一、IGF-I对ISP损伤大鼠心肌ATP、ADP、AMP变化影响的实验研究（论文文献综述）
魏鲟钰[1]（2021）在《花椒麻味物质对2型糖尿病大鼠蛋白质代谢影响的机制研究》文中进行了进一步梳理截止到2019年,全球已有4.63亿人患有糖尿病,预计到2045年会增加到7亿人。2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）是一种由胰岛素分泌相对不足或胰岛素抵抗引发的一种慢性代谢性疾病,以持续高血糖为特点,易引发机体糖脂代谢、蛋白质代谢、矿物质和维生素代谢紊乱,或易引发炎症反应而导致骨骼肌萎缩。目前,口服降糖药物是提高机体胰岛素敏感性和降低高血糖最常见的方法,然而大多数口服降糖药物均有不同程度的副作用。因此,发现高效、低毒、可替代的治疗T2DM的天然新化合物已成为预防或治疗糖尿病的当务之急。花椒（Zanthoxylum bungeanum）属于芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum L.）,是我国传统的“八大调味品之一”。其中,酰胺类物质是花椒的主要呈味成分,也称为花椒麻味物质（Zanthoxylum alkylamides）。近年来研究表明花椒麻味物质具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎镇痛、降血糖、降低胆固醇以及麻醉等多种生理活性。近年来,有研究者将目光转向了花椒麻味物质在蛋白质代谢方面的影响上。已有证据表明,花椒麻味物质能够促进健康SD大鼠机体蛋白质合成,并改善1型糖尿病大鼠蛋白质代谢紊乱,然而,花椒麻味物质是否能够改善由T2DM造成的蛋白质代谢紊乱以及其潜在的作用机制尚不清楚。因此,本研究以高脂高糖饲料喂养并结合低剂量（40 mg/kg·bw）链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）腹腔注射诱导构建T2DM大鼠模型,并根据体重和空腹血糖随机分为5组（n=6）:（1）模型对照组（Diabetes model group,DM）:灌胃相同体积大豆食用油;（2）二甲双胍阳性对照组（Metformin group,ME）:灌胃135 mg/kg·bw二甲双胍;（3）低剂量组（Low-dose group,LDG）:灌胃2 mg/kg bw花椒麻味物质;（4）中剂量组（Medium-dose group,MDG）:灌胃4 mg/kg·bw花椒麻味物质;（5）高剂量花椒麻味物质组（High-dose group,HDG）:灌胃8 mg/kg·bw花椒麻味物质;并以普通标准饲料喂养的正常大鼠作为空白对照组（Control normal,CN）,灌胃相同体积的大豆食用油。实验周期为28 d,实验期间每周测定实验大鼠体重和空腹血糖,实验结束后,采集大鼠血浆、空肠、肝脏和骨骼肌等组织,测定血浆生理生化指标并从分子水平上探讨花椒麻味物质对T2DM大鼠蛋白质代谢的影响以及其潜在的作用机制,为探寻治疗T2DM的天然药物提供科学依据。其主要研究结果如下:（1）花椒麻味物质对T2DM大鼠机体基础生理生化指标的影响实验表明,与DM组相比,花椒麻味物质能够显着抵抗由于T2DM而导致的T2DM大鼠体重的下降（p<0.01）,并显着改善由T2DM引发的肝脏和肾脏肿大;呈剂量依赖性地显着降低T2DM大鼠高血糖症状并提高胰岛素敏感性;显着降低（p<0.05）T2DM大鼠血浆甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量,显着增加（p<0.05）高密度脂蛋白胆固醇含量,效果以高剂量花椒麻味物质和二甲双胍最佳;显着增加（p<0.05）T2DM大鼠血浆总蛋白（Total protein,TP）和白蛋白（Albumin,ALB）水平,显着降低（p<0.05）球蛋白（Globulin,GPs）水平,但对白蛋白/球蛋白水平影响效果不显着（p>0.05）;呈剂量依赖性地显着降低（p<0.05）T2DM大鼠血浆尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）和肌酐（Creatinine,Cr）水平,作用效果同样以高剂量和二甲双胍最佳;显着增加（p<0.01）T2DM大鼠血浆C肽和胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor 1,IGF-1）水平;显着降低（p<0.05）T2DM大鼠血浆游离三碘甲状腺原氨酸（Free triiodothyronine,FT3）和血浆游离甲状腺素（Free thyroxine,FT4）水平,显着增加（p<0.05）血浆白脂素（Asprosin,ASP）水平;显着降低（p<0.05）T2DM大鼠血浆促炎因子（IL-6,CRP）水平并增加抗炎因子（IL-10,ADP）水平;显着降低（p<0.05）T2DM大鼠肝脏谷草转氨酶（Glutamic oxalacetic transaminase,AST）和谷丙转氨酶（Glutamic pyruvic transaminase,ALT）活性;显着增加（p<0.01）T2DM大鼠粪便中6种短链脂肪酸含量。综上,花椒麻味物质和二甲双胍相似,能够改善T2DM大鼠体重下降和高血糖症状,提高胰岛素敏感性并改善胰岛素抵抗。此外,T2DM大鼠中作为蛋白质代谢诊断标志物（TP、BUN、Cr、胰岛素、IGF-1等）和能量代谢诊断标志物（FT3、FT4、ASP、短链脂肪酸等）的水平发生了紊乱,而花椒麻味物质能够有效改善这一症状且该作用呈现剂量效应,表明花椒麻味物质能够作为改善T2DM大鼠蛋白质代谢的潜在物质,且高剂量花椒麻味物质与二甲双胍作用相似。（2）花椒麻味物质对T2DM大鼠血浆以及组织内氨基酸含量及氨基酸运载体m RNA的影响采用柱前衍生高效液相色谱法测定T2DM大鼠血浆、空肠、肝脏和骨骼肌内氨基酸水平,并通过实时荧光定量PCR技术探究不同组织内基酸运载体的基因表达量。实验表明,谷氨酸（Glutamate,Glu）和丙氨酸（Alanine,Ala）是造成T2DM大鼠血浆、空肠和肝脏中氨基酸水平显着差异的主要成分,而组氨酸（Histidine,His）、脯氨酸（Proline,Pro）、苏氨酸（Threonine,Thr）、缬氨酸（Valine,Val）和胱氨酸（Cystine）则是造成T2DM大鼠骨骼肌氨基酸水平显着差异的主要成分。与DM组相比,二甲双胍和花椒麻味物质能够显着降低（p<0.05）T2DM大鼠血浆中Glu和支链氨基酸（Branched chain amino acid,BCAA）等氨基酸水平;显着降低（p<0.05）T2DM大鼠空肠BCAA、蛋氨酸（Methionine,Met）和半胱氨酸（Cysteine,Cys）等氨基酸水平并增加谷氨酰胺（Glutamine,Gln）、Ala和甘氨酸（Glycine,Gly）等氨基酸水平;显着降低（p<0.05）T2DM大鼠肝脏BCAA、Val、Met和Glu等氨基酸水平,而显着增加（p<0.05）Ala和Gln等氨基酸水平;显着降低（p<0.05）T2DM大鼠骨骼肌BCAA、亮氨酸（Leucine,Leu）、Cystine和Thr等氨基酸水平并增加Gln、Cys和Gly等氨基酸水平。花椒麻味物质和二甲双胍还能显着上调（p<0.05）T2DM大鼠空肠中碱性氨基酸运载体(b0,+LAT、CAT1和y+LAT1)以及以及肝脏中CAT2 m RNA相对表达,与之对应的,在血浆、空肠和肝脏中,其所转运的氨基酸（Arg、Ala、Asn、Gln等）水平也均有不同程度的改善;显着下调（p<0.05）T2DM大鼠空肠中中性氨基酸运载体LAT1mRNA相对表达量并显着上调（p<0.05）T2DM大鼠空肠和骨骼肌中SNAT2 m RNA相对表达量,相应的,T2DM大鼠血浆以及各组织中中性氨基酸水平也有所改善;显着上调（p<0.05）T2DM大鼠空肠和骨骼肌中PAT1 mRNA相对表达量,调节了Pro、Ala、Gly、Ser等水平的异常。综上,T2DM大鼠机体内血浆和各组织内氨基酸水平的紊乱是由不同氨基酸主导的,花椒麻味物质能够调控T2DM大鼠空肠、肝脏和骨骼肌中氨基酸运载的表达进而促进氨基酸的转运,进一步提示花椒麻味物质可能是改善T2DM大鼠蛋白质代谢的潜在物。其中,高剂量花椒麻味物质作用效果与二甲双胍最相近。（3）花椒麻味物质对T2DM大鼠蛋白质合成代谢的影响实验表明,花椒麻味物质能够显着上调（p<0.05或p<0.01）T2DM大鼠肝脏和骨骼肌中IGF-1、IGF-IR、PI3K、Akt和m TORmRNA相对表达量;显着上调（p<0.05或p<0.01）T2DM大鼠骨骼肌PI3Kp85、PI3Kp110、p-Akt、p-TOR蛋白相对表达量以及增加p-Akt/Akt和p-m TOR/mTOR比值。此外,花椒麻味物质同样能够显着上调（p<0.05或p<0.01）T2DM大鼠骨骼肌AMPK、PPARγ和GLUT4 m RNA相对表达量,显着上调（p<0.05或p<0.01）p-AMPK、PPARγ和GLUT4蛋白相对表达量以及增加p-AMPK/AMPK比值。结果提示:花椒麻味物质能够上调IGF-1,IGF-1的表达进而上调PI3K表达量,促进下游信号因子Akt磷酸化活化,从而上调mTOR表达,最终促进蛋白质合成;同时通过促进AMPK磷酸化活化,进而调控GLUT4转运,促进骨骼肌葡萄糖转运进而改善能量代谢,最终改善蛋白质合成代谢;上调PPARγ表达,进而改善能量代谢,但其具体机制还需深入探究。（4）花椒麻味物质对T2MD大鼠蛋白质分解代谢的影响实验表明,花椒麻味物质能够显着下调（p<0.05或p<0.01）T2DM大鼠骨骼肌Fox O1、Fox O3a,MuRF1,MAFbx,TNF-α和NFκBmRNA相对表达量;显着下调（p<0.05或p<0.01）T2DM大鼠骨骼肌FoxO1、FoxO3a,MuRF1,MAFbx,TNF-α,p-NFκB蛋白相对表达量以及p-NFκB/NFκB比值。结果提示:花椒麻味物质能够上调PI3K表达,促进Akt表达,从而下调FoxOs基因表达并下调E3泛素蛋白酶MuRF1和MAFbx表达,通过泛素蛋白酶系统抑制了蛋白质分解,改善蛋白质分解代谢;下调了TNF-α表达,抑制MSTN表达进而上调MyoD表达,促进蛋白质合成;下调TNF-α表达,抑制NFκB活化,抑制炎症因子IL-6和CRP分泌,改善炎症,同时下调MuRF1和MAFbx表达,并通过泛素蛋白酶系统抑制了蛋白质分解。通过以上研究,本文得到如下结论:（1）花椒麻味物质能够改善T2DM大鼠体重下降趋势,降低高血糖,改善血浆胰岛素水平异常并增加IGF-1含量,激活Ins/IGF-1介导的PI3K/Akt/m TOR来促进T2DM大鼠骨骼肌蛋白质合成;促进AMPK以及PPARγ信号通路转导进而改善T2DM大鼠机体能量代谢,为蛋白质合成提供能量;（2）花椒麻味物质能够显着降低T2DM大鼠血浆炎症因子水平,通过抑制TNF-α/NFκB信号转导,抑制炎症反应的发生;抑制TNF-α/MSTN信号转导进而促进蛋白质合成;通过下调TNF-α/NFκB和PI3K/Akt/FoxOs途径转导,通过抑制泛素蛋白酶系统,抑制T2DM大鼠骨骼肌蛋白质分解,最终改善T2DM症状。
王文平[2]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中研究说明研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
史馨钰[3]（2020）在《左、右归丸对AMPK/mTOR介导的PMOP大鼠糖、脂代谢及能量代谢的实验研究》文中研究指明目的:本研究从中医学“阴阳互济”的理论出发,选用张景岳创立滋补肾阴的代表方剂左归丸和温补肾阳的代表方剂右归丸,通过研究左、右归丸对PMOP模型大鼠糖、脂代谢和能量代谢的影响,以及左、右归丸基于AMPK/m TOR信号通路对PMOP模型大鼠糖、脂代谢紊乱和能量代谢紊乱的防治作用,为“阴阳互济”理论指导防治PMOP女性绝经后代谢紊乱提供实验依据。材料与方法:本实验选取SPF级2月龄雌性未生育SD大鼠60只,体重在200220g,按照体重随机分层为空白组（KB）8只,假手术组（SHAM）8只,去卵巢模型组44只。去卵巢模型组采用双侧背部卵巢切除术制备模型,假手术组只切除卵巢周围与卵巢等大的部分脂肪组织,而空白组（KB）则不做任何处理。术后1周,因双侧背部卵巢切除术死亡的大鼠有4只,将成活的40只大鼠再次按体重随机分为去卵巢模型组（OVX）、左归丸组（ZGW）、右归丸组（YGW）、补佳乐组（BJL）,与原来的空白组（KB）和假手术组（SHAM）共计6组。各治疗组灌胃对应药物,KB组、SHAM组、OVX组灌胃蒸馏水。经过12周给药治疗后,剔除死亡大鼠和不符合纳入标准的大鼠8只。本实验共计纳入实验大鼠48只,每组各8只。各组大鼠在麻醉状态下进行左侧股骨骨密度检测,并采用剪尾取血的方法进行糖耐量检测。取材前24h禁食不禁水,末次给药2h后称重,并按0.3m L·100g-1的标准为各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液进行麻醉。待大鼠麻醉后进行腹主动脉取血,取得的血液静置2h后按2000r/min*20min来进行离心,将离心提取的血清分装于无菌EP管并置于﹣80℃冻存,待用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶;取大鼠左侧后肢胫骨近端1/3部分,仔细剥离胫骨附着的肌肉筋膜及结缔组织,固定并脱钙数周后制作石蜡切片,用于形态学HE检测;取大鼠新鲜肝脏后称量湿重,用于统计大鼠肝脏指数,再将肝脏前叶装于无菌EP管并置于﹣80℃冻存,用于形态学HE检测;取大鼠肩胛部棕色脂肪组织及腹后壁脂肪组织称量湿重,用于统计大鼠肩胛部棕色脂肪指数和腹后壁脂肪指数,并将肩胛部棕色脂肪组织置于4%多聚甲醛固定,用于形态学HE检测,将腹后壁脂肪组织装于无菌EP管并置于﹣80℃冻存,采用蛋白印迹法（WB）检测大鼠腹后壁脂肪组织AMPKα1、m-TORC1、p70S6k1的蛋白磷酸化表达情况,C/EBPα、C/EBPβ、TSC2、Rheb、4EBP1的蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR法检测大鼠腹后壁脂肪组织AMPKα1、m-TORC1的基因表达情况;采用高效液相色谱法（HPLC）检测大鼠腹后壁脂肪组织中ATP含量。结果:1.左、右归丸对去卵巢大鼠骨密度的影响与KB组比较,OVX组大鼠左侧股骨骨密度指数有所降低（P<0.05）;与OVX组比较,给药组大鼠左侧股骨骨密度指数均有所提高;与BJL组比较,ZGW组、YGW组的大鼠骨密度水平与之相近,差异无统计学意义,ZGW组较YGW组大鼠的骨密度指数高。2.左、右归丸对去卵巢大鼠骨组织形态学的影响实验结果表明,KB组和SHAM组大鼠左侧后肢胫骨近端骨髓腔内骨小梁数量较多、结构紧密、分布均匀,骨小梁较粗,形态完整,虽然排列也有不规则,但骨小梁之间彼此连接形成错综复杂的网状结构,且骨小梁之间的骨髓腔腔隙比较小;而OVX组大鼠左侧后肢胫骨近端骨小梁形态上与KB组有明显区别,骨小梁数量明显减少、结构稀疏、分布不均,骨小梁变细,表面较为光滑,出现断裂,彼此之间缺乏相互连接,甚至在局部出现空洞。ZGW组、YGW组、BJL组大鼠给药治疗12周后,骨小梁数目有不同程度增多,结构排列和组织形态逐渐与KB组接近,小梁间连接有所改善,且骨髓腔缩小。其中,ZGW组效果更明显。3.左、右归丸对去卵巢大鼠肝功能的影响与KB组比较,OVX组大鼠血清ALT、AST显着升高（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组均可降低血清ALT、AST（P<0.01）;与BJL组比较,ZGW组、YGW组无显着性差异（P>0.05）。4.左、右归丸对去卵巢大鼠肝脏指数及组织形态学的影响与KB组比较,OVX组大鼠肝脏指数升高（P<0.05或P<0.01）,ZGW组、YGW组、BJL组也有所升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组均可显着降低肝脏指数（P<0.01）;与BJL组比较,ZGW组和YGW组无显着性差异（P>0.05）。实验结果表明,KB组与SHAM组大鼠肝脏组织结构正常,肝细胞排列规整,且形态清晰;而OVX组肝脏组织肿胀,细胞形态不清晰,里面明显可见较多脂肪空泡,肝细胞结构变形,且排列层次可见稍有紊乱;ZGW组、YGW组、BJL组给药治疗12周后,大鼠肝脏组织的形态结构明显得到改善,肝细胞形态变得清晰,且排列变得规整。5.左、右归丸对去卵巢大鼠糖耐量的影响实验结果表明,各组大鼠空腹血糖无明显差异。与KB组比较,OVX组大鼠在灌胃50%葡萄糖溶液30min之后,血糖水平显着升高;灌胃60min时血糖下降速度明显减慢;120 min时血糖不能恢复到正常水平。ZGW组、YGW组、BJL组与KB组血糖变化趋势基本相同,只有OVX组出现明显糖耐量异常情况。各组大鼠AUC水平,与KB比较,OVX组大鼠AUC水平显着升高（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组大鼠AUC水平显着降低（P<0.01）;与BJL组比较,ZGW组、YGW组差异无统计学意义（P>0.05）,但ZGW组较YGW组大鼠的AUC水平低。6.左、右归丸对去卵巢大鼠血脂的影响与KB组比较,OVX组大鼠血清TC、TG、LDL-C显着升高（P<0.01）,OVX组血清HDL-C显着降低（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组均可降低血清TC、TG、LDL-C（P<0.05或P<0.01）、显着升高血清HDL-C（P<0.01）;ZGW组、YGW组、BJL组间差异无统计学意义（P>0.05）。7.左、右归丸对去卵巢大鼠体内脂肪分布的影响与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪指数显着升高（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组大鼠腹后壁脂肪指数显着降低（P<0.01）;与BJL组比较,ZGW组、YGW组大鼠腹后壁脂肪指数差异无统计学意义（P>0.05）,但YGW组效果更明显。各组大鼠肩胛部棕色脂肪指数差异无统计学意义（P>0.05）。8.左、右归丸对去卵巢大鼠棕色脂肪组织形态学的影响实验结果表明,KB组与SHAM组大鼠肩胛部棕色脂肪组织结构正常,脂肪细胞体积均匀、较小,形态清晰,排列规整且集中,颜色较深,呈现棕色;而OVX组脂肪细胞体积明显增大,且排列层次稍见紊乱,呈疏散状,颜色明显变浅,白色居多;ZGW组、YGW组、BJL组给药治疗12周后,大鼠肩胛部棕色脂肪组织形态结构明显改善,可见脂肪细胞排列更加规整且集中,颜色明显变深,呈现棕色。9.左、右归丸对去卵巢大鼠腹后壁脂肪组织C/EBPα、C/EBPβ蛋白表达的影响与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪C/EBPα、C/EBPβ蛋白表达显着升高（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组大鼠腹后壁脂肪C/EBPα、C/EBPβ蛋白表达显着降低（P<0.01）;与BJL组比较,ZGW组、YGW组腹后壁脂肪C/EBPα、C/EBPβ蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。10左、右归丸对去卵巢大鼠腹后壁脂肪组织ATP含量的影响与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪ATP含量显着降低（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组大鼠腹后壁脂肪ATP含量显着升高（P<0.01）;与BJL组比较,ZGW组大鼠腹后壁脂肪ATP含量差异无统计学意义（P>0.05）,YGW组大鼠腹后壁脂肪ATP含量差异不明显（P<0.05）;ZGW组与YGW组之间差异无统计学意义（P>0.05）。11.左、右归丸对去卵巢大鼠腹后壁脂肪组织AMPKα1基因与蛋白磷酸化表达影响与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪AMPKα1 m RNA表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组大鼠腹后壁脂肪AMPKα1 m RNA表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与BJL组比较,ZGW、YGW组大鼠腹后壁脂肪AMPKα1 m RNA表达的差异无统计学意义（P>0.05）。与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪AMPKα1磷酸化水平显着降低（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组大鼠腹后壁脂肪AMPKα1磷酸化水平显着升高（P<0.01）;与BJL组比较,ZGW组大鼠腹后壁脂肪AMPKα1磷酸化水平的差异无统计学意义（P>0.05）,YGW组大鼠腹后壁脂肪AMPKα1磷酸化水平升高不明显（P<0.05）。12.左、右归丸对去卵巢大鼠腹后壁脂肪组织m-TORC1基因与蛋白磷酸化表达影响与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪m-TORC1 m RNA表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组大鼠腹后壁脂肪m-TORC1m RNA表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与BJL组比较,ZGW、YGW组大鼠腹后壁脂肪m-TORC1 m RNA表达的差异无统计学意义（P>0.05）。与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪m-TORC1磷酸化水平显着升高（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组大鼠腹后壁脂肪m-TORC1磷酸化水平显着降低（P<0.01）;与BJL组比较,YGW组大鼠腹后壁脂肪m-TORC1磷酸化水平的差异无统计学意义（P>0.05）,YGW组大鼠腹后壁脂肪m-TORC1磷酸化水平降低更明显（P<0.05）。13.左、右归丸对去卵巢大鼠腹后壁脂肪组织p70S6k1蛋白磷酸化表达的影响与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪p70S6k1磷酸化水平显着升高（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组大鼠腹后壁脂肪p70S6k1磷酸化水平显着降低（P<0.01）;与BJL组比较,YGW组大鼠腹后壁脂肪p70S6k1磷酸化水平的差异无统计学意义（P>0.05）,YGW组大鼠腹后壁脂肪p70S6k1磷酸化水平降低更明显（P<0.05）。14.左、右归丸对去卵巢大鼠腹后壁脂肪组织TSC2、Rheb、4EBP1蛋白表达的影响与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪TSC2蛋白表达显着降低（P<0.01）;与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组大鼠腹后壁脂肪TSC2蛋白表达显着升高（P<0.01）;与BJL组比较,ZGW、YGW组大鼠腹后壁脂肪TSC2蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）。与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪Rheb蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组大鼠腹后壁脂肪Rheb蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与BJL组比较,ZGW、YGW组大鼠腹后壁脂肪Rheb蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）。与KB组比较,OVX组大鼠腹后壁脂肪4EBP1蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组大鼠腹后壁脂肪4EBP1蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与BJL组比较,ZGW、YGW组大鼠腹后壁脂肪4EBP1蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.大鼠去除双侧卵巢后,骨量丢失,骨组织形态结构破坏,出现高转换型骨代谢状态,成功复制了绝经后骨质疏松模型。同时,绝经后骨质疏松大鼠肝功能异常,糖耐量异常,体重增加,体脂分布发生改变,血脂显着升高。2.左、右归丸均能有效防治绝经后骨质疏松症,在一定程度上改善骨量丢失,减缓骨组织破坏;其中,左归丸稍优于右归丸和补佳乐。3.左、右归丸均能有效防治绝经后糖、脂代谢紊乱,在一定程度上缓解糖耐量异常情况,改善肝功能和血脂水平;其中,左、右归丸没有明显差异。4.左、右归丸均能通过干预AMPK/m TOR信号通路调节绝经后糖、脂代谢及能量代谢紊乱;其中,左、右归丸没有明显差异。5.“阳化气、阴成形”是机体能量与物质代谢的理论基础,而“阴阳互济”治法通过调节“阴阳平衡”来影响代谢平衡。
郭雨萱[4]（2020）在《PHLDA1在H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的机制研究》文中提出目的:在心血管疾病中,由于心肌缺血再灌注造成的死亡占很大比例。其中,在再灌注过程中,会观察到氧化应激损伤的产生。在缺血/再灌注模型中观察到,当系统无法在氧化剂分子的生产和利用之间建立平衡时,会产生氧化应激。氧化应激过程中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过量产生导致蛋白质,DNA和脂质损伤,引起细胞损伤。PHLDA1首先在T细胞受体激活诱导的细胞凋亡中被鉴定出来,目前的研究表明PHLDA1在不同的细胞种类和刺激下起到不同的作用,目前关于PHLDA1在氧化应激诱导的心肌细胞（H9c2）损伤和心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未报道。本研究主要探究PHLDA1在氧化应激诱导的心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的作用,以及PHLDA1通过结合Bax在氧化应激诱导的心肌细胞损伤中的作用机制。研究方法:1、培养H9c2心肌细胞,分别用不同浓度的H2O2处理细胞。CCK8实验观察细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡。用Western blot检测PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3,PARP1的表达水平。筛选合适药物浓度用于后续试验。300μM H2O2处理H9c2不同时间。Western blot检测PHLDA1蛋白的表达水平。筛选合适药物刺激时间用于后续试验。2、在H9c2细胞中转染Flag-PHLDA1质粒和对照组质粒,转染46h后300μM H2O2处理或者不处理H9c2 90min,CCK8实验观察细胞活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测Flag-PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3、PARP1的表达水平,JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的改变,ROS检测试剂盒检测细胞内ROS的改变。3、在H9c2心肌细胞中转染对照siRNA和PHLDA1 siRNA,300μM H2O2处理或者不处理H9c2 90min,CCK8实验观察细胞活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3、PARP1的表达水平,JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的改变,ROS检测试剂盒检测细胞内ROS的改变。4、对SD雄性大鼠进行尾静脉注射对照shRNA和PHLDA1 shRNA腺病毒,注射3周后分别进行单纯灌流（对照组）和缺血再灌注（IR）处理,HE染色检测心肌形态变化,TTC检测心肌梗死面积变化,TUNEL染色检测心肌凋亡率变化,Western blot检测PHLDA1和PARP1的表达水平,免疫组化检测caspase 3的表达水平。5、内外源免疫共沉淀实验检测PHLDA1与Bax结合,并在H2O2刺激下结合变化。在H9c2心肌细胞中过表达、敲减PHLDA1后,心肌敲除PHLDA1后,Western blot检测Bax的表达水平。6、Western blot检测PHLDA1影响Bax的表达水平的途径。结果:1、不同浓度H2O2刺激H9c2心肌细胞,随着刺激浓度的增加,细胞活性下降、凋亡率逐渐上升,凋亡相关蛋白和PHLDA1的表达增加。随着刺激时间的延长,PHLDA1的表达增加。2、H9c2心肌细胞中过表达PHLDA1,与转染空载组相比,过表达PHLDA1并给予H2O2刺激后,细胞活性,凋亡率下降,凋亡相关蛋白的表达增加,线粒体膜电位降低更明显,活性氧的产生更多。3、H9c2心肌细胞中敲减PHLDA1,与转染NC组相比,敲减PHLDA1并给予H2O2刺激后,细胞活性,凋亡率上升,凋亡相关蛋白的表达减少,线粒体膜电位降低得到抑制,活性氧的产生减少。4、心肌组织中敲低PHLDA1,与注射NC组相比,敲减PHLDA1并给予缺血再灌注损伤,心肌形态得到维持,心肌梗死面积减少,凋亡蛋白的表达减少,凋亡率减少。5、免疫共沉淀实验验证Bax与PHLDA1结合,并在氧化应激条件下结合增强。6、MG132消除了PHLDA1对Bax蛋白的降解,CHX抑制蛋白质转录,敲低PHLDA1使Bax降解更快。结论:1、氧化应激引起的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中,PHLDA1表达增加。2、PHLDA1在氧化应激诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中起到促进作用。3、PHLDA1与Bax结合参与氧化应激诱导的H9c2心肌细胞损伤。同时PHLDA1通过蛋白酶体途径引起Bax的变化。
牛小伟[5]（2019）在《当归多糖通过Oip5-as1调节SIRT1-AMPK-PGC1α通路改善心肌缺血再灌注损伤的实验研究》文中指出背景:急性心肌梗死（AMI）是在世界范围内发病率和死亡率较高的疾病之一。再灌注治疗是改善AMI患者预后的关键。但再灌注本身会增加心肌和冠脉循环的不可逆性损伤,导致梗死面积增加,即心肌缺血再灌注（MI/R）损伤。因此,在恢复心肌有效再灌注的基础上,采取能够改善MI/R损伤的心肌保护措施具有重要临床意义。许多中药在AMI中具有抗心肌缺血损伤、防止心室重构和保护心功能的作用,其中作为甘肃省道地药材的当归是常用药物之一。然而,当归对心肌保护作用的活性成分尚不明确,其发挥疗效的分子机制有待于进一步研究。目的:研究当归活性成分改善MI/R损伤的作用及分子机制。方法:1.运用网络药理学方法筛选当归对心肌保护作用的主要活性成分及可能的信号通路（第一部分）。2.采用体内外实验及分子生物学方法研究由网络药理学筛选出的当归活性成分—当归多糖（ASP）改善MI/R损伤的作用和SIRT1-AMPK-PGC1α信号机制（第二部分）。3.通过实验研究ASP对lncRNA Oip5-as1的影响及Oip5-as1对SIRT1-AMPKPGC1α信号通路的调节作用（第三部分）。结果:1.网络药理学发现ASP可能是当归保护心肌的重要活性成分,SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路是潜在作用机理。2.细胞实验发现ASP通过激活SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路发挥保护线粒体、抗氧化应激以及减少心肌细胞凋亡的作用。3.细胞实验显示ASP促进Oip5-as1的表达丰度。Oip5-as1作为竞争性内源RNA（ce RNA）调控SIRT1 m RNA的表达,进而激活SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路。4.动物实验发现ASP改善MI/R损伤,促进Oip5-as1的表达水平,上调SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路。结论:1.利用网络药理学筛选当归活性成分及其在心肌保护中的作用机制是一种可行的方法。2.ASP通过上调Oip5-as1表达,激活SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路,从而缓解氧化应激,抑制线粒体凋亡途径,最终减少细胞凋亡,改善MI/R损伤。
罗晨曦[6]（2018）在《益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠心肌线粒体自噬的作用机制研究》文中研究说明冠心病（Coronary Heart Disease,CHD）是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称,亦称为缺血性心脏病,是严重威胁人类身体健康的心血管疾病之一。冠心病是世界范围内的常见病和多发病,发病率和死亡率逐年上升,并且发病年龄具有年轻化的趋势。因此,冠心病的防治已成为医学界面临的一个重大问题。心肌缺血缺氧是冠心病的重要病理基础。冠心病属于中医学“心痛”“胸痹”的范畴。中医学认为,心脉失养、心血瘀阻是冠心病最主要的病机,冠心病气虚血瘀证成为临床最常见的证型,气虚为本,血瘀为标,发病过程多虚实相间,互相兼杂。益气活血方（YQHXF）是本课题组在古方补阳还五汤的基础上研制的配方颗粒剂,由益气药黄芪和活血药桃仁、红花、赤芍、川芎、当归、地龙组成。中药复方在治疗疾病上具有多环节、多靶点,多途径的优势,深入阐明复方益气活血的作用机理,明确中药的作用靶标,将为临床提供有力的依据和参考。近年来,线粒体在缺血性心血管疾病发展过程中扮演的角色受到越来越多的关注。线粒体是细胞能量代谢的中心,大部分能量由线粒体通过氧化磷酸化以ATP的形式提供,是高耗能心肌细胞ATP的主要来源。线粒体不仅是能量供应的场所,更是细胞信号转导中心,参与大量信号级联反应,调控细胞内钙稳态、ROS产生、细胞的凋亡和自噬等重要生物学功能,进而调节细胞的存活和死亡。缺血缺氧条件下会产生明显的氧化应激反应,线粒体通过电子传递体及氧化磷酸化过程产生ATP的同时也会产生大量活性氧（ROS）,过量的ROS又会反过来攻击细胞及亚细胞成分脂膜,引发脂质过氧化反应,破坏线粒体结构完整性。线粒体在呼吸氧化过程中,将产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜,在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位AΨm,正常的膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的先决条件,膜电位的稳定有利于维持细胞的正常生理功能,而膜电位的破坏是线粒体结构和功能损伤的重要指标,也是细胞凋亡过程中最早发生的事件。因此减少线粒体损伤,保护线粒体结构和功能的完整性对于保护心肌细胞损伤具有十分重要的意义。研究表明,受损的线粒体可以通过自噬-溶酶体途径特异性地进行降解,从而缓解因线粒体功能障碍而引起的细胞氧化应激损伤。这种特异性地通过自噬降解线粒体的途径则称为线粒体自噬。一般情况下,通过正常的线粒体自噬,细胞可降解并清除受损或功能障碍的线粒体,以维持细胞内线粒体质量和数量的平衡,保护细胞功能。但也有研究显示,过度的自噬也会促进心肌细胞损失。线粒体自噬除了清除受损的线粒体也会降解正常的线粒体,关键蛋白和细胞器的过度降解不利于细胞稳态的维持。一直以来,线粒体自噬在脑血管和神经退行性疾病中研究的较多,在心血管疾病方面研究较少,其对心脏功能保护作用的主要机制也并不明确。基于此,本研究将采用在体大鼠冠心病气虚血瘀证病证结合模型和H9C2心肌细胞系缺氧复氧损伤模型来研究益气活血方及其有效成分对心肌细胞的保护作用,并从线粒体自噬的角度探讨其对线粒体结构和功能的保护作用及机制。动物实验的主要研究内容及方法如下:1.建立大鼠冠心病气虚血瘀证病证结合模型,初步评价YQHXF对模型大鼠心肌的保护作用。主要实验方法为观察大鼠宏观体征,采集舌面色彩饱和度,采集脉搏搏动幅度,检测大鼠抓力等方面对大鼠进行中医证候评价;采用小动物超声仪采集大鼠超声心动图、ELISA法检测血清NT-proBNP、ALD、AngⅡ水平评价大鼠心功能;采用MASSON染色测定心肌梗死面积,HE染色光镜观察心肌组织病理学改变。2.在确定YQHXF抗心肌损伤作用的基础上,进一步考察YQHXF对心肌细胞线粒体结构和功能的影响。采用透射电镜观察线粒体超微结构及形态的改变;ELISA试剂盒检测血清ATP水平,初步评价其对线粒体功能损伤的影响。3.考察YQHXF对线粒体自噬水平的影响。采用免疫组化检测心肌PINK1,Parkin,HSP0蛋白表达水平,Western Blot实验检测PINK1,Parkin,Caspase3蛋白表达变化。依据复方组方特点和文献研究基础,选择黄芪甲苷（AS）和阿魏酸（FA）分别部分代表复方中益气药和活血药来进行细胞水平的实验研究,主要研究内容及方法如下:1.考察FA和AS对正常培养大鼠H9C2心肌细胞活力的影响。在此基础上,建立细胞缺氧复氧损伤模型,通过测定细胞活力以及TUNEL法测定细胞凋亡水平,Western Blot法检测Caspase3水平,初步明确二者对心肌细胞H/R损伤的保护作用。2.采用流式细胞仪分析心肌细胞中过氧化物ROS含量变化,化学发光法检测线粒体膜电位ΔΨm的改变,ADP/ATP试剂盒检测心肌细胞ATP水平,考察二者对线粒体功能的保护作用。3.采用荧光探针MitoTracker Green-LysoTracker Red共定位检测线粒体-溶酶体结合水平及免疫荧光法检测PINK1-HSP60和Parkin-HSP60共定位水平观察线粒体的数量及自噬程度,Western Blot法检测PINK1,Parkin,LCII,P62蛋白表达的变化,考察PINK1/Parkin通路对线粒体自噬的影响,并阐明其可能的作用机制。研究结果如下:1.YQHXF高剂量（349.2 mg·ml-1）组能够增加模型大鼠体重和抓力水平,升高舌面RGB值,提升脉搏幅度等中医证候水平;显着提升模型大鼠超声心动图EF、FS、LVIDd、LVIDs 指标,降低血清 NT-proBNP、ALD、AngⅡ含量。YQHXF 低剂量（174.6 mg·ml-1）组可以恢复模型大鼠体重和抓力水平,升高舌面RGB值,提高心脏射血分数EF;降低血清NT-proBNP、ALD、AngⅡ含量;对模型大鼠脉搏幅度以及心功能FS、LVIDd、LVIDs指标有一定改善,但无统计学意义。同时,YQHXF高低剂量组均能明显减少心肌损伤面积,减轻心肌细胞的变性、坏死及炎性细胞的浸润。2.对线粒体超微结构进行观察发现,YQHXF可以改善模型大鼠心肌线粒体肿胀,缓解内嵴结构的破裂,维持线粒体形态结构;同时,对大鼠血清ATP水平的测定显示,YQHXF可以提高机体ATP水平。3.对心肌组织进行免疫组化和免疫印记检测表明,YQHXF可以抑制线粒体自噬通路蛋白PINK1,Parkin的过度表达,增加线粒体基质蛋白HSP60的表达,减少凋亡蛋白caspase3的表达。4.AS和FA均能抑制H/R损伤造成的H9C2心肌细胞凋亡,保护心肌细胞损伤。5.AS和FA均能降低细胞ADP/ATP比率,恢复线粒体膜电位ΔΨm,降低ROS水平。6.AS和FA均能抑制线粒体-溶酶体的结合,增加线粒体基质蛋白HSP60的表达,抑制线粒体自噬通路蛋白PINK 1,Parkin的过度表达,增加P62蛋白以及抑制LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表达。综上所述,本研究发现:1.YQHXF可以改善冠心病气虚血瘀证模型大鼠气虚和血瘀的中医证候表现,保护心脏功能。通过保护线粒体结构和功能,缓解心肌组织变性坏死,抑制心肌细胞凋亡,发挥保护冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠缺血心肌的作用。2.YQHXF对冠心病气虚血瘀证模型大鼠心肌细胞的保护作用与维持线粒体结构与功能的完整,减轻线粒体损伤密切相关。3.YQHXF有效成分AS和FA均有显着的抗H9C2心肌细胞H/R损伤的作用,该作用是通过PINK1/Parkin途径抑制线粒体过度自噬,稳定线粒体数量,保护线粒体结构和功能,从而抑制细胞凋亡来发挥心肌保护作用。
赵艳坤[7]（2017）在《脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的影响机制研究》文中研究指明在无血清共培养条件下,为研究脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSCs）对奶牛乳腺上皮细胞（Bovine Mammary Gland Epithelial Cells,BMECs）增殖、凋亡、及乳脂、乳蛋白合成的影响,揭示非外源性细胞因子对BMECs泌乳调控的具体作用机制。本试验分为三个部分:第一部分,以UC-MSCs和BMECs为研究对象,纯化扩增选取生长状态最佳的P（Passage,P）5代UC-MSCs和P8代BMECs,将2种细胞以直接和间接接触两种共培养方式作为试验组,直接接触是按照UC-MSCs:BMECs分别为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10的浓度梯度混合共培养,间接接触则是提取UC-MSCs的上清液作为条件培养基重悬BMECs,对照组为UC-MSCs和BMECs单培养组,于0、4、8、12、24、36、48、60、72 h时观察各组细胞的生长变化,采用细胞增殖与活性检测试剂盒CCK-8法检测各组细胞增殖情况,并结合细胞形态学观察筛选出UC-MSCs和BMECs最佳共培养条件。第二部分,以最佳共培养比例和时间为基准,建立UC-MSCs和BMECs（1:2）共培养试验组,对比单独培养的UC-MSCs和BMECs,48 h后,ELISA法检测各组上清中IGF-I分泌情况;利用Transwell?小室将UC-MSCs和BMECs上下双层共培养,于不同时间点提取各组RNA,实时荧光定量PCR检测细胞中IGF-ⅠR、IGF-ⅠmRNA的表达。第三部分,在Transwell?小室共培养验证IGF-I最佳分泌条件的基础上,以BMECs单纯培养为对照,分别采用IGF-ⅠR抑制剂AG1024、JAK2信号特异性阻断剂AG490和PI-3K信号特异性阻断剂LY294002处理细胞,观察处理前后各组细胞生长情况,采用Annexin V-FITC/PI双参数法和流式细胞仪检测细胞凋亡,测定上清中IGF-Ⅰ和CSN2、CSN3、TG含量变化,RT-qPCR检测细胞信号通路相关基因PI-3K、AKT、mTOR、JAK2、STAT5、ELF5的表达丰度,细胞凋亡基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相对定量值,及乳脂、乳蛋白合成关键基因ACACA、FASN、SREBP1及CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度。结果:第一部分,优化了UC-MSCs和BMECs最适共培养条件,结果显示,48 h,条件培养基BMECs组光密度（Optical density,OD）值显着高于对照组（P<0.05）,而1:2浓度组极显着高于对照组（P<0.01）,显着高于其他各组（P<0.05）;第二部分,Transwell?小室明确了UC-MSCs和BMECs之间的相互作用,结果显示,48 h,两种共培养方案IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR mRNA表达值显着或极显着高于单培养组（P<0.05,P<0.01）,共培养组IGF-Ⅰ浓度显着高于UC-MSCs组（P<0.05）,极显着高于BMECs组（P<0.01）,BMECs/UC-MSCs组显着高于UC-MSCs/BMECs组（P<0.05）;第三部分,证实了UC-MSCs对BMECs凋亡、乳脂乳蛋白的影响及可能作用途径,结果显示,试验组的凋亡率极显着低于其他各组（P<0.01）,试验组较对照组Bcl-2 mRNA表达丰度极显着上调（P<0.01）、Caspase-3、Bax mRNA表达显着下调（P<0.05）,AG1024、LY294002和AG490处理后,上调了各组细胞凋亡率和Bax、Caspase-3 mRNA表达丰度,下调了Bcl-2 mRNA表达丰度,均具有统计学意义;乳脂、乳蛋白合成的结果显示,试验组各项指标均显着或极显着高于对照组（P<0.05,P<0.01）,AG1024处理对IGF-Ⅰ具有极显着抑制效果（P<0.01）,显着和极显着降低TG、CSN2、CSN3含量及各基因相对表达丰度（P<0.05,P<0.01）,AG490处理显着降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度（P<0.05）,但对ACACA、FASN、SREBP1 mRNA的表达无显着影响（P>0.05）,LY294002处理抑制了PI-3K（P<0.01）、AKT、mTOR（P<0.05）mRNA的表达,显着降低了TG、CSN2、CSN3含量及各基因表达（P<0.05）,AG1024和AG490共同处理时乳脂合成关键基因表达变化较AG1024单独处理差异不显着（P>0.05）,AG1024和LY294002共同处理显着下调了CSN2、CSN3 mRNA的表达（P<0.05）,极显着降低了其他各指标（P<0.01）。综上所述,本研究建立了UC-MSCs和BMECs最适共培养条件,且利用Transwell?小室明确了UC-MSCs和BMECs之间的作用,发现UC-MSCs对BMECs中IGF-Ⅰ及其受体相应基因的表达起促进作用,IGF-I参与UC-MSCs对BMECs凋亡、乳脂及乳蛋白合成的调节作用,PI-3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路是IGF-I调控BMECs凋亡、泌乳功能的共同通路,但JAK2/STAT5信号通路不参与UC-MSCs对BMECs乳脂合成的调控,因此可以说UC-MSCs通过IGF-I介导PI-3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路协同抑制BMECs凋亡,提高其存活率,从而促进BMECs乳脂、乳蛋白合成,进而调控BMECs泌乳性能,不仅弥补了BMECs自身IGF-I分泌不足的缺陷,也为进一步探究内源性IGF-Ⅰ对BMECs生物学功能的调节作用奠定理论基础。
李琳[8]（2014）在《人参皂苷Rgl对大鼠心肌缺血再灌注损伤改善作用及机制探讨》文中研究说明背景：缺血再灌注（ischemia/repe rfusion, I/R）是急性冠脉综合征患者介入或溶栓治疗后出现再损伤的主要病理基础,临床上缺少有效的药物干预。能量代谢障碍为起始环节,及其诱导的炎症介质和凋亡反应在I/R损伤中扮演重要角色。心肌缺血缺氧期,ATP合成酶δ亚基ATP 5D低表达,导致了心肌ATP生成不足。另一方面,心肌泵血耗氧,又致ATP降解增多。ATP减少是缺血期心肌收缩蛋白损伤的主要因素之一。I/R引起的能量代谢异常和过量产生的过氧化物破坏了心肌肌丝骨架蛋白。过量产生的活性氧自由基（ROS）一方面可以直接造成细胞结构破坏和功能受损；另一方面,又可以激活核因子κB （nuclear factor κB, NF-κB）,通过NF-κB启动炎性因子和粘附因子的表达,促进白细胞与血管内皮细胞的相互反应和游出,加重血管和心肌损伤,进一步诱导了细胞的凋亡。Rho激（Rho-kinase,ROCK）酶信号通路和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （PI3K/Akt）信号通路均是参与细胞凋亡的重要的信号通路。PI3K及其下游分子所介导的抗凋亡作用已经成为药物研究领域的焦点。人参皂苷Rgl （ginsenoside Rgl, Rg1）是人参中分离出的单体皂苷之一,具有广泛的生物学活性。大量的研究表明人参皂苷对心血管系统、神经系统、免疫系统都有影响,可以抑制细胞凋亡、扩张血管、改善心功能、抗衰老、美容等作用。但目前尚无体内试验的证据,从能量代谢、抑制炎症和细胞凋亡的角度,探讨人参皂苷Rg1对大鼠心肌缺血再灌注损伤的改善作用及机制。目的：本研究通过评价Rg1对I/R的大鼠心肌梗死、心脏表面血流量、心功能、心肌能量代谢、凋亡、炎症及相关调控蛋白的改善作用,观察Rg1对心脏缺血再灌注损伤的干预作用,并通过大鼠心肌NF-κB, Rho激酶和PI3K/Akt信号通路,探讨Rg1的作用机理。方法：取体重为240-260 g的雄性Spragu-Dawley （SD）大鼠144只,随机分为4组,分别为假手术组（Sham）;本底组（Rgl+Sham）;模型组（I/R）；预给药组（Rgl+I/R）。麻醉下开胸,结扎冠状动脉左前降支30分钟,造成缺血,解除结扎形成再灌注。在缺血前30分钟,经由左侧股静脉连续泵入Rgl （1 mg/kg,5 mg/kg,10 mg/kg）至再灌注90分钟。于缺血前、缺血30分、再灌注30分、再灌注60分、再灌注90分,用激光扫描多普勒血流量仪测定心脏表面血流量,用心内导管法测定心功能。在再灌注90分,取心肌组织,用2,3,5-氯化三苯基四氮唑和伊文斯氏蓝法染心肌缺血和梗死面积；用苏木素-伊红法染心肌形态结构；用鬼笔环肽染色法观察心肌纤维F-actin;用凋亡染色标记核断裂的心肌细胞；用透射电镜观察心肌纤维和线粒体的超微结构。在再灌注90分,从心肌组织中提取RNA,用实时定量聚合酶链式反应检测ATP合成酶δ亚基（ATP-5D） mRNA的水平；取心肌组织中的蛋白,用酶标法检测大鼠心肌三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate, ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）、磷酸腺苷（adenosine monophosphate, AMP）、丙二醛（malondialde hyde, MDA）的含量；取大鼠血清用酶标法检测肌钙蛋白I （Cardiac Troponin I, cTnI）的含量；用蛋白免疫印迹法检测大鼠心肌组织中B淋巴细胞瘤-2 （B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated x protein, Bax）、活化型半胱天冬酶-3 （cleaved caspase-3）、肌钙蛋白I （Cardiac Troponin I, cTnI）、Rho激酶（Rho-kinase,ROCK）及其底物肌球蛋白磷酸酶（MYPT-1）磷酸化、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidyl Inositol 3-kinase,PI3K）P及其磷酸化I3K、 蛋白激酶B（Akt）及其磷酸化Akt、ATP合成酶6亚基（ATP-5D）、磷酸化肌球蛋白轻链（phosphorylated myosin light chain,p-MLC）、细胞浆中和细胞核中核因子κB （nuclear factor κB, NF-kB）的表达；用免疫组织化学染色法检测心肌组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、细胞间黏附分子（Intercellular adhesion molecule,ICAM-1）、中性粒细胞黏附分子（CD18）的表达。结果：在缺血前30 min,连续性静脉滴注Rg1至再灌注结束,可以减轻大鼠心肌梗死面积。5mg/kg的Rg1可以显着性地：1.减轻I/R引起的大鼠心肌形态学改变,包括心肌纤维断裂、线粒体肿大；2.抑制I/R组大鼠心肌中cTnI水平的降低,血清中的cTnI水平的升高。3.改善I/R引起的大鼠心功能异常；4.抑制I/R引起的大鼠心脏表面血流量的降低；5.抑制I/R引起的大鼠心肌细胞凋亡,抑制Bcl-2的降低,抑制Bax和Cleaved-caspase3的增加；6.进一步升高P-PI3K/PI3K以及P-Akt/Akt的比值,发挥抗凋亡作用；7.抑制I/R导致的ROCK的激活以及其底物MYPT-1的磷酸化水平；8.抑制I/R引起的大鼠心肌细胞浆中NF-κB P65的水平降低,细胞核中NF-κB P65的表达升高,9.抑制I/R引起的大鼠心肌ADP/ATP、AMP/ATP比值的升高,MDA含量的增加,抑制I/R引起的心肌ATP-5D mRNA水平和蛋白的表达降低、MLC磷酸化水平的升高。10.抑制I/R引起的MPO、ICAM-1、CD18表达的增强结论：本研究证实了Rgl可以通过抑制I/R引起的大鼠心肌能量代谢异常和氧化应激损伤,改善了I/R大鼠的心肌纤维损伤和心肌细胞凋亡,改善I/R大鼠的心肌结构、心功能和心脏血流量,减轻心脏缺血再灌注损伤。Rg1的作用机制可能与抑制I/R导致的ROCK的激活及其底物MYPT-1的磷酸化水平,抑制I/R引起的NF-κB核转位及其介导的炎症反应,升高P-PI3K/PI3K以及P-Akt/Akt的比值有关。
李雪丽[9]（2014）在《中药复方双参宁心抗心肌缺血/再灌注损伤作用及线粒体保护机制研究》文中进行了进一步梳理冠心病是世界范围内严重危害人类健康的常见病和多发病。心肌缺血、缺氧是冠心病的重要病理改变,及时恢复血流再灌虽然能够挽救心梗患者的生命,但随之引起的心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion, I/R）损伤极易导致心肌顿抑、心律失常甚至猝死等事件发生,严重影响心梗患者的预后。目前,研究认为心肌I/R损伤的发病机制主要包括能量代谢障碍、自由基损伤、钙超载和细胞凋亡等,而线粒体不仅是高耗能心肌细胞ATP的主要来源,更具有参与调控细胞内钙稳态、ROS产生、细胞的凋亡和自噬及细胞信号转导等重要的生物学功能。因此,近年来线粒体在心肌I/R过程中扮演的角色已经受到广泛关注,而保护线粒体的结构和功能,增强其缺血耐受性成为防治I/R损伤的重要策略。中医学认为,心血瘀阻致使心脉失养,不通则痛,从而引起“胸痹”、“心痛”,其特点与现代冠心病心绞痛基本相符。心气虚是胸痹心痛发病的主要机制之一,其中气虚为本,血瘀为标,发病过程中多虚实相间,互相兼杂。因此,“胸痹”、“心痛”的重要治则常不离益气活血,祛瘀止痛。复方双参宁心（SSNX）是本院研发的治疗气虚血瘀证冠心病心绞痛的组分中药,由人参、丹参和延胡索中的活性成分群组成,即人参总皂苷、丹参总酚酸和延胡索总生物碱成分按原方比例配伍而成。其中,人参益气补虚,丹参活血化瘀,延胡索辛散温通、行气止痛,三药配伍,标本兼治,以达益气活血,理气止痛之功效。SSNX组分特色明显,疗效确切,极具应用前景,值得深入研究开发。前期药理研究表明,SSNX对缺血心肌有较好的保护作用,可有效改善缺血心脏的血流动力学参数,并促进心功能的恢复。由于心梗后心功能的恢复与具有完整舒缩功能的心肌细胞的数量以及细胞的能量代谢状态密切相关,且初步研究发现SSNX可能通过改善心肌细胞能量代谢和降低细胞不可逆损伤达到抗心肌缺血性损伤的作用,因此,深入系统的阐明SSNX的这一保护作用及机理,将为其临床应用提供有力依据和参考。正常情况下,心肌所需ATP约97%来源于线粒体氧化磷酸化,以维持心肌细胞的舒缩功能和离子泵功能,而I/R引起的线粒体结构及功能的改变将直接导致心肌细胞的能量代谢障碍；此外,心肌I/R可导致线粒体呼吸链酶活性降低,线粒体膜电位（△Ψm）降低,促凋亡蛋白释放启动细胞凋亡等。最近的研究发现,横跨线粒体内膜和外膜的线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）对I/R过程中心肌细胞的死亡起到关键的调控作用。特别是在再灌注初期, ROS的爆发性生成,Ca2+的迅速聚集以及pH的逐渐恢复均为mPTP的开放提供了有利条件,而mPTP的开放将直接导致线粒体内膜通透性转换,线粒体肿胀甚至破裂,最终导致细胞死亡。目前,通过直接干预mPTP组成成分或间接减少mPTP开启诱因来抑制mPTP的开启被认为是防治心肌I/R损伤的重要策略。基于此,本研究将采用在体大鼠心肌I/R损伤模型和原代心肌细胞缺氧复氧损伤模型来研究SSNX及其主要入血活性成分对心肌能量代谢和心肌细胞凋亡的作用,并研究其对线粒体的保护作用及机制。动物实验的主要研究内容及方法如下：1.建立大鼠心肌I/R损伤模型,初步评价SSNX对心肌I/R损伤的保护作用。主要实验方法为采用NBT染色测定心肌梗死面积,HE染色光镜观察心肌组织病理学改变,紫外可见分光光度法检测心肌酶LDH和CK-MB的漏出,心肌组织MDA的含量及GSH-Px的活力变化。2.在确定SSNX抗心肌I/R损伤作用的基础上,进一步考察SSNX对I/R损伤心肌能量代谢和心肌细胞凋亡的影响。本实验主要采用HPLC法测定心肌高能磷酸物ATP, ADP和AMP的含量并计算总腺苷酸量（TAN=ATP+ADP+AMP）和细胞能荷,评价心肌细胞的能量代谢状态；采用TUNEL法测定心肌细胞的凋亡程度,Western blot实验测定cleaved-caspase3蛋白表达变化。3.考察SSNX对I/R心肌线粒体损伤的影响。本实验首先采用透射电镜观察线粒体超微结构及形态的改变；然后分离制备新鲜线粒体和胞浆部分,分别测定线粒体代谢酶Complex I、Complex IV和柠檬酸合酶（citrate synthase,CS）的活力,线粒体通透性转换程度及胞浆Cyt c的含量。依据前期对SSNX体内药代动力学和药动学/药效学数据分析研究结果,选择SSNX主要入血活性成分人参皂苷Rgi、Re、丹酚酸A （salvianolic acid A, SAA）、迷迭香酸（rosmarinic acid, RA）、延胡索乙素（tetrahydropalmatine, THP）和脱氢紫堇碱（dehydrocorydaline, DHC）进行细胞水平的实验研究,主要研究内容及方法如下：1.建立大鼠乳鼠原代心肌细胞培养体系,考察Rg1、Re、SAA、RA、THP、 DHC对正常培养心肌细胞活力的影响。在此基础上,建立细胞缺氧或缺氧复氧（hypoxia reoxygenation, H/R）损伤模型,通过测定心肌细胞LDH漏出,细胞活力以及ROS的产生,初步明确各成分对心肌细胞缺氧或H/R损伤的保护作用。2.采用化学发光法测定心肌细胞ATP含量,并进一步分析心肌细胞胞外02和胞内氧O2消耗的情况,考察各成分对缺氧或H/R损伤所致细胞能量代谢障碍的影响。3.采用流式仪分析心肌细胞的凋亡百分数和△Ψm的改变,Western blot实验测定cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2和p-Akt （Ser473）蛋白表达的变化,考察SAA、RA、THP和DHC对H/R损伤所致心肌细胞凋亡的影响。4.采用流式仪分析心肌细胞mPTP开放的程度,Western blot实验测定心肌细胞HKI、mitoHKII、GSK-3β和p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达的变化,考察有效成分对H/R损伤导致mPTP开放的影响,并阐明其可能的作用机制。研究结果如下：1. SSNX22.5mg·kg"1和45mg·kg-1可明显减小大鼠I/R损伤心肌梗死面积和降低心肌酶LDH和CK-MB的漏出；并明显改善I/R损伤导致的心肌纤维变性、坏死,心肌细胞间质水肿及炎性细胞的浸润,降低I/R心肌组织MDA的生成和增加GSH-Px活力。2. SSNX45mg·kg-1可明显减少I/R导致的ATP耗竭,并改善心肌细胞能荷状态；同时,SSNX22.5mg·kg-1和45mg·kg-1均能明显降低I/R导致的心肌细胞凋亡,其中45mg·kg-1剂量组能显着降低cleaved-caspase3的蛋白表达。3. SSNX22.5mg-kg-1和45mg-kg-1能够明显减轻I/R导致的线粒体肿胀和维持线粒体的基本形态及基质密度,并且SSNX可明显减少I/R诱导的线粒体Cyt c释放,促进线粒体Complex I酶活力恢复和降低Ca2+诱导的线粒体肿胀速率。4. SAA、RA、THP、DHC可明显抑制H/R损伤所致心肌细胞LDH的漏出,并能增加细胞活力和降低ROS的产生；SAA和RA还可明显增加H/R后心肌细胞ATP水平,但THP和DHC对缺氧和H/R损伤心肌细胞ATP水平均没有表现出明显改善作用。5.Rg1和Re对H/R损伤所致心肌细胞LDH漏出和ATP水平降低未见明显的改善作用,但Rg1和Re对缺氧损伤心肌细胞活力的下降和ROS的产生都具有明显的改善作用,并能明显增加缺氧损伤心肌细胞胞内02的消耗和细胞内ATP水平；同时,Rg1和Re可显着增加心肌细胞p-Akt （Ser473）蛋白的表达。6. SAA、RA和THP能够明显抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡。其中,SAA和RA能够明显改善H/R损伤导致的细胞△甲m下降,但THP对△Ψm没有表现出明显的保护作用；此外,SAA和RA均能明显降低H/R导致的cleaved-caspase3蛋白表达增加,并增加细胞p-Akt （Ser473）蛋白表达,并且SAA还能显着降低Bax/Bcl-2蛋白表达。7.SAA可明显减轻H/R损伤导致的心肌细胞mPTP开放程度,SAA对H/R损伤造成的mitoHKII蛋白表达降低没有明显的改善作用,但可明显增加细胞p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达,并且当Akt信号通路被LY294002阻断后,SAA增加p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达的作用明显降低。综上所述,本研究发现：1. SSNX通过改善心肌能量代谢和抑制心肌细胞凋亡而发挥抗大鼠心肌I/R损伤作用。2. SSNX对I/R损伤心肌线粒体的结构和形态具有保护作用,通过降低Cyt c释放阻断线粒体途径的细胞凋亡,并能促进Complex I酶活力恢复和降低线粒体通透性转换程度,从而降低心肌细胞的不可逆损伤。因此,线粒体保护是SSNX发挥抗心肌I/R损伤作用的重要途径。3.SSNX主要入血活性成分SAA、RA、THP和DHC均具有显着的抗心肌细胞H/R损伤作用,其中SAA、RA和THP是其抗心肌细胞凋亡的物质基础,并且SAA和RA还能够改善心肌细胞的能量代谢,其保护作用可能是通过激活Akt信号通路实现的。4.SAA可能通过增加p-GSK-3β （Ser9）蛋白表达使GSK-3β失活从而降低心肌细胞mPTP开放程度发挥抗H/R损伤作用,且该保护作用是Akt信号通路依赖的。5. SSNX主要入血活性成分Rg1和Re对缺氧损伤心肌细胞具有显着的保护作用,并明显改善心肌细胞的能量代谢状态,其保护作用与Akt信号通路的激活密切相关。
陈晓光[10]（2013）在《过氧化物酶模拟酶DhHP-6对心肌缺血再灌注损伤保护作用机制研究》文中研究表明缺血组织恢复血流灌注时，导致再灌注区心肌细胞及局部血管网显着的病理生理变化，这些变化共同作用可促使进一步的组织损伤，该病理过程称为“缺血再灌注损伤”。再灌注后大量Ca2+内流，并产生大量自由基，是再灌注心肌细胞损伤的主要机制。随着再灌注治疗的广泛开展，再灌注损伤已成为一个普遍的临床问题，引起了人们的极大关注。本论文以在体大鼠心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）动物模型和体外培养的H9c2心肌细胞缺氧再给氧（H/R）损伤模型，拟探讨由本实验室设计并合成的过氧化物酶模拟酶DhHP-6对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其相关机制。试验结果表明，对于大鼠心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）动物模型（:1）DhHP-6(2.0mg·kg-1)可保护大鼠MI/RI导致的心肌损伤：减少MI/RI大鼠心肌梗死面积，降低S-T段，降低血清CK、LDH、GOT活性；改善心肌组织损伤病理学改变；（2）DhHP-6可增强MI/RI大鼠抗氧化能力：增强血清和心肌组织SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量，增加GSH含量，减少心肌组织ROS产生；（3）DhHP-6对MI/RI大鼠具有抗细胞凋亡作用：降低心肌细胞凋亡率，上调心肌组织抗凋亡蛋白Bcl-2表达量，提高Bcl-2/Bax，下调Caspase-3蛋白表达。对于体外培养的H9c2心肌细胞缺氧再给氧（H/R）损伤模型，DhHP-6(4.0μmol·L-1)可明显增加H/R损伤H9c2心肌细胞的细胞存活率，减少LDH释放量，升高Ca++-ATPase活性，改善损伤细胞形态学变化，降低细胞凋亡率；增强SOD活性，降低MDA含量，减少ROS产生。DhHP-6对H/R引起的H9c2心肌细胞损伤具有保护作用。通过建立H9c2心肌细胞H/R损伤模型，研究DhHP-6抗心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡机制。结果表明：（1）DhHP-6(4μmol·L-1)通过激活SIRT1/P53通路，激活SIRT1，使P53去乙酰化，抑制P53、P21活性，从而增加Bcl-2/Bax的表达，抑制Caspase-3，从而抑制细胞凋亡；（2）DhHP-6通过SIRT1/AKT通路激活SIRT1信号，进而激活AKT信号通路，使Bcl-2/Bax增加，抑制Caspase-3的活性,从而抑制细胞凋亡；（3）DhHP-6的作用也可能与SIRT1/JNK通路相关，通过激活ERK而抑制P38信。本研究证明DhHP-6具有抗大鼠心肌缺血再灌注及H9c2心肌细胞缺氧再给氧损伤作用。DhHP-6可通过激活SIRT1/P53通路，抑制P53、P21活性，增加Bcl-2/Bax，抑制Caspase-3，抑制心肌细胞凋亡；并与激活SIRT1/AKT通路有关。
二、IGF-I对ISP损伤大鼠心肌ATP、ADP、AMP变化影响的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IGF-I对ISP损伤大鼠心肌ATP、ADP、AMP变化影响的实验研究（论文提纲范文）
（1）花椒麻味物质对2型糖尿病大鼠蛋白质代谢影响的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词索引 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 花椒麻味物质的研究进展 |
| 1.1.1 花椒麻味物质概述 |
| 1.1.2 花椒麻味物质的生理功效 |
| 1.2 2型糖尿病发病机制 |
| 1.2.1 胰岛β细胞功能受损 |
| 1.2.2 激素分泌异常 |
| 1.2.3 胰岛素抵抗 |
| 1.2.4 脂质异位沉积 |
| 1.2.5 炎症和氧化应激 |
| 1.2.6 线粒体功能障碍 |
| 1.2.7 内质网应激 |
| 1.3 动物体内蛋白质合成代谢机制研究 |
| 1.3.1 机体蛋白质合成代谢关键调控通路 |
| 1.3.2 影响机体蛋白质合成代谢的因素 |
| 1.4 机体蛋白质分解代谢机制研究 |
| 1.4.1 泛素-蛋白酶体系统 |
| 1.4.2 机体蛋白质分解代谢关键调控因子 |
| 1.5 研究意义 |
| 1.6 研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 花椒麻味物质对2 型糖尿病大鼠机体基础生理生化指标影响的研究 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 花椒麻味物质的提取与制备 |
| 2.2.2 花椒麻味物质灌胃溶液的配制 |
| 2.2.3 试验动物模型的构建及分组 |
| 2.2.4 指标分析测定方法 |
| 2.3 实验数据统计与分析 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 受试物花椒麻味物质含量的测定 |
| 2.4.2 花椒麻味物质对T2DM大鼠体重的影响 |
| 2.4.3 花椒麻味物质对T2DM大鼠脏器指数的影响 |
| 2.4.4 花椒麻味物质对T2DM大鼠空腹血糖和糖化血清蛋白的影响 |
| 2.4.5 花椒麻味物质对T2DM大鼠OGTT的影响 |
| 2.4.6 花椒麻味物质对T2DM大鼠胰岛素敏感性的影响 |
| 2.4.7 花椒麻味物质对T2DM大鼠血浆血脂水平的影响 |
| 2.4.8 花椒麻味物质对T2DM大鼠血浆中血浆蛋白的影响 |
| 2.4.9 花椒麻味物质对T2DM大鼠血浆尿素氮和肌酐的影响 |
| 2.4.10 花椒麻味物质对T2DM大鼠血浆激素的影响 |
| 2.4.11 花椒麻味物质对T2DM大鼠血浆中炎症因子的影响 |
| 2.4.12 花椒麻味物质对T2DM大鼠肝脏酶活的影响 |
| 2.4.13 花椒麻味物质对T2DM大鼠粪便中短链脂肪酸的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 花椒麻味物质对2型糖尿病大鼠组织内氨基酸含量以及氨基酸运载体mRNA的影响 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物材料 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 氨基酸标准溶液的制备 |
| 3.2.2 氨基酸的衍生 |
| 3.2.3 液相色谱条件 |
| 3.2.4 组织中氨基酸运载体mRNA表达测定 |
| 3.3 实验数据统计与分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 花椒麻味物质对T2DM大鼠血浆中氨基酸含量的影响 |
| 3.4.2 花椒麻味物质对T2DM大鼠空肠中氨基酸含量的影响 |
| 3.4.3 花椒麻味物质对T2DM大鼠肝脏中氨基酸含量的影响 |
| 3.4.4 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌中氨基酸含量的影响 |
| 3.4.5 不同组织内氨基酸水平的多元数据分析 |
| 3.4.6 花椒麻味物质对T2DM大鼠空肠中氨基酸运载体mRNA表达的影响 |
| 3.4.7 花椒麻味物质对T2DM大鼠肝脏中氨基酸运载体mRNA表达的影响 |
| 3.4.8 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌中氨基酸运载体mRNA表达的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第4章 花椒麻味物质对T2DM大鼠蛋白质合成代谢紊乱的影响及机制的研究 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物材料 |
| 4.1.2 主要试剂和耗材 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 RT-qPCR |
| 4.2.2 Western Blot |
| 4.3 实验数据统计与分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 花椒麻味物质对T2DM大鼠肝脏蛋白质合成相关基因表达量的影响 |
| 4.4.2 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌蛋白质合成相关基因表达量的影响 |
| 4.4.3 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌能量代谢相关基因表达量的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第5章 花椒麻味物质对T2DM大鼠蛋白质分解代谢紊乱的影响及机制的研究 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物材料 |
| 5.1.2 主要试剂和耗材 |
| 5.1.3 主要仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 RT-qPCR |
| 5.2.2 Western Blot |
| 5.3 实验数据统计与分析 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌MSTN和 MyoD表达量的影响 |
| 5.4.2 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌MuRF1表达量的影响 |
| 5.4.3 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌MAFbx表达量的影响 |
| 5.4.4 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌FoxOs表达量的影响 |
| 5.4.5 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌NFκB表达量的影响 |
| 5.4.6 花椒麻味物质对T2DM大鼠骨骼肌TNF-α表达量的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 结论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
（2）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）左、右归丸对AMPK/mTOR介导的PMOP大鼠糖、脂代谢及能量代谢的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 左、右归丸对PMOP大鼠糖、脂代谢及能量代谢的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 左、右归丸对PMOP大鼠腹部脂肪AMPK/m TOR信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 绝经后女性能量代谢紊乱的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）PHLDA1在H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验动物和饲料 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞传代与培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 细胞分组 |
| 2.2.5 CCK8测定H9c2心肌细胞存活率 |
| 2.2.6 流式测定H9c2心肌细胞凋亡率 |
| 2.2.7 JC-1测定H9c2心肌细胞线粒体膜电位 |
| 2.2.8 ROS测定细胞内ROS |
| 2.2.9 RT-q PCR测定小干扰RNA敲减效率 |
| 2.2.10 大鼠尾静脉注射及离体心脏造模 |
| 2.2.11 TTC染色测定心肌梗死面积 |
| 2.2.12 HE染色测定心肌组织形态 |
| 2.2.13 Tunel测定心肌组织凋亡率 |
| 2.2.14 IHC测定Cleaved-caspase3表达量 |
| 2.2.15 WB检测蛋白量的多少 |
| 2.2.16 免疫共沉淀测定蛋白互作 |
| 2.2.17 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 H_2O_2 刺激H9c2 心肌细胞可以引起PHLDA1 表达增加 |
| 3.2 过表达PHLDA1 加重氧化应激诱导的H9c2 心肌细胞损伤 |
| 3.3 敲减PHLDA1 减轻氧化应激诱导的H9c2 心肌细胞损伤 |
| 3.4 敲减PHLDA1减轻离体心脏缺血再灌注损伤 |
| 3.5 Bax被鉴定为PHLDA1 新的结合蛋白并且在氧化应激情况下结合增强 |
| 3.6 PHLDA1 通过蛋白酶体途径调节Bax稳定性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本文创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）当归多糖通过Oip5-as1调节SIRT1-AMPK-PGC1α通路改善心肌缺血再灌注损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 :基于网络药理学方法探索当归对心肌保护作用的活性成分 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 资料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第二部分 :SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路介导当归多糖抗心肌缺血再灌注损伤的作用 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第三部分 :当归多糖通过Oip5-as1 调控SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路改善心肌缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠心肌线粒体自噬的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 综述一 线粒体自噬在心脏保护中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 冠心病现代研究进展与中医药防治策略 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 技术路线图 |
| 实验研究 |
| 第一部分 益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠心肌保护作用机制研究 |
| 一 益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠心肌保护作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 二 益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠心肌保护机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益气活血方有效成分抗H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤作用研究 |
| 一 益气活血方有效成分对H9C2心肌细胞的毒性作用考察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 二 益气活血方有效成分抗H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 益气活血方有效成分抗H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤机制研究 |
| 一 益气活血方有效成分对缺氧复氧损伤H9C2心肌细胞线粒体功能的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 二 益气活血方有效成分对缺氧复氧损伤H9C2心肌细胞线粒体自噬的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的影响机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脐带间充质干细胞的生物学特性 |
| 1.2 间充质干细胞共培养的研究进展 |
| 1.3 奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的研究进展 |
| 1.4 乳蛋白合成关键基因 |
| 1.5 乳脂合成的关键基因 |
| 1.6 泌乳调控主要信号通路 |
| 1.7 胰岛素样生长因子对乳腺发育及泌乳调控的研究进展 |
| 1.8 研究目的、意义及内容 |
| 1.9 试验技术路线 |
| 第2章 无血清条件下脐带间充质干细胞与乳腺上皮细胞最适共培养条件筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 无血清条件下UC-MSCs和 BMECs共培养对IGF-Ⅰ表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 与UC-MSCs共培养对BMECs凋亡的影响及作用机制 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 与UC-MSCs共培养对BMECs乳脂、乳蛋白合成的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 UC-MSCs对 BMECs乳脂、乳蛋白合成的调控作用机制 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文结论 |
| 第8章 特色与创新点 |
| 第9章 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）人参皂苷Rgl对大鼠心肌缺血再灌注损伤改善作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述一 心肌缺血再灌注损伤研究进展 |
| 1 缺血再灌注损伤的病理生理机制 |
| 2 心肌缺血再灌注损伤的保护机制 |
| 3 结语 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中药单体人参皂苷Rg1的药理及毒理作用研究进展 |
| 1 药理活性研究 |
| 2 人参皂苷Rg1的药代动力学研究 |
| 3 人参皂苷Rg1毒理作用研究 |
| 4 展望与前景 |
| 参考文献 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 药品 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 试剂及配制 |
| 2.5 大鼠心脏I/R模型的建立和给药方法 |
| 2.6 TTC和依文思蓝染色 |
| 2.7 心脏表面血流量的测定 |
| 2.8 血流动力学检测心功能 |
| 2.9 组织形态学染色 |
| 2.10 免疫荧光组织化学染色 |
| 2.11 心肌细胞的TUNEL染色 |
| 2.12 蛋白质印迹分析 |
| 2.13 mRNA提取与反转录实时定量PCR |
| 2.14 血清中cTnI,心脏组织中MDA,MPO含量测定及ATP,ADP,AMP含量测定 |
| 2.15 心肌组织中ICAM-1、MPO、CD18的免疫组织化学观察 |
| 2.16 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Rg1对I/R介导的心脏梗死面积的影响 |
| 3.2 Rg1对I/R引起的心脏形态学的影响 |
| 3.3 Rg1对IfR引起的心肌细胞F-actin的影响 |
| 3.4 Rg1对I/R引起的心肌组织和血清中cTnI含量的影响 |
| 3.5 Rg1对I/R引起的心肌细胞凋亡的影响 |
| 3.6 Rg1对I/R引起的凋亡相关蛋白的影响 |
| 3.7 Rg1对I/R引起的PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 3.8 Rg1对I/R引起的Rho激酶及其底物的影响 |
| 3.9 Rg1对I/R引起的心脏血流动力学的影响 |
| 3.10 Rg1对I/R引起的心脏血流量的影响 |
| 3.11 Rg1对I/R后能量代谢的影响 |
| 3.12 Rg1对I/R诱导的大鼠心肌炎症相关因子的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）中药复方双参宁心抗心肌缺血/再灌注损伤作用及线粒体保护机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 综述一 线粒体在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及中药的防治现状 |
| 1 心肌缺血/再灌注导致线粒体内稳态失衡 |
| 2 线粒体在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用 |
| 3 中药对缺血/再灌注心肌线粒体损伤的保护作用 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 心肌缺血/再灌注线粒体能量代谢调节新策略及中药干预 |
| 1 线粒体能量代谢障碍加速心肌I/R损伤进程 |
| 2 干预线粒体能量代谢的新策略 |
| 3 中药干预改善心肌线粒体能量代谢的研究 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 Akt信号通路的激活与心肌缺血/再灌注损伤——线粒体的保护作用 |
| 1 Akt的结构及质膜激活 |
| 2 Akt在心肌I/R损伤中的作用 |
| 3 Akt介导的心肌线粒体保护作用机制 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 技术路线图 |
| 第一部分 双参宁心对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用研究 |
| 一 双参宁心对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的药效学研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 二 双参宁心对缺血/再灌注心肌线粒体损伤的保护作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 双参宁心主要入血活性成分抗心肌细胞缺氧复氧损伤作用研究 |
| 一 双参宁心主要入血活性成分对大鼠乳鼠原代心肌细胞的毒性作用考察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 二 双参宁心主要入血活性成分抗心肌细胞缺氧复氧损伤作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 双参宁心主要入血活性成分抗心肌细胞缺氧复氧损伤机制研究 |
| 一 双参宁心主要入血活性成分对缺氧/复氧损伤心肌细胞呼吸代谢作用的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 二 双参宁心主要入血活性成分抗缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 三 丹酚酸A抗缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡作用机制研究——抑制mPTP开放 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）过氧化物酶模拟酶DhHP-6对心肌缺血再灌注损伤保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 选题的意义及研究背景介绍 |
| 1.2 心肌缺血再灌注损伤及机制研究概况 |
| 1.2.1 自由基与心肌缺血再灌注损伤 |
| 1.2.2 钙超载与心肌缺血再灌注损伤 |
| 1.2.3 细胞调亡与心肌缺血再灌注损伤 |
| 1.2.4 心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡信号转导通路 |
| 1.3 心肌缺血再灌注损伤的治疗药物研究概况 |
| 1.3.1 中药治疗 |
| 1.3.2 化学药治疗 |
| 1.4 抗心肌缺血再灌注损伤多肽类药物及作用机制研究概况 |
| 1.5 SIRT1 与心肌缺血再灌注损伤 |
| 1.5.1 SIRT1 结构 |
| 1.5.2 与 SIRT1 作用的蛋白因子 |
| 1.5.3 Sirtl 的调控因子 |
| 1.5.4 SIRT1 的生物学功能 |
| 1.5.5 SIRT1 与心血管疾病 |
| 1.5.6 小结及展望 |
| 1.6 本论文的研究意义与立题依据 |
| 第2章 DHHP-6 对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验药品与主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型(MI/RI)的制备 |
| 2.2.2 动物分组与给药方法 |
| 2.2.3 心电图(ECG)记录 |
| 2.2.4 血清心肌标志酶 LDH、GOT、CK 的测定 |
| 2.2.5 心肌组织 SOD、MDA 测定 |
| 2.2.6 心肌梗死面积测定 |
| 2.2.7 心肌组织形态学观察 |
| 2.2.8 心肌细胞凋亡检测 |
| 2.2.9 心肌组织 ROS 的检测 |
| 2.2.10 Western Blot 检测Caspase-3、Bcl-2、Bax、SIRT1、P53蛋白表达的变化 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 DhHP-6 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积的影响 |
| 2.3.2 DhHP-6 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心电图 S-T 段改变的影响 |
| 2.3.3 DhHP-6 对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清 LDH、GOT、CK 活性的影响 |
| 2.3.4 DhHP-6 对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血清 SOD、CAT、GSH-Px 活性及 MDA、GSH 含量的影响 |
| 2.3.5 DhHP-6 对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌组织 SOD、CAT、GSH-Px 活性及 MDA、GSH 含量的影响 |
| 2.3.6 DhHP-6 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织病理改变的影响 |
| 2.3.7 DhHP-6 对 MI/RI 大鼠心肌组织 ROS 的影响 |
| 2.3.8 DhHP-6 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 2.3.9 DhHP-6 对 MI/RI 大鼠心肌组织 Caspase-3 蛋白表达的影响 |
| 2.3.10 DhHP-6对MI/RI大鼠心肌组织Bcl-2,Bax 蛋白表达的影响 |
| 2.3.11 DhHP-6对MI/RI大鼠对心肌组织SIRT1 蛋白表达的影响 |
| 2.3.12 DhHP-6 对MI/RI 大鼠对心肌组织P53 蛋白及乙酰化P53 蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 DHHP-6 对体外培养 H9C2 心肌细胞缺氧再给氧损伤保护作用的实验研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验药品、H9c2 心肌细胞、试剂 |
| 3.1.2 试剂配制 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 H9c2心肌细胞缺氧再给氧损伤（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型的构建 |
| 3.2.2 实验分组与给药 |
| 3.2.3 细胞存活率的测定（MTT 比色法） |
| 3.2.4 细胞 LDH、SOD 活性、MDA 含量的测定 |
| 3.2.5 细胞 Ca2+-ATPase 酶活性的测定 |
| 2.2.6 心肌细胞 ROS 的检测 |
| 3.2.7 细胞核DAPI 染色 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 DhHP-6 对缺氧再给氧损伤 H9c2 心肌细胞存活率的影响 |
| 3.3.2 DhHP-6 对缺氧再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 LDH 释放量的影响 |
| 3.3.3 DhHP-6 对缺氧再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 Ca2+-ATPase 活性的影响 |
| 3.3.4 DhHP-6 对缺氧再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 MDA 含量的影响 |
| 3.3.5 DhHP-6 对缺氧再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 SOD 活性的影响 |
| 3.3.6 DhHP-6 对缺氧再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 ROS 的影响 |
| 3.3.7 DhHP-6 对缺氧再给氧损伤 H9c2 心肌细胞凋亡形态的影响（DAPI 染色结果） |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 DHHP-6 对缺氧/再给氧损伤引起 H9C2 心肌细胞凋亡的影响及机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 心肌细胞 |
| 4.1.2 主要试剂及来源 |
| 4.1.3 主要抗体及来源 |
| 4.1.4 主要实验试剂配制 |
| 4.1.5 Western Blot 实验试剂配制 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 心肌细胞培养 |
| 4.2.2 心肌细胞损伤模型的建立及鉴定 |
| 4.2.3 心肌细胞存活率的检测 |
| 4.2.4 细胞活力的检测（MTT 比色法） |
| 4.2.5 细胞 LDH 漏出量的检测 |
| 4.2.6 体外培养心肌细胞 Ca2+-ATP 酶的测定 |
| 4.2.7 Hoechst 33342 荧光染色法检测细胞凋亡 |
| 4.2.8 细胞内 ROS 的检测 |
| 4.2.9 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DhHP-6 对缺氧/再给氧（H/R）损伤H9c2 心肌细胞SIRT1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.2 DhHP-6 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞总 p53 蛋白（T-p53）及乙酰化 p53 蛋白（A-p53）表达的影响 |
| 4.3.3 DhHP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、SIRT1 激活剂Resveratrol 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 SIRT1 蛋白质表达的影响 |
| 4.3.4 DhHP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide 、 SIRT1 激活剂Resveratrol对缺氧/再给氧损伤H9c2心肌细胞T-p53 及A-p53 蛋白质表达的影响 |
| 4.3.5 DhHP-6 与 SIRT1 激活剂 Resveratrol、与 SIRT1 抑制剂Nicotinamide 相互作用对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 p21 蛋白质表达的影响 |
| 4.3.6 DHhP-6 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 MAPK 信号通路中 p-ERK 蛋白、p-P38 蛋白、 p-JNK 蛋白表达的影响 |
| 4.3.7 DHhP-6 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 PI3K/AKT 通路p-AKT 蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.8 DHhP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、ERK 抑制剂 PD98059对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 p-ERK 蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.9 DHhP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、P38 抑制剂 SB203580 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 MAPK 信号通路中 p-P38 蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.10 DHhP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、JNK 抑制剂SP600125 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 MAPK 信号通路 p-JNK 蛋白表达的影响 |
| 4.3.11 SIRT1 激活剂 Resveratrol 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 JNK 信号通路中 p-JNK 蛋白表达的影响。 |
| 4.3.12 JNK 抑制剂 SP600125 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞SITR1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.13 DHhP-6，SIRT1 抑制剂 Nicotinamide，PI3K/AKT 抑制剂LY294002 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 MAPK 信号通路中 p-AKT 蛋白表达的影响 |
| 4.3.14 SIRT1 激活剂 Resveratrol 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 PI3K/AKT 信号通路中 p-AKT 蛋白表达的影响 |
| 4.3.15 PI3K/AKT 抑制剂 LY294002 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 SITR1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.16 DhHP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、AKT 抑制剂LY294002 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞存活率的影响 |
| 4.3.17 DhHP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、AKT 抑制剂LY294002 对缺氧/再给氧损伤心肌细胞凋亡率的影响。 |
| 4.3.18 DhHP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、AKT 抑制剂LY294002 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响 |
| 4.3.19 DhHP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、AKT 抑制剂LY294002 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 Caspase-3 蛋白表达的影响 |
| 4.3.20 DhHP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、AKT 抑制剂LY294002 对缺氧/再给氧损伤 H9c2 心肌细胞 LDH 释放量 的影响 |
| 4.3.21 DhHP-6、SIRT1 抑制剂 Nicotinamide、AKT 抑制剂LY294002 对缺氧/再给氧损伤心肌细胞 ROS 产生的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的主要学术论文及科研成果 |
| 致谢 |
四、IGF-I对ISP损伤大鼠心肌ATP、ADP、AMP变化影响的实验研究（论文参考文献）
- [1]花椒麻味物质对2型糖尿病大鼠蛋白质代谢影响的机制研究[D]. 魏鲟钰. 西南大学, 2021(01)
- [2]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
- [3]左、右归丸对AMPK/mTOR介导的PMOP大鼠糖、脂代谢及能量代谢的实验研究[D]. 史馨钰. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [4]PHLDA1在H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的机制研究[D]. 郭雨萱. 中国医科大学, 2020(01)
- [5]当归多糖通过Oip5-as1调节SIRT1-AMPK-PGC1α通路改善心肌缺血再灌注损伤的实验研究[D]. 牛小伟. 兰州大学, 2019(02)
- [6]益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠心肌线粒体自噬的作用机制研究[D]. 罗晨曦. 北京中医药大学, 2018(02)
- [7]脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的影响机制研究[D]. 赵艳坤. 新疆农业大学, 2017
- [8]人参皂苷Rgl对大鼠心肌缺血再灌注损伤改善作用及机制探讨[D]. 李琳. 北京中医药大学, 2014(08)
- [9]中药复方双参宁心抗心肌缺血/再灌注损伤作用及线粒体保护机制研究[D]. 李雪丽. 北京中医药大学, 2014(01)
- [10]过氧化物酶模拟酶DhHP-6对心肌缺血再灌注损伤保护作用机制研究[D]. 陈晓光. 吉林大学, 2013(08)