一、Fc受体介导HCV跨膜研究系列报告:——丙型肝炎病毒定量及与基因型的关系（论文文献综述）
秦子健[1]（2021）在《机器学习方法用于丙型肝炎病毒抑制剂生物活性的预测研究》文中提出丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起。HCV感染者有很高的风险发展为严重肝病,包括肝硬化和肝纤维化等,而这些严重肝病通常会导致肝细胞癌。据世界卫生组织统计,全球的HCV感染者超过7000万人,且每年在以125万人的数量增加。目前还没有有效对抗HCV的疫苗,且近年来HCV的多基因型与多突变型,使得HCV感染的治疗愈加困难。本论文主要采用计算机辅助药物设计的研究方法,以丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶和NS5A蛋白这两个成药靶点为研究重点,利用化学信息学和机器学习的方法进行抑制剂的活性预测和抑制剂的虚拟筛选研究,利用分子动力学模拟方法进行抑制剂对突变型蛋白的耐药性机理研究,取得了较好的预测效果。此外,利用化学信息学和机器学习的方法对抗炎靶标环氧合酶-2建立了生物活性高低分类模型,取得了较好的分类效果。论文主要研究内容为:（1）使用多元线性回归、支持向量机和随机森林算法构建了 HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂的定量构效关系模型。收集512个抑制剂及生物活性IC50值构建数据集,计算每个分子的CORINA全局描述符和二维自相关描述符,使用多元线性回归（MLR）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）三种机器学习方法建立模型。最优SVM模型ModelD4对测试集的预测决定系数（r2）为0.843、标准误差（SEE）为0.647;最优RF模型ModelC6对测试集的预测r2为0.847、SEE为0.635。对两个最优模型的应用域分析,得知其对训练集和测试集抑制剂的覆盖率均大于97%,说明模型的预测结果可信。此后,将数据集拆分成非大环抑制剂子数据集和大环抑制剂子数据集,使用相同的流程基于子数据集建立模型。结果显示出所有的子模型的预测效果均优于总模型。最终得到两组模型可作为有力的虚拟筛选工具:即SVM总模型ModelD4、非大环抑制剂子模型ModelLB2和大环抑制剂子模型ModelMD2;RF总模型ModelC6、非大环抑制剂子模型ModelLB3和大环抑制剂子模型ModelMD3。通过对模型所用分子描述符的分析,我们得知π原子电荷、孤对电子的原子电负性是较为重要的理化性质,可旋转键个数是连接非大环抑制剂和大环抑制剂之间的桥梁。（2）使用定量构效关系模型方法和三维形状与静电相似性比对方法进行了 HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂的虚拟筛选。筛选了 Specs数据库和ChemDiv数据库,两数据库总计超过1 81万个小分子。使用两种方法平行对数据库进行虚拟筛选,第一种方法是使用定量构效关系模型预测的方法,通过之前建立的三个SVM模型对数据库中所有分子的生物活性IC50值进行预测,最终得到367个平均预测活性IC50低于100 nM的非大环分子;第二种方法是基于配体化合物的三维形状与静电相似性比对的方法,将上市药物对应的晶体结构中的配体构象作为模版分子构象,找出数据库中与模版分子构象在三维形状、化学基团和静电相似性之和较高的分子,最终得到相似性指数高于1.2的119个非大环分子和22个大环分子。两种筛选方法共筛选得到508个分子。随后,对这508个分子的进行结构聚类,仅保留每个聚类中心预测活性最高的85个分子。通过手动分类,将85个分子根据它们的分子骨架划分为13类,保留了每类骨架中预测活性最高的分子作为候选分子。最后,通过分子对接、分子动力学模拟、结合自由能计算和结合模式分析,进一步对虚拟筛选结果进行验证,得到3个可以与NS3/4A蛋白酶具有较强相互作用的候选分子,它们可用于进一步研究。（3）使用比较分子力场分析（CoMFA）方法和比较分子相似性指数分析（CoMSIA）方法构建了 HCVNS5A蛋白吲哚四环类抑制剂对野生型与突变型蛋白活性的三维定量构效关系模型。收集了 196个吲哚四环类抑制剂以及它们的三组生物活性,即野生型GT-1a、突变型GT-1a Y93H和突变型GT-1a L31V的EC90值构成三组数据集。使用OMEGA程序对每个抑制剂生成了 600个构象,并使用ROCS进行分子叠合。使用CoMFA和CoMSIA方法分别建立模型。在建模过程中,我们定义了四个参数选择规则和一个过训练评价公式来选择最佳参数。对于三组数据集GT-1a、GT-1a Y93H和GT-1a L31V,最优模型的测试集预测决定系数（r2）分别为0.682、0.779 和 0.782,标准误差（SEE）分别为 0.418、0.608和0.560。通过对最优模型的等势图分析,总结出在药物艾尔巴韦（elbasvir）分子Z基团对位引入一个相对较小、非负电、疏水、无氢键受体的基团,将Z基团的苯环替换为杂环,在四环核心基团上引入体积较小的吸电子取代基,在缬氨酸的异丙基中引入氢键受体且不要替换为体积过大的基团,在脯氨酸中引入疏水性基团且不要引入氢键受体和负电基团可以同时提高抑制剂对野生型蛋白和两个突变型蛋白的生物活性。（4）利用分子对接和分子动力学模拟方法完成了 HCVNS5A蛋白上市药物艾尔巴韦对突变型Y93H和L31V的耐药性机理研究。结合PDB和NCBI数据库,手动补全NS5A蛋白缺失的N端残基,构建完整的野生型NS5A蛋白的三维结构。随后手动突变构建了 Y93H和L31V两种单突变型蛋白的三维结构。将药物分子艾尔巴韦（elbasvir）分别对接至三个蛋白的结合口袋中,构建初始复合物体系。使用Amber程序对三组复合物体系平行进行分子动力学模拟,包含能量最小化、加热、恒压、平衡和80ns的生产模拟。通过对模拟过程中RMSD的变化、结合自由能的计算、结合自由能的分解和结合模式的分析,从分子角度推断了两突变导致艾尔巴韦分子抑制活性降低的主要原因:对于Y93H突变,由于H93与药物分子的咪唑发生静电排斥,使药物分子在口袋中发生较大偏移和翻转,从而降低了抑制活性;对于L31V突变,由于V31使得蛋白linker部分的柔性增大,使得linker与药物分子的帽子基团相互作用减弱,从而降低了抑制活性。（5）使用支持向量机和随机森林算法构建了环氧合酶-2（COX-2）抑制剂的生物活性分类模型,并使用K均值和t分布随机邻域嵌入算法进行分子骨架聚类研究。收集2925个COX-2抑制剂和生物活性IC50值,使用1 μM作为阈值将抑制剂定义为高、低活性,使用MACCS指纹、ECFP4指纹和CORINA分子描述符表征每个分子,使用支持向量机（SVM）和随机森林（RF）两种机器学习算法建立模型。此外,我们进一步将2925个抑制剂以0.1μM和10 μM作为阈值定义为高、中、低活性,并去除中间活性抑制剂,使用剩余的1630个抑制剂建立活性分布更加明确的分类模型,得到的最优模型是以ECFP4指纹建立的随机森林模型,其对外部测试集的马修斯相关系数（MCC）达到0.68。以MACCS指纹为输入,使用K均值聚类算法和t分布随机邻域嵌入算法将抑制剂聚类为8个子集。通过描述符分析和聚类分析,得知芳香族氮原子、卤素原子、含硫双键和含氧双键对生物活性有利,而羟基、非芳香性双键氮原子对生物活性不利。综上所述,本论文以HCV的NS3/4A蛋白酶和NS5A蛋白这两个药物靶标作为研究重点。对于NS3/4A蛋白酶靶点,我们使用基于配体的药物筛选方法建立抑制剂的生物活性预测模型并用于虚拟筛选,用于发现具有新颖骨架的候选分子。对于NS5A靶点,我们使用基于配体和基于受体的药物设计研究方法,探究上市药物分子对野生型和突变型蛋白生物活性的差异,探索抑制剂对突变产生耐药性的原因。此外,本论文涉及第三个药物靶标,即对抗炎药物靶标COX-2进行了化学信息学相关研究。本论文的研究工作对基于HCVNS3/4A蛋白酶、HCVNS5A蛋白和COX-2的药物设计具有一定的参考价值。
朱丹[2]（2021）在《生物信息学预测丙肝病毒与登革病毒T细胞交叉反应的研究》文中研究表明[目 的]本研究以丙型肝炎病毒（HCV）和登革病毒（DENV）两种黄病毒科病毒基因结构、地理分布、感染人群等方面的分析为线索,利用生物信息学方法检验两种病毒之间是否存在相似的氨基酸序列,这些序列是否可以诱导两种病毒特异性的T细胞免疫反应,以及这种T细胞交叉反应在不同HCV基因型之间是否存在差异。[方 法]通过GenBank数据库下载两种病毒不同基因型和血清型的氨基酸序列;使用蛋白质比对数据库Blastp和生物信息学软件DNAMAN 8.0比对分析DENV与HCV氨基酸序列,筛选两种病毒之间5个及以上相同且连续的氨基酸序列作为备选序列,依次用小写字母a、b、c等表示对应序列。根据两种病毒的原始氨基酸序列,将筛选出的备选序列两端分别延长10个氨基酸,用大写字母A、B、C等表示对应序列。以DENV 1型氨基酸序列为参照,通过序列分析软件BioEdit进行HCV与DENV之间对应位置氨基酸保守性比较。最后,以两种病毒代表序列为参照,将延长后的备选序列导入生物信息学软件（SYFPEITHI、NetMHCpan4.1、NetMHCⅡpan4.0）进行 CD4+、CD8+T 细胞表位预测,评估 DENV与HCV在延长后的备选序列中对应位置共有的表位分值,比较HCV基因1型与HCV基因3型预测得分值的差异。[结 果]通过序列比对,发现DENV的NS3区与HCV的NS3区之间存在两条相对保守且连续5个以上的氨基酸序列,分别为备选序列a（TATPPGSV）和备选序列b（GRRQR）;在备选序列a方面,DENV与HCV的相似程度比其他黄病毒属氨基酸序列高。在备选序列a中,DENV不同血清型之间存在1-2氨基酸位点的变异;分析DENV与HCV之间的变异情况时发现,三条HCV基因1a型序列与DENV 1型完全相同,HCV基因1b型中有两条序列与DENV 1型完全相同,仅有一条与DENV 1型有1个氨基酸不同（TATPPGSI）。而HCV基因3型所有序列都有1个氨基酸与DENV 1型不同,并且都是V到I的变异（TATPPGSI）。备选序列b在两种病毒的不同基因型和血清型中完全相同。扩大HCV氨基酸序列数量,比较DENV与HCV两段相同序列间的变异情况,发现该结果与上述结果一致,HCV基因3型表现了更显着的V到I的变异（TATPPGSI）。在对延长后的A序列CD4+T细胞表位预测分析发现,通过SYFPEITHI软件预测出6条DENV表位可能与HCV存在潜在交叉反应,且xxxxxxxTATPPGSx（DENV与HCV相同的位点用氨基酸缩写符号表示,其余位置用x代替）所对应的等位基因HLA-DRB1*0101在HCV基因1型中预测得分高于HCV基因3型（27 vs.19）,其余五条预测表位中HCV基因1型与HCV基因3型得分无差异。利用NetMHCⅡpan4.0在线软件对DENV 1-4型A序列进行表位预测发现其潜在表位主要集中在 xxxxxxxxTATPPGS、xxxxxxxTATPPGSx、xxxxxxTATPPGSxx、xxxxxTATPPGSxxx。将 DENV 与 HCV 对应以上四个主要潜在表位进行分析,发现等位基因 HLA-DRB1*04、DRB4*01 以及DQA10103-DQB10603与HCV基因1型预测得分均高于HCV基因3型。对延长后的A序列进行CD8+T细胞表位预测分析发现,利用SYFPEITHI在线软件预测出11条DENV与HCV可能存在潜在交叉反应的表位。其中6条HCV基因1型潜在表位预测得分高于HCV基因3型,仅1条HCV基因3型得分高于HCV基因1型。采用NetMHCpan4.1对DENV进行免疫表位预测时共预测出17条潜在表位,但与HCV无相对应的潜在表位。对延长后的B序列进行CD8+T细胞表位预测发现,通过SYFPEITHI在线软件预测出12条DENV与HCV可能存在潜在交叉反应的表位,其中有2条HCV基因1型潜在表位预测得分高于HCV基因3型。利用NetMHCpan4.1预测出1条DENV与HCV可能存在潜在交叉反应的CD8+T细胞表位,且HCV基因1型预测得分高于HCV基因3型（0.429 vs.0.421）。通过SYFPEITHI、NetMHCⅡpan4.0在线软件进行DENV与HCV CD4+T细胞免疫表位预测显示,两种病毒之间无对应的潜在表位。[结 论]HCV与DENV之间在NS3区存在相对保守的氨基酸序列,并且两种病毒的对应序列预测出潜在的CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位,HCV基因1型所对应的预测表位分值明显高于HCV基因3型。这提示了 HCV与DENV之间可能存在潜在的T细胞免疫交叉反应,并且DENV特异性T细胞免疫反应可能成为影响HCV基因3型地理分布的原因。此外,这些潜在表位也可为今后HCV与DENV联合疫苗的研发及设计提供一定的理论基础。
邵榆岚[3]（2021）在《抗寨卡病毒和登革病毒药物筛选体系建立及DAA药物的药效评价》文中指出寨卡病毒（ZIKV）和登革病毒（DENV）是最常见的虫媒病毒,通过节肢动物尤其是埃及伊蚊（Aedes.aegypti）或白纹伊蚊（Aedes.albopictus）叮咬感染哺乳动物和人类,经过血液和性接触等在人与人之间传播。近年来,寨卡病毒和登革病毒已经呈现全球广泛流行的严峻态势。据报道,全球约有100多个国家和地区报告了寨卡病毒传播病例,128个国家近40亿人面临登革热病毒感染的风险。我国西南边境的云南省常年遭受东南亚输入性风险和本地感染等巨大威胁。至今,针对寨卡病毒和登革病毒尚无疫苗预防,并且没有特异性治疗药物被批准,灭蚊防叮咬和临床上采用适应症治疗是应对寨卡病毒和登革病毒感染的主要预防控制手段。因此,寨卡病毒和登革病毒的特异性药物研究成为刻不容缓的重要任务。采用已批准的直接抗病毒药物（DAA）治疗是新发病毒药物研究的重要策略之一,DAA药物有可能在黄病毒属病毒上扩大适用症,用于危害严重的寨卡热和登革热患者治疗。本研究论文首先建立抗寨卡病毒和登革病毒体外药物筛选的方法体系,然后通过生物信息学分析比较靶标蛋白、分子对接候选DAA化合物,确定待测DAA化合物后进行体外药物效果评价,以期确定现有DAA药物体外抗寨卡病毒和登革病毒的效果,为临床用药提供实验数据。首先,建立抗寨卡病毒和登革病毒体外药物筛选方法体系。细胞毒性实验方法为铺板量1×104cells/孔的BHK-21细胞培养过夜后加入阳性药物Ribavirin,作用48 h和72 h的细胞毒性CC50分别为240.5μM和289μM。药物有效性实验方法是在细胞铺板过夜后,采用寨卡病毒和登革病毒最适感染量每孔1×105copies孵育2 h后加入Ribavirin,作用48 h和72 h的抗寨卡病毒有效性EC50分别为1.616μM和3.439μM,抗登革病毒有效性EC50分别为5.919μM和0.2739μM。Ribavirin对ZIKV作用48 h时的选择指数为148.5、72 h时的选择指数为86.25;Ribavirin对DENV2作用48 h的选择指数为40.63、72 h时的选择指数为1087.99。然后,理论分析常见黄病毒科病毒靶标蛋白的基本特征和结构比对,候选DAA化合物与ZIKV、DENV2靶标蛋白进行分子对接和相互作用分析。结果表明,黄病毒属病毒的聚合酶蛋白二级结构组成与分布比蛋白酶蛋白更具有相似性;ZIKV、YFV、WNV的蛋白酶三级结构相似性较高,ZIKV、DENV2、JEV的聚合酶三级结构相似性较高;HCV蛋白酶和聚合酶靶标蛋白与小分子配体的对接口袋适用于黄病毒属病毒;ZIKV、WNV、JEV的蛋白酶进化关系较近,DENV2和YFV的蛋白酶进化关系较近,ZIKV、DENV2、HCV、YFV的聚合酶进化关系较近。分子对接结果确定了Lopinavir、Paritaprevir、Sofosbuvir和Dasabuvir作为待测的DAA化合物;相互作用分析ZIKV蛋白酶与其抑制剂结合比DENV2稳定,Sofosbuvir与ZIKV、DENV2聚合酶靶标蛋白结合比Dasabuvir稳定。最后,待测DAA化合物对寨卡病毒和登革病毒的抗病毒效果进行体外评价,初步获得药物选择指数,采用最适药物浓度进行不同的药物作用时间、病毒感染时间、病毒感染剂量等方面的病毒抑制作用,并且采用药物半数有效浓度进行多靶标联合用药效果评价。结果表明,DAA化合物Lopinavir、Paritaprevir、Dasabuvir、Sofosbuvir治疗ZIKV 48 h时的选择指数SI值分别为1466.92、1214.67、949.15、5.87,Lopinavir、Paritaprevir、Dasabuvir治疗DENV2 48 h的选择指数SI值分别为540.68、721.13、1173.40,Sofosbuvir治疗DENV2 72 h的选择指数SI值为14.98,4种DAA化合物对ZIKV、DENV2均表现为低毒高效的作用。进一步分析化合物最适药物浓度,随着药物作用时间延长,4种DAA化合物对ZIKV仍然表现出较好抗病毒效果,而对DENV2的病毒抑制率呈下降趋势,其中聚合酶抑制剂对DENV2作用效果较好;随着病毒感染孵育时间延长,4种DAA化合物对ZIKV和DENV2抑制率均降低,Sofosbuvir是长时间感染病毒后治疗效果最好的药物;随着病毒浓度的增加,4种DAA化合物对ZIKV抑制率均降低,聚合酶抑制剂对高剂量DENV2仍然具有明显的抗病毒效果。Lopinavir与Ribavirin或Dasabuvir的联合用药对ZIKV治疗效果最好,Paritaprevir与Sofosbuvir的联合用药抗ZIKV效果较好;Lopinavir的联合用药对DENV2治疗效果不佳,Paritaprevir与Ribavirin或Sofosbuvir的联合用药对DENV2抑制效果较好。综上所述,本研究成功建立了抗寨卡病毒和登革病毒体外药物筛选的方法体系。从理论角度揭示了黄病毒科病毒以蛋白酶和聚合酶作为药物靶标,蛋白质结构方面具有相似性,预示DAA药物能够用于治疗黄病毒属病毒。通过实验数据验证了Lopinavir、Paritaprevir、Dasabuvir、Sofosbuvir对寨卡病毒和登革病毒的药物效果。为治疗寨卡病毒和登革病毒临床用药提供参考。
何延华[4]（2020）在《非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种重要的牛传染性疾病,其隐秘性、长时间一过性感染以及持续感染动物形成的病毒存储库使得BVD-MD在全球牛群中肆虐,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NCP（noncytopathic）BVDV感染能够引起牛免疫力下降,继发其它病原微生物感染,其主要原因是NCP BVDV感染不能很好地诱导细胞产生固有免疫应答。Ⅰ型干扰素（type I interferon,IFN-Ⅰ）通路是固有免疫的主要组成部分,在机体控制并清除病原体的过程中扮演关键角色。目前,BVDV免疫抑制及持续感染的分子机制仍然不清楚,为了进一步明确NCP BVDV的致病机理,了解病毒与宿主之间的相互作用关系,本论文对NCP BVDV抑制IFN-Ⅰ产生的分子机制进行探索性研究。目的:（1）通过转录组测序技术获得NCP BVDV感染宿主细胞的m RNA文库,以生物信息学为平台分析NCP BVDV诱导的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）富集的通路和参与的细胞过程,为理解病毒与宿主之间的相互作用奠定基础（2）构建牛IFN-β（Bo IFN-β）启动子荧光素酶报告系统分析了NCP BVDV及其非结构蛋白对干扰素表达的影响,鉴定NCP BVDV抑制宿主干扰素生成的靶标。同时,为今后研究病毒抑制Bo IFN-β的作用机理提供便利工具。（3）对NCP BVDV诱导宿主细胞上调表达的牛SIKE1（Bo SIKE1）基因进行功能研究,确定Bo SIKE1与BVDV增殖的关系,为阐明SIKE1在固有免疫应答中作用机制提供依据。方法:（1）首先,利用牛外周血单核细胞分离液分离了牛外周血单核细胞,经流式细胞仪检测单核细胞表面抗原CD14的表达水平,然后用NCP BVDV感染牛单核细胞,在感染不同时期收集样本。在Illumina Hiseq 2500测序平台测序,测序结果利用生物信息学方法分析DEGs,随后对DEGs进行GO和KEGG聚类分析,筛选IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs进行荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证。（2）其次,利用分子生物学技术克隆牛的IFN-β启动子功能元件序列,构建荧光素酶报告系统,利用荧光素酶报告基因分析方法检测NCP BVDV及其非结构蛋白对poly（I:C）诱导的IFN-β、NF-κB和IRSE的荧光素酶活性,采用蛋白免疫印迹法检测IFN-Ⅰ通路相关分子IRF7、IRF7磷酸化和RIG-I蛋白的表达情况,验证NCP BVDV及非结构蛋白对抑制宿主IFN-Ⅰ产生的影响。（3）最后,克隆及表达Bo SIKE1基因,制备相应的多克隆抗体,通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹法验证过表达和干扰Bo SIKE1对BVDV增殖的影响。采用LC-MS/MS和Co-IP等方法筛选Bo SIKE1的互作蛋白。结果:（1）NCP BVDV感染牛单核细胞后,细胞免疫荧光检测显示成功构建了NCP BVDV体外原代细胞感染模型;对转录组测序分析,在感染2 h后,筛选出DEGs 9959个,其中4968个DEGs上调;在感染24 h后,筛选出DEGs 7977个,其中4184个DEGs表达上调;进一步分析免疫应答途径相关DEGs,对感染2 h与24 h的DEGs进行比较,感染2 h与免疫反应或抗病毒活性相关的DEGs明显高于24 h;利用KEGG聚类分析筛选95个Ⅰ型干扰素信号通路相关的DEGs,利用q RT-PCR证实了筛选的干扰素信号通路、干扰素刺激基因（Interferon（IFN）-stimulated genes,ISGs）和参与固有免疫应答的基因（IRF7、DDX3X、TLR13、DDX 58、MVAS、TLR9、TRAF6、IRF1、IFIT1、STAT1、ISG20、TRIM25、Mx1、NLRX1、CYLD、SIKE1和ZAP70）的差异表达水平与转录组测序结果基本一致。（2）克隆Bo IFN-β的启动子功能元件序列,成功的构建Bo IFN-β基因启动子荧光素酶报告系统;利用抗性基因筛选获得Bo IFNβ3-Luc-MDBK细胞系,用NCP BVDV感染Bo IFNβ3-Luc–MDBK细胞发现NCP BVDV毒株感染可明显抑制poly（I:C）诱导的IFN-β3的转录活性,同时也抑制了下游抗病毒基因的表达;基因合成NCP BVDV的7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)基因并连接慢病毒载体,酶切鉴定和测序表明重组慢病毒载体构建成功,并且包装的慢病毒感染MDBK后能够表达目的基因;通过荧光素酶报告系统检测NCP BVDV及7个非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu IRSE和Bo IFN-β的荧光素酶活性,结果表明,NCP BVDV能够抑制IFN-β的转录表达,其中非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-β的转录表达有显着的抑制作用;在HEK293T细胞中过表达NS4B蛋白,可以显着抑制IRF7的表达以及磷酸化水平,对RIG-I的表达没有抑制作用。（3）克隆到Bo SIKE1基因的ORF为642 bp,同源性分析发现,Bo SIKE与羊、猪、人和鼠的氨基酸相似度分别为99%、96.1.0%、94.2%和91.1%;构建原核重组表达质粒p ET22b-Bo SIKE1,转化大肠杆菌并表达了约为25 k Da的目的条带,通过诱导条件优化Bo SIKE1融合蛋白均以包涵体形式表达,纯化Bo SIKE1蛋白并成功制备了兔多克隆抗体,抗体ELISA效价检测抗体滴度达到1:128000以上;通过过表达和干扰验证了Bo SIKE对BVDV增殖的影响,Bo SIKE1过表达后引起BVDV复制增强,干扰Bo SIKE1的表达会引起BVDV复制降低,Bo SIKE具有抑制抗病毒免疫的作用。LC-MS/MS和Co-IP数据显示Bo SIKE1与微管蛋白TUBA1D之间存在直接相互作用。推测SIKE可能介导固有免疫所需的细胞骨架重排,是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。结论:（1）成功构建NCP BVDV感染牛原代免疫细胞模型并获得不同感染时间转录组差异表达谱,筛选了95个IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs。（2）通过干扰素启动子荧光素酶报告系统检测发现,NCP BVDV非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-Ⅰ的产生具体抑制作用。（3）Bo SIKE1能够影响NCP BVDV的增殖,Bo SIKE1与TUBA1D之间存在直接相互作用,推测Bo SIKE1蛋白可能是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。
刘存[5]（2020）在《BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响》文中认为牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是一种可感染多种偶蹄动物的传染性病原,可引起牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD）,可造成严重的经济损失。天然免疫在抗病毒感染中发挥重要的作用,其与病毒间相互作用的分子机制,可以为疫病防控提供新的思路。干扰素（Interferon,IFN）系统是天然免疫的重要组成部分,而干扰素诱导蛋白是干扰素系统的效应分子,发挥直接抗病毒作用。黏病毒抵抗蛋白（Myxovirus-resistant protein,Mx）是IFN诱导抗病毒状态的关键成分,对其抗病毒作用机制的研究,有助于对病原与宿主间相互作用的认识。本文主要从BVDV与宿主相互作用的角度,围绕BVDV感染牛肾细胞（Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK）前后转录组学变化及牛Mx1蛋白对BVDV感染作用的影响进行了研究,获得了以下结果。1.分离鉴定了BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株2株病毒（1）通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光等方法由牛血清和胎牛血清中分离、鉴定2株BVDV毒株,命名为BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株。利用BVDV 5’UTR序列基因型分型分析,发现BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株分别属于1a和1b基因型。（2）通过氨基酸序列比对分析和同源性比较分析,发现BVDV BJ-2013株的NS2蛋白氨基酸序列中存在12个氨基酸（LGEGNWLVNADR）的插入,BVDV BJ-2013株与BVDV 08GB44-1株的核苷酸和氨基酸同源性最高,而BVDV BJ-2016株与BVDV HJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性最高。通过遗传演化分析,BVDV BJ-2013株与BVDV08GB44-1、Oregon株位于同一分支,亲缘关系较近;BVDV BJ-2016株与BVDV HJ-1、PJ、08GB45-2等分离毒株被分配于同一进化分支中,显示它们之间的亲缘关系较近。2.BVDV感染MDBK细胞前后转录组学的比较分析（1）通过转录组学测序技术,比较了BVDV BJ-2016株感染MDBK细胞前后不同时间的细胞转录组的变化。结果显示,共获得转录本53929条,注释到24616个基因,注释到新转录本26651条、新基因2359个。（2）通过基因差异表达分析,在Mock vs MBV 2h、Mock vs MBV 6h、Mock vs MBV12h、Mock vs MBV 24h比较组中分别筛选了1297、1732、3072、1877个差异表达基因。通过差异表达基因的GO富集分析、KEGG pathway富集分析等,发现BVDV感染细胞后引起脂质代谢相关基因的表达上调,表明BVDV感染后改变了细胞的代谢网络;发现BVDV感染细胞后引起补体和凝血级联反应信号通路中F3、C3、C1R等基因表达下调和部分具有抗病毒作用基因（如ISG15、IFITM1、Mx1等）的表达呈现显着变化,提示补体系统在BVDV感染过程中发挥重要作用,提示BVDV感染后对细胞内天然免疫的抑制有助于其感染形成。3.牛Mx1蛋白对BVDV的复制具有抑制作用（1）通过牛Mx1基因过表达慢病毒和sh RNA干扰慢病毒的感染,分别建立了Mx1基因稳定过表达和稳定敲低的MDBK细胞系。鉴定结果显示,牛Mx1基因稳定过表达细胞系中Mx1基因的表达上调5.15倍,Mx1基因稳定敲低的细胞系中Mx1基因的敲低效率达93.03%。通过BVDV分别感染Mx1基因稳定过表达和稳定敲低的细胞系,检测BVDV复制水平,结果显示,牛Mx1基因的过表达可显着抑制BVDV复制（P<0.01）,而Mx1基因的敲低显着促进BVDV复制（P<0.01）,表明牛Mx1蛋白对BVDV复制具有抑制作用。（2）通过在反转录过程引入非病毒序列对BVDV正负链RNA进行区分,建立了BVDV链特异性荧光定量PCR方法。通过BVDV感染Mx1基因稳定过表达和稳定敲低细胞,检测细胞内BVDV正负链RNA的变化,结果显示,Mx1基因的过表达降低了细胞中BVDV正负链RNA的含量,在BVDV感染后12～24 h间显着降低细胞内BVDV正链RNA的含量（P<0.05或P<0.01）,在感染后6～36 h间,显着降低了BVDV负链RNA的含量（P<0.05或P<0.01）,显示Mx1基因过表达抑制BVDV正负链RNA的复制;Mx1基因的敲低提高了细胞中BVDV正负链RNA的含量,BVDV感染后6～36 h间显着提高了BVDV负链RNA的含量（P<0.01）,而BVDV正链RNA仅在BVDV感染后24～36 h呈显着提高（P<0.05）,显示Mx1基因的敲低促进正负链RNA复制。结果表明,Mx1蛋白对BVDV正负链RNA的复制具有抑制作用。综上所述,本研究分离鉴定了BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株2株病毒,明确了BVDV感染MDBK细胞前后转录组学变化及其部分差异基因的作用,建立了BVDV链特异性荧光定量PCR方法,发现牛Mx1蛋白显着抑制BVDV复制及BVDV正负链RNA的复制。研究结果为解析BVDV与宿主间的相互作用和牛Mx1蛋白抗BVDV感染作用及机制提供了新的科学资料。
张维达[6]（2020）在《一株新疆PRRSV的分离鉴定及其对猪FcRn蛋白丰度的影响》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,又称为猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起母猪的繁殖障碍和仔猪严重的呼吸系统疾病的高度接触性传染病。自2006年以后,我国在江西、河南、湖南等省发生了高致病性蓝耳病（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS）,给我国养猪业带来了严重的经济损失,所以对PRRSV的遗传进化规律和致病机制的探究具有重要意义。黏膜免疫作为机体免疫系统重要的组成部分之一,主要是通过多聚免疫球蛋白受体（polymeric immunoglobulin receptor,p Ig R）介导Ig A转运到黏膜表面发挥作用;在黏膜分泌物中存在的Ig G也发挥着重要的生物学作用。Ig G转运到黏膜表面主要是通过新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor,Fc Rn）介导,并在黏膜表面保护机体防止病原入侵的过程中起着重要作用。PRRSV可以通过子宫阴道黏膜或者呼吸道黏膜感染进一步进入机体,并对机体的免疫系统产生强烈的免疫抑制,所以Fc Rn在抗PRRSV感染中也可能起到重要的作用。目前有关Fc Rn的研究主要集中在人和小鼠方面,对猪Fc Rn及其在病毒感染机体中所发挥功能的研究很少。本研究以人和小鼠的Fc Rn功能以及本实验室在病原感染对猪Fc Rn表达调控方面的研究为基础,聚焦于PRRSV感染对宿主细胞Fc Rn表达的影响,以期为PRRSV免疫逃逸和持续性感染的分子机制研究提供线索。主要研究内容和结果如下:1.HP-PRRSV的分离鉴定与遗传进化分析本研究于2018年从新疆某猪场采集的病猪血液中分离了一株PRRSV,命名为XJ-China-2018。对临床样品采用RT-PCR扩增鉴定,在Marc-145细胞上进行病毒分离培养,采用间接免疫荧光对细胞培养物进行鉴定。通过噬斑纯化后,利用RT-PCR对分离株的全基因组进行扩增,应用Seq Man软件对测序结果进行拼接,并根据NCBI上已公布的PRRSV全基因组作为参考,将Nsp2和ORF5基因核苷酸序列进行遗传进化与同源性对比分析。结果表明临床病料经RT-PCR检测呈PRRSV核酸阳性,处理后的病料接种至Marc-145细胞72h之后产生CPE,间接免疫荧光鉴定为PRRSV抗原阳性。全基因组、Nsp2基因和ORF5基因核苷酸序列分析和同源性比对显示该分离毒株属于中国的高致病性PRRSV亚群。2.HP-PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞对Fc Rn表达的影响以及分子机制研究首先使用细胞自动计数仪和间接免疫荧光检测,排除了HP-PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）引起细胞死亡对Fc Rn检测过程造成的影响。Western-blot结果显示PRRSV感染PAMs能够显着下调Fc Rn的蛋白水平。同时发现PRRSV JXA1-R弱毒株与新疆分离株XJ-China-2018都能下调PAMs细胞Fc Rn的蛋白水平,且这种下调趋势呈剂量依赖性,可能与病毒的复制有关。为了探究PRRSV下调PAMs中Fc Rn表达的分子机制,使用蛋白酶抑制剂MG132和细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK分别作用PRRSV感染后的PAMs细胞,结果发现只有MG132能够显着抑制PRRSV感染细胞引起的Fc Rn下调作用。以上结果表明HP-PRRSV感染可能诱导Fc Rn通过蛋白酶体途径降解,从而导致PAMs中Fc Rn蛋白丰度下降。综上所述,本实验从临床病料成功分离了一株PRRSV,进一步研究表明PRRSV可能通过蛋白酶体途径下调Fc Rn的蛋白水平。本研究为PRRSV感染抑制黏膜免疫的分子机制提供了新的理论依据,为PRRSV免疫逃逸和持续性感染的研究提供了新线索。
张留君[7]（2020）在《PAM中的激活型Fcγ受体和Sn受体抑制PRRSV-ADE感染中的天然抗病毒免疫应答》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是影响全世界猪生产的最为重要的传染性疾病之一。PRRS以母猪的繁殖失败和仔猪的呼吸窘迫为主要特征。引起PRRS的病原体为猪繁殖与呼吸综合症病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）。PRRSV隶属于尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）家族,是一种具有囊膜结构的、单股正链的RNA病毒。PRRSV具有非常严格的噬猪的单核/巨噬细胞系特性,并且,完全已经分化的猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophage,PAM）是PRRSV感染的主要目标细胞。在自然条件下,PRRSV只能够感染各种年龄阶段的猪。PRRSV感染猪后能够引起猪的免疫抑制并在已感染猪的体内长期存在而造成持续性的感染。虽然,已经被感染的猪能够产生快速的体液免疫应答。但是,PRRSV感染猪后所诱导产生的抗PRRSV的亚中和抗体或非中和抗体可能会通过Fc受体介导的抗体依赖性增强作用（Antibody-dependent enhancement,ADE）而有助于PRRS的发展。ADE不仅有利于PRRSV持续性感染的发病机理,而且还是开发有效针对PRRSV的疫苗的主要障碍。然而,PRRSV-ADE感染的精确机制仍旧是令人困惑地。因此,清楚地了解病毒通过ADE途径引发感染的事件过程对于有效地防控PRRSV感染至关重要。猪的激活型Fcγ受体（Fc gamma receptor,FcγR）（FcγRⅠ 和 FcγRⅢ）和猪的 Sn（Sialodhesin,Sn）受体均已经被克隆许多年。但是,它们在PRRSV-ADE感染介导的天然抗病毒免疫应答中的作用还没有被研究。本研究旨在探索猪的激活型FcγR和猪的Sn（pSn）受体在PRRSV-ADE感染介导的天然抗病毒免疫应答中的作用,以增强人们对于PRRSV-ADE感染机制的理解,从而为PRRSV感染的预防和治疗提供参考。一、PRRSV-ADE感染抑制PAM中的天然抗病毒免疫应答在本次的研究中,我们的结果显示,PRRSV感染诱导PAM中的干扰素α（Interferon-α,IFN-α）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素10（Interleukine-10,IL-10）的表达水平,表明了 PRRSV感染能够诱导天然抗病毒免疫应答。我们的结果也显示,猪抗PRRSV的特异性IgG能够介导PRRSV-ADE感染,并且PRRSV-ADE感染抑制PAM中的IFN-α和TNF-α的表达水平,而增强IL-10的表达水平,表明了 PRRSV-ADE感染能够抑制天然抗病毒免疫应答。二、PAM中的激活型Fcγ受体和Sn受体参与PRRSV-ADE感染在本次的研究中,我们的结果显示,PAM中的FcyRⅠ和FcγRⅢ表达水平的降低都抑制PRRSV-ADE感染,表明了猪的激活型FcγR能够参与PRRSV-ADE感染。我们的结果还显示,PAM中pSn受体的pSn1、pSn2、pSn3、pSn4、pSn5和pSn6结构域的封闭都抑制PRRSV-ADE感染,表明了pSn受体能够参与PRRSV-ADE感染,并且pSn受体的pSn1、pSn2、pSn3、pSn4、pSn5和pSn6结构域在介导PRRSV-ADE感染的过程中发挥着重要的作用。三、激活型Fcγ受体的激活抑制PAM中的天然抗病毒免疫应答在本次的研究中,我们的结果显示,FcγRⅠ的激活和FcyRⅢ的激活都抑制PAM中的IFN-α和TNF-α的表达水平,而增强IL-10的表达水平,表明了猪激活型的Fc γR信号能够抑制天然抗病毒免疫应答。我们的结果也显示,PAM中的FcγRⅠ的激活和FcγRⅢ的激活都抑制poly（I:C）诱导的IFN-α和TNF-α的表达水平,而都增强poly（I:C）诱导的IL-10的表达水平,表明了猪激活型的FcγR信号能够抑制poly（I:C）诱导的天然抗病毒免疫应答。此外,我们的结果还显示,PAM中的FcyRⅠ的激活和FcγRⅢ的激活都抑制PRRSV感染诱导的IFN-α和TNF-α的表达水平,而都增强PRRSV感染诱导的IL-10的表达水平并都促进PRRSV的复制水平,表明了猪激活型的FcγR信号能够抑制抗PRRSV感染的天然抗病毒免疫应答。四、Sn受体的激活抑制PAM中的天然抗病毒免疫应答在本次的研究中,我们的结果显示,PAM中pSn受体的pSn1、pSn2、pSn3、pSn4和pSn5结构域的激活都抑制IFN-α和TNF-α的表达水平,而都增强IL-10的表达水平,表明了 pSn受体信号能够抑制天然抗病毒免疫应答,并且pSn受体的pSn1、pSn2、pSn3、pSn4和pSn5结构域在抑制天然抗病毒免疫应答的过程中发挥着重要的作用。综上所述,我们当前的研究证实了 PRRSV-ADE感染能够抑制PAM中的IFN-α和TNF-α的表达水平而增强IL-10的表达水平。我们的研究还证实了 PAM中的FcyRⅠ、FcγRⅢ和pSn受体都能够参与PRRSV-ADE感染,并且这三种受体的激活信号都能够抑制PAM中的IFN-α和TNF-α的表达水平而增强IL-10的表达水平。因此,PRRSV-ADE感染可能通过激活型FcγR和pSn受体来共同抑制PAM中的天然抗病毒免疫应答,从而增强PRRSV的感染。
王燕明[8]（2020）在《免疫性血小板减少症发病机制及干预机制的研究》文中研究表明研究背景:免疫性血小板减少症（ITP）属获得性、异质性、自身免疫性疾病,以孤立性血小板减少为主要特征,是临床实践中最常见的出血性疾病,约占所有出血性疾病的1/3。ITP缺乏实验室特异性的“金标准”,尽管2019新版共识已出版,但其主要聚焦于治疗,ITP迄今为止仍为排除性诊断。ITP主要分为原发性和继发性,前者是指排除所有已知的继发性ITP病因,而继发性ITP主要是指由遗传或获得性易感疾病所触发的,例如:自身免疫性疾病（系统性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征等）、甲状腺疾病、药物诱导的血小板减少、同种免疫性血小板减少、淋巴系统增殖性疾病、骨髓增生异常（再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征）、恶性血液病、慢性肝病、脾功能亢进、血小板消耗性减少、妊娠血小板减少、急慢性感染、假性血小板减少以及先天性血小板减少等。ITP的发病机制复杂,为多种机制综合作用的结果,其中对自身抗原的免疫失耐受是最基本的机制。而ITP经典的发病机制为特异性血小板自身抗体介导及细胞毒T细胞直接杀伤血小板,导致血小板破坏增多。同时细胞毒T细胞协同血小板自身抗体可直接作用于骨髓巨核细胞,导致其成熟障碍,从骨髓水平影响血小板的生成。此外,近几年来,血小板去唾液酸化,并导致其在肝内破坏,这是非依赖免疫球蛋白Fc部分c末端受体（Fc受体）的血小板清除之重要途径。ITP的治疗遵循个体化原则,需权衡患者年龄、出血程度、合并症、合并用药等因素。其治疗策略旨在恢复与止血作用相匹配的血小板计数而并非使血小板计数恢复正常值。一线治疗专注于抑制自身抗体的产生和血小板破坏,皮质类固醇为ITP一线治疗的首选,能够广泛调节自身免疫紊乱状态。其主要包括传统剂量的泼尼松及大剂量地塞米松。鉴于传统剂量泼尼松需逐渐减量、疗程较长,大剂量地塞米松因起效快、疗程短、皮质类固醇副作用大大减少等优势而逐渐取代传统剂量泼尼松。虽皮质类固醇有效经济,但临床仍有大约1/3的患者对其无效,需转入二线治疗。二线治疗为FTP患者长期治疗的主要方式,主要包括抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗、重组人血小板生成素受体激动剂（recombinant human thrombopoietin receptor agonist,TPO-RA）、脾切除、免疫抑制剂等。随着新的治疗药物不断出现,以及手术相关的感染、血栓及致死等相关风险,脾切除率逐渐下降。文献报道,继发性 ITP（HCV 相关）,即 Secondary-ITP（HCV-associated）患者较原发性ITP患者,其出血的发生率更高、严重程度更重,在临床上严重影响患者手术及有创操作、增加输注血小板花费、输血相关风险及影响抗病毒药物的应用,成为临床大夫面临的棘手问题,而亟待发现新机制并可能为提升血小板治疗提供依据。而作为人-鼠嵌合单抗抗体利妥昔单抗,能够与B细胞表面特异性跨膜受体CD20结合,从而引起B细胞的打孔效应,其中可能的机制包括补体依赖的细胞毒作用（CDC）、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等,最终导致B细胞清除。其总有效率达60%,长期有效率达20～25%,因相当于“药物性脾切除”,在原发性ITP治疗中越来越受到重视。但其价格相对昂贵,临床上尚缺乏对其治疗反应预测的指标。本研究通过应用荧光素标记的ECL和RCA-I抗体的平均荧光强度及实时定量PCR法检测血小板脱唾液酸化和Neu1表达的水平,首次为出血风险更为严重的Secondary-ITP（HCV-associated）患者血小板清除的发病机理提供了新的见解,为提升血小板治疗提供了有力的理论依据。同时,应用抗核抗体（ANA）检测,评估利妥昔单抗在原发性ITP患者治疗中的近期及远期治疗效果,并比较了其他检测指标的可能干扰作用,为临床预测ITP中利妥昔单抗治疗反应提供了有效的实验室指标,填补了国内外空白。第一部分:血小板去唾液酸化:继发性免疫性血小板减少症（丙型肝炎病毒相关）的一种新型发病机制及干预机制研究研究目的:本研究通过检测继发性ITP（HCV相关）即Secondary ITP（HCV-associated）患者和正常对照血小板去唾液酸化水平,分析两组血小板去唾液酸化水平的关系,并分析与血小板破坏的相关性;检测继发性ITP（HCV相关）患者抗丙肝病毒治疗前后的血小板去唾液酸化水平,分析其与疗效的关系;检测治疗后血小板去唾液酸化及神经氨酸酶1（neuraminidase 1,Neu1）表达水平。从而明确继发性ITP（HCV相关）患者体内是否存在血小板去唾液酸化水平的异常,血小板去唾液酸化水平在HCV病程进展及治疗过程中及之后的变化。旨在诠释Secondary ITP（HCV-associated）的一种新的发病机制,从而为 Secondary ITP（HCV-associated）的治疗提供新的干预措施。研究方法:1.入组45例Secondary ITP（HCV-associated）患者,接受直接抗病毒药物（DAA）治疗,治疗前收取外周血,治疗开始12周后,评价临床疗效,并且收取外周血。同时入组21例健康志愿者作为正常对照,血常规检测血小板数目。2.采用流式细胞术检测血小板去唾液酸化后暴露的β半乳糖（βGals）的水平,即以PE-Cy5-CD41a单克隆抗体标记血小板,并同时与FITC-ECL,FITC-RCA-I共孵育,以后两者的平均荧光强度用来反映血小板的去唾液酸化水平。3.应用RT-PCR法检测Secondary ITP（HCV-associated）患者和正常对照、治疗前后的Neu1拷贝数。结果:1.Secondary ITP（HCV-associated）患者血小板ECL、RCA-I的平均荧光强度显着高于正常对照。2.Secondary ITP（HCV-associated）患者治疗后持续病毒学应答12周（SVR12）及NR率分别为91.4%、8.6%,SVR12患者治疗后ECL、RCA-I的平均荧光强度均较治疗前显着降低,而NR患者治疗前后ECL、RCA-I的平均荧光强度无统计学差异。3.Secondary ITP（HCV-associated）患者较健康对照组相比,其Neu1拷贝数更高。结论:1.试验组Secondary ITP（HCV-associated）患者血小板去唾液酸化水平明显高于健康对照组。2.经DAA治疗后,雷迪帕韦/索非布韦（吉二代）及维帕他韦/索非布韦（吉三代）组患者血小板去唾液酸化水平均下降,血小板计数水平升高,从而阐明血小板去唾液酸化水平的升高可能与慢性丙肝患者血小板减少的发生存在密切关联,这为丙肝合并血小板减少症的新机制,从而有望为Secondary ITP（HCV-associated）患者提供新的治疗策略。3.第二部分:原发免疫性血小板减少症抗核抗体与利妥昔单抗干预反应的相关性研究研究目的:检测原发性ITP患者利妥昔单抗治疗前外周血中ANA水平,对比ANA阳性和阴性ITP患者的早期疗效,包括有效率和起效时间;同时评价两组间性别、年龄、初始血小板计数、IgG水平、骨髓中巨核细胞计数、不同利妥昔单抗剂量对利妥昔单抗治疗反应可能的影响,通过对比ANA阳性组及阴性组ITP患者随访半年、1年及2年的持续缓解率,比较二者的远期疗效,并评价二者的生存曲线。从而为ITP利妥昔单抗的治疗反应提供了有力的预测指标。研究方法:1.应用连续队列研究的方法,回顾性地分析了国内三家中心,分别为山东大学齐鲁医院、烟台毓璜顶医院、泰安中心医院成人原发性ITP患者的临床记录（2012.01-2018.12）,选取应用利妥昔单抗治疗的患者共287例。2.通过免疫荧光技术在Hep-2细胞底物上测定ANA。3.根据患者治疗前体内ANA滴度,分为ANA 阳性组98例和阴性组189例。4.同时收集患者年龄、性别、疾病持续时间、基线血小板计数、血清免疫球蛋白（Ig）G水平,骨髓巨核细胞计数及出血评分。5.所有患者随访时间至少于利妥昔单抗治疗后2年,评估ANA阳性组及阴性组ITP患者的早期、远期有效率。对前者的评价是基于国际最新ITP诊疗及实践指南,而后者则是指,获得早期缓解后患者外周血小板计数持续达30×109/L以上的时间。结果:1.ANA阳性组及阴性组在性别、年龄、初始血小板中位计数、IgG中位水平、ITP持续时间、出血分数、骨髓巨核细胞中位计数间均无显着差异。2.ANA阳性组较ANA阴性组相比,早期有效率明显升高,有明显的统计学差异。3.ANA阳性组随访6个月时总有效率及完全反应（CR）率呈直线下降,而ANA阴性患者的总有效率及CR率下降不明显。4.ANA阳性组在随访1年后总有效率低于5%,随访2年后有效率接近0。而ANA阴性组在在随访1年后总有效率仍达35.4%,缓解率达19%,随访2年后总有效率仍高于20%。结论:1.与利妥昔单抗治疗后的ANA阴性组相比,ANA阳性组的ITP患者的早期总有效率及完全反应率更高,但远期有效率更短。2.ANA阴性组的远期有效率与其他利妥昔单抗治疗的研究报告相当。3.ANA筛查可能是预测ITP中利妥昔单抗治疗反应的有效指标。
巫晶晶[9]（2020）在《TNF家族免疫相关基因多态性与高危人群HCV易感性及慢性化的关联研究》文中研究表明[背景]全球约有1.85亿人感染了丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）,而中国HCV感染者约有1000万例。研究表明55%-85%的HCV感染者无法自发清除病毒会发展为慢性丙型肝炎,严重者可进展为肝硬化和肝癌等终末期肝病。因而丙型肝炎的现状不容忽视,研究影响HCV易感性和慢性化的因素在丙型肝炎防治中具有重要意义。研究已经确定HCV感染结局受HCV生物学特性、宿主因素和环境因素的影响,宿主免疫与HCV感染的结局尤其相关。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）家族的大多数成员影响免疫细胞的存活、增殖、分化或活化。其中TNFSF11、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFSF13和TNFRSF13B的基因多态性已被证实与多种免疫疾病相关。因此,我们推测这些免疫相关基因突变可能影响HCV易感性和慢性化。[目的]探讨TNFSF11、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFSF13和TNFRSF13B基因多态性与HCV易感性及慢性化的关系。[方法]本研究采用病例对照研究和病例-病例研究设计,结合现场流行病学及分子生物学相关技术,在中国HCV感染高危人群中（血液透析人群、吸毒人群和有偿献血人群）,对所选基因上8个潜在功能性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）进行基因分型,利用四种遗传模型分析SNPs与HCV感染的易感性和慢性化的关系。并进一步采用分层分析、联合作用分析以及生物信息学分析来探讨这些位点和HCV感染结局关联及可能的生物学机制。[结果]研究发现TNFRSF13B-rs34562254（C>T,显性模型:调整OR=1.234,95%CI=1.052-1.447,P=0.010;相加模型:调整OR=1.182,95%CI=1.053-1.326,P=0.005）与HCV感染风险显着相关,TNFSF11-rs9525641（T>C,隐性模型:调整OR=1.505,95%CI=1.126-2.012,P=0.006;相加模型:调整OR=1.208,95%CI=1.024-1.425,P=0.025）和TNFRSF11B-rs2073617（T>C,隐性模型:调整OR=1.424,95%CI=1.029-1.971,P=0.033;相加模型:调整OR=1.202,95%CI=1.013-1.426,P=0.035）与HCV感染慢性化风险显着相关。联合作用显示,与未携带危险等位基因者相比,携带3-4个危险等位基因者感染HCV的风险增加（调整OR=1.669,95%CI=1.054-2.643,P=0.029）。生物信息学分析提示,rs9525641、rs2073617和rs34562254可能具有通过调节相应基因区域的转录调控原件活性的功能,从而影响基因的表达水平。[结论]在中国汉族HCV感染高危人群中,TNFRSF13B rs34562254-T等位基因是HCV感染的危险因素;而TNFSF11 rs9525641-C和TNFRSF11B rs2073617-C等位基因是HCV感染慢性化的危险因素。本研究结果将为探索我国人群HCV易感性及慢性化机制,完善人体感染HCV的免疫图谱,筛查高危人群及预防HCV感染慢性化提供理论依据。
王一倩[10]（2020）在《microRNA-206通过调控ACACA途径抑制HCV增殖的研究》文中研究说明丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是一种具有包膜结构的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科肝炎病毒属,主要感染肝细胞,具有以多种方式逃避宿主免疫反应的能力,是引起丙型肝炎的病因。自1989年首次命名HCV以来,全球范围内已有超过1.8亿人感染HCV,每年新增感染病例3.5万人,HCV感染已成为世界范围内严重的公共卫生问题。HCV的主要感染途径是血液传播、母婴传播和性传播等。HCV感染后极少数人体内的病毒可能会发生自发性清除,但慢性感染发生率甚高,绝大多数（约80%）的HCV感染者会发展为慢性肝炎,少数会进而转化为肝纤维化、肝硬化或肝细胞癌,给患者、家庭和社会带来沉重的负担和影响。研究表明,HCV的感染和复制与脂类代谢相关蛋白密切相关。解码HCV与脂代谢及脂蛋白作用途径的相互关系有助于深入了解HCV的感染过程和发病机制。micro RNA作为体内转录后基因表达调控的重要因子,在生物的物质代谢、细胞生长、凋亡以及癌变等生物进程中起到重要调节作用,可以调控包括肝癌在内的多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡。micro RNA-206（miR-206）作为近年来热点研究的micro RNA之一,已被证实参与到脂类代谢过程中,miR-206可通过抑制肝细胞内的肝X受体α（nuclear receptor subfamily 1 group H member3,NR1H3或LXRα）的表达,进而减少肝内脂滴的形成和堆积。HCV进入体内后,与脂蛋白形成病毒脂质颗粒从而完成其在宿主体内的复制、增殖和致病过程。然而,miR-206是否在HCV感染和致病中发挥生物学功能尚未可知。本研究中,我们首先构建了表达miR-206的慢病毒质粒,并用该质粒对Huh7.5.1细胞进行感染,最终成功构建稳定表达外源miR-206的细胞系,为后续实验提供了材料基础。随后我们通过用完全培养基和高脂培养基对Huh7.5.1细胞进行培养,完成了高脂培养体系的建立,为后续研究脂类是否对miR-206参与HCV增殖、感染和致病过程的研究奠定了实验基础。通过生物信息学分析,我们筛选了6种脂代谢基因作为miR-206抑制的靶基因,分别为ACACA、PEMT、PLCG1、AGPAT1、HADH和ELOVL4基因。通过比较分析转染与未转染miR-206的细胞系中这6种基因的m RNA表达水平,证实了miR-206能够抑制ACACA、PEMT和PLCG1三种基因的表达水平,且该抑制作用在正常培养体系和高脂培养体系中均存在。HCV感染后,miR-206对ACACA和PEMT基因的抑制作用增强,而高脂培养条件下,ACACA和PLCG1基因的表达受到抑制,这为我们后续实验提供了参考作用。随后我们证实无论在高脂或正常对照培养体系下,miR-206的稳定表达均对HCV的增殖有抑制作用。基于以上结果,我们推测miR-206可能通过抑制ACACA脂代谢信号通路完成对HCV增殖的影响,因此我们对ACACA脂代谢相关通路进行了分析。HCV感染后,在正常对照和高脂培养条件下对细胞进行miR-206的瞬时转染,分析转染对照质粒组与转染miR-206质粒组间ACACA代谢通路相关基因（NR1H3、SREBF1和FASN）的m RNA表达情况。结果显示在正常对照培养条件下,与对照组相比miR-206在转染后12 h表达水平有所升高,但无统计学差异,转染24h后miR-206的表达水平显着升高,随后在48 h时降低。ACACA、NR1H3、SREBF1和FASN基因m RNA的表达水平在miR-206转染后24 h有所下降,但只有miR-206的直接作用基因ACACA和NR1H3的表达水平表现出统计学差异;在转染后48 h,该通路4个基因的m RNA表达水平显着低于对照组;除FASN基因外,miR-206对该通路基因m RNA水平的显着抑制作用持续到转染后72 h。在高脂培养体系下,miR-206转染48 h后,其表达水平才表现出升高趋势,但与对照组相比无明显差异。而ACACA脂代谢通路的4个基因的表达水平在转染组和对照组间均未表现出明显差异,这可能是由于miR-206表达水平受限导致的结果。通过本研究,我们确定了miR-206对HCV增殖具有抑制作用,而该抑制作用可能通过ACACA脂代谢通路完成。该结果为进一步研究miR-206在HCV感染、增殖和致病过程中扮演的角色奠定了理论和实验基础,并为miR-206作为新型HCV感染治疗药物的研发提供了理论依据。
二、Fc受体介导HCV跨膜研究系列报告:——丙型肝炎病毒定量及与基因型的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Fc受体介导HCV跨膜研究系列报告:——丙型肝炎病毒定量及与基因型的关系（论文提纲范文）
（1）机器学习方法用于丙型肝炎病毒抑制剂生物活性的预测研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号和缩略词说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎和丙型肝炎病毒 |
| 1.1.1 丙型肝炎概述 |
| 1.1.2 丙型肝炎病毒的起源、流行病学和多样性 |
| 1.1.3 丙型肝炎病毒的基因组 |
| 1.1.4 丙型肝炎病毒的复制周期 |
| 1.1.5 丙型肝炎病毒的药物靶标 |
| 1.1.6 丙型肝炎病毒感染的治疗 |
| 1.2 丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的结构及其抑制剂 |
| 1.2.1 NS3/4A蛋白酶的结构和底物结合位点 |
| 1.2.2 NS3/4A蛋白酶的突破性抑制剂 |
| 1.2.3 NS3/4A蛋白酶抑制剂的研究进展 |
| 1.3 丙型肝炎病毒NS5A蛋白的结构及其抑制剂 |
| 1.3.1 NS5A蛋白的结构 |
| 1.3.2 NS5A蛋白抑制剂的研究进展 |
| 1.4 计算机辅助药物设计 |
| 1.4.1 计算机辅助药物设计概述 |
| 1.4.2 定量构效关系与机器学习 |
| 1.4.3 分子对接与分子动力学模拟 |
| 1.5 本论文的研究目的意义和研究方案 |
| 第二章 丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂的定量构效关系研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 数据集的建立 |
| 2.2.2 训练集与测试集的划分 |
| 2.2.3 分子描述符的计算 |
| 2.2.4 分子描述符的筛选 |
| 2.2.5 机器学习方法与最优参数的确定 |
| 2.2.6 模型的评价指标 |
| 2.2.7 模型的应用域 |
| 2.2.8 子模型的建立 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 数据集相关结果 |
| 2.3.2 分子描述符筛选结果 |
| 2.3.3 多元线性回归模型结果 |
| 2.3.4 支持向量机模型结果 |
| 2.3.5 随机森林模型结果 |
| 2.3.6 模型的应用域结果 |
| 2.3.7 子模型的数据集与分子描述符筛选结果 |
| 2.3.8 子模型的模型结果 |
| 2.3.9 总模型与子模型的比较 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂的虚拟筛选研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 机器学习法筛选所用QSAR模型 |
| 3.2.2 形状与静电相似性法筛选所用模版分子构象 |
| 3.2.3 类药性过滤规则的修正 |
| 3.2.4 大型商业数据库的预处理 |
| 3.2.5 分子描述符的计算和QSAR模型筛选 |
| 3.2.6 三维构象的生成和形状与静电相似性筛选 |
| 3.2.7 筛选结果分子的结构聚类 |
| 3.2.8 候选分子的分子对接 |
| 3.2.9 候选分子的分子动力学模拟 |
| 3.2.10 候选分子的分子动力学模拟轨迹分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 虚拟筛选结果的分子结构聚类结果 |
| 3.3.2 虚拟筛选结果的分子结构特征 |
| 3.3.3 候选分子的分子动力学模拟的RMSD分析 |
| 3.3.4 候选分子的结合自由能分析 |
| 3.3.5 候选分子与NS3/4A蛋白酶的结合模式分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 丙型肝炎病毒NS5A蛋白抑制剂对野生型与突变型蛋白生物活性的三维定量构效关系研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 野生型与突变型数据集的建立 |
| 4.2.2 训练集与测试集的划分 |
| 4.2.3 数据集中抑制剂的分子叠合 |
| 4.2.4 CoMFA和CoMSIA描述符的计算 |
| 4.2.5 偏最小二乘法建模与最优模型的确定 |
| 4.2.6 模型的评价指标 |
| 4.2.7 数据集的拓展连接指纹分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 数据集与分子叠合相关结果 |
| 4.3.2 数据集中抑制剂的相似性分析 |
| 4.3.3 数据集GT-1a的模型结果 |
| 4.3.4 数据集GT-1a Y93H的模型结果 |
| 4.3.5 数据集GT-1a L31V的模型结果 |
| 4.3.6 最优模型的Tropsha参数评价 |
| 4.3.7 数据集GT-1a的等势图分析 |
| 4.3.8 数据集GT-1a Y93H的等势图分析 |
| 4.3.9 数据集GT-1a L31V的等势图分析 |
| 4.3.10 汇总三组等势图结果 |
| 4.3.11 ECFP指纹分析结果 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 丙型肝炎病毒NS5A上市药物艾尔巴韦对突变Y93H和L31V的耐药性机理研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 NS5A蛋白缺失氨基酸残基的构建 |
| 5.2.2 药物分子艾尔巴韦的分子对接 |
| 5.2.3 分子动力学模拟过程 |
| 5.2.4 体系的稳定性评价 |
| 5.2.5 MM/GBSA结合自由能的计算与分解 |
| 5.2.6 野生型与突变型的结合模式评价 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 NS5A蛋白构建结果 |
| 5.3.2 分子对接结果 |
| 5.3.3 分子动力学模拟过程中体系RMSD变化趋势 |
| 5.3.4 分子动力学模拟过程中体系的MM/GBSA结合自由能结果 |
| 5.3.5 MM/GBSA结合自由能分解结果 |
| 5.3.6 模拟最后时刻的结合模式分析 |
| 5.3.7 结合模式汇总 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 环氧合酶-2抑制剂的生物活性分类与分子结构聚类研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 数据集的建立 |
| 6.2.2 训练集与测试集的划分 |
| 6.2.3 分子指纹和分子描述符的计算和筛选 |
| 6.2.4 机器学习方法与最优参数的确定 |
| 6.2.5 模型的评价指标 |
| 6.2.6 分子结构的聚类 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 数据集相关结果与化学空间分布 |
| 6.3.2 分子描述符筛选结果 |
| 6.3.3 支持向量机模型结果 |
| 6.3.4 随机森林模型结果 |
| 6.3.5 诱饵分子集与外部测试集预测结果 |
| 6.3.6 抑制剂的结构聚类与高、低活性结构片段分析 |
| 6.3.7 MACCS指纹的信息增益分析 |
| 6.3.8 ECFP4指纹的信息增益分析 |
| 6.3.9 CORINA分子描述符分析 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 论文总结 |
| 7.2 论文创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 答辩委员会决议书 |
（2）生物信息学预测丙肝病毒与登革病毒T细胞交叉反应的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 登革病毒与丙型肝炎病毒病原学及流行病学特征分析 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）抗寨卡病毒和登革病毒药物筛选体系建立及DAA药物的药效评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 寨卡病毒和登革病毒的流行与危害 |
| 1.1.1 寨卡病毒发现与流行 |
| 1.1.2 登革病毒起源与流行 |
| 1.1.3 寨卡病毒和登革病毒的危害与防控 |
| 1.2 寨卡病毒和登革病毒的病原学特征 |
| 1.2.1 寨卡病毒和登革病毒的基因组学 |
| 1.2.2 寨卡病毒和登革病毒的生命周期 |
| 1.3 寨卡病毒和登革病毒潜在的药物治疗靶点 |
| 1.3.1 寨卡病毒和登革病毒关键蛋白的结构功能与药物靶点 |
| 1.3.2 HCV药物靶点 |
| 1.4 直接作用抗病毒药物 |
| 1.5 计算机辅助药物筛选方法 |
| 1.6 体外药物筛选的方法 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 1.8 研究技术路线 |
| 第二章 抗登革病毒和寨卡病毒药物筛选方法建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 BHK-21和C6/36细胞的培养 |
| 2.3.2 ZIKV和DENV2病毒的培养 |
| 2.3.3 构建Real Time PCR绝对定量标准曲线法检测病毒载量 |
| 2.3.3.1 方法原理与引物 |
| 2.2.3.2 提取病毒RNA |
| 2.2.3.3 一步法反转扩增目的片段 |
| 2.2.3.4 目的片段回收纯化 |
| 2.2.3.5 CaCl_2法制备感受态细胞 |
| 2.2.3.6 TA克隆 |
| 2.2.3.7 提取质粒DNA |
| 2.2.3.8 建立探针法绝对定量PCR标准曲线 |
| 2.3.4 BHK-21细胞生长规律 |
| 2.3.4.1 CCK-8原理及方法 |
| 2.3.4.2 细胞生长规律 |
| 2.3.5 病毒与细胞的最适感染复数 |
| 2.3.6 阳性化合物利巴韦林的细胞毒性测定 |
| 2.3.7 阳性化合物利巴韦林对病毒的抑制作用 |
| 2.3.7.1 .药物对病毒复制的抑制 |
| 2.3.7.2 药物作用后的病毒载量检测 |
| 2.3.8 阳性化合物的选择指数测定 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 ZIKV和DENV2的cDNA质粒标准品及qRT-PCR标准曲线法 |
| 2.4.2 BHK-21细胞生长特性 |
| 2.4.3 确定最适感染复数 |
| 2.4.4 阳性化合物利巴韦林抗ZIKV和DENV2活性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 候选DAA化合物与寨卡病毒和登革病毒靶标蛋白的分子对接 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验研究对象 |
| 3.2.2 主要数据分析方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 靶标蛋白生物信息学分析 |
| 3.3.2 靶标蛋白三级结构比对分析 |
| 3.3.3 靶标蛋白系统发育分析 |
| 3.3.4 候选DAA化合物与ZIKV和DENV2靶标蛋白分子对接 |
| 3.3.5 待测DAA化合物与ZIKV和DENV2靶标蛋白相互作用分析 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 靶标蛋白及DAA药物的确定 |
| 3.4.2 靶标蛋白的理化性质 |
| 3.4.3 靶标蛋白的疏水性质 |
| 3.4.4 靶标蛋白的二级结构 |
| 3.4.5 靶标蛋白的三级结构比对 |
| 3.4.6 靶标蛋白的系统发育 |
| 3.4.7 候选DAA化合物与ZIKV和DENV2的分子对接 |
| 3.4.8 待测DAA化合物与ZIKV和DENV2的相互作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 待测DAA化合物抗寨卡病毒和登革病毒的药效评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 待测DAA化合物的细胞毒性测定 |
| 4.3.2 待测DAA化合物对病毒的抑制作用 |
| 4.3.3 待测DAA化合物的选择指数测定 |
| 4.3.4 待测DAA化合物抗病毒最适药物浓度确定 |
| 4.3.5 最适药物浓度对药物作用时间依赖性分析 |
| 4.3.6 最适药物浓度对病毒感染时间依赖性分析 |
| 4.3.7 最适药物浓度对病毒感染剂量依赖性分析 |
| 4.3.8 多靶点联合用药分析 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 待测DAA化合物抗ZIKV和DENV2活性 |
| 4.4.2 待测DAA化合物抗病毒最适药物浓度确定 |
| 4.4.3 最适药物浓度的药物作用时间依赖性 |
| 4.4.4 最适药物浓度的病毒感染时间依赖性 |
| 4.4.5 最适药物浓度的病毒感染剂量依赖性 |
| 4.4.6 多靶点联合用药效果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 建立抗寨卡病毒和登革病毒药物筛选体系 |
| 5.2 候选DAA化合物与寨卡病毒和登革病毒靶标蛋白的分子对接 |
| 5.3 待测DAA化合物抗寨卡病毒和登革病毒药物效果评价 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表的论文 |
（4）非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒-黏膜病(BVDV-MD) |
| 2.1.1 BVDV流行病学 |
| 2.1.2 BVDV分子生物学特征 |
| 2.1.3 BVDV基因组及其编码蛋白 |
| 2.1.4 BVDV感染机制 |
| 2.1.5 BVDV持续性感染 |
| 2.1.6 BVDV免疫逃避 |
| 2.2 RNA-Seq技术筛选病毒相关宿主基因 |
| 2.2.1 RNA-Seq技术的发展 |
| 2.2.2 RNA-Seq技术的应用 |
| 2.2.3 单细胞测序技术(Sc RNA-Seq) |
| 2.3 抗病毒固有免疫 |
| 2.3.1 TLRs及其介导的信号通路 |
| 2.3.2 RLRs及其介导的信号通路 |
| 2.4 Ⅰ型干扰素(IFN-I) |
| 2.4.1 JAK-STAT通路 |
| 2.4.2 ISGs的抗病毒作用 |
| 2.5 病毒逃避Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 2.5.1 病毒抑制Ⅰ型干扰素上游信号通路 |
| 2.5.2 病毒抑制Ⅰ型干扰素下游信号通路 |
| 2.6 IFN信号的复杂性和宿主趋向性 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 3.2 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 3.3 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒分离株和实验动物 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 1.2.2 免疫荧光实验(IFA) |
| 1.2.3 NCP BVDV-LC病毒TCID50测定 |
| 1.2.4 BVDV感染牛外周血单核细胞 |
| 1.2.5 RNA提取 |
| 1.2.6 建库及测序 |
| 1.2.7 生物信息学分析 |
| 1.2.8 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 1.2.9 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 流式细胞术鉴定牛单核细胞 |
| 2.2 NCP BVDV感染牛外周血单核细胞免疫荧光检测 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)的筛选 |
| 2.4 GO聚类分析 |
| 2.5 KEGG分析 |
| 2.6 Ⅰ型干扰素信号通路相关DEGs分析 |
| 2.7 qRT-PCR验证部分DEGs |
| 3 讨论 |
| 3.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 3.2 NCP BVDV感染牛单核细胞DEGs分析 |
| 4 小结 |
| 试验二 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 牛Ⅰ型干扰素IFN-β启动子报告载体的构建和分析 |
| 1.2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核表达载体的构建及对干扰素启动子活性的影响 |
| 1.2.3 NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.4 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒载体构建及对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牛Ⅰ型干扰素IFNβ的启动子报告载体构建及活性分析 |
| 2.1.1 牛IFN-β启动子序列的克隆 |
| 2.1.2 BoIFN-β启动子报告载体的构建 |
| 2.1.3 BoIFNβ3-Luc-MDBK细胞的制备 |
| 2.1.4 BoIFNβ3-Luc MDBK细胞对BVDV复制的影响 |
| 2.1.5 ploy(I:C)对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建及对BoIFNβ3 启动子活性的影响 |
| 2.2.1 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建 |
| 2.2.2 BoIRF7和Bo DDX58对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.3 NCP BVDV在 MDBK细胞对干扰素信号通路的影响 |
| 2.3.1 NCP BVDV在 MDBK细胞上对干扰素通路相关分子转录的影响 |
| 2.3.2 NCP BVDV感染对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.4 NCP BVDV非结构蛋白对干扰素信号通路的影响 |
| 2.4.1 NCP BVDV非结构蛋白真核表达载体构建 |
| 2.4.2 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒的包装及感染MDBK细胞 |
| 2.4.3 NCP BVDV非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu-IRSE、BoIFN-β转录活性的影响 |
| 2.4.4 NCP BVDV非结构蛋白NS4B对 poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ通路蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞转染效率 |
| 3.2 病毒抑制IFN-Ⅰ信号通路的机制 |
| 3.3 BVDV非结构蛋白对IFN-Ⅰ通路的影响 |
| 4 小结 |
| 试验三 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物、细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BoSIKE1 基因的克隆及表达载体构建 |
| 1.2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1.2.3 NCP BVDV病毒感染MDBK细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 1.2.4 BoSIKE1 过表达和干扰对NCP BVDV复制的影响 |
| 1.2.5 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 1.2.6 BoSIKE1 与互作蛋白的Co-IP实验 |
| 1.2.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BoSIKE1 基因的克隆及同源性分析 |
| 2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.1 BoSIKE1 基因的原核表达 |
| 2.2.2 BoSIKE1 抗体的制备与鉴定 |
| 2.3 BVDV病毒感染宿主细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 2.4 BoSIKE1 过表达和干扰细胞的构建 |
| 2.5 BoSIKE1 过表达和干扰对BVDV复制的影响 |
| 2.6 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 2.7 BoSIKE1与TUBA1D蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BoSIKE对 NCP BVDV复制的影响 |
| 3.2 BoSIKE1 互作蛋白的鉴定及分析 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（5）BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻病毒研究进展 |
| 1.1 BVDV病原学概述 |
| 1.2 BVDV分子特征 |
| 1.3 BVDV生命周期 |
| 1.4 BVDV与宿主相互作用 |
| 1.4.1 宿主模式识别受体 |
| 1.4.2 BVDV感染对天然免疫细胞的影响 |
| 1.4.3 BVDV感染对细胞因子的影响 |
| 1.4.4 BVDV感染与细胞凋亡 |
| 1.4.5 BVDV感染与免疫逃逸 |
| 第二章 Mx蛋白及其抗病毒感染研究进展 |
| 2.1 Mx蛋白的结构 |
| 2.2 Mx蛋白抗病毒感染机制 |
| 2.2.1 Mx蛋白抗流感病毒感染机制 |
| 2.2.2 Mx蛋白抗弹状病毒科病毒感染机制 |
| 2.2.3 Mx蛋白抗布尼亚病毒科病毒感染机制 |
| 2.2.4 Mx蛋白抗副黏病毒科病毒感染机制 |
| 2.2.5 Mx蛋白抗黄病毒科病毒感染机制 |
| 2.2.6 Mx蛋白抗其他病毒感染机制 |
| 试验研究 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 细胞、菌毒种和主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 细胞的培养与传代 |
| 3.2.3 RNA提取及c DNA合成 |
| 3.2.4 PCR鉴定 |
| 3.2.5 病毒的分离 |
| 3.2.6 间接免疫荧光法鉴定BVDV |
| 3.2.7 病毒粒子的形态学观察 |
| 3.2.8 TCID50效价测定 |
| 3.2.9 病毒基因型的鉴定 |
| 3.2.10 全基因组序列测序及分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 血清样品RT-PCR检测 |
| 3.3.2 BVDV毒株的分离 |
| 3.3.3 间接免疫荧光法鉴定BVDV |
| 3.3.4 病毒粒子的形态学观察 |
| 3.3.5 TCID50效价测定 |
| 3.3.6 病毒基因型的鉴定 |
| 3.3.7 全基因组序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 BVDV感染MDBK细胞前后的转录组学测定及差异分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞和主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 BVDV BJ-2016株的增殖与特征 |
| 4.2.2 转录组测序 |
| 4.2.3 数据处理与评价 |
| 4.2.4 基因表达差异分析 |
| 4.2.5 差异表达基因富集分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 BVDV BJ-2016株生长特征 |
| 4.3.2 RNA提取与质量评估 |
| 4.3.3 数据处理与评价 |
| 4.3.4 基因表达差异分析 |
| 4.3.5 差异表达基因GO富集分析 |
| 4.3.6 差异表达基因KEGG Pathway富集分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛Mx1蛋白对BVDV复制的抑制作用研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、菌毒种和主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 BVDV链特异性荧光定量PCR方法的建立 |
| 5.2.3 牛Mx1基因的克隆 |
| 5.2.4 牛Mx1基因稳定过表达细胞系的构建及鉴定 |
| 5.2.5 Mx1基因稳定敲低细胞系的构建及鉴定 |
| 5.2.6 Western blot |
| 5.2.7 Mx1基因过表达对BVDV复制的影响 |
| 5.2.8 Mx1基因敲低对BVDV复制的影响 |
| 5.2.9 牛Mx1蛋白与BVDV蛋白相互作用验证 |
| 5.2.10 数据统计 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 BVDV链特异性RT-qPCR方法的建立 |
| 5.3.2 牛Mx1基因克隆及表达鉴定 |
| 5.3.3 Mx1基因稳定过表达细胞系的构建及鉴定 |
| 5.3.4 Mx1基因敲低细胞系的构建及鉴定 |
| 5.3.5 Mx1基因过表达对BVDV复制的影响 |
| 5.3.6 Mx1基因敲低对BVDV复制的影响 |
| 5.3.7 免疫共沉淀验证牛Mx蛋白与BVDV蛋白 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）一株新疆PRRSV的分离鉴定及其对猪FcRn蛋白丰度的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.PRRSV研究进展 |
| 1.1 PRRSV概述 |
| 1.2 PRRSV的结构特征 |
| 1.3 PRRSV基因组特征 |
| 1.3.1 主要非结构蛋白 |
| 1.3.2 主要结构蛋白 |
| 1.4 PRRSV对天然免疫的逃逸机制 |
| 1.4.1 PRRSV与早期I型干扰素的产生 |
| 1.4.2 PRRSV与 MHC-1 类分子 |
| 1.4.3 PRRSV与 Fc受体介导的ADE作用 |
| 2 新生儿Fc受体研究进展 |
| 2.1 FcRn的结构 |
| 2.2 FcRn的分布 |
| 2.3 FcRn的功能 |
| 2.3.1 FcRn以 pH依赖性结合IgG并介导IgG双向转运 |
| 2.3.2 FcRn维持血液中IgG与白蛋白的半衰期 |
| 2.3.3 FcRn介导抗原抗体复合物递呈 |
| 2.4 FcRn与病毒互作关系研究 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二章 PRRSV的分离鉴定及遗传进化分析 |
| 1 引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、病料和载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 病料处理和RNA的提取 |
| 2.2.3 病毒的分离 |
| 2.2.4 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.5 噬斑纯化实验 |
| 2.2.6 DH5α感受态细胞制备(氯化钙法) |
| 2.2.7 RT-PCR扩增,片段纯化回收,以及载体连接 |
| 2.2.8 质粒的转化、重组质粒的提取及鉴定 |
| 2.2.9 同源性以及遗传进化分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 临床病料的检测 |
| 3.2 病毒在Marc-145细胞上的增殖结果 |
| 3.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.4 噬斑纯化实验结果 |
| 3.5 病毒的全基因组扩增 |
| 3.6 病毒全基因组的同源性比对及遗传变异分析 |
| 3.7 PRRSV Nsp2 基因同源性比对和遗传进化分析 |
| 3.8 PRRSV ORF5 基因同源性比对和遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 PRRSV感染PAMs影响猪FcRn的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HP-PRRSV的增殖 |
| 2.2.2 间接免疫荧光 |
| 2.2.3 PAMs和 Marc-145 细胞总RNA提取及反转录反应 |
| 2.2.4 荧光定量RT-PCR检测基因mRNA水平 |
| 2.2.5 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.2.6 Western-blot检测基因蛋白水平的表达 |
| 2.2.7 统计学方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRRSV感染PAMs对细胞形态和细胞活性的影响 |
| 3.2 PRRSV通过蛋白酶体途径降解PAMs细胞中FcRn |
| 3.2.1 PRRSV感染PAMs在蛋白水平上下调FcRn |
| 3.2.2 HP-PRRSV诱导PAMs中 FcRn通过蛋白酶体途径降解 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）PAM中的激活型Fcγ受体和Sn受体抑制PRRSV-ADE感染中的天然抗病毒免疫应答（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 第二章 试验部分 |
| 引言 |
| 试验一、PRRSV-ADE感染抑制PAM中的天然抗病毒免疫应答 |
| 1 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 试验二、PAM中的激活型Fcγ受体和Sn受体参与PRRSV-ADE感染 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 试验三、激活型Fcγ受体的激活抑制PAM中的天然抗病毒免疫应答 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 试验四、Sn受体的激活抑制PAM中的天然抗病毒免疫应答 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 全文总结 |
| 创新性 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 基金支持 |
| 已发表文章 |
（8）免疫性血小板减少症发病机制及干预机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 中文正文 |
| 第一部分: 血小板去唾液酸化:继发免疫性血小板减少症(丙型肝炎病毒相关)的一种新型发病机制及干预机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 原发免疫性血小板减少症抗核抗体与利妥昔单抗干预反应的相关性研究 |
| 前言 |
| 对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 综述 克隆性造血与原发免疫性血小板减少症 |
| 参考文献 |
| 英文正文 |
| Part I Platelet desialylation:A new pathogenesis and intervention mechanism of secondary immune thrombocytopenia (hepatitis C virus-associated) |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
| Figures and Tables |
| Part II The association between antinuclear antibody and response to rituximab treatment in adult patients with primary immunethrombocytopenia |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
| Tables |
| Figure legend |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二(Submitted) |
（9）TNF家族免疫相关基因多态性与高危人群HCV易感性及慢性化的关联研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 丙型肝炎病毒感染与宿主免疫反应及遗传变异的关系 |
| 参考文献 |
| 附录一 主要缩写词中英文对照 |
| 附录二 研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）microRNA-206通过调控ACACA途径抑制HCV增殖的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HCV感染概述 |
| 1.1.1 HCV感染危害严重 |
| 1.1.2 HCV感染机制 |
| 1.1.3 HCV患者的治疗及其存在的问题 |
| 1.2 HCV感染与脂质代谢密切相关 |
| 1.3 microRNA-206 参与脂质代谢过程 |
| 1.4 本文中miR-206调控基因 |
| 1.4.1 ACACA |
| 1.4.2 AGPAT1 |
| 1.4.3 PLCG1 |
| 1.4.4 PEMT |
| 1.4.5 HADH |
| 1.4.6 ELOVL4 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线图 |
| 第二章 稳定转染miR-206细胞系的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要材料和试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 构建慢病毒稳定转染细胞系 |
| 2.3.1.1 miR-206表达载体的构建 |
| 2.3.1.2 慢病毒载体 |
| 2.3.1.3 质粒的转化 |
| 2.3.1.4 挑取单克隆进行扩增 |
| 2.3.1.5 菌液PCR |
| 2.3.1.6 测序验证 |
| 2.3.1.7 质粒扩大培养 |
| 2.3.1.8 质粒的提取 |
| 2.3.1.9 慢病毒的包装 |
| 2.3.2 确定嘌呤霉素最佳筛选浓度 |
| 2.3.3 以所确定的最佳筛选浓度嘌呤霉素对细胞进行筛选 |
| 2.3.4 分离克隆以获得最大数量的细胞 |
| 2.3.5 扩大培养成活克隆,进行第二轮稳定株筛选 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 miR-206稳定表达细胞系的建立 |
| 2.4.2 嘌呤霉素最佳筛选浓度的确定 |
| 2.4.3 稳定转染miR-206细胞系的筛选 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 高脂培养体系的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要材料和试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 高脂培养基的配制 |
| 3.3.2 对照培养基的配制 |
| 3.3.3 细胞处理 |
| 3.3.4 油红O染色 |
| 3.3.5 高脂培养下细胞株的再次筛选 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 油红O染色情况 |
| 3.4.2 高脂培养下细胞株的再次筛选 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 HCV感染细胞后miR-206 调控脂代谢相关基因的表达变化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 主要材料和试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 病毒培养 |
| 4.3.2 细胞处理 |
| 4.3.3 对miR206抑制的脂代谢相关基因进行预测 |
| 4.3.4 脂代谢基因mRNA表达量的测定 |
| 4.3.4.1 细胞总RNA的提取 |
| 4.3.4.2 RNA逆转录 |
| 4.3.4.3 脂代谢相关基因mRNA表达水平的检测 |
| 4.3.5 病毒载量的检测 |
| 4.3.5.1 上清中病毒RNA的提取 |
| 4.3.5.2 上清中病毒载量的测定 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 miR-206作用靶基因的预测及验证 |
| 4.4.2 HCV感染与miR-206 调控脂代谢基因表达量水平的关系 |
| 4.4.3 miR-206 能够抑制HCV的增殖 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 验证miR-206/ACACA信号通路对HCV的抑制作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 主要材料和试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 病毒培养 |
| 5.3.2 瞬时转染方法的构建 |
| 5.3.2.1 实验所需试剂 |
| 5.3.2.2 实验所需耗材 |
| 5.3.2.3 实验方案 |
| 5.3.2.4 实验具体操作 |
| 5.3.3 ACACA通路基因m RNA表达量的测定 |
| 5.3.3.1 细胞总RNA的提取 |
| 5.3.3.2 RNA逆转录 |
| 5.3.3.3 ACACA脂代谢通路基因m RNA表达水平的检测. |
| 5.3.4 病毒载量的检测 |
| 5.3.4.1 上清中病毒RNA的提取 |
| 5.3.4.2 上清中病毒载量的测定 |
| 5.3.5 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 miR-206的瞬时转染后的表达 |
| 5.4.2 miR-206/ACACA通路基因m RNA水平表达量分析 |
| 5.4.3 上清中病毒载量变化及分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A攻读硕士期间发表论文 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 资助基金 |
四、Fc受体介导HCV跨膜研究系列报告:——丙型肝炎病毒定量及与基因型的关系（论文参考文献）
- [1]机器学习方法用于丙型肝炎病毒抑制剂生物活性的预测研究[D]. 秦子健. 北京化工大学, 2021
- [2]生物信息学预测丙肝病毒与登革病毒T细胞交叉反应的研究[D]. 朱丹. 昆明医科大学, 2021(01)
- [3]抗寨卡病毒和登革病毒药物筛选体系建立及DAA药物的药效评价[D]. 邵榆岚. 昆明理工大学, 2021(01)
- [4]非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索[D]. 何延华. 石河子大学, 2020
- [5]BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响[D]. 刘存. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [6]一株新疆PRRSV的分离鉴定及其对猪FcRn蛋白丰度的影响[D]. 张维达. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]PAM中的激活型Fcγ受体和Sn受体抑制PRRSV-ADE感染中的天然抗病毒免疫应答[D]. 张留君. 河南农业大学, 2020
- [8]免疫性血小板减少症发病机制及干预机制的研究[D]. 王燕明. 山东大学, 2020(01)
- [9]TNF家族免疫相关基因多态性与高危人群HCV易感性及慢性化的关联研究[D]. 巫晶晶. 南京医科大学, 2020(07)
- [10]microRNA-206通过调控ACACA途径抑制HCV增殖的研究[D]. 王一倩. 昆明理工大学, 2020(05)