改进的In-fusion技术构建整合载体,双酶切结果显示增效蛋白质基因连接方向正确,p LTV1-En构建成功;通过高温整合获得重组工程菌Bt71En。表明,Pu GV-Ps与Pu GV增效蛋白质基因同源性较高,其二级结构复杂,影响载体构建,通过高温处理连接片段可以明显提高载体的连接效率。
王建林[6]（2014）在《脂肪酸分析酶热传感器的构建和粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白的纯化》文中指出糖尿病是世界性疾病,其病因、发病机制复杂,至今还没有完全阐明,但总的来说是由胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌缺陷这两个因素引起的。现有的研究发现FFA与这两个因素的发生直接相关。本研究以铜绿假单胞菌PAO1的长链脂酰辅酶A合成酶FadD1为对象,主要进行了以下研究:1)以PAO1的基因组为模板,利用PCR扩增得到fadD1基因。序列分析发现fadD1的开放阅读框（open reading frame,ORF）长1689bp,编码562个氨基酸残基,预测分子量为61.7kDa。结构域分析表明,fadD1包含1个AMP结合功能域。将fadD1基因克隆到克隆载体上,并构建重组表达载体,实现了重组蛋白在大肠杆菌中的表达。2)利用Ni2+亲和层析树脂纯化FadD1,并做酶活检测。将纯化后的FadD1固定到孔径可控的玻璃球上,构建了酶热传感器,并对传感器进行初步检测。本研究表达的铜绿假单胞菌长链脂酰辅酶A合成酶FadD1可以体外检测FFA,并将FadD1固定在酶热传感器上,通过检测酶促反应产生的热来分析游离脂肪酸的含量,将使FFA的检测变得更为快速灵敏、稳定可靠,有希望为糖尿病的前期诊断提供一种全新的方法。课题组前期的研究发现病毒增效蛋白ENHANCIN可以通过降解围食膜蛋白对生物杀虫剂起到明显的增效作用,具有较大的应用价值,本论文的另一部分研究工作是针对粉纹夜蛾颗粒体病毒ENHANCIN展开了蛋白纯化相关研究,主要包括:双HIS标签ENHANCIN的重组表达载体的构建、蛋白的诱导表达、蛋白的亲和层析纯化、纯化蛋白对棉铃虫围食膜蛋白的体外酶解,研究结表达的粉纹夜蛾颗粒体病毒ENHANCIN可有效降解棉铃虫围食膜蛋白,为农林业害虫的生物防治方法提供了理论依据和实践基础。
徐健,赵松,刘琴,杨青,李传明[7]（2013）在《转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性》文中进行了进一步梳理以东方粘虫为转宿主增殖的颗粒体病毒（PuGV Ps）DNA为模板通过PCR反应扩增出一条2.7 kb的特异性基因片段,纯化的PCR产物克隆到载体质粒pET 15b中,构建重组质粒pET 15b En,重组质粒外源基因测序证明PCR扩增产物是粘虫颗粒体病毒转宿主病毒PuGV Ps增效蛋白的全长基因。与原始美洲粘虫颗粒体病毒（PuGV）增效蛋白基因的序列比较,两者同源性达99.59%。11个突变碱基中有7个集中在5′端下游500 bp,而3′端上游500 bp仅1个碱基发生突变。PuGV Ps增效蛋白基因重组质粒pET 15b En转化到大肠杆菌中构建重组菌,在IPTG诱导下表达了108 kD的表达产物,Ni2+柱纯化证明表达产物是目标增效蛋白。LB培养液中加入0.2%的葡萄糖后有利于增效蛋白基因的表达。生物测定结果表明,粗提的表达产物具有增效活性,可以提高Btδ内毒素对棉铃虫、甜菜夜蛾的敏感性。
张小霞,梁振普,陈晓慧,宋小凤,王丽薇,邵新峰[8]（2012）在《黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究》文中提出增效蛋白（ENHANCIN）是一种主要在昆虫杆状病毒中存在的杀虫增效因子,黄地老虎颗粒体病毒（Agrotis segetum granulovirus,AgseGV）基因组中有一个ORF的编码产物为杆状病毒ENHANCIN同源物,命名为en-hancin-like。生物信息学分析结果表明,AgseGV的enhancin-like基因编码产物含有ENHANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a-螺旋跨膜区,在其C-末端拥有类似哺乳动物的脯氨酸富集区。为了确定AgseGV的EN-HANCIN-like蛋白是否具有增效功能,构建了AgseGV的enhancin-like全基因和5′端片段（1 017bp）的原核表达载体。利用层析技术纯化截短片段的原核表达产物,以其为抗原制备了抗体。利用自制抗体和His-tag抗体,Western blot检测了enhancin-like全基因的表达产物。结果表明,在融合蛋白预期大小处显示出阳性条带,证明目的基因得到了良好的表达。以棉铃虫为供试虫进行生物测定,证明在棉铃虫核多角体病毒（HaNPV）浓度为1.17×102 PIBS/mL时,AgseGV enhancin-like的全基因原核表达产物能使其感染3龄初幼虫的死亡率提高16.25%,增效作用显着。但是,5’端截短片段的原核表达产物对HaNPV没有增效作用。
陈晓慧[9]（2011）在《黄地老虎颗粒体病毒ORF55基因的功能研究》文中提出增效蛋白（ENHANCIN）是一种主要由昆虫杆状病毒编码的金属蛋白酶,现已证明它可以促进核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus ,NPV）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）等多种经消化道作用的微生物杀虫剂对害虫的感染,在生物杀虫剂的推广应用和抗虫转基因植物等方面具有很强的应用潜力。本研究利用PCR技术从AsGV基因组中获得enhancin-like全基因及其N-端1020bp截短序列及N-端2679bp截短序列,并对全基因进行序列分析;以PET-32a和PET-28a为表达载体,重组表达质粒转化大肠杆菌（BL21（DE3））,构建全基因及两个截短体的原核表达菌株;纯化分离N-端1020bp的原核表达产物,免疫兔子制备AsGV ENHANCIN的特异性抗体;SDS-PAGE、Western Blot检测目的基因的原核表达,利用亲和层析纯化目的蛋白;初步纯化得到的目的蛋白和不同浓度的HaNPV混合感染3龄初棉铃虫（6日龄）,采用室内生物测定法,鉴定三个基因的原核表达产物对棉铃虫核型多角体病毒（HaNPV）感染性的增效作用。序列分析表明该基因编码产物含有ENHANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a-螺旋跨膜区,另外其拥有特异的C-端脯氨酸富集区,这些特征可能与其作用机制有关;实验获得AsGV ENHANCIN的特异性抗体,并实现AsGV的enhancin-like全基因及两个截短序列（N-端1020bp及N-端2679bp序列）的原核表达;生物测定实验表明,HaNPV浓度为1.17×102 PIBS/mL、1.17×103 PIBS/mL、1.17×104 PIBS/mL时,全蛋白能使幼虫死亡率分别提高16.25%、21.25%和12.5%,增效作用显着,而N-1020截短体则无增效作用,N-2679蛋白有微弱的增效作用。由于N-2679蛋白是舍弃全蛋白C-端脯氨酸富集区得到的蛋白,推测蛋白的C-端脯氨酸富集区在蛋白功能中发挥重要的作用,根据哺乳动物中脯氨酸富集区的功能,推测其发挥的是介导作用,全蛋白作为中介分子增效病毒的感染性。本文的研究为AsGV编码ENHANCIN的推测提供了实验依据,也为生物农药增效剂ENHANCIN的规模化生产和推广应用奠定了研究基础,也有助于丰富对ENHANCIN的增效机制的认识。
赵丹[10]（2011）在《苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析》文中研究说明病毒增效蛋白是金属蛋白酶,能够特异性降解昆虫肠粘蛋白（IIM）,从而增强病毒或是Bt杀虫晶体蛋白对昆虫的感染。蜡状芽孢杆菌组发现了芽孢杆菌属的基因组中含有enhancin -like基因,它编码的肽段与病毒的增效蛋白相似性为20%30%,研究发现苏云金杆菌BMB171中的Enhancin-like蛋白能够降解棉铃虫幼虫的肠粘蛋白从而增强cry1Ac蛋白对棉铃虫的毒性,与病毒增效蛋白的作用相似。细菌中Enhancin-like蛋白的增效作用是否具有广谱性尚不明确。本研究从实验室保存的Bt菌株中筛选并成功克隆得到enhancin-like基因,提交GenBank登记,登录号为JF806504。该基因读码框为2202个碱基,编码733个氨基酸,预测的蛋白质的分子量为84kDa。Blastn结果发现其与病毒增效蛋白的相似性为22%25%,与细菌增效蛋白的相似性为96100%,并且具有保守锌结合结构域（HEIAH）,属于金属蛋白酶超家族成员。将重组表达质粒pET30a-enhancin-like转化E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测,enhancin-like基因在E.coli BL21（DE3）成功表达84 kDa的蛋白,再将enhancin-like基因连接到穿梭载体pSXY422b,电激转化HD73-（cry-）,构建工程菌,Western blot分析表明,enhancin-like基因能在HD73-（cry-）中稳定表达。利用亲和层析的方法得到纯化的Enhancin-like蛋白。纯化的Enhancin-like蛋白体外处理粉纹夜蛾和甜菜夜蛾围食膜,围食膜肠粘蛋白未降解。生物活性测定纯化的Enhancin-like蛋白与Cry9Ea蛋白共同饲喂粉纹夜蛾幼虫,与单独用Cry9Ea蛋白饲喂粉纹夜蛾时,死亡率均为60%,而Enhancin与Cry9Ea蛋白共同饲喂粉纹夜蛾时死亡率显着提高达到100%,Enhancin-like蛋白单独饲喂时无杀虫活性。用Cry9Ea蛋白单独饲喂甜菜夜蛾时,死亡率为5%,Enhancin-like蛋白与Cry9Ea蛋白共同饲喂后死亡率没有变化,而Enhancin与Cry9Ea蛋白共同饲喂甜菜夜蛾时死亡率显着提高达到100%,Enhancin-like蛋白单独饲喂时则无杀虫活性。生测结果表明Enhancin-like蛋白没有增加Cry9Ea蛋白的毒性。
二、粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白的增效作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白的增效作用（论文提纲范文）
（1）美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 美国白蛾简介 |
| 1.1.1 美国白蛾发生与为害状况 |
| 1.1.2 美国白蛾防治现状 |
| 1.2 苏云金杆菌及杀虫蛋白概述 |
| 1.2.1 苏云金杆菌Bt概况 |
| 1.2.2 Bt杀虫蛋白种类 |
| 1.2.3 Bt杀虫晶体蛋白的进化 |
| 1.2.4 Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.2.5 Bt杀虫晶体蛋白作用机制 |
| 1.2.6 Bt杀虫蛋白增效途径 |
| 1.3 Bt杀虫蛋白在昆虫中肠受体 |
| 1.3.1 氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN) |
| 1.3.2 钙粘蛋白(Cadherin,CAD) |
| 1.3.3 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP) |
| 1.3.4 ABC转运体(ATP-binding cassette transporter,ABC) |
| 1.3.5 其它受体蛋白 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 对美国白蛾高效活性Bt菌株的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要溶液及试剂 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Bt菌株对美国白蛾杀虫活性测定 |
| 2.2.2 Bt菌株晶体形态观察 |
| 2.2.3 Bt菌株cry基因型鉴定 |
| 2.2.4 Bt菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Bt菌株对美国白蛾杀虫活性测定 |
| 2.3.2 Bt菌株晶体形态观察 |
| 2.3.3 Bt菌株cry基因型鉴定 |
| 2.3.4 Bt菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 对美国白蛾高效Cry1Ab35蛋白的表达及活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 菌株及质粒 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要溶液及试剂 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Bt菌株质粒的提取 |
| 3.2.2 cry1Ab35基因的克隆与原核表达 |
| 3.2.3 Bt工程菌HD1Ab35的构建 |
| 3.2.4 Bt工程菌HD1Ab35晶体蛋白提取 |
| 3.2.5 Cry1Ab35蛋白浓度的测定 |
| 3.2.6 Cry1Ab35蛋白抗体的制备 |
| 3.2.7 Cry1Ab35蛋白杀虫活性测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 cry1Ab35基因的克隆与序列分析 |
| 3.3.2 cry1Ab35基因的原核表达 |
| 3.3.3 工程菌HD1Ab35的构建及鉴定 |
| 3.3.4 工程菌HD1Ab35晶体蛋白形态观察 |
| 3.3.5 工程菌HD1Ab35晶体蛋白的表达及定量 |
| 3.3.6 Cry1Ab35蛋白杀虫活性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性增效因子 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试昆虫 |
| 4.1.2 菌株及质粒 |
| 4.1.3 昆虫病毒 |
| 4.1.4 主要溶液及试剂 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 TnGV的增殖、提取与纯化 |
| 4.2.2 TnGV Enhancin蛋白的制备 |
| 4.2.3 Bt GS36菌株enhancin-like基因的克隆 |
| 4.2.4 Enhancin-like蛋白的原核表达 |
| 4.2.5 Enhancin-like蛋白的提取与纯化 |
| 4.2.6 三种增效因子在Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性中的增效作用分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 TnGV Enhancin蛋白的检测 |
| 4.3.2 enhancin-like基因的克隆及序列分析 |
| 4.3.3 enhancin-like基因的原核表达 |
| 4.3.5 三种增效因子在Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性中的增效作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 美国白蛾中肠Cry1Ab35蛋白结合蛋白的鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 菌株及质粒 |
| 5.1.3 主要溶液及试剂 |
| 5.1.4 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Cry1Ab35蛋白的活化 |
| 5.2.2 美国白蛾中肠BBMV蛋白的提取 |
| 5.2.3 Ligandblot检测Cry1Ab35蛋白结合蛋白 |
| 5.2.4 Cry1Ab35蛋白结合蛋白LC-MS/MS分析 |
| 5.2.5 美国白蛾幼虫及组织样本制备 |
| 5.2.6 美国白蛾总RNA的提取及cDNA合成 |
| 5.2.7 hcapns基因的克隆与序列分析 |
| 5.2.8 hcapns基因时空表达分析 |
| 5.2.9 饲喂美国白蛾幼虫Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表达分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Cry1Ab35蛋白的活化 |
| 5.3.2 美国白蛾中肠BBMV蛋白的检测 |
| 5.3.3 Cry1Ab35蛋白美国白蛾中肠BBMV结合蛋白的鉴定 |
| 5.3.4 美国白蛾中肠Cry1Ab35蛋白结合蛋白质谱分析 |
| 5.3.5 hcapns基因的克隆 |
| 5.3.6 hcapns基因序列分析 |
| 5.3.7 hcapns基因时空表达分析 |
| 5.3.8 饲喂美国白蛾幼虫Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表达水平分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 美国白蛾HcAPNs蛋白的表达及功能分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 供试昆虫 |
| 6.1.2 菌株及质粒 |
| 6.1.3 培养基及试剂 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 重组HcAPNs蛋白在昆虫细胞系Sf9中的表达 |
| 6.2.2 重组HcAPNs蛋白与Cry1Ab35蛋白结合分析 |
| 6.2.3 hcapns基因RNAi及功能分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 重组Bacmid-hcapns的构建 |
| 6.3.2 重组HcAPNs蛋白在昆虫细胞系Sf9中的表达 |
| 6.3.3 重组HcAPNs蛋白与Cry1Ab35蛋白结合分析 |
| 6.3.4 dsRNA的合成及检测 |
| 6.3.5 注射美国白蛾幼虫dsRNA-hcapns后hcapns基因表达水平检测 |
| 6.3.6 注射dsRNA-hcapns美国白蛾幼虫对Cry1Ab35蛋白敏感性测定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间已发表论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（3）杆状病毒增效因子及其增效机理（论文提纲范文）
| 1 增效因子的种类 |
| 1.1 蛋白类增效因子 |
| (1)杆状病毒增效蛋白(Enhancin) |
| (2)昆虫痘病毒纺锤体蛋白(Fusolin) |
| (3)杆状病毒GP37蛋白 |
| 1.2 酶类增效因子 |
| (1)几丁质酶(Chitinase) |
| (2)组织蛋白酶(Cathepsin) |
| 1.3 其他增效因子 |
| (1)荧光增白剂(Calcofluor) |
| (2)几丁质合成抑制剂 |
| 2 增效因子的增效机理 |
| 2.1 影响昆虫围食膜的完整性和渗透性 |
| (1)通过作用于几丁质破坏昆虫围食膜的完整性 |
| (2)通过降解围食膜蛋白增大围食膜的渗透性 |
| (3)通过自身尖端结构刺穿围食膜形成穿孔 |
| 2.2 促进病毒粒子与中肠微绒毛吸附并介导其与中肠上皮细胞融合 |
| 2.3 其他 |
| 3 展望 |
（5）PuGV-Ps增效蛋白质基因特征及其整合载体的构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1. 1 试验材料 |
| 1. 2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2. 1 增效蛋白质氨基酸序列分析 |
| 2. 2 Pu GV-Ps 增效蛋白质进化树分析 |
| 2. 3 Pu GV-Ps 增效蛋白质基因的二级结构 |
| 2. 4 In-fusion 技术构建增效整合载体 |
| 3 讨 论 |
（6）脂肪酸分析酶热传感器的构建和粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白的纯化（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 酶热传感器的工作原理 |
| 1.2 酶热传感器研究历史 |
| 1.2.1 简单系统 |
| 1.2.2 经典系统 |
| 1.2.3 小型系统 |
| 1.2.4 微型系统 |
| 1.2.5 杂合型系统 |
| 1.3 酶热传感器的应用 |
| 1.3.1 临床应用 |
| 1.3.2 工业发酵分析和过程控制 |
| 1.3.3 酶活检测 |
| 1.3.4 环境监测 |
| 1.4 酶热传感器的优势 |
| 1.5 Ⅱ型糖尿病与游离脂肪酸 |
| 1.5.1 FFA与胰岛素抵抗 |
| 1.5.2 FFA与p细胞分泌缺陷 |
| 1.6 FFA的检测意义及方法 |
| 1.7 铜绿假单胞菌长链脂酞辅酶A合成酶的特异性 |
| 1.8 粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白 |
| 1.8.1 ENHANCIN的分子特征 |
| 1.8.2 ENHANCIN的作用机制 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株与载体 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 酶和其它试剂 |
| 3.1.4 主要溶液 |
| 3.1.5 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 pET-32a(+)/fadD1原核表达载体的构建和鉴定 |
| 3.2.2 FadD1的原核表达 |
| 3.2.3 FadD1的Western blot验证 |
| 3.2.4 FadD1的纯化 |
| 3.2.5 FadD1的体外活性测定 |
| 3.2.6 FadD1的固定化与传感器的组装 |
| 3.2.7 酶热传感器的调试与检测 |
| 3.2.7.1 进样条件优化 |
| 3.2.7.2 底物的电压响应检测 |
| 3.2.8 Tn-En的原核表达载体构建 |
| 3.2.9 Tn-En的原核表达 |
| 3.2.10 Tn-En的纯化 |
| 3.2.11 Tn-En的复性 |
| 3.2.12 Tn-En与围食膜的体外酶解 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 PAO1基因组提取 |
| 4.2 fadD1的PCR扩增 |
| 4.3 fadD1的重组克隆载体的构建 |
| 4.4 fadD1的重组表达载体的酶切验证 |
| 4.5 FadD1的表达及Western Blot验证 |
| 4.6 FadD1的纯化 |
| 4.7 FadD1的活性检测 |
| 4.8 FadD1的固定化及酶热传感器的组装 |
| 4.9 酶热传感器的调试与检测 |
| 4.10 底物的电压响应检测 |
| 4.11 TN-En的重组表达载体的酶切验证 |
| 4.12 Tn-En的原核表达 |
| 4.13 Tn-En的纯化 |
| 4.14 Tn-En的复性 |
| 4.15 Tn-En与围食膜的体外孵育 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
（7）转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 Pu GV-Ps基因组DNA及质粒DNA提取 |
| 1.2.2 Pu GV-Ps增效蛋白基因的PCR扩增 |
| 1.2.3 Pu GV-Ps增效蛋白基因重组质粒的构建和测序 |
| 1.2.4 大肠杆菌转化菌株的诱导表达和纯化 |
| 1.2.5 增效蛋白表达产物对Btδ-内毒素的增效活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Pu GV-Ps增效蛋白基因的PCR扩增 |
| 2.2 Pu GV-Ps增效蛋白基因的克隆和测序 |
| 2.3 重组增效蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.4 重组增效基因表达产物对Btδ-内毒素的增效活性 |
| 3 讨论 |
（8）黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 病毒纯化及其DNA的制备 |
| 3 引物设计 |
| 5 目的基因扩增、克隆及测序 |
| 6 表达质粒的构建 |
| 7 EnN-As蛋白的表达、纯化和抗体制备 |
| 8 En-As蛋白的表达及Western blot鉴定 |
| 9 En-As与EnN-As对HaNPV的增效作用研究 |
| 9.1 蛋白处理液的制备 |
| 9.2 生物测定 |
| 10 生物信息学分析 |
| 结 果 |
| 1 En-As和EnN-As编码序列的克隆 |
| 2 序列分析 |
| 3 表达载体的构建与鉴定 |
| 4 抗体的制备及检测 |
| 5 En-As蛋白的表达及Western blot鉴定 |
| 6 表达蛋白的功能研究 |
| 讨 论 |
（9）黄地老虎颗粒体病毒ORF55基因的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒简介 |
| 1.2 增效蛋白简介 |
| 1.3 增效蛋白的发现及分布 |
| 1.3.1 增效蛋白的发现 |
| 1.3.2 增效蛋白的分布 |
| 1.4 增效蛋白的特征 |
| 1.4.1 分子特征 |
| 1.4.1.1 增效蛋白基因是晚期表达基因 |
| 1.4.1.2 增效蛋白的定位 |
| 1.4.1.3 增效蛋白拥有保守的锌结合位点 |
| 1.4.1.4 增效蛋白富含酸性氨基酸和可能的糖基化位点 |
| 1.4.1.5 增效蛋白氨基酸水平同源性差异较大 |
| 1.4.2 生化特征 |
| 1.4.2.1 金属蛋白酶性质 |
| 1.4.2.2 其他生化性质 |
| 1.5 增效蛋白的作用机制 |
| 1.5.1 介导学说 |
| 1.5.2 酶解学说 |
| 1.6 增效蛋白的应用研究 |
| 1.6.1 GV 与NPV 的复配 |
| 1.6.2 构建含增效蛋白基因的重组病毒 |
| 1.6.3 增效蛋白应用于植物转基因 |
| 1.6.4 增效蛋白工程菌株的构建 |
| 1.7 增效蛋白的研究展望 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 菌株与载体 |
| 3.1.2 酶和其它试剂 |
| 3.1.3 主要溶液 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.1.6 棉铃虫人工饲料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 病毒纯化及AsGV 基因组制备 |
| 3.2.1.1 病毒纯化 |
| 3.2.1.2 病毒DNA 的制备 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 基因的克隆及序列分析 |
| 3.2.3.1 目的基因扩增 |
| 3.2.3.2 基因的克隆与测序 |
| 3.2.3.3 序列分析 |
| 3.2.4 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2.5 目的蛋白的表达 |
| 3.2.5.1 蛋白诱导 |
| 3.2.5.2 蛋白提取 |
| 3.2.6 目的蛋白的纯化 |
| 3.2.7 抗体的制备 |
| 3.2.7.1 抗原准备 |
| 3.2.7.2 动物免疫及抗体效价检测 |
| 3.2.7.3 抗体特异性检测 |
| 3.2.8 目的蛋白的Western blot |
| 3.2.9 目的蛋白的功能鉴定 |
| 3.2.9.1 蛋白处理液的制备 |
| 3.2.9.2 生物测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 AsGV 基因组的制备 |
| 4.2 序列分析 |
| 4.3 目的基因的扩增 |
| 4.4 基因表达载体的构建 |
| 4.4.1 表达载体的构建策略 |
| 4.4.2 表达载体的验证 |
| 4.5 N-1020 蛋白的表达及优化 |
| 4.5.1 N-1020 蛋白的表达 |
| 4.5.2 表达条件的优化 |
| 4.6 抗体的制备和检测 |
| 4.6.1 抗原制备和抗体特异性鉴定 |
| 4.6.2 抗体的效价检测 |
| 4.7 全蛋白的表达及Western blot 鉴定 |
| 4.8 N-2679 蛋白的表达及纯化 |
| 4.9 生物测定结果分析 |
| 4.9.1 全蛋白生物测定结果 |
| 4.9.2 N-1020 蛋白生物测定结果 |
| 4.9.3 N-2679 蛋白生物测定结果 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 5.2.1 AsGV ORF55 的编码产物的增效作用 |
| 5.2.2 AsGV ORF55 编码产物的作用机制 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（10）苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 苏云金杆菌概述 |
| 1.1.1 苏云金杆菌的毒力因子 |
| 1.1.2 杀虫晶体蛋白 |
| 1.1.3 杀虫晶体蛋白的杀虫机理 |
| 1.1.4 杀虫晶体蛋白的应用 |
| 1.1.5 杀虫晶体蛋白与其它物质间的增效 |
| 1.1.6 苏云金杆菌存在的问题及解决方法 |
| 1.2 昆虫杆状病毒增效蛋白 |
| 1.2.1 昆虫杆状病毒增效蛋白的发现及其增效活性 |
| 1.2.2 增效蛋白的生化特性 |
| 1.2.3 增效蛋白的作用机理 |
| 1.2.4 昆虫病毒增效蛋白的应用 |
| 1.3 细菌中增效蛋白类似基因的发现及研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试昆虫与颗粒体病毒 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 培养基与抗生素 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 常用仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 E. coli 质粒DNA 的提取 |
| 2.2.2 Bt 菌株质粒DNA 的提取 |
| 2.2.3 enhancin-like 基因的克隆 |
| 2.2.4 基因的序列的测定与分析 |
| 2.2.5 enhancin-like 基因在E. coli 中的诱导表达 |
| 2.2.6 目的蛋白的纯化 |
| 2.2.7 目的蛋白的定量及抗体制备 |
| 2.2.8 工程菌的构建 |
| 2.2.9 Western blot 检测外源蛋白的表达 |
| 2.2.10 Cry9Ea 蛋白的制备及蛋白浓度测定 |
| 2.2.11 粉纹夜蛾颗粒体病毒TnGV 的活体增殖与纯化 |
| 2.2.12 Enhancin-like 蛋白体外处理围食膜 |
| 2.2.13 Enhancin-like 蛋白对Cry9Ea6 蛋白的增效作用分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 enhancin-like 基因的PCR 鉴定 |
| 3.2 enhancin-like 基因的克隆 |
| 3.3 enhancin-like 基因的序列测定与分析 |
| 3.4 enhancin-like 基因在E. coli 中的诱导表达 |
| 3.5 enhancin-like 蛋白的纯化及定量 |
| 3.6 Bt 工程菌的构建和分子检测 |
| 3.7 工程菌HDenhancin-like 的western bolt 分析 |
| 3.8 Enhancin-like 蛋白对围食膜的作用 |
| 3.9 Enhancin-like 蛋白与Cry9Ea 蛋白的协同作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 缩略词 |
| 附录 2 GenBank 登记资料 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白的增效作用（论文参考文献）
- [1]美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究[D]. 张雅昆. 河北农业大学, 2018(02)
- [2]Bt杀虫晶体蛋白增效物质的研究进展[J]. 龚莉君,柳傲,刘大成,杨中侠. 华中昆虫研究, 2016(00)
- [3]杆状病毒增效因子及其增效机理[J]. 张林娜,陈文峰,尹新明,李文明,刘向阳,张忠信. 病毒学报, 2016(05)
- [4]粘虫颗粒体病毒增效蛋白基因片段优化及功能[J]. 韩光杰,刘琴,徐贝贝,王建军,祁建杭,李传明,徐健. 微生物学报, 2016(09)
- [5]PuGV-Ps增效蛋白质基因特征及其整合载体的构建[J]. 韩光杰,赵松,刘琴,李传明,徐健. 江苏农业学报, 2015(02)
- [6]脂肪酸分析酶热传感器的构建和粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白的纯化[D]. 王建林. 河南农业大学, 2014(07)
- [7]转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性[J]. 徐健,赵松,刘琴,杨青,李传明. 中国生物防治学报, 2013(03)
- [8]黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究[J]. 张小霞,梁振普,陈晓慧,宋小凤,王丽薇,邵新峰. 病毒学报, 2012(03)
- [9]黄地老虎颗粒体病毒ORF55基因的功能研究[D]. 陈晓慧. 河南农业大学, 2011(08)
- [10]苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析[D]. 赵丹. 河北农业大学, 2011(08)