一、抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体的建立（论文文献综述）
邵婷[1]（2021）在《猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究》文中指出猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是一种自主复制型单股负链DNA病毒,其复制完全依赖于宿主细胞的复制酶系统。PPV基因组主要包含两个开放性阅读框（Open reading frame,ORFs）ORF1和ORF2,ORF1编码非结构蛋白NS1、NS2和NS3,ORF2编码结构蛋白VP1和VP2。其中,VP2是病毒最重要的结构蛋白,占病毒衣壳组分的90%以上,是PPV最主要的免疫原性蛋白,能够刺激机体产生免疫反应,并且在病毒复制过程中发挥重要作用。微小染色体维持蛋白3（Minichromosome maintenance protein 3,MCM3）是MCM2～7复合物的组成亚基之一,参与了调控MCM复合物的组装,并与细胞DNA复制起始位点结合,从而影响细胞DNA的复制。还有研究报道,MCM复合物参与调控腺联病毒、疱疹病毒以及人细小病毒等多种病毒的复制过程。本实验室前期研究发现,在PPV感染过程中,PPV VP2通过与MCM3互作招募MCM3至病毒复制起始位点,促进病毒的复制。然而,PPV VP2是如何劫持MCM3促进自身复制的机制迄今尚不清楚。本研究拟首先制备VP2和NS1的多克隆抗体。然后,通过real-time PCR检测PPV感染PK-15细胞后病毒和细胞DNA的复制水平,通过Co-IP和Ch IP试验检测PPV感染PK-15细胞后MCM3与组蛋白H3的结合能力以及MCM3与细胞DNA复制起始位点的结合能力,研究PPV感染对宿主细胞DNA和自身复制的影响。最后,检测PPV感染对PK-15细胞MCM3表达及磷酸化水平的影响,确定MCM3磷酸化位点及调控MCM3磷酸化的关键病毒蛋白;检测MCM3磷酸化对VP2与MCM3的互作、MCM3与组蛋白H3的互作以及对PPV复制的影响。研究结果旨在阐明PPV VP2劫持MCM3促进自身复制的机制,为进一步探索PPV的致病机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.扩增并纯化得到PPV病毒粒子。构建NS1特异性片段（1395 nt～1986 nt）ns1s的原核表达载体p ET-32a-ns1s,经表达纯化得到NS1S重组蛋白。分别用纯化的PPV病毒粒子和NS1S重组蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制备出鼠抗PPV VP2和NS1的多克隆抗体,间接ELISA和western blotting检测结果显示,鼠抗PPV VP2和NS1多克隆抗体效价均为1:256000,并且能够很好的识别原核/真核表达的PPV VP2、NS1重组蛋白以及PPV感染PK-15细胞内源性PPV VP2和NS1。2.以1 MOI PPV感染PK-15细胞,在感染0、12、24 h后real-time PCR检测PPV和细胞DNA复制水平的变化,结果显示,随着感染时间的延长,PPV病毒拷贝数显着升高（P<0.05）,宿主细胞DNA拷贝数显着降低（P<0.05）。Co-IP和Ch IP检测PPV感染后MCM3与组蛋白H3的结合情况以及MCM3与细胞DNA复制起始位点Lamin b2prom以及dhfr prom的结合情况,Co-IP结果显示,与Mock对照组相比,PPV感染组MCM3与组蛋白H3的结合能力显着降低（P<0.05）;Ch IP结果显示,与Mock对照组相比,PPV感染组MCM3和细胞DNA复制起始位点Lamin b2 prom以及dhfr prom的结合能力显着降低（P<0.05）。3.以1 MOI PPV感染PK-15细胞,在感染0、12、24、36 h后western blotting检测MCM3的表达及磷酸化水平的变化,结果显示,随着PPV感染时间的延长,MCM3总蛋白的表达无明显变化（p>0.05）,MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平显着降低（P<0.05）。重组质粒pCI-Flag-ns1、pCI-His-vp2分别转染PK-15细胞,在转染0、12、24、36 h后western blotting检测MCM3的表达及磷酸化水平的变化,结果显示,随着转染时间的延长,NS1重组质粒转染组中MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平显着降低（P<0.05）;而VP2重组质粒转染组中MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平无明显变化（P>0.05）。用重组质粒pCI-His-vp2与pCI-neo或与pCI-Flag-ns1共转染PK-15细胞,Co-IP结果显示,与pCI-His-vp2和pCI-neo共转染组相比,pCI-Flag-ns1和pCI-His-vp2共转染组中VP2与MCM3结合能力显着增加（P<0.05）。用重组质粒pCI-Flag-ns1转染PK-15细胞,Co-IP结果显示,与pCI-neo空载体转染组相比,pCI-Flag-ns1转染组中MCM3与组蛋白H3的结合能力显着降低（P<0.05）。最后构建过表达Flag-MCM3T 160A重组蛋白的PK-15细胞,1 MOI PPV感染野生型PK-15细胞、PK-15MCM3细胞和PK-15MCM3T160A细胞,在感染后24 h检测病毒粒子拷贝数、TCID50以及PPV VP2的表达,结果显示,与野生型PK-15细胞感染组相比,PK-15MCM3细胞感染组和PK-15MCM3T160A细胞感染组病毒粒子拷贝数和TCID50均显着升高（P<0.05）,同时,PPV VP2的表达也显着升高（P<0.05）;与PK-15MCM3细胞感染组相比,PK-15MCM3T160A细胞感染组病毒粒子拷贝数和TCID50均显着升高（P<0.05）,同时,PPV VP2的表达也显着升高（P<0.05）。本研究成功制备出鼠抗PPV VP2和NS1的多克隆抗体。发现PPV感染PK-15细胞后随着感染时间的延长,PPV复制水平显着升高,而细胞DNA复制水平却显着降低,MCM3与组蛋白H3及细胞DNA复制起始位点的结合能力显着降低。发现PPV NS1是PPV感染抑制MCM3 160位苏氨酸磷酸化的关键病毒蛋白,并且MCM3磷酸化降低促进了VP2与MCM3的互作、抑制了MCM3与组蛋白H3的互作。构建了MCM3T160A过表达细胞系,并命名为PK-15MCM3T160A细胞,发现了MCM3 160位苏氨酸磷酸化位点的突变显着促进了PPV的复制。上述研究结果阐明了PPV VP2劫持MCM3促进自身复制的分子机制,为进一步探索PPV的致病机制提供理论依据。
焦翠翠,金宏丽,冯娜,黄培,刘迪,李丽娜,赵健,王倩,丁秋雨,杨松涛,夏咸柱,石晶,王化磊[2]（2021）在《大熊猫源细小病毒病毒样颗粒的构建与免疫原性》文中研究指明将大熊猫源细小病毒VP2基因优化后克隆至pFastBac Dual载体,重组获得穿梭质粒rBacmid-Panda-dVP2,转染Sf9细胞拯救获得表达大熊猫源细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒rpFBD-Panda-dVP2。rpFBD-Panda-dVP2感染Sf9细胞会形成明显的细胞病变,间接免疫荧光鉴定显示rpFBD-Panda-dVP2感染的Sf9细胞可见明显的绿色荧光。对感染细胞后收获的抗原进行Western blot鉴定,结果显示在约65 kDa处可见明显的目的蛋白条带;电镜下可见与天然细小病毒形态大小相似的粒子,表明rpFBD-Panda-dVP2感染昆虫细胞后可成功组装成病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）,获得的VLPs血凝效价可达1∶215。将大熊猫源细小病毒VLPs免疫幼猫后可诱导机体产生血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）抗体,HI效价最高可达1∶211,且保护性抗体水平可持续至少12个月。大熊猫源细小病毒VLPs的成功构建,为大熊猫细小病毒病新型基因工程疫苗的研制奠定基础,对防控大熊猫细小病毒病具有重要意义。
韩聪[3]（2020）在《宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究》文中研究指明猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显着升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高（96.3%）。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高（98.2%）。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高（90.9%）。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异（p>0.05）,而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显着高于对照组（p<0.05）。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显着低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数（p<0.05）。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序（5’TTCTCTGAA3’）,该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆（PCV2-MDS）不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链（负链）的探针（RFP）和靶向病毒基因组模板链（正链）的探针（CP）阳性细胞数量都显着降低（p<0.05）;荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显着低于野生型PCV2感染细胞（p<0.05）。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株（PCV2-Nm A）感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显着降低（p<0.05）。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显着增加（p<0.05）,48 h进一步增加（p<0.01）,DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显着降低（p<0.05）。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着降低（p<0.01）。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15（PKV）发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显着增加（p<0.05）,并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着升高（p<0.05）。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）,且病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.01）。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显着下降（p<0.01）。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显着降低（p<0.01）。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显着降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显着低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显着降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。
李希辰[4]（2020）在《犬细小病毒基因工程抗体的研究》文中提出犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染引起,严重危害犬类健康的传染病,具有发病率高、传染性强、死亡率高等特点。目前犬细小病毒病没有特效药物,目前采用的单克隆抗体在CPV感染早期有良好的治疗效果,但单克隆抗体为鼠源,具有较高的免疫原性,不能连续注射。本研究通过对已有单克隆抗体进行犬源化改造,制备适合犬用的免疫原性低的抗CPV抗体药物。首先对已有抗CPV的杂交瘤细胞株4H8进行鉴定,4H8抗体亚型为IgG2b,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10111 L/mol,只与CPV VLPs反应。经RACE-PCR提取4H8抗体可变区序列,用NCBI IgBLAST分析。将4H8抗体可变区序列与在ENA网站上查到的鼠源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H,共转染HEK-293、HEK-293F细胞进行表达。采用间接ELISA检测鼠源CPV基因工程抗体（CA）的表达量,CA在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L;血凝抑制、中和试验检测其生物活性,CA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:24、1:152,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:26、1:1 290。纯化CA后进行SDS-PAGE分析在55和25 Ku处出现条带;间接免疫荧光检测,CA能与CPV发生特异性结合。确定经过改造的CA依然保持活性后,进行犬源化改造。将4H8抗体可变区序列与在NCBI网站上查到的犬源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-cL和pcDNA3.1（+）-cH,按照CA的方法进行表达和检测犬源CPV基因工程抗体（CCA）。CCA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:25、1:203,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:29和1:2 580。CCA经Protein A亲和层析柱纯化后纯度在95%以上,血抑和中和效价分别为1:212和1:32 768。经BCA法检测CCA在HEK-293F细胞中的表达量为89.65 mg/L。SDS-PAGE分析CCA在55和25 Ku处出现条带,Western-blot检测重链能与兔抗犬IgG-HRP结合,间接免疫荧光检测CCA能中和CPV。以上结果表明,本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度高、免疫原性低的犬源化CPV基因工程抗体。
吴以振[5]（2019）在《猪伪狂犬病毒UL19基因原核表达及单克隆抗体的制备》文中研究指明猪伪狂犬病（Rseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Rseudorabies virus,PRV）引起的多种家畜及野生动物共患的急性,热性传染病,以呼吸困难和精神紊乱为主要特征。伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科,α-疱疹病毒亚科,水痘-带状病毒属。临床上PRV感染以新生仔猪神经紊乱、死亡、成年猪呼吸困难、母猪繁殖障碍为特征,给养殖业带来严重的经济损失。自2011年以来,高致病力的PRV在我国猪群中出现,给该病的防控带来了新的挑战。UL19蛋白为PRV衣壳蛋白的主要成分,与病毒基因组紧密结合形成核糖体蛋白,且与病毒在宿主细胞内转运有关,同时还在蛋白组装、基因组进入核内等方面发挥着不可替代的作用。伪狂犬病毒具有潜伏感染特征,剂量适中即可以在其天然宿主猪的三叉神经节中潜伏,且不产生裂解性感染,一旦宿主免疫力降低,即可激活病毒产生急性感染。为了更好的研究PRV在神经细胞中潜伏的状态,制备了 UL19单克隆抗体,对研究病毒在细胞中状态和传递示踪建立良好的操作平台,以便更好的研究潜伏感染中病毒粒子所处的状态。同时UL19参与PRV在宿主细胞内的入侵、复制、转运及潜伏感染机制等,可以分析感染该蛋白在细胞中的分布,也可以将其作为病毒载量内参,定量病毒其它蛋白在不同时间段的量,为进一步研究病毒在感染细胞中病毒载量提供定量标准。本研究应用PCR技术扩增了 PRV UL19基因片段,将目的基因连接到pCold-TF中构建重组原核表达质粒pCold-TF-UL1 9并通过IPTG诱导表达和纯化。以纯化的PRV UL19蛋白为抗原免疫小鼠,三免后进行细胞融合,后继续亚克隆培养,筛选单克隆抗体细胞。以此建立了检测PRV抗原的间接ELISA方法,用于筛选杂交瘤细胞株。结果:采用PCR方法可有效地扩增PRV UL19基因片段,其大小为1 653 bp;同时成功地构建了 pCold-TF-UL1 9表达载体,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE及Western blot可分析出该重组蛋白大小约为110kDa,且主要以可溶性方式表达。采用间接ELISA方法初步筛选出四株杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞株经有限稀释法继续培养,再经Western blot鉴定,获得一株分泌稳定且特异性强的单克隆抗体细胞株,并将其命名为3D8。本研究成功地克隆和表达出PRV UL19,并以重组表达蛋白PRV UL19建立了间接ELISA检测方法,同时以重组蛋白免疫小鼠后制备出抗PRVUL19单克隆抗体细胞株,为研究病毒在细胞中状态和传递示踪建立良好的操作平台,也为该病的控制提供重要的手段。
聂晓晶[6]（2012）在《人细小病毒B19 VP1独特区蛋白对心肌细胞的影响及机制》文中提出【背景】人细小病毒B19（Human parvovirus B19，简称B19病毒）是一种单链线状小DNA病毒，能导致多系统疾病，如自然流产、胎儿畸形、再生障碍性贫血危象、肾小球肾炎、关节炎等，严重者可致死。本实验室首次报道心脏发育畸形的胎儿心脏尸检标本及先天性心脏病（CHD）心肌组织标本中有较高的B19病毒DNA检测阳性率，提示B19病毒感染可能与部分CHD发病相关，接着国外研究还提示B19病毒感染可引起心肌炎、川崎病、冠状动脉病变等心血管疾病。值得重视的是，由于B19病毒不能常规培养分离和不能感染实验动物如鼠、狗和猪等，因此其感染导致上述疾病的机理尚未阐明。B19病毒基因编码的结构蛋白VP2蛋白包含在VP1蛋白中，VP1蛋白N末端的227个氨基酸叫做VP1独特区蛋白（VP1u蛋白）。既往研究将VP1u蛋白作为亚单位疫苗研究的候选分子，本实验室发现VP1u蛋白可导致BALB/c小鼠心脏病变，包括心肌纤维间隙增宽、肌丝崩解、线粒体空泡化等。这一结果提示须重新审视B19病毒VP1u蛋白的功能，并回答下列相关问题：B19病毒VP1u蛋白引起心脏病变的机制是什么？是病毒蛋白直接毒性作用造成组织损伤，还是其刺激机体产生的抗体导致心脏损害？其通过什么信号通路导致心肌损伤？其引起心肌病变与B19病毒致胎儿心脏水肿、流产、心脏畸形有无相关性？它是否强烈地告知B19病毒VP1u蛋白用于疫苗研究的不可能性？为此，本项目将用纯化的B19病毒VP1u蛋白和单克隆抗体（mAb）作用离体心肌细胞和鼠（包括孕鼠），用光镜、电镜、免疫组织化学、流式细胞仪和信号通路分析等方法，研究心肌细胞结构、凋亡、细胞表面标志物、细胞因子、细胞粘附分子和信号通路变化。这将有助于揭示B19病毒感染的发病机制，也有助于对病毒蛋白毒性和免疫损伤机制的认识或致病相关通路的新发现，并进一步促进B19病毒致病机理及预防疫苗的研究。【目的】1.获得B19病毒VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb，为后续研究奠定基础。2.研究B19病毒VP1u蛋白对离体和整体动物心肌细胞结构、凋亡、相关细胞因子、细胞表面标志物和信号通路的影响，从病毒蛋白毒性、免疫损伤、信号通路改变方面探讨B19病毒VP1u蛋白致心肌病变的机制。3.研究B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏重量、结构、凋亡、细胞表面标志物、信号通路及胎鼠流产的影响，探讨B19病毒VP1u蛋白与心脏发育和胎鼠流产的关系。【方法】1. B19病毒VP1u蛋白纯化及mAb制备⑴根据已经构建的VP1u蛋白表达纯化体系获得B19病毒VP1u蛋白。⑵用B19病毒VP1u蛋白免疫小鼠，免疫后脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得鼠源性mAb。2. B19病毒VP1u蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究⑴采用酶消化、差速贴壁和5-溴脱氧尿苷（5-Brdu）抑制法获得高纯度离体培养心肌细胞。⑵给予B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预离体心肌细胞，首先计算VP1u蛋白入心肌细胞率，然后，通过光镜和电镜观察心肌细胞结构，干化学分析法检测心肌酶谱和ELISA法定量检测细胞因子变化。⑶TUNEL免疫荧光法、流式细胞仪检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预离体心肌细胞导致心肌细胞凋亡情况。⑷免疫细胞化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预心肌细胞后细胞粘附分子ICAM-1（CD54）、VCAM-1（CD106）和E-selectin（CD62E）变化。⑸Western blot检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后离体心肌细胞NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路变化。3. B19病毒VP1u蛋白致正常鼠心脏病变的研究⑴用B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射BALB/c小鼠，光镜和电镜观察心脏组织结构变化，干化学分析法检测心肌酶谱变化，ELISA法定量检测细胞因子变化。⑵TUNEL免疫荧光法、免疫组织化学法和流式细胞仪检测VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预鼠心脏中心肌细胞凋亡情况。⑶免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预鼠心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin变化。⑷原位分子杂交技术检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预鼠心肌细胞中NF-κB、PKC-α及PDGF-β变化。⑸根据实验结果提出B19病毒VP1u蛋白引起心肌病变的信号通路。4. B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响⑴用B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射BALB/c孕鼠，观察流产情况，采集胎鼠心脏组织，称重，光镜和电镜观察心脏组织结构。⑵TUNEL免疫荧光法和免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心脏中心肌细胞凋亡情况。⑶免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin变化。⑷原位分子杂交技术检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心肌细胞中NF-κB、PKC-α及PDGF-β变化。【结果】1. B19病毒VP1u蛋白纯化及mAb制备⑴获得分子量22kDa、浓度1.2mg/mL、纯度96.7%的B19病毒VP1u蛋白，并获得两株分泌抗B19病毒VP1u蛋白mAb的细胞株，分别命名4-H-5和5-B-9，两株mAb细胞株分泌抗体均为IgG2a，抗体稀释倍数为1:16000时检测结果仍为阳性，4-H-5抗体的效价高于5-B-9，纯化后抗VP1u蛋白mAb浓度分别是900μg/mL（4-H-5）和1110μg/mL（5-B-9）。2. B19病毒VP1u蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究⑴通过酶消化法、差速贴壁法和5-Brdu抑制法得到离体培养心肌细胞，68h心肌细胞贴壁，1216h出现不规律搏动，自发搏动频率4080次/min。贴壁心肌细胞呈梭形，中心可见细胞核，每个细胞向外伸出数个突起，心肌细胞存活率82%。56d形成菊花状功能小体，此时搏动较规律，52.6±18.6次/min。⑵离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb共同干预组、抗VP1u蛋白mAb干预组电镜下发现细胞自噬。⑶离体心肌细胞实验中，BCA法检测细胞培养液中VP1u蛋白量，进入心肌细胞的VP1u蛋白量是0.0360.468μg，统计学处理，P>0.05，各剂量组在不同时间点差别无统计学意义；P>0.05，各剂量组组间差别无统计学意义。ELISA法直接检测心肌细胞匀浆中VP1u蛋白量，进入心肌细胞VP1u蛋白量0.0120.076μg，统计学处理，P>0.05，各剂量组在不同时间点差别无统计学意义；P>0.05，各剂量组组间差别无统计学意义。⑷离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞培养液中心肌酶谱与对照组比较，P>0.05，差别无统计学意义。⑸离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞培养液中IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β1与对照组比较，P>0.05，差别无统计学意义。⑹离体心肌细胞实验中，通过TUNEL免疫荧光和流式细胞分析技术，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞发生细胞凋亡。B19病毒VP1u蛋白干预组细胞凋亡率5.4%，B19病毒VP1u蛋白和抗B19病毒VP1u蛋白mAb共同干预组细胞凋亡率7.7%，抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞凋亡率15.5%。⑺离体心肌细胞实验中，免疫组织化学提示B19病毒VP1u蛋白刺激心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达增强。⑻离体心肌细胞实验中，PKC/p38MAPK信号通路和NF-κB信号通路参与B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞凋亡。3. B19病毒VP1u蛋白致正常鼠心脏病变的研究⑴整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组光镜下均发现心肌细胞间隙增宽，细胞核肿胀，核浆比例增高；电镜下均可见心肌细胞中线粒体聚集，细胞核稍缩小，核染色质致密并边集于核膜处。⑵整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组AST、CK、CK-MB、LDH和α-HBDB值行LSD-t检验，组间两两比较，P<0.05，干预组与对照组间差别有统计学意义。⑶整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β1值行LSD-t检验，组间两两比较，P<0.05，干预组与对照组间差别有统计学意义。⑷整体动物实验中，通过TUNEL免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞分析技术，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞发生细胞凋亡。抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射组，细胞凋亡率最高（15.9%）。该凋亡过程中伴有抑制凋亡分子Bcl-2出现。⑸整体动物实验中，免疫组织化学提示B19病毒VP1u蛋白刺激心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达增强。⑹整体动物实验中，通过原位分子杂交技术在B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组检出NF-κB、PKC-α及PDGF-β。4. B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响⑴对胎鼠心脏影响研究中，实验期间有23只小鼠怀孕，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组均未见胎鼠流产。各组产仔数量进行组间方差分析，P>0.05，差别无统计学意义；各组胎鼠心脏重量进行组间方差分析，P>0.05，差别无统计学意义。⑵对胎鼠心脏影响研究中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb注射组光镜下均可见心肌细胞间隙增宽，胞质透明淡染，部分心肌细胞脂肪变性。电镜下VP1u蛋白注射组可见心肌细胞间隙增宽，细胞膜下空泡，可见次级溶酶体；VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb共同注射组、抗VP1u蛋白mAb注射组均可见线粒体聚集在增宽的心肌细胞间隙中，线粒体有空泡化。⑶对胎鼠心脏影响研究中，通过TUNEL免疫荧光和免疫组织化学，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导胎鼠心肌细胞发生细胞凋亡。⑷对胎鼠心脏影响研究中，免疫组织化学法在VP1u蛋白注射组和或抗VP1u蛋白mAb注射组心脏组织中检出微弱棕色信号提示有少量ICAM-1、VCAM-1和E-selectin。⑸对胎鼠心脏影响研究中，通过原位分子杂交技术在VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组检出NF-κB、PKC-α及PDGF-β。【结论】⑴获得B19病毒VP1u蛋白和两株分泌抗B19病毒VP1u蛋白mAb的细胞株，为后续B19病毒VP1u蛋白相关研究奠定了基础。⑵通过ELISA法检测心肌细胞匀浆中VP1u蛋白量和BCA法检测细胞培养液中VP1u蛋白量，结果提示VP1u蛋白没有进入心肌细胞内。⑶离体心肌细胞培养时，干预组心肌酶谱没有升高，而整体动物研究时，干预组心肌酶谱升高，提示VP1u蛋白并非直接破坏心肌细胞膜，可能与VP1u蛋白依赖分子拟态刺激机体产生自身抗体引起免疫性心肌损伤有关。⑷首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞凋亡。⑸心肌细胞发生凋亡过程中，伴有ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和Bcl-2等抑制细胞凋亡分子升高，提示抑制凋亡与促进凋亡的对抗随着时间变化而变化，为了阐明两者的相互关系，将进一步研究不同时间点相关分析。⑹首次揭示B19病毒VP1u蛋白致心肌细胞凋亡过程中包含有NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路，需要相应信号通路抑制剂来进一步证实上述信号通路是否为主要信号通路。⑺本研究结果揭示B19病毒VP1u蛋白能引起胎鼠心脏水肿，但没有引起胎鼠死亡、流产和心脏发育畸形。
肖霞[7]（2011）在《人细小病毒B19抗体检测方法的建立》文中研究说明人细小病毒B19（human parvovirus B19）为细小病毒科红病毒属的成员,主要通过呼吸道传播,也可通过输血或血液制品传播,还可以在母婴之间垂直传播。对于免疫功能正常的人群,B19主要引起儿童的传染性红斑和成年人的关节痛或关节病;而对于免疫力低下者,感染B19会引起单纯红细胞再生障碍及慢性贫血;对于孕妇,B19感染严重时可致胎儿水肿,宫内死胎等。由于目前国内没有商业化的B19抗体检测试剂,有必要建立B19血清抗体检测方法。本研究拟利用原核表达系统或真核表达系统表达B19病毒衣壳蛋白VP2,用纯化后的VP2蛋白作为检测抗原,初步建立抗B19血清IgG和IgM抗体检测的酶联免疫吸附试验（ELISA）法。一、人细小病毒B19衣壳蛋白VP2的制备实验目的:利用原核表达系统和重组腺病毒真核表达系统分别表达并纯化B19病毒衣壳蛋白VP2。方法:分析VP2编码区,利用重叠延伸PCR合成密码子优化的VP2基因,测序验证后,亚克隆到原核表达载体pET30a（+）或pET44a（+）,分别将重组质粒转化对应的宿主菌,利用IPTG诱导目的蛋白表达。包涵体蛋白在变性后使用DEAE琼脂糖阴离子交换层析法或固化金属层析法纯化;十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blotting分析评价纯化效果;将部分纯化蛋白免疫新西兰大白兔,收集抗血清,再利用亲和层析法分离纯化血清IgG。在构建腺病毒表达系统过程中,先构建携带B19 VP2基因的穿梭质粒,与骨架质粒pAdEasy-1在E. coli BJ5183菌株中同源重组产生腺病毒质粒,线性化后转染293细胞,拯救并扩增携带VP2基因的重组腺病毒Ad5-VP2;Ad5-VP2感染293细胞,Western blot检测B19 VP2蛋白的表达情况。结果:重叠延伸PCR结合突变校正方法,最终得到密码子优化的B19 VP2编码区;成功构建了两种原核表达载体,实现了目的蛋白的以包涵体形式高效表达;采用更换表达载体和表达细胞等多种实验方案,未能实现VP2蛋白的可溶性表达;采用变性条件下的阴离子交换层析由包涵体得到纯化的VP2蛋白,多步透析、降低变性剂浓度复性得到部分可溶性蛋白。变性的纯化蛋白免疫动物,得到抗B19VP2的兔IgG,并进行辣根过氧化物酶标记。另外,成功构建了携带B19 VP2基因的重组腺病毒,在其感染的293细胞能够检测到B19 VP2的表达,但其表达量低,不足以形成病毒样颗粒（VLP）或用于蛋白纯化。结论:采用多种实验方案成功表达了VP2,但未能获得B19 VP2形成的VLP;通过包涵体变性-复性最终获得了可溶性VP2,并制备了HRP标记的兔抗B19 VP2 IgG,为建立检测人血清抗B19抗体的ELISA方法打下了基础。二、人细小病毒B19抗体检测方法的建立实验目的:建立人血清细小病毒B19抗体（IgG和IgM）检测的ELISA方法。方法:先以不同浓度人IgG包被ELISA板,确定辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG抗体的适宜稀释度;再以棋盘滴定的方法确定可溶性VP2使用浓度、人血清稀释度以及包被液的种类,建立检测人血清B19 IgG的间接ELISA方法。以可溶性VP2包被ELISA板,确定HRP标记兔抗VP2 IgG的使用稀释度;再以棋盘滴定的方法确定抗人IgM抗体的包被浓度和血清稀释度,建立捕获ELISA方法检测人血清抗B19 IgM抗体。最后利用建立的ELISA方法对355份孕妇和献血员的血清进行了检测,并以德国维润公司的人细小病毒B19 IgG/IgM定量检测试剂盒为对照,分析检测结果。结果:在人血清细小病毒B19 IgG抗体检测的ELISA建立中,确定了包被抗原VP2的浓度为5μg/ml,封闭液的成分为5%NCS的PBS,封闭时间为2h,山羊抗人IgG-HRP的稀释比例为1:10000;在人血清细小病毒B19 IgM抗体检测的ELISA建立中,确定了兔抗人IgM的包被浓度为5μg/ml,封闭液的成分为5%的NCS,抗原VP2的稀释比例为1:100,兔抗人VP2-HRP的稀释比例为1:6000。结论:初步建立了B19病毒人血清IgG或IgM抗体检测的ELISA方法。综上所述,我们合成了细小病毒B19衣壳蛋白VP2的基因编码区,并构建了原核表达载体,纯化制备了可溶性VP2蛋白;初步建立了人血清抗B19 IgG和IgM检测的ELISA方法,并对355份血清进行了实际检测。方法的可靠性还有待进一步评价。
田丽红[8]（2010）在《虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的原核表达及应用研究》文中进行了进一步梳理猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus,FPV）引起猫科动物以高热、呕吐、脱水、白细胞严重减少和出血性肠炎为主要特征的急性、高度接触性传染病。在自然条件下,FPV可感染虎、豹、狮、水貂、浣熊等多种食肉类动物,具有很高的致死率,严重威胁圈养及野生虎等大型猫科动物的养殖和保护,迫切需要建立能够同时大批量检测多种动物FPV感染的通用诊断方法。VP2蛋白为FPV主要结构蛋白,是FPV衣壳的主要成分,暴露在衣壳蛋白表面,为FPV的主要免疫保护性抗原蛋白,能诱导机体产生中和抗体,是研究FPV诊断抗原制备的首选对象。目前,尚未见有利用原核表达系统完整表达VP2基因的报道。本研究利用CRFK细胞对某东北某虎林园发生传染性出血性肠炎的老虎粪便进行了病毒的分离和鉴定,对分离的虎源FPV保护性抗原VP2蛋白全长基因进行克隆与遗传变异分析。在此基础上,利用原核表达载体PGEX-6P-1在BL21宿主菌中表达该基因。以表达的重组VP2蛋白作为抗原,通过建立检测家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA方法来研究2种属来源FPV VP2蛋白的抗原特性变化及该蛋白作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。基于VP2蛋白为检测FPV优势诊断抗原特性,利用纯化的重组VP2蛋白替代传统的全病毒成份作为诊断抗原,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的SPA作为广谱第二抗体,初步建立适用于2种猫科动物猫泛白细胞减少症血清抗体检测的SPA-ELISA方法。用建立的SPA-ELISA方法对临床30份猫血清样本、86份虎血清样本进行检测,同时与HI、间接ELISA方法进行比较。在此基础上,以纯化的重组VP2蛋白为免疫原,FPV全病毒作为筛选抗原,运用淋巴细胞杂交瘤技术,制备虎源FPV VP2蛋白特异性单克隆抗体。结果如下：利用CRFK细胞从老虎粪便中成功分离出强毒株FPV-HLJ2,测得该毒株VP2基因全长为1755个核苷酸,编码584个氨基酸。序列分析表明该病毒与虎源FPV-HLJ株核苷酸同源性为100%,实为同一毒株。利用原核表达系统实现了虎源FPVVP2基因的表达,SDS-PAGE和Western blot显示表达产物以包涵体形式存在,大小约为84 ku,并具有抗原性。其中目的蛋白58 ku, GST标签蛋白26ku。在家猫猫泛白细胞减少症间接ELISA抗体检测法的应用中,该外源表达蛋白亦显示出很好的抗原特异性,VP2蛋白上一些位点氨基酸的变异并未影响FPV抗原性,表达的重组VP2蛋白可以作为诊断抗原用于家猫FPV抗体的间接ELISA检测,初步证明该蛋白具有作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。以纯化的重组VP2蛋白替代传统的全病毒成份作为诊断抗原,建立了SPA-ELISA方法,确定了检测2种猫科动物FPV抗体的SPA-ELISA最佳操作程序,批内及批间重复试验均显示变异系数小于10%。对临床30份猫血清样本、86份虎血清样本的对比检测结果显不,SPA-ELISA方法检出率较高,大于HI法的检出率,与间接ELISA法接近。三种检测方法检测猫血清的总体符合率为96.7%。在虎血清检测中,SPA-ELISA方法的阳性检出率亦高于HI方法,二者总体符合率为94.2%。以重组VP2蛋白作为免疫抗原,用FPV全病毒作为筛选抗原,采用传统的杂交瘤技术,经过间接ELISA方法筛选和有限稀释法亚克隆,最终获得了1株可稳定分泌虎源FPVVP2蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C4。间接ELISA方法测定3C4株单抗腹水效价为1：12800,亚类鉴定为IgG2a类型,间接免疫荧光鉴定试验显示,该株单抗能使接种虎源FPV的CRFK细胞产生亮绿色荧光,而免疫印迹试验显示该株单抗未见特异性反应带。本研究初步明确了2种属来源的FPV抗原性差异,实现了FPV VP2蛋白的初步实践应用。基于FPV VP2蛋白建立的SPA-ELISA诊断方法,解决了目前虎等猫科动物FPV抗体检测方法非常单一、不能大批量检测等问题,有望用于豹、狮、熊猫、豹猫、浣熊、水貂、猞猁等更多种类动物血清猫泛白细胞减少症病毒抗体的检测。对实现适用于更多种圈养及野生猫科动物等猫瘟热病的快速诊断、疫情监测、流行病学调查和免疫抗体效价测定具有重要意义。基于FPV VP2蛋白制备的FPV VP2蛋白特异性单克隆抗体,为FPV、CPV和MEV诊断及分子生物学研究提供一种更为敏感和特异的试剂。
许东亮,张国成,聂晓晶,李志宏,孙新,张学红[9]（2009）在《人细小病毒B19VP1蛋白表达及检测特异性抗体临床应用研究》文中进行了进一步梳理目的探讨检测人细小病毒B19IgM和IgG抗体国产试剂的敏感性、特异性以及诊断准确度,探讨其临床应用价值。方法标本来源为2006年5月至2008年6月第四军医大学西京医院收治的心肌炎、血液病、呼吸道感染等患儿165例,用重组质粒VP1-PQE30,转化大肠埃希菌M15,测序正确后发酵培养,IPIG诱导表达,通过SDS-PAGE及蛋白质印迹分析表达产物,表达蛋白经AKTAexplorer100快速纯化系统纯化。经滴定选择最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释度,建立表达蛋白ELISA检测人细小病毒B19抗体方法,探讨其实用性。结果用表达纯化蛋白抗原建立的ELISA方法与腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒的抗体阳性血清无交叉反应。其检测B19IgM和IgG的敏感性分别为87.50%、89.28%,特异性分别为90.34%、90.90%,诊断准确度为97.01%、95.54%。两种方法有较好的一致性。结论用国产的表达纯化B19病毒VP1蛋白,所建立的表达蛋白ELISA方法,检测人细小病毒B19IgM、IgG抗体,有较好的敏感性、特异性和诊断准确度。方法方便快捷、成本低,值得进一步深入研究、推广应用。
邹小辉,董流昕,宋敬东,屈建国,于修平,鲁茁壮,洪涛[10]（2009）在《人细小病毒B19病毒样颗粒的制备》文中研究指明采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒（VLPs）。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。
二、抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体的建立（论文提纲范文）
（1）猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRAC T |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 细小病毒宿主互作蛋白研究进展 |
| 1.1 细小病毒概述 |
| 1.1.1 细小病毒分子生物学特征 |
| 1.1.2 细小病毒感染与复制机制 |
| 1.2 细小病毒宿主互作蛋白研究进展 |
| 1.2.1 STAT5 |
| 1.2.2 p53 |
| 1.2.3 细胞生长受体因子结合蛋白2 |
| 1.2.4 磷脂酰肌醇3-激酶样激酶家族蛋白 |
| 1.2.5 MCM家族蛋白 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪细小病毒VP2 和NS1 多克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株、毒株和菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PPV增殖 |
| 2.2.2 PPV鉴定 |
| 2.2.3 PPV病毒粒子的纯化及鉴定 |
| 2.2.4 PPV滴度测定 |
| 2.2.5 重组质粒p ET-32a-ns1s的构建与鉴定 |
| 2.2.6 NS1S重组蛋白的原核表达及鉴定 |
| 2.2.7 NS1S重组蛋白的纯化效果鉴定 |
| 2.2.8 VP2 与NS1 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.9 VP2 与NS1 多克隆抗体效价检测 |
| 2.2.10 VP2 与NS1 多克隆抗体特异性检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PPV的增殖与鉴定 |
| 2.3.2 PPV病毒粒子纯化效果检测 |
| 2.3.3 PPV滴度测定 |
| 2.3.4 NS1 抗原表位预测 |
| 2.3.5 重组质粒p ET-32a-ns1s的构建与鉴定 |
| 2.3.6 NS1S重组蛋白的表达鉴定 |
| 2.3.7 NS1S重组蛋白最佳诱导表达条件的筛选 |
| 2.3.8 NS1S重组蛋白的纯化 |
| 2.3.9 VP2 与NS1 多克隆抗体的效价检测 |
| 2.3.10 VP2 与NS1 多克隆抗体的特异性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪细小病毒感染对宿主细胞DNA和自身复制影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株和毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Real-time PCR检测PPV拷贝数 |
| 3.2.2 Real-time PCR检测PPV感染后细胞DN A复制水平的变化 |
| 3.2.3 Co-IP检测PPV感染后MCM3 与组蛋白H3 的互作 |
| 3.2.4 Ch IP检测PPV感染对MCM3 与细胞DNA复制起始位点结合的影响 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PPV感染PK-15 细胞后病毒拷贝数显着增加 |
| 3.3.2 PPV感染显着抑制PK-15 细胞DNA的复制 |
| 3.3.3 PPV感染显着降低MCM3 与组蛋白H3 的互作 |
| 3.3.4 PPV感染显着降低MCM3 与宿主细胞DNA复制起始位点的结合 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猪细小病毒VP2 与宿主蛋白MCM3 对病毒复制的影响及机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞株、毒株和菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 westernblotting检测PPV感染对PK-15 细胞MCM3 表达及磷酸化的影响 |
| 4.2.2 筛选PPV感染过程中调控MCM3 磷酸化的病毒蛋白 |
| 4.2.3 Co-IP检测MCM3 磷酸化对VP2与MCM3 互作的影响 |
| 4.2.4 Co-IP检测MCM3 磷酸化对MCM3 与组蛋白H3 互作影响 |
| 4.2.5 MCM3 160 位点突变质粒pCI-Flag-mcm3~(T160A)的构建及鉴定 |
| 4.2.6 过表达MCM3及MCM3~(T160A)的PK-15 细胞系的构建和鉴定 |
| 4.2.7 过表达MCM3及MCM3~(T160A)的PK-15 细胞系的细胞活性检测 |
| 4.2.8 Real-time PCR检测病毒DNA拷贝数 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PPV感染显着降低PK-15 细胞MCM3 160 位苏氨酸的磷酸化 |
| 4.3.2 NS1 能够显着抑制MCM3 160 位苏氨酸的磷酸化 |
| 4.3.3 MCM3 磷酸化水平降低显着促进VP2与MCM3 的互作 |
| 4.3.4 MCM3 磷酸化水平降低显着抑制MCM3与组蛋白H3 的互作 |
| 4.3.5 MCM3 160 位苏氨酸位点突变质粒pCI-Flag-mcm3~(T160A)的构建及鉴定 |
| 4.3.6 过表达MCM3及MCM3T160A的 PK-15 细胞系的构建 |
| 4.3.7 MCM3 160 位苏氨酸突变能够促进PPV的复制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）大熊猫源细小病毒病毒样颗粒的构建与免疫原性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 VP2基因的引物设计及PCR扩增 |
| 1.3 重组供体质粒及穿梭质粒的构建 |
| 1.4 重组杆状病毒的拯救 |
| 1.5 间接免疫荧光鉴定 |
| 1.6 SDS-PAGE及Western blot检测 |
| 1.7 电镜观察 |
| 1.8 血凝检测 |
| 1.9 动物免疫试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 转移载体的构建 |
| 2.2 重组杆粒rBacmid-Panda-dVP2的构建与鉴定 |
| 2.3 重组杆状病毒的拯救与鉴定 |
| 2.3.1 间接免疫荧光鉴定 |
| 2.3.2 SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.3 Western blot鉴定 |
| 2.3.4 电镜观察 |
| 2.3.5 血凝检测 |
| 2.4 动物免疫结果 |
| 3 讨论 |
（3）宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 NPM蛋白家族 |
| 1.1.2 Hsp家族成员 |
| 1.1.3 组蛋白分子伴侣 |
| 1.1.4 MCM家族成员 |
| 1.1.5 STAT家族成员 |
| 1.1.6 TRIM家族成员 |
| 1.1.7 波形蛋白 |
| 1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制 |
| 1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制 |
| 1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 2.1.2 载体及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对 |
| 2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 试验动物及分组设计 |
| 2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测 |
| 2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.5 STAT5序列比对分析 |
| 2.3.6 NPM1序列比对分析 |
| 2.3.7 DNAJB6序列比对分析 |
| 2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化 |
| 2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及菌种 |
| 3.1.2 载体、主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 stat5原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响 |
| 3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域 |
| 3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作 |
| 3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作 |
| 3.3.4 干扰stat5 表达显着抑制 PCV2 的复制 |
| 3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定 |
| 3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域 |
| 3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 4.1.2 载体和主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响 |
| 4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响 |
| 4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1 |
| 4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建 |
| 4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作 |
| 4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平 |
| 4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响 |
| 4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定 |
| 4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作 |
| 4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域 |
| 4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 5.1.2 载体和主要试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数 |
| 5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况 |
| 5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建 |
| 5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建 |
| 5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定 |
| 5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体 |
| 5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平 |
| 5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达 |
| 5.2.13 抑制试验 |
| 5.2.14 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达 |
| 5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位 |
| 5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作 |
| 5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域 |
| 5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定 |
| 5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制 |
| 5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制 |
| 5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成 |
| 5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）犬细小病毒基因工程抗体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 基因工程抗体 |
| 1.1.1 嵌合抗体 |
| 1.1.2 改型抗体 |
| 1.1.3 全人源抗体 |
| 1.1.4 单链抗体 |
| 1.1.5 双特异性抗体 |
| 1.2 基因工程抗体的制备 |
| 1.2.1 抗体基因的重组及表达 |
| 1.2.2 基因工程抗体表达系统 |
| 1.3 犬细小病毒的研究进展 |
| 1.3.1 犬细小病毒编码的蛋白质及其功能 |
| 1.3.2 犬细小病毒的致病机制 |
| 1.3.3 犬细小病毒的流行情况 |
| 1.3.4 犬细小病毒的现有疫苗 |
| 1.3.5 犬细小病毒的治疗研究进展 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 病毒与细胞 |
| 2.2 主要溶液及配制方法 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 杂交瘤细胞株的鉴定 |
| 2.3.2 鼠源CPV基因工程抗体的制备 |
| 2.3.3 表达蛋白鼠源CPV基因工程抗体的活性鉴定 |
| 2.3.4 悬浮细胞表达鼠源CPV基因工程抗体 |
| 2.3.5 鼠源CPV基因工程抗体表达量检测 |
| 2.3.6 鼠源CPV基因工程抗体纯化 |
| 2.3.7 SDS-PAGE检测鼠源CPV基因工程抗体 |
| 2.3.8 间接免疫荧光检测鼠源CPV基因工程抗体 |
| 2.3.9 犬源化CPV基因工程抗体的制备 |
| 2.3.10 表达蛋白犬源化CPV基因工程抗体的活性鉴定 |
| 2.3.11 悬浮细胞表达犬源化CPV基因工程抗体 |
| 2.3.12 犬源化CPV基因工程抗体纯化 |
| 2.3.13 SDS-PAGE及 Western-blot检测犬源化CPV基因工程抗体 |
| 2.3.14 犬源化CPV基因工程抗体表达量检测 |
| 2.3.15 间接免疫荧光检测犬源化CPV基因工程抗体 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 杂交瘤细胞株的鉴定 |
| 3.1.1 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.1.2 单克隆抗体相对亲和力测定 |
| 3.1.3 单克隆抗体特异性测定 |
| 3.2 鼠源CPV基因工程抗体的制备 |
| 3.2.1 鼠源CPV基因工程抗体可变区序列的获得 |
| 3.2.2 鼠源抗体可变区序列分区 |
| 3.2.3 鼠源CPV基因工程抗体真核表达载体鉴定 |
| 3.3 表达鼠源CPV基因工程抗体的活性研究 |
| 3.3.1 血凝抑制检测 |
| 3.3.2 中和试验检测 |
| 3.4 鼠源CPV基因工程抗体表达量检测 |
| 3.5 SDS-PAGE检测鼠源CPV基因工程抗体 |
| 3.6 间接免疫荧光检测鼠源CPV基因工程抗体 |
| 3.7 犬源化CPV基因工程抗体表达载体构建鉴定 |
| 3.8 表达犬源化CPV基因工程抗体的活性研究 |
| 3.8.1 血凝抑制检测 |
| 3.8.2 中和实验检测 |
| 3.9 犬源化CPV基因工程抗体纯化 |
| 3.10 SDS-PAGE及 Western-blot检测犬源化CPV基因工程抗体 |
| 3.11 犬源化CPV基因工程抗体蛋白纯度分析 |
| 3.12 间接免疫荧光检测犬源化CPV基因工程抗体 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 论文中提出的新方法和新思路 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（5）猪伪狂犬病毒UL19基因原核表达及单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文和符号清单 |
| 文献综述 |
| 1.1 伪狂犬病 |
| 1.2 伪狂犬病毒基因组结构 |
| 1.3 生物学特性 |
| 1.4 伪狂犬病毒主要蛋白及功能 |
| 1.5 流行病学 |
| 1.6 诊断技术 |
| 1.7 预防措施 |
| 1.8 单克隆抗体的研究进展 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体、菌株及试剂盒 |
| 1.1.2 主要试剂及配置 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 病毒、细胞和实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 伪狂犬病毒重组UL19基因的原核表达 |
| 1.2.2 间接ELISA方法的初步建立 |
| 1.2.3 伪狂犬病毒UL19蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 UL19蛋白的原核表达结果 |
| 2.1.1 目的基因的扩增及鉴定结果 |
| 2.1.2 重组质粒的构建及鉴定结果 |
| 2.1.3 重组质粒的表达纯化及鉴定结果 |
| 2.2 间接ELISA方法初步的优化结果 |
| 2.2.1 抗原浓度及一抗稀释度的最佳优化结果 |
| 2.2.2 抗原最佳包被时间的优化结果 |
| 2.2.3 最佳封闭液及最佳封闭时间的确定 |
| 2.2.4 血清反应时间的优化结果 |
| 2.2.5 酶标二抗稀释度及反应条件的优化结果 |
| 2.2.6 显色温度与时间的优化结果 |
| 2.2.7 间接ELISA方法临界值的确定 |
| 2.2.8 重复性试验结果 |
| 2.2.9 特异性试验结果 |
| 2.3 伪狂犬病毒UL19蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.3.1 免疫小鼠血清效价的测定结果 |
| 2.3.2 细胞融合及融合细胞筛选结果 |
| 2.3.3 腹水中单克隆抗体效价测定 |
| 2.3.4 单克隆抗体特异性鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）人细小病毒B19 VP1独特区蛋白对心肌细胞的影响及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 B19 病毒 VP1u 蛋白纯化及单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 附图 |
| 实验二 B19 病毒 VP1u 蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 附图 |
| 实验三 B19 病毒 VP1u 蛋白致正常鼠心脏病变的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 附图 |
| 实验四 B19 病毒 VP1u 蛋白对胎鼠心脏的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 附图 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）人细小病毒B19抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 文献综述 |
| 1. 细小病毒B19 的生物学特性 |
| 2. 细小病毒B19 的流行病学及临床表现 |
| 3. B19 病毒的检测 |
| 4. 国内外研究现状 |
| 第一部分 B19 病毒VP2 蛋白的制备 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 B19 病毒VP2 蛋白的原核表达 |
| 2.1.1 质粒pMD-VP2N 中VP2 基因密码子的优化 |
| 2.1.2 原核表达载体的构建 |
| 2.1.3 VP2 蛋白的原核表达 |
| 2.1.4 SDS-PAGE 及Western blotting 鉴定VP2 蛋白的表达 |
| 2.1.5 VP2 蛋白的纯化 |
| 2.1.6 VP2 蛋白的复性 |
| 2.2 B19 病毒VP2 蛋白的真核表达 |
| 2.2.1 携带VP2 基因的真核表达载体Ad5-VP2 的构建 |
| 2.2.2 VP2 在293 细胞中的表达及鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 VP2 基因密码子的优化 |
| 3.2 合成的opt-VP2 基因中突变碱基的修复 |
| 3.3 原核表达载体的构建 |
| 3.3.1 pET30a(+)-VP2 质粒的构建 |
| 3.3.2 pET44a(+)-VP2 质粒的构建 |
| 3.4 VP2 蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.4.1 不含His 标签的VP2 蛋白的表达及纯化 |
| 3.4.2 含His 标签的VP2 蛋白的表达及纯化 |
| 3.5 VP2 蛋白的复性 |
| 3.6 穿梭质粒shuttle-VP2 的构建 |
| 3.7 重组腺病毒Ad5-VP2 的制备 |
| 3.8 重组腺病毒Ad5-VP2 的制备及VP2 在293 细胞中的表达及鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二部分 人细小病毒B19 抗体检测方法的初步建立 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 血清中B19 IgG 检测方法的初步建立 |
| 2.1.1 实验条件的确定 |
| 2.1.2 IgG 抗体检测方法的建立 |
| 2.2 血清中B19 IgM 检测方法的初步建立 |
| 2.2.1 实验条件的确定 |
| 2.2.2 IgM 抗体检测方法的建立 |
| 3. 结果 |
| 3.1 血清中B19 IgG 检测方法的初步建立 |
| 3.1.1 山羊抗人IgG-HRP 稀释比例的确定 |
| 3.1.2 抗原包被浓度及封闭液成分的确定 |
| 3.1.3 IgG 抗体检测方法的建立 |
| 3.2 血清中B19 IgM 检测方法的初步建立 |
| 3.2.1 兔抗人VP2-HRP 的稀释比例进行确定 |
| 3.2.2 IgM 抗体检测方法的建立 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的原核表达及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景(或引言) |
| 1.2 猫泛白细胞减少症病毒研究概况 |
| 1.2.1 病毒演化及分类学地位 |
| 1.2.2 FPV的形态学特征及理化学性质 |
| 1.2.3 FPV的细胞嗜性及其体外培养 |
| 1.2.4 FPV基因组结构 |
| 1.2.5 FPV基因组的复制与转录 |
| 1.2.6 FPV编码蛋白 |
| 1.3 猫泛白细胞减少症研究概况 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.3.3 诊断 |
| 1.3.4 防制 |
| 1.4 葡萄球菌A蛋白研究概况 |
| 1.4.1 SPA生物学特性 |
| 1.4.2 SPA应用 |
| 1.5 单克隆抗体在细小病毒研究上的应用 |
| 1.5.1 单克隆抗体概述 |
| 1.5.2 单克隆抗体在肉食兽细小病毒研究上的应用 |
| 1.6 课题研究的目的和意义 |
| 2 虎源猫泛白细胞减少症病毒的分离和鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株及菌株 |
| 2.1.2 病料 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂及其配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 金标记FPV试纸条检测 |
| 2.2.2 病毒分离 |
| 2.2.3 毒株的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离 |
| 2.3.2 血凝试验 |
| 2.3.3 电镜试验 |
| 2.3.4 VP2基因序列测定 |
| 2.3.5 人工感染幼猫试验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 病毒的分离 |
| 2.4.2 病毒的鉴定 |
| 2.5 本章小节 |
| 3 虎源FPV VP2基因的原核表达及其抗原特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 质粒载体与菌种 |
| 3.1.3 抗体和血清 |
| 3.1.4 主要试剂及其配制 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 VP2基因原核表达载体(PGEX-6P-VP2)的构建 |
| 3.2.2 重组VP2蛋白的诱导表达 |
| 3.2.3 重组VP2蛋白的纯化 |
| 3.2.4 重组VP2蛋白的Western blot分析 |
| 3.2.5 纯化重组VP2蛋白抗原特性研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 虎源FPV VP2基因原核表达载体的构建和鉴定 |
| 3.3.2 重组VP2蛋白的诱导表达 |
| 3.3.3 诱导表达条件的优化 |
| 3.3.4 表达产物的可溶性分析 |
| 3.3.5 重组VP2蛋白的纯化 |
| 3.3.6 纯化重组VP2蛋白Western blot分析 |
| 3.3.7 纯化重组VP2蛋白抗原特性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 表达基因的选择 |
| 3.4.2 表达载体的选择 |
| 3.4.3 VP2蛋白纯化 |
| 3.4.4 VP2蛋白抗原特性研究 |
| 3.4.5 纯化重组蛋白中的E.coli菌体成分 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 检测二种猫科动物猫瘟热抗体SPA-ELISA方法的建立及应用研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 抗体和血清 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 虎抗FPV阳性血清的制备 |
| 4.2.2 SPA-ELISA方法的建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 虎抗FPV阳性血清的制备 |
| 4.3.2 SPA-ELISA方法的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于FPV检测法 |
| 4.4.2 SPA-ELISA结果判定标准的确定 |
| 4.4.3 SPA-ELISA试验条件优化 |
| 4.4.4 ELISA操作规范 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 虎源FPV VP2蛋白特异性单克隆抗体的制备 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 免疫抗原、检测抗原及细胞系 |
| 5.1.2 抗体和血清 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 主要试剂及其配制 |
| 5.1.5 主要设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 动物免疫 |
| 5.2.2 单克隆抗体筛选方法的建立 |
| 5.2.3 饲养细胞的制备 |
| 5.2.4 骨髓瘤细胞的复苏与培养 |
| 5.2.5 脾细胞的制备 |
| 5.2.6 细胞融合 |
| 5.2.7 融合细胞的检测 |
| 5.2.8 阳性细胞的克隆 |
| 5.2.9 细胞冻存 |
| 5.2.10 细胞复苏 |
| 5.2.11 单克隆抗体腹水的制备 |
| 5.2.12 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 免疫小鼠血清抗体效价 |
| 5.3.2 ELISA检测抗原最佳包被浓度的确定 |
| 5.3.3 细胞融合与杂交瘤细胞株的建立 |
| 5.3.4 单抗腹水效价的测定和亚型鉴定 |
| 5.3.5 间接免疫荧光(IFA)鉴定试验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 免疫抗原的制备 |
| 5.4.2 单克隆抗体筛选方法的建立 |
| 5.4.3 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 |
| 5.4.4 关于单抗制备影响因素 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）人细小病毒B19VP1蛋白表达及检测特异性抗体临床应用研究（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 HPV B19 VP1蛋白表达 |
| 1.4 HPVB19 VP1蛋白纯化 |
| 1.5 HPVB19 VP1蛋白的包被浓度测定 |
| 1.6 病毒的特异性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 HPVB19 Ig M的检测结果 |
| 2.2 HPVB19 Ig G的检测结果 |
| 2.3 表达蛋白ELISA对病毒的特异性检测结果 |
| 3 讨论 |
（10）人细小病毒B19病毒样颗粒的制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料及试剂 |
| 1.2 VP2基因的合成 |
| 1.3 重组杆状病毒表达载体Bacmid-VP2的构建 |
| 1.4 重组杆状病毒rBac-VP2的制备及病毒滴度测定 |
| 1.5 VP2在Sf9细胞中的表达与鉴定 |
| 1.6 B19 VLPs的初步分离及电镜观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 携带VP2基因的重组杆状病毒的制备 |
| 2.2 B19 VP2蛋白在昆虫细胞中的表达 |
| 2.3 VLPs的初步纯化及电镜观察 |
| 3 讨论 |
四、抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体的建立（论文参考文献）
- [1]猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究[D]. 邵婷. 西北农林科技大学, 2021
- [2]大熊猫源细小病毒病毒样颗粒的构建与免疫原性[J]. 焦翠翠,金宏丽,冯娜,黄培,刘迪,李丽娜,赵健,王倩,丁秋雨,杨松涛,夏咸柱,石晶,王化磊. 中国兽医学报, 2021(01)
- [3]宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究[D]. 韩聪. 西北农林科技大学, 2020
- [4]犬细小病毒基因工程抗体的研究[D]. 李希辰. 长春工业大学, 2020(01)
- [5]猪伪狂犬病毒UL19基因原核表达及单克隆抗体的制备[D]. 吴以振. 安徽农业大学, 2019(04)
- [6]人细小病毒B19 VP1独特区蛋白对心肌细胞的影响及机制[D]. 聂晓晶. 第四军医大学, 2012(01)
- [7]人细小病毒B19抗体检测方法的建立[D]. 肖霞. 山东师范大学, 2011(08)
- [8]虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的原核表达及应用研究[D]. 田丽红. 东北林业大学, 2010(12)
- [9]人细小病毒B19VP1蛋白表达及检测特异性抗体临床应用研究[J]. 许东亮,张国成,聂晓晶,李志宏,孙新,张学红. 中国实用儿科杂志, 2009(10)
- [10]人细小病毒B19病毒样颗粒的制备[J]. 邹小辉,董流昕,宋敬东,屈建国,于修平,鲁茁壮,洪涛. 生物工程学报, 2009(04)