一、尖吻蝮蛇毒素对小鼠骨骼肌和心肌损伤的电子显微镜初步观察（论文文献综述）
程馨妍[1]（2021）在《基于光敏型多孔氧化锌的广谱解毒技术》文中认为毒蛇咬伤是一种外科中毒类急症,其官方急救原则是减少毒素扩散并尽早使用相应的抗蛇毒血清。然而抗蛇毒血清不仅种类匮乏,难以生产和保存,并且很难在第一时间实施救治。因此如果能开发一款方便使用的广谱解蛇毒的纳米材料,对于研究治疗毒蛇咬伤的新药开发,将是很有意义的。受到煮鸡蛋的启发,本文提出了一种基于氧化锌复合物（Zn O Complex,简写为ZC）的蛇毒处理新理念。体外和体外内吸附实验证明ZC可以广谱吸附蛇毒,有效降低血液中的有毒蛋白的浓度。更重要的是,ZC还能响应近红外（Near-Infrared,简写为NIR）激光,产生升温效应,致使蛇毒蛋白发生水解,从而进一步延长动物的生存时间,降低死亡率。此外,ZC不仅具有较好的生物相容性,还可以抑制细菌繁殖、消除炎症、有助于蛇咬伤后导致的开放性创面愈合。
董阳婷[2]（2018）在《氧化应激在β-淀粉样蛋白及氟化物引起的实验性中枢神经损伤病理过程中的作用及其分子机制》文中研究说明目的:氧化应激（Oxidative stress,OS）在多种疾病的发生机制中起着重要作用。在本课题组过去的研究中发现,阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）发病中的关键蛋白之一―β-淀粉样肽（b-Amyloid peptide,Ab）可引起氧化应激水平升高;长期摄入过量氟化物可造成慢性氟中毒,导致机体全身性损伤,其主要损伤机制与氟诱导体内自由基过多有关。为了深入了解OS的致病作用,本文选择AD患者脑组织标本、β-淀粉样肽前体蛋白（b-Amyloid precursor protein,APP）高表达转基因小鼠、慢性氟中毒实验大鼠、经Ab处理的体外培养神经细胞,研究OS在该两种疾病中枢神经损伤中的作用及其分子发生机制。方法:1.AD研究:（1）研究对象:采用AD患者及对照组（非神经系统疾病）尸体解剖大脑海马及皮质颞叶区组织切片标本、APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠模型（APP高表达）及体外培养神经细胞（原代培养海马神经元和SH-SY5Y细胞系细胞）。（2）处理方法:用4月龄及8月龄转基因动物,经灌胃给予20 mg/kg白藜芦醇（Resveratrol,RSV）―一种沉默信息调节因子（Silent information regulators,SIRTs）激活剂、20 mg/kg苏拉明（Suramin）―SIRTs抑制剂、对照组动物给予生理盐水,处理时间为2个月。细胞模型采用0.5mmol/L Ab寡聚体（Aboligomers,AbOs）、10或50mmol/L RSV、200或300μg/mL Suramin、20mmol/L ZLN005及过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator 1α,PGC-1α）转染质粒分别或合并处理,孵育时间为2448 h。（3）测定方法:用HE、尼氏染色、透射电镜及免疫组织化学方法检查人体或动物脑组织神经病理学形态变化;用免疫荧光或免疫组织化学方法检测SIRTs（SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5）在脑组织中的表达及定位;用CCK-8试验检测细胞的存活率;流式细胞技术或激光共聚焦显微镜检测体外培养细胞内凋亡或活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平;用ELISA试剂盒检测血清、脑脊液中α-可溶性分泌型APP片断（α-form soluble secreted APP,αAPPs）及脑组织中不可溶性Ab含量;用蛋白印迹（Western-blotting）、免疫荧光或免疫组化、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）检测试剂盒分别检测小鼠脑组织不同脑区和体外培养细胞中各种相关蛋白（SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5等）、mRNA表达水平及NAD+水平;用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力。2.慢性氟中毒研究:（1）研究对象:选择Sprague-Dawley（SD）大鼠。（2）处理方法:通过饮水加氟（50 mg/L,用氟化钠配制）及Vit E灌胃处理（50 mg/kg体重/天）复制慢性氟中毒动物模型及抗氧化剂处理动物模型,饲养时间为10个月。（3）测定方法:慢性氟中毒动物模型复制检查,包括脑重、氟斑牙程度、用氟电极方法测定尿氟及骨氟含量;采用生物化学方法测定氧化物阴离子(O2.-)、脂质过氧化物（其代谢产物丙二醛）水平;用免疫组化方法测定胆碱能毒蕈碱样受体（Muscarinic acetylcholine receptors,mAChRs）蛋白表达水平;用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力。结果:1.AD部分:（1）人脑标本:结果显示,与正常人比较,AD患者大脑海马及颞叶皮质区SIRTs（SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5）表达均明显降低,并且出现大量的老年斑,老年斑的数量及分布与其的表达呈负相关的关系;（2）AD动物模型:结果显示,经过大量繁殖及基因型鉴定,AD动物模型成功建立;不同月龄段双转基因小鼠学习记忆能力较野生对照小鼠明显降低,脑重亦降低;较野生对照组比较,双转基因小鼠大脑神经元内尼氏小体明显减少,不同月龄双转基因小鼠大脑海马及皮质区均出现数量不等的老年斑,且其数量及分布程度随月龄增加而增加;电镜检查显示,不同月龄双转基因小鼠大脑神经元细胞核核膜局部有缺如,甚至核染色质边集,线粒体嵴和膜出现不同程度融合、断裂、消失;应用RSV处理双转基因小鼠后,其学习记忆能力及脑组织病理学变化明显改善,而Suramin则可进一步加重这些改变。双转基因小鼠海马及皮质区SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5蛋白及mRNA表达均出现不同程度降低,其在大脑海马及皮质区均有分布;同时,双转基因小鼠海马及皮质区PGC-1α、OGG1、α7 nAChR、Syn及SNAP25蛋白表达明显降低,Apo E、Caspase3蛋白表达明显升高;另外,α-分泌酶（ADAM10）及β-分泌酶（BACE2）蛋白表达出现不同程度降低,而β-分泌酶（BACE1）明显升高;而上述改变均可被RSV逆转,动物老年斑明显减少。双转基因小鼠血清及脑脊液中αAPPs含量明显降低;脑组织中不可溶性Aβ水平明显增加,NAD+含量明显降低;而经过RSV处理的双转基因小鼠αAPPs及NAD+含量明显升高,不可溶性Aβ水平明显降低,应用Suramin则出现相反的作用。双转基因小鼠血清、脑组织及线粒体中OS水平与抗氧化酶水平明显升高或降低;应用RSV后,其可降低OS,升高抗氧化酶活性,而Suramin则出现相反的作用。（3）细胞模型:结果显示,原代培养的大鼠海马神经元纯度约达到83%左右,PGC-1α沉默的海马神经元及SH-SY5Y细胞中PGC-1α蛋白表达水平均明显低于野生对照组细胞;加AbOs处理后,神经元内SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5蛋白及mRNA表达均出现不同程度降低;应用RSV预处理神经元后,SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5表达明显升高,且RSV可明显清除进入细胞内的AbOs,而Suramin则可进一步加重AbOs的毒性作用;另外,AbOs处理神经元后,细胞内PGC-1α、OGG1、α7 nAChR蛋白表达明显降低,Apo E、Caspase3蛋白表达明显升高;ADAM10及BACE2蛋白表达降低,而BACE1蛋白表达明显升高,RSV预处理细胞后,其可抑制上述改变。AbOs可以使神经元内NAD+水平明显降低,细胞凋亡,细胞内ROS及OS水平明显升高,而细胞及线粒体内抗氧化酶含量明显降低;RSV与处理细胞后,可逆转上述改变,而Suramin则加重上述改变。另外,随着PGC-1α的沉默,SIRT1不能抑制Apo E的表达;而激活PGC-1α后,即使抑制SIRT1的表达,也能调控Apo E的表达。2.慢性氟中毒部分:结果显示,染氟成年大鼠出现不同程度的氟斑牙,尿氟及骨氟含量高于对照组,脑重未见明显变化,学习记忆能力明显降低,同时脑组织M1、M3受体蛋白表达水平均低于对照组;脑组织O2·-及MDA水平明显升高。经Vit E处理的慢性氟中毒大鼠上述毒性改变明显减弱。相关分析结果发现,随着大鼠学习记忆能力降低,M1、M3受体蛋白表达呈降低趋势,两两存在正相关关系。结论:（1）AD患者脑组织、APP高表达转基因小鼠脑组织及经AbOs的神经细胞中OS水平升高,SIRTs表达的降低,可能是导致老年斑大量聚集的原因之一。（2）RSV通过增加SIRTs的表达,减少AbOs诱导的细胞毒性作用,其机制可能涉及SIRTs激活后调控其下游的一系列蛋白,降低线粒体自由基和ROS产生,减少细胞脂质过氧化水平,提升抗氧化酶活性,减少Apo E的改变,抑制线粒体DNA损伤,从而减少细胞凋亡,进而降低细胞老化所引起的学习记忆能力的改变。（3）SIRTs激活后通过刺激α7 nAChR的表达,活化ADAM10,增强APP非淀粉代谢途径,促进sAPPα分泌,从而减少Ab在大脑中的沉积。（4）慢性氟中毒大鼠脑组织中OS水平升高,mAChR M1及M3受体蛋白表达水平降低,MDA及O2·-水平升高,受体水平减低与OS水平的上升有显着性负性相关,这些改变可能是氟中毒大鼠学习记忆能力降低的机制;抗氧化剂对慢性氟中毒脑组织损伤有一定抑制作用。（5）OS在AD及慢性氟中毒中枢神经系统病理损伤机制中有重要作用,抗氧化剂处理或提高抗氧化水平可对抗过量Ab或氟化物引起的神经损伤。
刘晓曼[3]（2018）在《从黄柏炭止血作用及其机制研究探讨“炒炭止血”与“烧灰存性”》文中进行了进一步梳理背景:中药炭药的临床应用历史悠久,仲景《金匮要略》中有数个处方与中药制炭相关。如王不留行散后注“桑根皮以上三味烧灰存性,勿令灰过”,枳实芍药散中注“枳实（烧令黑,勿太过）”,其所提出的“烧灰存性,勿令灰过”是最早的炭药炮制标准。目前制炭多以经验判断,临床疗效良莠不齐,炭药用于止血在历代中医用药中占有十分重要的地位,而探究“炒炭止血”关键物质基础成为炭药现代研究的重点和难点。黄柏炭（PCC）是黄柏高温炭化的产物,苦寒之性大减,清热燥湿之中兼有收涩之性,临床常用于治疗便血、崩漏下血等。黄柏含有生物碱类、柠檬苦素类等活性成分,在高温炭化后,原有的这些主要成分几乎完全消失,但却产生了止血作用。虽然PCC的止血效果得到了相当多的临床证据的支持,但其止血作用的物质基础及机制尚不明了。目的:本研究引进纳米学科表征技术,以黄柏炭为研究对象,探究新发现的存在于PCC水煎液中的黄柏炭碳点（PCC-CDs）的制备工艺标准,基于多种出血模型评价PCC-CDs的止血作用并探究其作用机制,证实PCC-CDs是黄柏高温炭化后产生止血作用的关键物质基础之一,为阐明“炒炭止血”物质基础与仲景炭药“烧灰存性”科学内涵提供部分实验依据。方法:1.建立PCC-CDs的制备方法及分离纯化方法,以白眉蛇毒血凝酶（HC）为止血阳性对照药,利用小鼠断尾出血模型初步评价PCC-CDs的止血作用。2.考察马弗炉锻烧温度及时间,运用透射电子显微镜表征技术（TEM）,以电镜结果和止血效果为评价指标,优化PCC-CDs的制备条件。3.利用高效液相色谱法（HPLC）对PCC-CDs水溶液进行成分分析;运用TEM、HRTEM、EDS和XPS等技术,结合傅立叶变换红外光谱（FTIR）、紫外光谱（UV-Vis）、荧光光谱（FL）等现代中药研究常用分析技术,对优选出的PCC-CDs进行理化性质表征并计算其量子产率。4.通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测不同浓度PCC-CDs水溶液对细胞活力的影响,评价其细胞毒性,初步获取PCC-CDs的安全性参数。5.运用断尾出血模型考察皮下注射（sc）,灌胃注射（ig）和腹腔注射（ip）3种给药方式PCC-CDs的止血效果。运用毛细玻璃管法,测定PCC-CDs单次给药后10min、45min、90min、120min、180min、300min和480min各时间点的凝血时间。采用小鼠断尾出血、肝脏损伤出血模型,考察PCC-CDs止血作用的量-效关系。通过PCC-CDs肝素钠拮抗实验及其对小鼠血小板计数（PLT）和凝血四项（PT、APTT、TT、FIB）的影响,探究PCC-CDs发挥止血作用可能的途径。6.建立五步蛇毒（AAV）急性出血模型,设对照组、模型组、PCC-CDs高、中、低剂量组,每组按时间点（1h、3 h、12 h、1d、2d和5d）设6个亚组。各组各时间点取全血检测PLT,取血浆检测6-keto-PGF1α、TXB2、t-PA和PAI-1的含量,探究PCC-CDs对AAV急性出血模型的止血作用及其作用机制。各组各时间点取血清检测BUN、CRE,取肾脏行HE染色观察肾脏病理光镜改变,以ELISA法检测肾组织中IL-10、IL-1β和MCP-1的含量,探究PCC-CDs对AAV出血致小鼠急性肾损伤的保护作用及机制。结果:1.在马弗炉300℃煅烧1h的制备条件下,所得PCC-CDs电镜下呈较均匀分散的球形,粒径小于10 nm,晶格间距约为0.24 nm。在断尾出血模型中,PCC组和PCC-CDs组的止血时间无差别（P>0.05）,二者与NS组、黄柏生药组相比,止血时间均明显缩短（P<0.05）,与HC组止血时间差异无统计学意义（P>0.05）。2.在PCC-CDs制备方法的考察中,马弗炉煅烧温度分别为250℃、300℃、350℃、400℃和450℃时,所得PCC的制炭产率及电镜下粒径和形状均存在差异,止血效果也不尽相同,综合电镜结果和止血效果,优选出350℃组。进一步考察350℃条件下的煅烧时间,分别为15 min、30 min、45 min和60min,综合电镜结果和止血效果优选出60min组。最终PCC-CDs的最优化制备条件为马弗炉350℃煅烧1 h。3.PCC-CDs成分分析及理化性质表征:（1）HPLC法检测PCC-CDs水溶液,未检测到存在于生黄柏中的生物碱类和柠檬苦素类等活性成分。（2）PCC-CDs的形貌:PCC-CDs在TEM下呈球形并均匀分布,直径范围为1.2-4.8nm,粒径分布为2.640±0.694 nm;经HRTEM衍射测得PCC-CDs的晶格间距约为0.232 nm。（3）PCC-CDs光谱性质:①UV-Vis显示PCC-CDs在270 nm处有一个弱吸收峰。②FL结果显示PCC-CDs的最强发射波长为438 nm,最强激发波长为363 nm。③FTIR结果显示PCC-CDs在3385、3130、2925、2860、1566、1401 和 1121 cm-1 处显示特征吸收峰。3385cm-1处为-N-H基团;在3130cm-1处可观察到-O-H基团的存在;在2925和2860cm-1处的微弱吸收归属于-CH的伸缩;此外,PCC-CDs中1566 cm-1处的吸收峰被认为是-C=O的特征吸收峰;PCC-CDs在1401cm-1处的吸收峰可能为C-N,N-H或COO-基团;在1121cm-1处的吸收峰为-C-O。（4）PCC-CDs的元素及表面结构:EDS结果表明PCC-CDs主要由C和O组成,含量比为575:175,接近于3,与XPS的结果相一致。XPS结果表明PCC-CDs主要由碳（71.64%,原子百分比）,氮（1.30%,原子百分比）和氧（23.26%,原子百分比）组成。经XPS分峰分析得PCC-CDs表面可能存在C-C/C=C、C=O、C-O、C=N、O-C=O、C-OH、C=O、N=C、C-N-C和N-（C）3等官能团。XPS的分析结果与FTIR结果相一致。（5）PCC-CDs提取率为0.26%,相对量子产率为9.62%。4.在CCK-8细胞毒性实验中,当PCC-CDs水溶液浓度为0、0.01、0.1、1、10、100和1000μg/mL时,细胞活力均在100%左右,而浓度为5000μg/mL时细胞活力开始下降,浓度为10000 μg/mL时细胞活力逐渐下降至52.78%。5.PCC-CDs的止血作用及其作用机制研究:（1）与NS组相比,sc、ig和ip3种给药方式断尾止血时间均缩短,差异具有统计学意义（P<0.05）;sc和ip组止血时间与阳性对照组无差别（P>0.05）。（2）PCC-CDs单次给药后,10 min已表现出促凝作用,10 min、45 min、90 min、120 min、180 min和300 min各时间点给药组凝血时间与对照组差异均具有统计学意义（P<0.05）,自300min至480min,给药组凝血时间逐渐延长至与对照组趋同（P>0.05）。（3）在小鼠断尾出血和肝脏损伤出血两种实验模型中,PCC-CDs组止血时间明显缩短,与NS组相比差异具有统计学意义（P<0.05）且与阳性药无差别（P>0.05）。（4）PCC-CDs肝素钠拮抗实验中,与NS组相比,HC组、PCC-CDs组和HS+PCC-CDs组止血时间均缩短（P<0.05）;PCC-CDs组与HC组止血时间无差别（P>0.05）;与PCC-CDs组相比,HS+PCC-CDs组止血时间明显延长（P<0.05）。（5）PLT与凝血四项测定结果:与NS相比,PCC-CDs组PLT、FIB升高（P<0.05）,PT降低（P<0.05）。6.PCC-CDs对AAV急性出血模型的作用及其机制研究:（1）在AAV造模剂量考察实验中,LD50组（2mg/kg）死亡4只小鼠,其余组小鼠无死亡;1/2倍LD50组和1/4倍LD50组小鼠均出现了中毒症状。LD50组PLT下降至（134.00±42.81）× 109/L,1/2 倍 LD50 组 PLT 下降至（343.80±63.41）× 109/L,1/4 倍 LD50 组下降至（751.30±70.64）× 1 09/L,与 NS 组[（1160.10±77.38）× 1 09/L]相比,差异均具有统计学意义（P<0.01）。综合分析筛选出的建立AAV急性出血模型的AAV剂量为1 mg/kg。（2）AAV急性出血实验中,模型组在1h、3h、12h、1d和2d,5个时间点的PLT均比NS组下降（P<0.05）,而治疗组抑制了AAV所导致的PLT下降,其中高剂量组3 h、12 h、1d和2d4个时间点与模型组差异均具有统计学意义（P<0.05）。与NS组相比,模型组的6-keto-PGF1α和t-PA升高（P<0.05）、TXB2和PAI-1下降（P<0.05）,而治疗组可明显抑制AAV造成的TXB2和PAI-1的下降,且可缓解6-keto-PGF1α和t-PA的升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）在探究PCC-CDs对AAV出血致小鼠急性肾损伤保护作用及其机制的实验中,1 d、2d和5d,3个时间点模型组BUN、CRE比NS组升高（P<0.05）,而治疗组可抑制AAV造成的BUN、CRE的升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。模型组肾脏病理形态学结果:1h即可见肾小球充血,肾小管周围毛细血管充血,肾小管肿胀扩张,小管上皮细胞水肿、变性,而治疗组肾小管肿胀和充血均较模型组减轻。模型组IL-10、IL-1β和MCP-1,与NS组相比升高（P<0.05）,而治疗组可抑制AAV造成的IL-10、IL-1β和MCP-1的升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.本研究首次发现黄柏炭碳点,优选出的制备条件为马弗炉350℃锻烧1h。所得黄柏炭碳点为直径1.2-4.8nm、晶格间距0.232nm、制炭产率39.28%,主要由C、O、N元素组成,表面存在羰基、羧基、羟基、醚基和氨基等活性官能团的类碳点成分。黄柏炭碳点水溶液中不存在小分子、金属离子或盐类等常规的中药药效活性成分。2.黄柏炭碳点水溶液浓度低于1000μg/mL（约相当于PCC3g/mL）时无细胞毒性,体内外均具有与白眉蛇毒血凝酶相当的止血作用,单次给药其止血效应自10 min起至5h维持在较高水平,5-8 h逐渐降至正常,推荐给药方式为皮下注射和腹腔注射。3.黄柏炭碳点主要通过激活内源性凝血途径,增加血小板含量、提高TXB2含量促进血小板聚集,促进纤维蛋白的生成,提高PAI-1含量抑制纤溶系统活性发挥止血作用。4.以黄柏炭为例,“炒炭止血”物质基础与仲景炭药“烧灰存性”科学内涵可阐释为“表面存在大量可塑性活性基团的黄柏炭碳点是黄柏炭发挥止血作用的关键物质基础之一。在制备黄柏炭时,马弗炉350℃锻烧1h以制备止血作用最佳的黄柏炭碳点,太过或不及不能产生止血作用或止血作用较弱”。
崔迪[4]（2017）在《抗阻训练控制骨骼肌质量分子机制研究》文中进行了进一步梳理骨骼肌是机体重要的运动及代谢器官,约占全身质量的1/3～1/2,衰老及退行性疾病的发生引起骨骼肌衰减从而影响人们生活质量并进一步恶化疾病状态。抗阻训练（Resistance Exercise,以下简称RE）或力量训练（Strength Training,以下简称ST）的产生源自于人们对力量的着迷,长期从事抗阻运动可有效刺激肌肉肥大、改善骨骼肌功能抑制肌肉衰减并防治肌肉衰减相关疾病的发生。已有报道提供了人体实验数据支持以上观点,但其分子机制尚待进一步研究。其中,以mTOR信号为中心的蛋白质合成调控通路在抗阻运动重塑骨骼肌质量与功能的过程中的作用机制仍待进一步揭示,而骨骼肌在体干细胞,即肌卫星细胞（Satellite Cell,以下简称SC）,在抗阻运动介导的骨骼肌肥大过程中的必要与否尚存争议。运动与骨骼肌健康领域中,多种实验动物抗阻训练模型如断肌腱术、协同肌剥离术、爬梯、电刺激骨骼肌收缩、被动跳水或后肢伸展及复杂抗阻训练笼盒/设备等先后被运动科学家报道,但均受限于模型非自主性、机体侵害损伤及非生理条件等因素影响不能在研究中广泛使用及推广,目前尚缺乏生理条件下有效合理的小鼠自主抗阻训练动物模型。为探讨生理条件下抗阻训练介导骨骼肌质量控制的分子机制,本研究研发了小鼠自主举重训练模型并通过急性、短时及长时训练研究不同时长举重训练对骨骼肌质量控制相关蛋白质合成与降解、肌卫星细胞活性等影响及其分子机制,同时采用骨骼肌卫星细胞（Satellite Cell,以下简称SC）缺失（Pax7Cre-RosaDTA,以下简称mSCD）转基因小鼠模型探究骨骼肌卫星细胞在抗阻运动介导骨骼肌肥大过程中的必要性,采用糖皮质激素地塞米松（Dexamethasone,以下简称Dex）诱导小鼠肌萎缩模型探索短时举重训练对药物性骨骼肌流失的干预作用及可能机制,旨在揭示抗阻运动介导骨骼肌质量控制、防治骨骼肌衰减的综合内在机制,为运动抗衰老及相关肌病、代谢相关疾病的运动防治提供理论参考和基础研究数据支持。目的:介绍小鼠自主举重训练模型设计思路、校准方法及不同时长（包括急性、长时、短时）举重训练方案;探究不同时长举重训练对骨骼肌质量及收缩功能的影响;探究急性举重训练对小鼠骨骼肌转录组基因表达的影响;探究不同时长举重训练对骨骼肌蛋白质合成的影响;探究不同时长举重训练对骨骼肌蛋白质降解的影响;探究不同时长举重训练对小鼠糖代谢功能的影响;探究不同时长举重训练对肌卫星细胞激活的影响;探究肌卫星细胞在长时举重训练介导骨骼肌肥大过程中的必要性;探究短时举重训练对糖皮质激素诱导骨骼肌萎缩模型的抑制作用。方法:1)小鼠自主举重模型建立与运动训练方案确定小鼠自主举重模型设计思路是利用食物的奖励策略,诱导小鼠利用举重笼具进行后肢屈伸的抗阻力量练习。该举重模型的设计基于小鼠普通饲养笼具（290×180× 200 mm）,根据笼具顶部周长及面积,切割透明塑料钢板裁制为相应大小,并粘合底座使其与普通饲养笼盒完全吻合,该笼盖即为举重模型的底座。在距离笼盖短边距离3 cm处,凿钻大小为10 cm×10 cm的矩形孔,使用相同的材料以三角接头将举重门孔固定,以便将食盒固定在门孔上方。采用金属钢板制作举重杠杆,沿钢板正中两侧凿钻直径为2.5 cm大小的圆形门孔以便小鼠通过该孔探寻食物,举重杠杆一侧固定在塑料钢板盖上,一侧则通过三角架可上下活动,伸出笼盒部分打孔以添加负荷重量。杠杆臂下端附着磁铁,与其对应笼盒部分固定磁力感应器,后者与计算机相连用以记录小鼠举重次数与频率。使用10-12周龄清洁级野生型C57BL/6雄性小鼠分别进行急性举重练习（n=1）及长时举重练习（n=4）,测试举重模型并根据小鼠举重情况确定运动训练方案。2)不同时长举重训练对小鼠骨骼肌质量控制的影响本研究先后观察了急性（Acute Weightlifting,以下简称AWL）、短时（Short-term WL,以下简称 SWL）及长时（Long-term WL,以下简称 LWL）举重训练对小鼠骨骼肌质量的影响。急性举重训练干预实验中,10-12周龄雄性清洁级C57BL/6小鼠,随机分为对照组（Con,n=5）及急性举重训练干预组（AWL,n=5）,分别置于举重笼具及普通饲养笼中,AWL组小鼠进行为期一天的急性举重训练,训练时间从下午6:00至第二日晨6:00,举重负荷为150%体重（Body Weight,以下简称BW）。短时举重训练干预实验中,10-12周龄雄性清洁级C57BL/6小鼠,随机分为对照组（Con,n=5）及短时举重训练干预组（SWL,n=5）,SWL组小鼠进行为期2周的举重训练运动干预,举重负荷从100%BW增加至240%BW。长时举重训练干预实验中,10-12周龄雄性清洁级野生型C57BL/6小鼠,随机分为对照组（Con,n=8）及长时举重训练干预组（LWL,n=8）,LWL组小鼠进行为期8周的举重训练运动干预,举重负荷从100%BW增加至240%BW并维持240%BW直至训练结束。无论短时或长时举重训练干预,运动组小鼠置于举重笼具前禁食2小时,训练时间从下午6:00（熄灯）至第二天上午9:00,白天置于普通饲养笼具中,每2-3天训练周期后休息1天,对照组与训练组禁食干预一致。运动干预后进行相关功能测试,后采用颈椎脱臼处死小鼠并采集后肢骨骼肌及内脏样本。a)不同时长举重训练对小鼠体重、骨骼肌质量及收缩功能的影响采用Aurora在体肌力评价系统测试小鼠后肢骨骼肌最大肌力、单收缩肌力、力量-频率关系、疲劳与恢复;采用精密电子称称量比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌、心肌、附睾脂肪质量,使用游标卡尺测量胫骨长度作为组织相对质量参考值;采用超声磁共振技术（Echo-MRI）评价长时举重小鼠身体成分;采用核磁共振技术（MRI）检测长时举重训练对小鼠后肢骨骼肌横截面积影响;采用跑台耐力实验评价长时举重训练对小鼠有氧运动能力影响;采用超声心动信号采集系统检测小鼠心肌收缩功能;采用HE染色技术检测短时举重训练对小鼠骨骼肌肌纤维横截面积影响。b)急性举重训练对小鼠骨骼肌转录组基因表达影响制备腓肠肌mRNA,采用Illumina测序平台进行转录组测序（RNA-sequencing,以下简称RNA-seq）;抽提腓肠肌、胫骨前肌、股四头肌、心肌、肝脏组织总mRNA并制备相应cDNA样品,采用Semi-quantitive PCR技术检测Tweak,Fn14,D1scr1,Nr4a3,Cytb等基因mRNA表达。c)探究不同时长举重训练对骨骼肌蛋白质合成的影响采用表面感应翻译技术（Surface sensingoftransltion,以下简称SUnSET）技术检测小鼠骨骼肌及内脏组织蛋白质合成;采用免疫印迹技术（Western Blot,以下简称WB）技术检测蛋白质合成相关Akt、p70S6k、4e-Bp-1蛋白表达及磷酸化修饰。d)探究不同时长举重训练对骨骼肌蛋白质降解的影响采用WB技术检测蛋白降解相关蛋白泛素化（Ubiquitination）;采用WB技术检测细胞自噬相关Lc3、p62蛋白表达、Lc3Ⅱ1/Lc3Ⅰ比值及线粒体含量相关Cox4或线粒体复合物Ⅰ-Ⅴ蛋白表达。e)探究长时举重训练对小鼠糖代谢功能的影响采用腹腔注射葡萄糖实验（Introperitoneal glucoe tolerance test,以下简称IGTT）检测长时举重训练对小鼠血糖清除能力影响;采用免疫印迹WB技术检测糖代谢相关Glut4蛋白表达及胰岛素刺激下Akt蛋白表达及磷酸化修饰。f)探究不同时长举重训练对Notch1蛋白表达及肌卫星细胞的影响采用WB技术检测细胞增殖相关Notch1蛋白表达;采用点击化学（Click chemistry）技术检测EdU标记骨骼肌DNA合成;采用免疫荧光技术检测Pax7标记肌卫星细胞。3)探究长时举重训练对成体肌卫星细胞缺失转基因小鼠骨骼肌质量的影响10-12周龄雄性mSCD小鼠及其同窝对照WT小鼠各10只,每种基因型小鼠又分为安静对照组（Sed）及举重干预组（WL）,即mSCD-Sed、mSCD-WL、WT-Sed、WT-WL,每组各5只。举重组（mSCD-WL、WT-WL）小鼠进行为期8周的举重训练,即负荷强度从100%BW增加到240%BW并保持至运动干预结束,每2-3天训练周期后休息1天。采用Aurora在体肌力评价系统测试小鼠后肢骨骼肌收缩功能;采用IGTT技术检测小鼠葡萄糖清除能力;采用精密电子称称量比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌、心肌、附睾脂肪质量,使用游标卡尺测量胫骨长度作为组织相对质量参考值。4)探究短时举重训练对糖皮质激素诱导骨骼肌萎缩的干预作用10-12周龄清洁级野生型C57BL/6雄性小鼠,随机分为对照组（Con,n=5）、地塞米松注射组（Dex,n=4）及地塞米松+举重组（Dex+WL,n=4）,Dex及Dex+WL组小鼠连续7天腹腔注射25mg/Kg BW剂量的Dex,运动组小鼠进行为期2周的短时举重训练。采用Aurora在体肌力评价系统测试小鼠后肢骨骼肌收缩功能;采用精密电子称称量比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌、心肌、附睾脂肪质量,使用游标卡尺测量胫骨长度作为组织相对质量的参考;采用SUnSET技术检测小鼠骨骼肌蛋白质合成。结果:1)小鼠自主举重模型建立与运动训练方案确立野生型小鼠能够使用举重模型进行自主抗阻练习,举重笼盒添加重量与负荷强度线性关系良好;急性举重训练预实验小鼠在100%、150%、200%BW负荷强度举重次数分别为645、291、5;长时举重预实验中随着负荷强度从100%增加到300%BW过程中,小鼠举重次数逐渐下降,在240%BW负荷强度下保持约200次/晚的举重频次。2)不同时长举重训练对小鼠骨骼肌质量控制的影响a)急性举重运动干预结果显示,在150%BW负荷强度下,小鼠举重次数为422±64次,小鼠运动前后无体重下降现象,未比较急性举重小鼠骨骼肌质量变化。短时举重运动训练数据显示,鼠举重次数根据负荷强度的增加而降低,在240%BW负荷强度下基本保持约200次的频数;短时举重训练对小鼠骨骼肌、心脏附睾脂肪湿重的影响不大（P>0.05）,具体来说SWL组小鼠比目鱼肌质量较Con小鼠有增加趋势,而附睾脂肪湿重较Con组呈下降趋势;SWL组小鼠后肢肌肉最大肌力输出较Con呈增加趋势,而不论使用体重还是用腓肠肌质量为参考,最大肌力在两组比较中差异不明显（P>0.05）;力量-频率曲线关系百分比曲线,两组比较无差异,而在与腓肠肌质量相对肌力比较中SWL组小鼠在80、100、125 Hz频率刺激下力量输出显着高于Con组小鼠（P<0.05）;SWL组较Con组小鼠在肌纤维数量无差异,肌纤维横截面积在WL组呈增加趋势,而在具体肌纤维面积分布及数量变化上也无差异（P>0.05）。长时举重训练干预研究结果显示,小鼠举重次数根据负荷强度的增加而降低,在240%BW负荷强度下基本保持200次左右;8周运动过程中LWL小鼠体重逐渐增加,在运动干预结束的第8周,LWL组小鼠体重较Con组小鼠显着增加（P<0.01）;与Con比,LWL小鼠骨骼肌最大收缩肌力及短时收缩力相对值均显着增加（P<0.01）,无论参考体重或肌肉质量相对最大肌力及短时兴对收缩肌力均显着增加（P<0.05）;力量-频率关系最大值百分比在Con与LWL组无显着差异（P>0.05）,而肌力与体重相对值则呈现LWL组显着高于Con（P<0.01）,LWL组小鼠在相对体重收缩肌力在40及60 Hz显着高于Con组（P<0.01）;与最大值百分比疲劳曲线在LWL组较Con右移（P<0.01）,与体重相对肌力曲线也表现右移现象（P<0.01）,提示LWL组小鼠骨骼肌疲劳时间延长,这与到达50%最大肌力的时间差异变化一致（P<0.05）,在疲劳后期仍能保持较高肌力输出（P<0.0 1）,15 min两组小鼠肌力恢复情况无差异（P>0.05）;Echo-MRI结果显示脂肪含量、瘦体重、自由水及总水量在两组小鼠间无变化（P>0.05）;小鼠后肢肌肉横断面MRI结果发现LWL小鼠显着高于Con组（P<0.05）,该结果与肌肉湿重称重变化一致,即比目鱼肌、跖肌、腓肠肌及趾长伸肌长时举重运动干预后均显着高于Con组（P<0.05）,胫骨前肌无论在MRI结果及肌肉湿重称重比较中均无差异（P>0.05）,股骨前后径差异显着而中外侧径无变化;内脏组织湿重变化分析发现,心脏相对质量变化无差异,而指征脂肪含量的附睾脂肪含量在LWL组显着下降（P<0.05）;Con组小鼠与LWL组小鼠在跑台耐力训练中总跑步距离无差异;小鼠超声心动各项参数,分析数据未见两组间参数差异,仅有心率呈现下降趋势,但差异不具显着性（P>0.05）。b)急性举重训练干预中,RNA测序（RNAseq）结果筛选出490个基因转录表达水平在对照组Con与急性举重干预组AWL间存在显着差异（P<0.05）,其中较Con组显着上调基因为341个,显着下调基因为149个;AWL组小鼠腓肠肌中Dscr1,Fn14及Nr4a3表达较Con组显着增加（P<0.05）,分别为Con组的1.51、2.31及2.94倍,与RNAseq的检测结果一致;Dscr1及Fn14的基因表达水平在股四头肌组织中AWL组较Con组差异显着（P<0.05）,而胫骨前肌组织中未见二者基因表达差异（P>0.05）;Dscr1基因表达水平在心肌及肝脏组织中未见差异（P>0.05）,而在心肌组织中AWL组Fn14表达较Con显着增加（P<0.05）。c)急性举重训练对Akt及4e-Bp1信号的总蛋白表达与磷酸化修饰均无影响,表现为AWL组与Con组间无差异（P>0.05）。短时举重训练显着增加小鼠骨骼肌蛋白质合成,表现为在跖肌中SWL组小鼠SUnSET蛋白质合成水平显着高于Con组小鼠（P<0.05）,而肝脏组织中无变化（P>0.05）。长时举重训练中,SUnSET检测蛋白质合成数据结果显示跖肌、腓肠肌及股四头肌Puromycin标记多肽在LWL组显着高于Con组（P<0.05）,LWL组胫骨前肌及心肌蛋白质合成也显着增加,肝脏（LV）组织两组间无变化;8周举重训练后p-AktS473/Akt比值使WL组小鼠骨骼肌显着高于Con组（P<0.05）,p-p70S6kThr389及p-4e-Bp-1S65含量显着增加（P<0.05）。d)急性举重训练实验中,与Con比Lc3Ⅰ蛋白表达在AWL组呈降低趋势,Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值无变化;CoxIV蛋白含量在两组比较中无差异（P>0.05）。短时举重训练中,与Con组比SWL组小鼠骨骼肌Lc3Ⅰ蛋白表达显着增加（P<0.05）,Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值显着下降（P<0.05）,两组小鼠p62蛋白表达无差异（P>0.05）;SWL组较Con组指征线粒体含量的Cox4蛋白表达无差异（P>0.05）,相应地线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ亦无差异（P>0.05）。长时举重训练促进LWL组小鼠骨骼肌Lc3Ⅰ含量显着增加（P<0.05）,而对Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值无影响,p62含量在LWL组骨骼肌中显着下降（P<0.05）,而Cox4含量在两组比较中无差异;LWL组小鼠骨骼肌Ubiqutin含量较Con组显着增加（P<0.05）。e)长时举重训练干预后,IGTT试验结果显示禁食后LWL组小鼠基础血液葡萄糖水平显着低于Con组,葡萄糖注射30 min后Con组小鼠血糖水平迅速增加,而LWL组小鼠峰值显着低于Con组,60 min及120 min后Con组及LWL小鼠血糖恢复到基础水平但LWL组小鼠的血糖读值均显着低于Con组（P<0.01）,曲线下面积（Area under curve,以下简称AUC）结果显示,LWL组小鼠较Con组小鼠显着降低（P<0.01）;LWL组小鼠骨骼肌Glut4蛋白表达较Con组小鼠无差异,而胰岛素刺激下LWL组小鼠骨骼肌p-AktS473/Akt较Con组小鼠显着增加（P<0.05）。f)急性举重训练对腓肠肌Notch1蛋白的表达无影响,表现为Con与AWL组间比较无差异（P>0.05）。短时举重训练中,SWL组较Con组小鼠Notch1蛋白表达无差异（P>0.05）;SWL组小鼠Edu阳性细胞个数较Con组呈增加趋势（P=0.09）。长时举重训练干预后,LWL组小鼠骨骼肌Notch1蛋白表达较Con组显着下调（P<0.05）。3)长时举重训练对诱导性骨骼肌卫星细胞缺失小鼠的研究结果显示,小鼠的运动情况变异系数较大,与之前长时举重运动干预情况不一致,可能是由于小鼠遗传背景不同而有所影响,WT-WL及mSCD-WL两组小鼠举重基本变化趋势一致无差异（P>0.05）;与长时举重运动干预一致地是,WT-WL组较WT-Sed组,mSCD-WL组较mSCD-Sed组小鼠糖耐量改善,表现为即刻0时血糖水平下降,葡萄糖注射后30 min血糖下降迅速（P<0.01）,并能继续保持较低水平并恢复至基础状态;AUC曲线变化与血糖耐量实验曲线变化一致,即WT-WL组较WT-Sed组、mSCD-WL组较mSCD-Sed组显着下降（P<0.05）,mSCD-Sed组与WT-Sed组比,无论血糖动态变化与AUC曲线均无差异（P>0.05）;与WT-Sed组比,mSCD-Sed组小鼠体重呈增加趋势,长时举重训练未改变WT-WL组及mSCD-WL组小鼠体重;骨骼肌湿重方面,与WT-Sed组比mSCD-Sed组小鼠比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、附睾脂肪无差异,心脏相对湿重呈下降趋势。长时举重训练干预对体重肌组织称重无影响,WT-WL组较WT-Sed、mSCD-WL组较mSCD-Sed组小鼠小鼠比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、附睾脂肪均呈下降趋势,而对心脏的作用呈相反增加趋势;小鼠骨骼肌收缩功能显示,WT-WL组较WT-Sed组、mSCD-WL组较mSCD-Sed组骨骼肌强直收缩及单收缩无差异（P>0.05）,mSCD-Sed组较WT-Sed组亦无变化（P>0.05）;骨骼肌强直收缩（Tetanic Force）及单收缩（Twitch Force）相对值比较中,WT-WL组较WT-Sed组、mSCD-WL组较mSCD-Sed组均呈升高趋势,提示8周长时举重训练对mSCD小鼠骨骼肌收缩功能肌力输出具有增加趋势;此外,前期预实验设计5只同窝雄性Pax7CreERr-ROSADTA176小鼠,随机选取2只作为对照（ConWL）,另外3只进行为期10天的Tamoxifen腹腔注射启动重组酶Cre剪切功能（TGWL）,经过一周Tamoxifen药物作用清除期,所有小鼠均进行为期4周的举重训练,观察两组（ConWL及TGWL）在抗阻运动干预后的适应性变化差别,结果主要发现,TGWL小鼠骨骼肌重及收缩功能低于ConWL小鼠（P=0.085）,骨骼质量表现为与ConWL相比,跖肌、腓肠肌显着下降（P<0.05）,而附睾脂肪质量增加（P=0.08）。肌肉强直收缩肌力输出在ConWL高于TGWL组（P=0.08）。4)短时举重训练结合Dex药物干预实验结果显示,实验前各组小鼠体重无差异,药物干预后Dex组小鼠体重较Con呈下降趋势但差异不具显着性（P>0.05）,Dex+WL组小鼠体重较Con及Dex组均显着下降（P<0.05）;与Con组比比目鱼肌湿重在Dex组无变化,而与Dex组比Dex+WL组小鼠比目鱼肌显着增加;Dex组小鼠跖肌、腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌湿重均显着下降,Dex+WL组较Dex在这几组骨骼肌湿重的变化中下降更明显（P<0.05）;Dex组小鼠心脏质量呈增加趋势（P=0.07）,Dex+WL组小鼠心脏湿重呈增加趋势,但平均值低于Dex组;附睾脂肪含量结果显示,Dex+WL小鼠无论较Con或Dex组均显着下降;与Con组Dex组小鼠后肢骨骼肌收缩最大肌力输出绝对值呈下降趋势,而Dex+WL组小鼠最大肌力绝对值平均数高于Dex组,与Con组接近,但差异不具显着性（P>0.05）;相对肌肉质量骨骼肌最大肌力输出结果显示,无论与Con还是Dex组比,Dex+WL组小鼠相对肌力显着增加（P<0.05）;Con、Dex及Dex+WL三组小鼠蛋白质合成无差异（P>0.05）。结论:1)本研究研发了自主举重抗阻训练小鼠模型,该模型利用食物奖励策略诱导小鼠进行后肢伸展（类似负重深蹲及提踵练习）运动;根据实验观察确定了急性、短时、长时举重训练的干预方案,为系统研究抗阻训练健康促进机制提供了运动实验动物模型。2)长时举重训练正向重塑了小鼠后肢骨骼肌质量及收缩功能,骨骼肌收缩功能的增加表现为最大肌力、单收缩肌力及抗疲劳能力的增加,该过程中蛋白质合成增加且该现象在举重训练的早期即可观察到;调控蛋白质合成mTOR信号的上游Akt及下游p70S6k、4e-Bp-1级联磷酸化事件参与了长时举重训练介导的骨骼肌肥大;蛋白质泛素化水平在长时举重训练后增加,细胞自噬能力增强（LCI显着增加）、自噬流增加（p62蛋白含量下降,即可被p62标记靶向物质减少）,提示抗阻训练介导骨骼肌肥大过程中蛋白质降解可能优先选择泛素蛋白酶体途径进行;糖代谢方面,长时举重训练显着增加小鼠葡萄糖快速清除能力,胰岛素刺激Akt信号的激活参与其中,而葡萄糖转运相关的Glut4信号并未发生改变,提示可能存在其他信号通路参与或代偿了抗阻运动引起的糖代谢改善,待进一步研究;短时举重训练促进骨骼肌肥大相关细胞增殖,与此相关的Notch1信号在长时举重训练后显着下调;急性150%BW负荷强度举重运动引起小鼠骨骼肌转录表达谱490个基因发生显着变化,Nr4a3倍比变化最高,后者在糖代谢中发挥重要作用,Nr4a3的运动应激可能成为未来研究运动促进骨骼肌健康的重要靶向;该举重训练的转录水平运动应激在小鼠下,肢肌群腓肠肌、跖肌、股四头肌中应答良好,胫骨前肌应答不明显。短时举重训练介导骨骼肌蛋白质合成增加,促进成肌干细胞增殖。3)为研究肌卫星细胞在抗阻运动介导骨骼肌适应过程中的作用及其相关机制,本研究试图采用诱导型肌卫星细胞缺失模型（mSCD,Pax7CreERT-ROSADTA176）并使用抗阻举重模型干预8周,观察小鼠骨骼肌质量、收缩功能及糖代谢变化。长时抗阻训练干预能够促进小鼠骨骼肌收缩功能增加,肌卫星细胞缺失小鼠不能获得野生型小鼠的适应性改善水平,而对糖代谢功能的改善与对照组野生型小鼠的运动适应相一致。4)本研究试图采用连续腹腔注射糖皮质激素（本研究采用地塞米松,Dexamethason,以下简称Dex）构建药物性肌萎缩模型,应用小鼠短时举重训练模型尝试观察抗阻运动对肌萎缩的干预作用。短期举重训练不能逆转Dex介导的骨骼肌萎缩,但能够保持小鼠后肢骨骼肌的相对收缩功能,这可能与Dex使用对骨骼肌蛋白质合成的抑制作用相关。
李江兵[5]（2017）在《眼镜蛇神经毒镇痛小肽片段的作用机制研究》文中研究指明疼痛是各种疾病中最为常见的信号之一,给患者带来极大的痛苦,严重影响他们的工作和生活。目前,临床用于疼痛治疗的药物（如吗啡、可待因、芬太尼、哌替啶、舒林酸等）几乎均具有成瘾性、剂量依赖性、毒性等不良效应。因此天然类镇痛药物给疼痛患者带来了希望。在这类药物的研究中,蛇毒一直处于研究的热点。研究表明蛇毒神经毒素的镇痛活性良好,且具有无成瘾性、无剂量依赖性、镇痛时效长等优点,故蛇毒神经毒素是开发副作用小、无成瘾性等镇痛药物的潜在理想原料,但对其具体的作用机制尚未明确。以往的研究一般认为蛇毒的镇痛效应是由其毒性引起的,但近些年有研究表明蛇毒神经毒素的镇痛效应是通过中枢系统起效,与经外周神经系统起作用的毒性机制截然不同。另外,有研究表明口服蛇毒神经毒素具有镇痛效应,而且发现其中一些低神经毒性多肽具有显着的镇痛活性,故我们推测其镇痛活性中心与毒性中心可能是两个独立的组分,且镇痛组分不易被胃蛋白酶所分解。本文首先对文献中部分具有镇痛效应的蛇毒神经毒素的LD50和镇痛起效剂量的相关性作了分析,进一步确认两者间并非完全一致,表明蛇毒镇痛活性中心与毒性中心确有可能是两个独立区域。课题组前期的研究结果表明,来自中华眼镜蛇的短链神经毒蛋白short neurotoxin C/coborotoxin c（CBTc）具有相对很弱的神经毒性和显着的口服镇痛活性,意味着该神经毒素具有独立的、镇痛效应很强的活性中心,且该镇痛活性中心耐胃蛋白酶水解。鉴于此,对CBTc的氨基酸序列和结构进行分析,根据胃蛋白酶水解位点及其在三级结构上所处的位置,设计了具有10个氨基酸的10肽（KDHRGTRIER）,用热板法、醋酸扭体法、福尔马林注射法验证其确有镇痛活性,其LD50为8.4 g/kg,95%可信限为7.3-9.7g/kg,表明小肽的毒性很低或无毒性,进而验证了蛇毒镇痛活性中心与毒性中心可能是两个独立组分的推测。根据长链神经毒素也具有镇痛活性,故对10肽作相应改造,期望有更高的镇痛活性和更长的镇痛时效:包括增加Loop C前端氨基酸,预期能更全面结合靶蛋白;末端增加2个Cys,预期能自然氧化形成二硫键,能增加稳定性和活性。经热板法和醋酸扭体法测定改造肽的镇痛活性,结果显示16肽的镇痛活性明显高于13肽和15肽,且均高于10肽,表明设计的肽达到了预期的目的,也验证了我们的假设。5-TAMRA标记10肽在无疼痛模型、右腿疼痛模型、左腿疼痛模型的成像结果显示,我们可初步推断镇痛小肽在灌胃和腹腔注射两种给药方式中的镇痛机制具有差异性:镇痛小肽灌胃给药具有镇痛活性可能与胃肠道的特殊受体或离子通道相关;在腹腔给药后起到镇痛效应可能与背根神经节密切相关;标记小肽的荧光富集于疼痛部位,初步推测该镇痛小肽可能是主动镇痛。
魏黎明[6]（2011）在《基于纳米金刚石的蛋白质组学新技术和新方法研究》文中认为本博士论文针对目前蛋白质组学研究中面临的分离富集及鉴定方面的热点与难点问题,将纳米金刚石材料与蛋白质分析结合起来,开展了一系列研究工作,发展了相关的新技术和新方法并进行了实际的应用研究：利用纳米金刚石成功实现了低丰度蛋白质/多肽的高效、快速、高回收率富集,并应用于宫内生长迟缓大鼠肾脏发育异常可能机制中差异蛋白质组学研究以及在肝癌血清肽组学中的实际应用；将纳米金刚石应用于MALDI靶上前处理中的研究,提高了多肽检出限,同时实现了靶上点样富集,提高了低丰度蛋白质的鉴定效率；利用该体系成功完成了蛋白酶的固定以及实际应用,提高了蛋白质的酶解效率；利用纳米金刚石表面多活性位点,成功实现了对其氨基苯硼酸的表面改性,从而完成了糖基化多肽的分离富集,在鼠肝蛋白液相单流份中鉴定了36个糖蛋白,确定了40条糖基化肽段；随后将纳米金刚石与磁性功能材料实现整合,使蛋白多肽的富集更快速、高效,提高了低分子量蛋白的鉴定与检出,并利用纳米金刚石磁性功能材料富集了经四环素刺激前后诱导乙肝病毒产生的HepAD38细胞分泌蛋白质组,研究了乙肝病毒改变免疫微环境在免疫耐受和病毒致病机制中的影响。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下：第一章绪论概述了蛋白质组学分离分析研究的主要技术手段和应用。对分离分析研究的新技术发展趋势,包括低丰度蛋白质或多肽分离富集、翻译后修饰蛋白质或多肽分离富集进展进行了简单的综述；详细概述了纳米金刚石的制备、性质等及其在分析化学、生物医药领域中的应用；提出了本论文选题的目的和意义。第二章针对低丰度蛋白及多肽的分离富集鉴定,利用爆炸法制备纳米金刚石表面多官能团的性能对低浓度多肽溶液进行了富集分析。表征了富集前后纳米金刚石的表面官能团改变,证明了对多肽或蛋白的充分富集能力。通过富集时间、富集容量、耐盐量、耐表面活性剂评价了纳米金刚石对多肽或蛋白的富集效率。通过不同pH值缓冲液进行了多肽富集实验,证明了该材料对多肽富集无pH值偏向性。通过实际样本胶内酶解多肽抽提液的直接冻干、zip-tip富集、纳米金刚石富集比较实验,纳米金刚石在低丰度蛋白质鉴定方面具有更好的表现。随后采用纳米金刚石辅助质谱鉴定应用于血清游离肽分离分析以及探索宫内生长迟缓大鼠肾脏发育异常的可能机制。我们在肝癌血清中寻找到了蛋白血纤维蛋白肽A（fibrinopeptide A）异常高表达,为后续的肝癌血清肽组学提供了参考数据。在IUGR新生鼠和正常新生鼠的肾脏蛋白质差异表达蛋白中寻找了可探索研究的波形蛋白以及串珠素蛋白。同时,证实能量代谢异常、氧化还原和凋亡的失衡以及信号转导和细胞增殖的异常可能参与了IUGR大鼠肾单位数目的减少和肾脏发育的异常。第三章针对提高质谱灵敏度与鉴定成功率问题,利用纳米金刚石对多肽或蛋白质的富集能力以及超细小颗粒特性,将其置于基质辅助激光解析质谱（MALDI）靶板作为MALDI靶上前处理基质提高了肽段的离子化效率。通过纳米金刚石作为辅助基质,使得肽段与基质更好的结合形成均匀分布样本层,无需MALDI激光寻找“hotspot"分析肽段,同一样本点从内到外激光定点分析肽段的重现性为11.8%,相对不锈钢靶板18.8%有较好的表现力。同时肽段的响应信号比直接点样分析提高约5倍,可以检测到0.1fmol肌红蛋白酶切肽段,以及62.5amol的标准肽。纳米金刚石除可进行辅助肽段离子化外,也可以实现靶上富集分析肽段,灵敏度较直接分析提高1个数量级,而且可以耐受500mN aCl,因此纳米金刚石在实际样品分析中比其他肽段前处理方法方便、灵敏。dNDs可以直接用于MALDI无机基质对小分子化合物的分析,同时亦可通过辅助涂层提高分析物的结晶均匀性、分析物的离子化效率从而进一步提高低丰度蛋白鉴定的成功率、可信度。因此dNDs辅助涂层在低丰度蛋白的鉴定过程中有着广阔的应用前景。第四章利用纳米金刚石的材料特性采用化学修饰进行了生物酶的固定,通过傅立叶变换红外光谱仪以及透射电镜等手段进行表征。生物酶在纳米金刚石固定化后,其耐热性、耐有机溶剂、耐酸性以及稳定性都有很好的提高,反复使用10次仍能保持60%的活性。通过与商品固定化酶的比较,其对蛋白质的酶解效率与质谱鉴定成功率都有明显提高。同时采用该方法进行了N-糖苷酶F的固定,10mmin完成了糖链的酶切,大大缩减了传统溶液酶解的时间,从而进一步提高了糖苷内切酶的酶解效率。第五章针对翻译后修饰蛋白中糖蛋白/糖肽的分离富集问题。利用纳米金刚石表面的多活性位点以及较大的比表面积,实现了对其功能化修饰以及糖肽的特异性富集。在超声分散条件下采用氨基苯硼酸对纳米金刚石进行功能化修饰,采用傅立叶变换红外光谱仪进行表征；通过复杂肽段中糖肽的特异性富集评价了该功能化材料的优点。与商品化硼酸磁珠相比,其选择性、富集效率与灵敏度都有较大的提高。采用160/18O定量标记法评价了纳米金刚石一一硼酸法对糖肽的富集回收率达72.2%。同时,我们将该方法用于大鼠肝脏样品液相分离部分中糖肽的富集,鉴定并确定了40条糖肽和36个糖基化位点,其中有7个位点在Swiss-prot和TrEMBL数据库有记录,新发现26个糖基化位点。通过上述研究表明氨基苯硼酸纳米金刚石可以快速、有效的富集糖肽,由于具有较高的富集回收率,富集灵敏度达250amol/μL,并且可以直接与MALDI-MS、LC-MS联用,可以将该方法用于实际样品中糖肽的分析鉴定。第六章针对分泌蛋白质的分离富集技术,采用水热法制备了具有超顺磁性的四氧化三铁磁性微球；采用溶胶-凝胶法在其表面包覆二氧化硅层,合成制备了具有核壳结构的Fe3O4@SiO2磁性硅球；并在其表面进行氨基硅烷化修饰,随后利用聚丙烯胺、碳化二胺、琥珀酰胺辅助反应试剂实现纳米金刚石在上述磁性功能材料上固定和键合。利用傅立叶变换红外光谱仪、透射电子显微镜等对我们制备的Fe3O4@SiO2@ [dND]n进行了表征。证实我们合成了以磁性材料为核的层层组装键合纳米金刚石。通过对标准蛋白酶解肽段/蛋白质的富集评价,证明该材料具有与纳米金刚石相似的富集能力,同时由于磁性材料的引入,大大提高了样品富集处理效率。采用Fe3O4@SiO2@[dND]n（?）寸蛋白的分离富集能力,我们成功富集了由四环素刺激前后诱导乙肝病毒产生的HepAD38细胞分泌上清,并采用iTRAQ技术进行了刺激前后分泌蛋白质表达量的差异分析。该材料的硅层表面与报道过的同类材料的聚合物表面相比,具有更好的生物相容性。将其应用于富集低丰度肽段,富集倍数达到100倍以上；即使对高浓度的盐溶液中的肽段仍能实现有效富集。总之,本论文围绕蛋白质组学研究的新技术、新方法,以纳米金刚石为基础建立了有效的分离富集等新方法,为解决蛋白质组学分析中的低丰度蛋白质、糖基化蛋白的分离富集及提高鉴定效率等问题提供了新颖有效的研究手段和方法。
冬黎黎[7]（2011）在《中介蝮蛇毒纤溶酶基因表达的研究》文中研究说明血栓性疾病是目前危害人类健康的首要疾病之一,而利用溶栓类药物治疗血栓性疾病被认为是最为有效的方法。蛇毒纤维蛋白（原）溶解酶（fibrin（ogen）olytic enzyme,FLE简称纤溶酶）是一种新型的强力溶栓剂,能直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白原。利用蛋白质分离技术从蛇毒中高度纯化而得的蛇毒纤溶酶在心脑血管疾病的治疗方面具有潜在的应用价值。然而天然蛇毒资源有限,不易分离、保存和运输,因此通过分子生物学的方法和基因工程技术获得高效、安全的蛇毒纤溶酶,对于更有效地治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。本实验利用双酶切技术从pMD18T-FLE I克隆载体上获得中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒纤溶酶基因片段,再将其亚克隆到真核表达载体pFASTBACHTa上,经转化、筛选和鉴定获得重组真核表达质粒pFASTBACHTa-FLE。将纯化后的重组质粒（约20μg）经小鼠尾静脉快速（5s内）注入小鼠体内,进行瞬时表达,8h后取小鼠肝脏组织制备实验样本。经SDS-PAGE分析显示,在小鼠肝脏中有重组蛋白表达,其分子量大小约为30kDa;再经Western blot检测,在30kDa处得到一条特异性的杂交条带,表明小鼠肝脏中表达的重组蛋白为FLE蛋白。免疫组织化学方法检测结果显示,重组FLE蛋白在小鼠肝脏组织中大量表达。纤维蛋白平板法鉴定纤溶活性结果表明,小鼠肝脏中表达的重组FLE蛋白具有较高的纤溶活性,且其活性呈现出剂量相关性和时间依赖性。本实验在真核表达体系中成功表达出中介蝮蛇毒纤溶酶重组蛋白,为进一步对蛇毒纤溶酶的生物学特性及其应用的研究奠定了坚实的基础。
王蓬文[8]（2011）在《姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠的神经保护作用》文中进行了进一步梳理阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种与年龄相关的以进行性记忆和认知功能障碍为特征的神经变性病。特征性病理变化表现为胆碱能神经元功能障碍、神经元和突触丢失、细胞外β-淀粉样肽（Amyloid beta, Aβ）聚集形成老年斑（senile plaques, SPs）和细胞内高度磷酸化的tau蛋白形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）。AD主要的神经分子病理改变是蛋白质的异常表达和加工。分子生物学的进展为揭示脑内这些蛋白质合成、运输和聚集机制提供了所需工具。本研究旨在通过姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ42/Aβ40的比例及ADDLs含量的影响,并进一步研究ADDLs和胰岛素信号转导通路的关系,探讨姜黄素神经元保护的作用机制,客观评价其疗效,为开发AD的中药防治提供理论依据。材料和方法1.采用APP/PS1双转基因小鼠及同月龄同背景的正常小鼠作为实验对象,每组12-15只。中药大、中、小剂量治疗组于3月龄对小鼠实施姜黄素灌胃治疗,罗格列酮组给予罗格列酮灌胃,1次/日,连续治疗3个月2.应用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力,评价姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠认知功能的影响。3.运用免疫组织化学方法观察治疗前后APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区Shank1和PSD95的变化,运用电子显微镜观察各组小鼠海马CA1区神经元和突触的改变,评价姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠突触结构和功能的影响。4.运用免疫组织化学和Western-blot方法观察APP/PS1双转基因小鼠治疗前后IDE、PS2、Aβ42、Aβ40和ADDLs的变化,判断姜黄素对Aβ级联反应的影响。5.运用免疫组织化学、Western-blot和RT-PCR方法观察APP/PS1双转基因小鼠InR、IRS-1等胰岛素信号转导通路相关蛋白的变化,判断姜黄素对胰岛素信号转导通路的影响。实验结果1.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠行为学和学习记忆的影响在Morris水迷宫实验中,与正常对照组相比模型组小鼠的逃避潜伏期和游泳距离分别明显延长和延长（P<0.01和P<0.05）；与模型组小鼠相比,罗格列酮组和姜黄素中剂量组小鼠的逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）,姜黄素大剂量组小鼠的逃避潜伏期缩短（P<0.05）,尽管如此,姜黄素大剂量组和姜黄素小剂量组与阳性药物组相比逃避潜伏期长（P<0.05）；与模型组小鼠相比,罗格列酮组、姜黄素中剂量和姜黄素大剂量组的小鼠游泳距离缩短（P<0.01和P<0.05）。2.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠神经元以及突触相关蛋白表达的影响超微结构：电镜观察正常对照组海马CA1区神经元和神经毡内结构均正常。模型组小鼠海马CA1区神经元出现程度不等的退行性变。细胞核形态不规则,部分核内染色质浓集；胞浆内脂褐素、脂滴增多,高尔基体囊泡扩张,粗面内质网离散,多聚核糖体解聚,部分线粒体变性。神经毡内可见髓鞘变性,突触数量减少、结构异常,突触小泡聚集增多。姜黄素可使突触增加,并使上述变化有不同程度的改善。免疫组织化学染色结果：模型组海马CA1区PSD-95和Shank1阳性细胞数较正常对照组明显减少（P<0.01）,罗格列酮组和姜黄素阳性细胞数较模型组增加（P<0.05）。Western blot结果：与正常对照组相比模型组PSD-95蛋白表达明显减少（P<0.01）；而与模型组相比罗格列酮组和姜黄素组蛋白表达增多（P<0.05）。3.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠Aβ的影响免疫组织化学染色结果：模型组小鼠海马CA1区Aβ生成酶PS2阳性细胞较正常对照组明显增加（P<0.01）；罗格列酮组,姜黄素大、中、小剂量组小鼠海马CA1区PS2阳性细胞明显减少（P<0.01）。模型组小鼠海马CA1区Aβ降解酶IDE和NEP阳性细胞较正常对照组明显减少（P<0.01）,与模型组相比,姜黄素中剂量组小鼠海马CA1区IDE阳性细胞增加（P<0.05）；姜黄素大、中、小剂量组小鼠海马CA1区NEP阳性细胞增加（P<0.05）。免疫组织化学染色的Aβ40和Aβ42阳性细胞计数模型组均较正常对照组小鼠阳性细胞表达明显增加,其中Aβ42阳性细胞计数增加更加明显；与模型组小鼠相比罗格列酮组和姜黄素治疗各组小鼠阳性细胞表达明显减低。模型组小鼠海马CA1区Aβ40、Aβ42、ADDLs阳性细胞平均灰度值较正常对照组明显降低（P<0.01）,姜黄素中剂量组、姜黄素小剂量组阳性细胞平均灰度值同模型组相比增加（P<0.05）。Western blot结果：各蛋白表达结果与免疫组化相符。4.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠胰岛素信号转导通路的影响免疫组织化学染色结果：与正常对照组相比,模型组小鼠海马InR、IRS-1阳性细胞计数明显增加（P<0.05和P<0.01）；与模型组相比罗格列酮组和姜黄素中剂量组InR、IRS-1阳性细胞计数增加得到改善（P<0.05和P<0.01）。与正常对照组相比,模型组小鼠海马CA1区p-IRS-1、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达均有不同程度的降低（P<0.05或P<0.01）,与模型组相比罗格列酮组和姜黄素中剂量组p-IRS-1、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白阳性细胞计数增加（P<0.05或P<0.01）。Western blot结果：各蛋白表达结果与免疫组化相符。RT-PCR结果：与正常对照组相比模型组小鼠海马InR mRNA和IRS-1 mRNA表达明显增加,罗格列酮组和姜黄素大、中、小剂量组可使其表达有不同程度的恢复。结论姜黄素保护神经元的机制是通过改善胰岛素信号转导障碍,减少Aβ42和ADDLs生成并增加其降解,影响Ap级联反应起作用的。
张煜[9]（2008）在《白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2的神经毒活性研究》文中认为用阳离子交换和凝胶过滤层析,从长白山白眉蝮蛇（Gloydius ussurensis）蛇毒中分离得到磷脂酶A2（Phospholipase A2,PLA2）的同源物,SDS-PAGE检测为一条单带,质谱检测分子量为13880.789;该蛋白49位氨基酸残基为Gln,命名为Gln49-PLA2,具有肌肉毒性,神经毒性,但缺乏磷脂酶A2活性。Gln49-PLA2能够剂量依赖性地抑制颈二腹肌神经信号正常传导并影响肌肉收缩,在100μg/ml剂量下,肌肉收缩幅度在150分钟后达到50%的抑制率;同时,随着Gln49-PLA2浓度的降低,肌肉收缩幅度的抑制效率也逐渐降低;实验证明Gln49-PLA2对突触后膜乙酰胆碱受体敏感性无影响,对神经肌肉信号传导收缩的抑制作用位点在突触前膜。Gln49-PLA2对小鼠坐骨神经动作电位幅度和传导速度的作用研究表明:Gln49-PLA2能浓度依赖性的抑制小鼠坐骨神经复合动作电位幅度和传导速度,在100μg/ml剂量下,Gln49-PLA2在作用40分钟后完全抑制坐骨神经标本动作电位与传导速度同时使其神经传导活性消失。Gln49-PLA2缺乏磷脂酶A2活性,但是在≥50μg/ml浓度下却表现一定出的肌肉毒性作用:肌酸激酶活性检测表明,在50-100μg/ml范围内,随着浓度增长肌酸激酶活性逐渐增加;同时染色切片标本观察显示Gln49-PLA2在100μg/ml浓度时,对肌肉组织细胞的损伤数量百分比达到30.7%。采用膜片钳技术,分析Gln49-PLA2神经毒性对大鼠海马神经元细胞表面离子通道电流的影响,结果表明:Gln49-PLA2在20μg/ml浓度下,显着抑制钾通道正常去极化,抑制钾电流峰值45.75%;同时促进钠通道开放,增加钠电流峰值到158.99%,明显降低神经细胞兴奋性。综上所述,Gln49-PLA2引起神经细胞电兴奋性降低,神经组织信号传导被明显抑制,通过神经细胞电压依赖型离子通道阻滞传递神经信号的动作电位产生,研究结果证实Gln49-PLA2是一种新的突触前神经毒素。
邓敏[10]（2008）在《白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒纤溶组分的分离纯化及性质研究》文中研究表明随着人们生活水平的提高,血栓栓塞性疾病患者逐年增加,血栓性疾病严重危害着人类的生命健康。因而开发出高效、无副作用、价廉的新型溶栓制剂是一项紧迫而重要的工作。蛇毒纤溶酶专一性较好,体内半衰期长且热稳定性较强。目前对蛇毒纤溶酶的开发研究主要集中于蝮亚科蛇蛇毒中,国内外先后对蝮亚科中的五步蛇（Agkistrodom acutus）、蝮蛇（Agkistrodom halys Pallas）、竹叶青（Trimeresurus stejnegeri）、烙铁头（Trimeresurus mucrosquamatus）等多种蛇毒的纤溶活性组分进行过报道,而对白唇竹叶青蛇蛇毒纤溶酶的研究未见报道。因此本研究以我国产白唇竹叶青蛇毒为研究对象,对其性质进行了分析研究,并从中提取出一种无出血作用的纤溶活性组分,初步鉴定该组分为α金属蛋白酶,并对理化性质及部分生物功能进行探讨,主要研究工作包括以下几个方面:1.测定白唇竹叶青蛇蛇毒的多种理化性质和生物活性,结果表明:白唇竹叶青蛇毒对小白鼠的半致死量（LD50）为7mg/kg;Lowry法测得毒液中蛋白质含量达81 %,SDS-PAGE电泳呈现多条蛋白质条带;具有水解酪蛋白的活性,且其活性可被EDTA抑制,提示白唇竹叶青蛇毒中含有金属蛋白酶;通过纤维蛋白平板法检测到毒液具有纤溶活性;具有精氨酸酯酶活性,检测到该蛇毒具有类凝血酶活性;该蛇毒的其他性质,如磷脂酶A2活性、5’核甘酸酶活性、碱性磷酸单酯酶活性、磷酸二酯酶活性。2.用DEAE-SephadexA-25, SephadexG-100和CM-SephadexC-50三步色谱法进行分离纯化,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出分子量为66.3KDa的金属蛋白酶。SDS-PAGE电泳结果显示在还原性和非还原性条件下均为单一条带,表明白唇竹叶青蛇毒纤溶组分是由单一肽链组成的蛋白分子。以酪蛋白为底物测得其蛋白质水解酶比活力为0.68U/mg。酶的最适作用温度为40℃,最适PH为7;抑制剂EDTA,EGTA,对酶活力有明显的抑制作用,而PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）、β-巯基乙醇对酶活力没有影响;Cu2+对酶活力有明显的抑制作用,Zn2+对其活性有一定的增强作用;未检测到精氨酸酯酶活性存在;纤维蛋白原原降解实验显示,该组分与纤维蛋白原于37℃孵育5分钟便能迅速水解纤维蛋白原或纤维蛋白Aα链,随后缓慢水解Bβ链,而对γ链无作用,提示该组分可能为一种α金属蛋白酶;出血活性实验中,小鼠未出现皮下出现斑点,显示其无不含出血毒活性。结论:我们首次从我国产的白唇竹叶青蛇（T. albolabris）毒中分离纯化得到一种新的蛇毒纤溶酶,该酶纤溶活性强能同时水解纤维蛋白原Aα链和Bβ链,且无出血作用。但有关该组分的分子结构、活性中心以及分子溶纤机制尚待进一步探讨,为进一步基因克隆与表达以及临床应用研究提供理论基础,以达到制备具有实际应用价值的蛇毒酶溶栓制剂的目的。
二、尖吻蝮蛇毒素对小鼠骨骼肌和心肌损伤的电子显微镜初步观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、尖吻蝮蛇毒素对小鼠骨骼肌和心肌损伤的电子显微镜初步观察（论文提纲范文）
（1）基于光敏型多孔氧化锌的广谱解毒技术（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 蛇毒简介及其危害 |
| 1.1.1 毒蛇咬伤及其危害 |
| 1.1.2 蛇毒种类及其分布 |
| 1.1.3 蛇毒病理生理作用机制 |
| 1.1.4 毒蛇咬伤后感染 |
| 1.2 抗蛇毒药物治疗 |
| 1.2.1 抗蛇毒血清 |
| 1.2.2 小分子治疗药物 |
| 1.2.3 天然药物化学 |
| 1.2.4 抗蛇毒药物作用机制 |
| 1.3 工程纳米粒子在抗蛇毒治疗中的应用 |
| 1.3.1 纳米粒子的抗感染治疗 |
| 1.3.2 纳米粒子的光热效应 |
| 1.3.3 纳米粒子的蛋白质吸附 |
| 1.3.4 纳米粒子的抗蛇毒治疗 |
| 1.3.5 ZnO |
| 1.4 本论文的选题意义和主要研究内容 |
| 1.4.1 本论文的选题意义 |
| 1.4.2 本论文的主要研究内容 |
| 第2章 ZC的制备及其结构和性能研究 |
| 2.1 实验原料及试剂 |
| 2.2 实验设备与仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 ZC的制备 |
| 2.3.2 ZC的抗菌性能 |
| 2.3.3 ZC的体外细胞毒性评价 |
| 2.3.4 溶血实验 |
| 2.3.5 小鼠体重和体内Zn~(2+)含量的测量 |
| 2.3.6 统计分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 ZC的材料表征 |
| 2.4.2 ZC的体外抗菌性能 |
| 2.4.3 ZC的体外生物相容性 |
| 2.4.4 ZC的体内生物相容性 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ZC吸附毒类蛋白的体外效果研究 |
| 3.1 实验原料及试剂 |
| 3.2 实验设备与仪器 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.3.2 吸附动力曲线 |
| 3.3.3 光热升温实验 |
| 3.3.4 SDS-PAGE |
| 3.3.5 毒液处理 |
| 3.3.6 蛇毒溶血实验 |
| 3.3.7 统计分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 ZC 吸附蛇毒蛋白,导致毒类蛋白浓度降低 |
| 3.4.2 ZC 吸附 PLA_2,导致毒类蛋白溶血率降低 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 ZC吸附毒类蛋白的体内效果研究 |
| 4.1 实验原料及试剂 |
| 4.2 实验设备与仪器 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.3.1 ZC延长小鼠生存时间 |
| 4.3.2 大鼠创面愈合实验 |
| 4.3.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 ZC体外处理VenomⅠ,死亡率降低,生存时间延长 |
| 4.4.2 ZC体内吸附VenomⅠ,上游注射可延长生存时间 |
| 4.4.3 ZC促进感染创面愈合,抗菌消炎 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 ZC吸附其他毒液的验证 |
| 5.1 实验原料及试剂 |
| 5.2 实验设备与仪器 |
| 5.3 实验步骤 |
| 5.3.1 毒液处理 |
| 5.3.2 上游注射治疗 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（2）氧化应激在β-淀粉样蛋白及氟化物引起的实验性中枢神经损伤病理过程中的作用及其分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（3）从黄柏炭止血作用及其机制研究探讨“炒炭止血”与“烧灰存性”（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 中药炭药研究进展 |
| 1 炭药的现代研究概况 |
| 2 制炭方法及控制标准的研究 |
| 3 炭药药效的研究 |
| 4 炭药止血物质基础的研究 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 出血性五步蛇毒研究进展 |
| 1 五步蛇咬伤的危害 |
| 2 五步蛇咬伤的治疗 |
| 3 五步蛇毒的治疗作用 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 文献研究 仲景“烧灰存性”思想对炭药传承与发展的影响 |
| 引言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 小结 |
| 实验研究 |
| 第一章 黄柏炭碳点止血活性的发现 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 小结 |
| 第二章 黄柏炭碳点制备条件的优化 |
| 引言 |
| 实验一 黄柏炭碳点煅烧温度的考察 |
| 实验二 黄柏炭碳点煅烧时间的考察 |
| 小结 |
| 第三章 黄柏炭碳点的理化性质表征及成分分析 |
| 引言 |
| 实验一 HPLC法测定黄柏炭碳点水溶液的成分 |
| 实验二 黄柏炭碳点的理化性质表征 |
| 实验三 黄柏炭碳点相对量子产率的计算 |
| 小结 |
| 第四章 黄柏炭碳点的细胞毒性实验 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 小结 |
| 第五章 黄柏炭碳点止血作用评价及其机制初探 |
| 引言 |
| 实验一 黄柏炭碳点给药方式比较 |
| 实验二 黄柏炭碳点凝血时效关系 |
| 实验三 黄柏炭碳点对断尾出血与肝损伤出血的影响 |
| 实验四 肝素钠拮抗实验 |
| 实验五 黄柏炭碳点对凝血四项及PLT的影响 |
| 小结 |
| 第六章 黄柏炭碳点对五步蛇毒急性出血模型的作用及其机制研究 |
| 引言 |
| 实验一 五步蛇毒急性出血模型的建立 |
| 实验二 黄柏炭碳点对五步蛇毒急性出血模型血小板计数及尿蛋白含量的影响 |
| 实验三 黄柏炭碳点对五步蛇毒急性出血模型的止血作用及其机制探究 |
| 实验四 黄柏炭碳点对五步蛇毒急性出血致小鼠肾损伤的保护作用及机制初探 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1 黄柏炭碳点是黄柏炭发挥止血作用的关键物质基础之一,而煅烧温度及时间决定了其止血效果 |
| 2 黄柏炭碳点的止血作用及机制 |
| 2.1 黄柏炭碳点在体内外均具有良好的止血作用 |
| 2.2 黄柏炭碳点通过提高血小板计数、促进血小板聚集发挥止血作用 |
| 2.3 黄柏炭碳点通过提升PAI-1含量抑制纤溶系统活性发挥止血作用 |
| 3 黄柏炭碳点的制备及止血效应研究为阐明“炒炭止血”物质基础及仲景炭药“烧灰存性”科学内涵提供部分实验依据 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 研究不足及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）抗阻训练控制骨骼肌质量分子机制研究（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 骨骼肌健康与抗阻训练 |
| 第一节 骨骼肌概述 |
| 1 骨骼肌结构与功能 |
| 1.1 骨骼肌的结构 |
| 1.2 骨骼肌的肌管系统 |
| 1.3 肌原纤维的肌丝组成 |
| 1.4 兴奋-收缩偶联 |
| 1.5 骨骼肌特性及收缩功能 |
| 2 骨骼肌发育生物学 |
| 3 肌纤维类型 |
| 4 骨骼肌萎缩/衰减及临床表现 |
| 第二节 骨骼肌的运动适应 |
| 1 骨骼肌与代谢 |
| 2 骨骼肌的内分泌功能 |
| 3 骨骼肌与炎症 |
| 第三节 抗阻训练及实验条件抗阻训练模型比较分析 |
| 1 抗阻训练 |
| 2 实验动物抗阻训练模型 |
| 第二章 抗阻训练健康促进机制 |
| 第一节 抗阻训练与骨骼肌蛋白质质量控制 |
| 1 mTORC为中心的骨骼肌蛋白质合成信号通路 |
| 2 骨骼肌蛋白质降解相关信号通路 |
| 2.1 泛素-蛋白酶体降解系统 |
| 2.2 细胞自噬 |
| 3 骨骼肌蛋白质质量的调节 |
| 3.1 激素调节 |
| 3.2 线粒体功能与蛋白质合成 |
| 3.3 外泌体及miRNA对蛋白质合成的调控 |
| 4 小结 |
| 第二节 抗阻训练与肌卫星细胞 |
| 1 骨骼肌卫星细胞概述 |
| 2 抗阻训练与肌卫星细胞 |
| 第三章 抗阻训练与疾病防御 |
| 1 败血症 |
| 2. Sarcopenia |
| 3 癌症恶病质 |
| 4 废用性萎缩 |
| 第二篇 研究报告 |
| 第一章 小鼠自主举重训练模型与运动方案 |
| 1 实验对象及方法 |
| 1.1 小鼠自主举重笼盒设计 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 运动方案测试 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 举重笼盒的负荷校准 |
| 2.2 预实验 |
| 2.3 小鼠举重训练方案制定及模型演变 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 小鼠抗阻训练举重模型的设计及优、劣势 |
| 3.2 举重训练运动方案的比较与讨论 |
| 3.3 举重训练模型的应用前景 |
| 4 小结 |
| 第二章 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌质量控制的影响 |
| 第一节 不同时长举重训练对小鼠体重、骨骼肌质量及收缩功能的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物分组及运动方案 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同时长举重训练情况及小鼠体重变化 |
| 2.2 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌质量的影响 |
| 2.3 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌收缩功能的影响 |
| 2.4 长时举重训练对小鼠跑台耐力试验及超声心动参数的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 小结 |
| 第二节 急性举重运动对小鼠骨骼肌转录组基因表达的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 运动方案与取材 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 急性举重运动对小鼠腓肠肌转录组影响 |
| 2.2 急性举重运动对小鼠不同骨骼肌肌群及内脏相关基因mRNA表达的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 小结 |
| 第三节 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌蛋白质合成与降解的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 运动方案与取材 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 急性举重运动对小鼠骨骼肌蛋白合成及降解相关信号蛋白表达的影响 |
| 2.2 短时举重训练对小鼠骨骼肌蛋白合成与降解的影响 |
| 2.3 长时举重训练对小鼠骨骼肌蛋白合成与降解相关信号蛋白表达的影响 |
| 2.4 长时举重训练对小鼠糖代谢的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 抗阻训练对蛋白质合成与降解的影响 |
| 3.2 抗阻训练对糖代谢的影响 |
| 4 小结 |
| 第四节 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌Notch1蛋白表达及细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 运动方案与取材 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 急性举重运动对骨骼肌Notch1蛋白表达的影响 |
| 2.2 短时举重训练对小鼠骨骼肌Notch1蛋白表达的影响 |
| 2.3 长时举重训练对小鼠骨骼肌Notch1蛋白表达的影响 |
| 2.4 短时举重训练对小鼠骨骼肌细胞增殖的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 小结 |
| 第三章 长时举重训练对肌卫星细胞缺失(Pax7~(CreER)-ROSA~(DTA176))小鼠的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物的繁殖 |
| 1.2 基因型鉴定 |
| 1.3 实验动物及分组 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 PAX7~(CreER)小鼠基因型鉴定 |
| 2.2 ROSA26-DTA176小鼠基因型鉴定 |
| 2.3 Pax7~(CreER)-ROSA~(DTA76) (mSCD)转基因小鼠基因型鉴定 |
| 2.4 mSCD小鼠举重情况 |
| 2.5 mSCD小鼠葡萄糖耐量试验 |
| 2.6 mSCD小鼠体重、骨骼肌及内脏组织湿重 |
| 2.7 mSCD小鼠骨骼肌收缩功能 |
| 2.8 预实验结果 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 肌卫星细胞缺失小鼠模型 |
| 3.2 长时举重训练对肌卫星细胞缺失小鼠骨骼肌质量及收缩功能的影响 |
| 3.3 长时举重训练对肌卫星细胞缺失小鼠糖代谢功能的影响 |
| 4 小结 |
| 第四章 短时举重运动对DEX诱导肌萎缩的干预研究 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 动物实验 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 短时举重训练及DEX对小鼠体重的影响 |
| 2.2 短时举重训练及DEX对小鼠骨骼肌及内脏组织湿重的影响 |
| 2.3 短时举重训练及DEX对小鼠骨骼肌收缩功能的影响 |
| 2.4 短时举重训练及DEX对小鼠骨骼肌蛋白合成的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 DEX诱导肌萎缩模型 |
| 3.2 DEX诱导肌萎缩模型的机制 |
| 3.3 抗阻训练对DEX诱导肌萎缩模型的干预机制 |
| 4 小结 |
| 第三篇 研究总结 |
| 1 主要结果与结论 |
| 2 主要创新之处 |
| 3 主要缺陷与不足 |
| 4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 RNAseq结果 |
| 附录2 缩略词 |
| 附录3 Aurora肌力评价系统 |
| 附录4 葡萄糖耐受实验及跑台耐力实验 |
| 附录5 H&E染色 |
| 附录6 总RNA提取及完整性鉴定 |
| 附录7 反转录及RT-PCR |
| 附录8 蛋白质凝胶电泳及免疫印迹 |
| 附录9 EdU染色 |
| 附录10 基因组DNA抽提 |
| 后记 |
| 作者简历及在学期间所取的科研成果 |
（5）眼镜蛇神经毒镇痛小肽片段的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疼痛的影响 |
| 1.2 疼痛机理 |
| 1.2.1 生理性疼痛 |
| 1.2.2 病理性疼痛 |
| 1.3 镇痛药物 |
| 1.3.1 抗炎镇痛药 |
| 1.3.2 中枢性镇痛药 |
| 1.4 蛇毒镇痛 |
| 1.4.1 蛇毒(Snake venom,SV) |
| 1.4.2 三指毒素(TFTs) |
| 1.5 三指毒素与烟碱型乙酰胆碱受体的相互作用 |
| 1.5.1 α-NTX及其结构 |
| 1.5.2 nAChRs的分类及结构 |
| 1.5.3 α-NTX与nAChRs的相互作用 |
| 1.6 研究三指毒素的意义 |
| 1.7 本文研究的主要内容和技术路线 |
| 1.7.1 本文研究的主要内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 设计10肽、合成并测定其镇痛活性 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛇毒神经毒素的镇痛活性中心与毒性中心的独立性分析 |
| 2.2.2 设计镇痛肽(10肽) |
| 2.2.3 合成10肽 |
| 2.3 测定10肽的镇痛活性 |
| 2.3.1 热板法 |
| 2.3.2 醋酸扭体法 |
| 2.3.3 福尔马林法 |
| 2.4 10肽的致死剂量(LD_(50))测定 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 合成10肽的纯度 |
| 2.5.2 合成10肽的镇痛活性 |
| 2.5.3 10肽的致死剂量(LD_(50)) |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 镇痛小肽的改造 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 镇痛小肽的改造及合成 |
| 3.3.2 测定改造肽的镇痛活性 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 热板法测定结果 |
| 3.4.2 醋酸扭体法测定结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 探究镇痛小肽的作用机制 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 标记小肽 |
| 4.2.2 标记小肽的浓度测定 |
| 4.2.3 标记小肽的镇痛活性鉴定 |
| 4.2.4 标记小肽的质谱鉴定 |
| 4.2.5 活体成像 |
| 4.2.6 疼痛模型 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 标记10肽的浓度 |
| 4.3.2 标记小肽(10肽)的质谱鉴定 |
| 4.3.3 标记小肽的镇痛活性 |
| 4.3.4 探究小肽的镇痛机制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（6）基于纳米金刚石的蛋白质组学新技术和新方法研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质组学研究技术 |
| 1.1.1. 蛋白质组学分离分析技术 |
| 1.1.1.1 蛋白质样本的制备技术 |
| 1.1.1.2 二维凝胶电泳技术 |
| 1.1.1.3 多维液相色谱分离技术 |
| 1.1.1.4 毛细管电泳分离技术 |
| 1.1.1.5 微流控芯片技术 |
| 1.1.2 蛋白质组学鉴定技术 |
| 1.1.2.1 传统鉴定技术 |
| 1.1.2.2 生物质谱技术 |
| 1.1.3 蛋白质组学定量研究技术 |
| 1.1.3.1 同位素代谢标记法 |
| 1.1.3.2 同位素化学标记法 |
| 1.1.3.3 非标定量法 |
| 1.2 蛋白质组学新技术和新方法研究进展 |
| 1.2.1 低丰度蛋白质或肽的分离富集 |
| 1.2.1.1 高丰度蛋白剔除低丰度蛋白富集 |
| 1.2.1.2 低丰度肽的富集和除盐技术 |
| 1.2.2. 翻译后修饰蛋白质的鉴定分析 |
| 1.2.2.1 磷酸化修饰肽/蛋白的特异性富集分析 |
| 1.2.2.2糖基化修饰的肽/蛋白的特异性富集分析 |
| 1.3 纳米金刚石的研究进展 |
| 1.3.1 纳米金刚石的制备 |
| 1.3.2 纳米金刚石的常规应用 |
| 1.3.3 纳米金刚石在分析化学及生物医学领域中的应用 |
| 1.3.3.1 生物大分子的吸附基质 |
| 1.3.3.2 色谱固定相 |
| 1.3.3.3 纳米金刚石作为载体和探针的应用 |
| 1.4 本论文选题的意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 纳米金刚石对低丰度肽/蛋白的富集及其在探讨宫内生长迟缓大鼠肾脏发育异常可能机制中的应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 材料与实际样本制备 |
| 2.2.3.1 dND储备液制备 |
| 2.2.3.2 标准蛋白的酶解 |
| 2.2.4. 实际样本准备 |
| 2.2.4.1 动物模型的建立与肾组织标本采集 |
| 2.2.4.2. 肾组织全蛋白抽提、双向凝胶电泳分离分析以及差异蛋白质的酶解 |
| 2.2.5 肽/蛋白的预处理 |
| 2.2.5.1 dND对肽/蛋白的富集预处理 |
| 2.2.5.2 传统富集方法对肽/蛋白富集预处理 |
| 2.2.6 MALDI-TOF/TOF分析及数据处理 |
| 2.2.7 dNDs的相关表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 dNDs对肽/蛋白的富集 |
| 2.3.2 dNDs富集性能 |
| 2.3.2.1 富集平衡时间 |
| 2.3.2.2 吸附容量 |
| 2.3.2.3 pH体系依赖度 |
| 2.3.3 dNDs富集前处理方法与传统前处理方法比较 |
| 2.3.3.1 低浓度肽段富集评价 |
| 2.3.3.2 耐盐度/耐表面活性剂性能评价 |
| 2.3.4 dNDs在肝癌血清多肽研究中的应用 |
| 2.3.5 dNDs在宫内生长迟缓大鼠肾脏发育异常可能机制中的应用 |
| 2.4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 纳米金刚石在MALDI靶上前处理方法中的应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 标准试剂与实际样本制备 |
| 3.2.3.1 标准蛋白/肽段制备 |
| 3.2.3.2 实际样本的制备 |
| 3.2.4. dNDs辅助涂层的制备 |
| 3.2.5. MALDI-TOF/TOF MS分析及数据处理 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 dNDs辅助涂层制备及其对质谱信号的增强研究 |
| 3.3.2 辅助涂层靶点内以及靶点间的样品信号重复性研究 |
| 3.3.3 缩小dNDs辅助涂层面积实现靶上富集 |
| 3.3.4 dNDs辅助涂层下的检测灵敏度评价 |
| 3.3.5 dNDs辅助涂层靶上耐盐评价 |
| 3.3.6 dNDs辅助涂层在实际样品中的应用 |
| 3.4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 纳米金刚石固定化酶及其在蛋白质组学中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 酶在dNDs表面的固定化过程 |
| 4.2.3.1 氧化/酸化dND颗粒制备 |
| 4.2.3.2 EDC/NHS活化dNDs表面 |
| 4.2.3.3 酶的固定 |
| 4.2.4 dNDs-酶的表征 |
| 4.2.4.1 电子显微镜表征 |
| 4.2.4.2 傅立叶变换红外光谱表征 |
| 4.2.5 dNDs-Try的性质评价 |
| 4.2.5.1 酶固定量的评价 |
| 4.2.5.2 dNDs-Try的反应动力学评价 |
| 4.2.5.3 dNDs-Try的耐受度评价 |
| 4.2.6 标准蛋白的溶液酶解 |
| 4.2.7 dNDs-Try以及dNDs-PNGase F对标准蛋白的酶解 |
| 4.2.8 MALDI-TOF-MS/MS分析及数据处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 酶的固定化以及表征 |
| 4.3.2 游离酶以及固定化酶的反应动力学研究 |
| 4.3.3 dNDs-Try的耐受度研究 |
| 4.3.4 dNDs-Try在蛋白质组学中的应用 |
| 4.3.4.1 在溶液体系中的应用 |
| 4.3.4.2 dNDs-Try MALDI靶上酶解 |
| 4.3.5 dNDs-PNGase F的制备评价 |
| 4.4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第五章 硼酸功能化dNDs的制备及其在糖蛋白/糖肽富集方法中的应用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 硼酸功能化dNDs的合成 |
| 5.2.3 硼酸功能化dNDs的表征 |
| 5.2.4 dNDs-PL/PEG-APBA纳米粒子用于富集糖基化肽 |
| 5.2.5 商品化硼酸磁珠对糖基化肽的富集 |
| 5.2.6 dNDs-PL/PEG-APBA纳米粒子用于鼠肝样品中糖基化蛋白分析 |
| 5.2.7 MALDI-MS |
| 5.2.8 鼠肝多肽馏分的Nano-LC/MS分析 |
| 5.2.9 Nano-LC/MS数据库检索分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 硼酸功能化dNDs的合成及其表征分析 |
| 5.3.2 糖肽的富集 |
| 5.3.2.1 dNDs-PL/PEG-APBA对N-糖肽的富集原理及流程 |
| 5.3.2.2 dNDs-PL/PEG-APBA对N-糖肽的富集及选择特异性评价 |
| 5.3.2.3 dNDs-PL/PEG-APBA对N-糖肽的富集效率评价 |
| 5.3.2.4 dNDs-PL/PEG-APBA对N-糖肽的富集回收率评价 |
| 5.3.2.5 dNDs-PL/PEG-APBA对小鼠肝脏中N-糖基化修饰蛋白的鉴定研究 |
| 5.4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第六章 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球的合成及其在分泌蛋白质组学中的应用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 材料和试剂 |
| 6.2.2 仪器设备 |
| 6.2.3 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球的合成 |
| 6.2.3.1 四氧化三铁磁性微球材料的合成 |
| 6.2.3.2 具有核壳结构的Fe_3O_4@SiO_2-NH_2磁性微球材料的合成 |
| 6.2.3.3 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球的合成 |
| 6.2.4 材料表征 |
| 6.2.4.1 电子显微镜表征 |
| 6.2.4.2 傅立叶变换红外光谱表征 |
| 6.2.5 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球用于肽段富集 |
| 6.2.5.1 标准蛋白的酶解 |
| 6.2.5.2 肽段的分离富集 |
| 6.2.5.3 MALDI-TOF/TOF分析及数据处理 |
| 6.2.6 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球用于蛋白富集 |
| 6.2.6.1 蛋白富集 |
| 6.2.6.2 SDS凝胶分离分析 |
| 6.2.7 Fe_3O_4@Si_O2@[dNDs]n磁性微球用于有/无四环素刺激HepAD38分泌差异分析 |
| 6.2.7.1 HepAD38细胞培养及分泌上清收集 |
| 6.2.7.2 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球用于分泌蛋白的富集 |
| 6.2.7.3 HepAD38(Tet~(+/-))分泌蛋白的itraq标记 |
| 6.2.7.4 HepAD38(Tet~(+/-))分泌蛋白的off-line 2D-LC-MS分析鉴定 |
| 6.3 结果讨论 |
| 6.3.1 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球的制备及表征 |
| 6.3.2 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球对肽段富集评价 |
| 6.3.3 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球对蛋白富集评价 |
| 6.3.4 Fe_3O_4@SiO_2@[dNDs]n磁性微球用于HepAD38(Tet~(+/-))差异分泌蛋白分析 |
| 6.4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 博士学位攻读期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（7）中介蝮蛇毒纤溶酶基因表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒概述 |
| 1.1.1 蛇毒金属蛋白酶 |
| 1.1.2 蛇毒丝氨酸蛋白酶 |
| 1.1.3 蛇毒其他主要成分 |
| 1.2 蛇毒纤溶酶研究进展 |
| 1.2.1 蛇毒纤溶酶的分布与分类 |
| 1.2.2 蛇毒纤溶酶的分离纯化 |
| 1.2.3 蛇毒纤溶酶的结构与基本性质 |
| 1.2.4 蛇毒纤溶酶的酶学特性 |
| 1.2.5 蛇毒纤溶酶的分子生物学研究 |
| 1.2.6 蛇毒纤溶酶的应用 |
| 1.3 中介蝮蛇毒纤溶酶的相关研究 |
| 1.3.1 中介蝮概述 |
| 1.3.2 中介蝮蛇毒纤溶酶研究现状 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 中介蝮蛇毒FLE 基因的真核表达载体构建 |
| 2.2.2 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.3 目的基因在小鼠肝脏细胞中的瞬时表达 |
| 2.2.4 重组蛋白的检测 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 重组表达质粒pFASTBACHTa-FLE 的鉴定 |
| 3.1.1 重组表达质粒的PCR 鉴定 |
| 3.1.2 重组表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.1.3 重组表达质粒的测序结果 |
| 3.2 小鼠肝脏中重组FLE 蛋白的SDS-PAGE 检测 |
| 3.3 小鼠肝脏中重组FLE 蛋白的Western blot 检测 |
| 3.4 小鼠肝脏中重组FLE 蛋白的免疫组织化学检测 |
| 3.5 小鼠肝脏中重组FLE 蛋白的纤溶活性鉴定 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 分析与讨论 |
| 4.1.1 重组FLE 蛋白的表达 |
| 4.1.2 重组FLE 蛋白的检测 |
| 4.2 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠的神经保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 综述Ⅰ |
| 参考文献 |
| 综述Ⅱ |
| 参考文献 |
| 引言 |
| 实验一 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠行为和学习记忆的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠神经元以及突触相关蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠Aβ的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠胰岛素信号转导通路的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附页 |
| 电镜图片 |
| 水迷宫彩图 |
| 免疫组织化学彩图 |
| 解链曲线彩图 |
（9）白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2的神经毒活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 蛇毒神经毒素的结构性质和作用机理 |
| 1.2.1 突触后神经毒素 |
| 1.2.2 突触前神经毒素 |
| 1.2.3 蛇毒神经毒素的作用机理 |
| 1.3 蛇毒神经毒素的镇痛机制研究 |
| 1.3.1 镇痛作用与痛觉调控相关方面的关系 |
| 1.4 蛇毒神经毒作用的靶蛋白-离子通道 |
| 1.4.1 离子通道的分类 |
| 1.4.2 离子通道的研究方法 |
| 1.5 蛇毒磷脂酶A_2的研究 |
| 1.5.1 磷脂酶A_2的一般性质 |
| 1.5.2 磷脂酶A_2的分类 |
| 1.5.3 蛇毒磷脂酶A_2的结构特征 |
| 1.5.4 蛇毒磷脂酶A_2的生物学功能 |
| 1.5.5 蛇毒PLA_2的药理作用的机制 |
| 1.6 蛇毒神经毒素的临床应用 |
| 1.7 展望 |
| 2 本课题研究的目的和意义 |
| 3 蛇毒磷脂酶A_2(Gln49-PLA_2)的分离纯化 |
| 3.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 白眉蝮蛇蛇毒Gln49-PLA_2的制备 |
| 3.2.2 蛋白浓度的确定 |
| 3.2.3 纯化蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 阳离子交换层析 |
| 3.3.2 凝胶过滤层析 |
| 3.3.3 蛋白电泳检测 |
| 3.3.4 Gln49-PLA_2分子量的确定 |
| 3.3.5 Gln49-PLA_2的定量 |
| 3.4 小结 |
| 4 Gln49-PLA_2的神经及肌肉毒性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验药品 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 动作电位与传导速度测量 |
| 4.2.2 神经肌肉传导实验 |
| 4.2.3 肌肉毒性的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 动作电位与传导速度的变化 |
| 4.3.2 Gln49-PLA_2对鸡颈二腹肌神经肌肉接点传递的阻滞作用 |
| 4.3.3 Gln49-PLA_2对颈二腹肌乙酰胆碱敏感性的影响 |
| 4.3.4 肌肉收缩基线上升 |
| 4.3.5 肌肉毒活性 |
| 4.3.6 形态学观察 |
| 4.4 小结 |
| 5 Gln49-PLA_2对离子通道的作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要药品与试剂 |
| 5.1.3 主要仪器和材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 海马神经元的急性分离 |
| 5.2.2 形态学观察 |
| 5.2.3 全细胞膜片钳记录 |
| 5.2.4 实验数据的处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 急性分离海马神经元形态学观察 |
| 5.3.2 Gln49-PLA_2对电压门控性钠通道电生理学特性的影响 |
| 5.3.3 Gln49-PLA_2对电压门控性钾通道电生理学特性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（10）白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒纤溶组分的分离纯化及性质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写一览表 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 本研究的主要内容 |
| 1.3 本研究的技术路线 |
| 2 白唇竹叶青蛇粗毒的性质研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 白唇竹叶青蛇毒纤溶组分的分离纯化及性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4 全文小结 |
| 5 文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况 |
| 致谢 |
四、尖吻蝮蛇毒素对小鼠骨骼肌和心肌损伤的电子显微镜初步观察（论文参考文献）
- [1]基于光敏型多孔氧化锌的广谱解毒技术[D]. 程馨妍. 南昌大学, 2021
- [2]氧化应激在β-淀粉样蛋白及氟化物引起的实验性中枢神经损伤病理过程中的作用及其分子机制[D]. 董阳婷. 贵州医科大学, 2018(07)
- [3]从黄柏炭止血作用及其机制研究探讨“炒炭止血”与“烧灰存性”[D]. 刘晓曼. 北京中医药大学, 2018(08)
- [4]抗阻训练控制骨骼肌质量分子机制研究[D]. 崔迪. 华东师范大学, 2017(04)
- [5]眼镜蛇神经毒镇痛小肽片段的作用机制研究[D]. 李江兵. 昆明理工大学, 2017(01)
- [6]基于纳米金刚石的蛋白质组学新技术和新方法研究[D]. 魏黎明. 复旦大学, 2011(08)
- [7]中介蝮蛇毒纤溶酶基因表达的研究[D]. 冬黎黎. 哈尔滨师范大学, 2011(04)
- [8]姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠的神经保护作用[D]. 王蓬文. 北京中医药大学, 2011(09)
- [9]白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2的神经毒活性研究[D]. 张煜. 大连理工大学, 2008(08)
- [10]白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒纤溶组分的分离纯化及性质研究[D]. 邓敏. 重庆师范大学, 2008(01)