一、瘤细胞转移能力分析的体外研究（论文文献综述）
孙志阳[1]（2021）在《SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究》文中认为黑色素瘤是由黑色素细胞恶变产生的一种恶性肿瘤,是所有皮肤癌患者死亡的主要原因。白藜芦醇是一种多酚类化合物,具有广泛药理学活性,如抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗老化等特性。黑色素瘤的异常细胞增殖及转移受多种生物学过程影响,SHC结合蛋白1（SHCBP1）参与多种细胞过程,与许多肿瘤发生发展相关。有文献报道白藜芦醇抑制黑色素瘤细胞增殖,但并未完全解析白藜芦醇抑制黑色素瘤细胞增殖的分子机理。本实验基于前期研究发现白藜芦醇抑制小鼠黑色素瘤B16细胞中SHCBP1的表达水平的结果,采用CCK-8、流式细胞术、Western Blot、Ed U染色等方法阐明白藜芦醇在抑制小鼠黑色素瘤（B16）细胞的分子机制,并进一步阐明SHCBP1在B16细胞中的生物学作用。本研究主要获得实验结果如下:1、白藜芦醇抑制B16细胞增殖、细胞集落形成和细胞迁移。这种影响是由于白藜芦醇抑制B16细胞中ERK及AKT信号通路,并促进细胞周期抑制因子p21、p27、p53蛋白的表达。同时发现白藜芦醇抑制B16细胞中SHCBP1蛋白的表达。2、SHCBP1在B16细胞中本底表达较高。通过获得干扰SHCBP1的B16细胞株,利用转录组测序分析差异基因KEGG通路,发现差异基因主要富集在细胞增殖、凋亡、氧化及炎症相关通路,说明SHCBP1的确影响B16细胞增殖。3、在B16细胞中单独干扰和超表达SHCBP1,结果发现SHCBP1加速B16细胞G1/S期进程,促进ERK和AKT的磷酸化,进一步影响Cyclin D1和P21的表达水平,从而调控细胞增殖过程。4、分别在SHCBP1干扰和超表达的情况下,用白藜芦醇处理B16细胞,结果发现,白藜芦醇抑制SHCBP1的表达,调控ERK信号通路从而影响B16细胞的细胞增殖,另一方面,白藜芦醇也通过AKT信号通路发挥调控B16细胞增殖效应。结论:本研究阐明白藜芦醇通过抑制SHCBP1/ERK和AKT信号通路抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖及迁移能力。为白藜芦醇临床治疗提供实验支撑,SHCBP1作为治疗黑色素瘤的临床诊断和靶向治疗提供理论依据和实验基础。
赵棋汀[2]（2021）在《多灶型转移肿瘤分泌的外泌体通过转运miR-199a-1-5p抑制CDKN1B来促进寡灶型转移到多灶型转移的进展》文中研究表明背景肿瘤的转移是一个特殊而又复杂的过程,是造成肿瘤治疗失败,导致患者死亡,致使肿瘤致死率居高不下的重要因素。肿瘤的转移有寡灶型转移（全身累积转移灶数目或者全身累积转移器官不超过5个）和多灶型转移（全身累积转移灶数目或者全身累积转移器官超过5个）之分。寡灶转移和多灶型转移是肿瘤转移的第二阶段——远位转移的两种转移形式。在这个阶段,要形成新的肿瘤生长的微环境。影响形成肿瘤生长的微环境的因素有很多,其中癌细胞通过自身分泌影响肿瘤微环境建立是一种途径,然而这方面的机制研究目前还很模糊。miRNA是一种内源性非编码单链小RNA分子,对肿瘤转移具有多种重要的调控作用。miRNA可通过影响癌细胞自身分泌,从而改变肿瘤生长的微环境,影响远位转移的肿瘤克隆性增殖和肿瘤转移灶的形成。但RNA分子极易在细胞外被降解。外泌体由各种类型的细胞分泌,广泛存在并分布于各种体液中,能够携带各种RNA并保护其免遭降解,与多种疾病的发生与进程密切相关。目前研究表明肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤的发生发展的调控,起到细胞间物质转运和信息传递的生理功能,重塑肿瘤微环境。但外泌体对肿瘤的具体作用及其调节机制尚不明确仍需深层次研究。目的1.探索外泌体对寡灶型转移向多灶型转移演变的影响。2.验证外泌体携带的miRNA对肿瘤转移的调控作用。3.研究外泌体携带的miRNA在肿瘤克隆增殖过程中的分子机制。方法1.通过共培养模拟体内多灶型转移对寡灶型转移的影响。2.通过超速离心的方法提取外泌体。3.通过TEM、NTA、WB检测外泌体。4.通过si RNA转染的方法瞬时敲低目的基因。5.通过miRNA mimics转染或慢病毒感染的方法瞬时或稳定过表达目的基因。6.通过RNA提取和RT-qPCR的方法检测目的基因表达水平。7.通过细胞迁移实验、细胞侵袭实验和克隆斑形成实验检测肿瘤细胞的体外迁移增殖能力。8.通过共聚焦荧光显微镜观察细胞摄取外泌体的变化。9.通过高通量测序的方法检测外泌体中miRNA表达水平的变化。10.通过KEGG数据库、TCGA数据库、Target Scan Human数据库、GEPIA数据库、Onco Lnc数据库和华大基因多组学系统进行生物信息学分析。11.通过流式细胞术分析细胞周期的变化。结果1.通过建立的体外寡灶型转移肿瘤细胞和多灶型转移肿瘤细胞的共培养模型,多灶型转移肿瘤细胞通过分泌外泌体在体外介导寡灶型转移向多灶型转移的演变过程。2.在远位转移阶段,多灶型转移肿瘤细胞分泌的外泌体可以增强寡灶型转移肿瘤的体外迁移、侵袭、克隆增殖能力。3.外泌体可以通过运输miRNA调控寡灶型转移向多灶型转移的演变过程。高通量测序分析,寡灶型转移肿瘤细胞和多灶型转移肿瘤细胞分泌的外泌体携带的miRNA存在着不同。4.外泌体携带的miR-199a-1-5p可以明显地促进寡灶型转移肿瘤细胞的体外迁移、侵袭、克隆增殖能力。5.CDKN1B基因是miR-199a-1-5p的靶基因。miR-199a-1-5p可以通过抑制CDKN1B基因的表达水平,从而增强寡灶型转移肿瘤细胞的体外迁移、侵袭、克隆增殖能力,诱导G1期向S期转变。结论1.本研究验证了在远位转移阶段,多灶型转移肿瘤细胞通过分泌外泌体在体外调控寡灶型转移向多灶型转移的演变过程,增强寡灶型转移肿瘤细胞的迁移、侵袭、克隆增殖能力。首次证明可以通过外泌体分泌调控细胞周期介导寡灶型转移向多灶型转移的进展2.本研究首次证明并验证了外泌体通过运输miR-199a-1-5p抑制CDKN1B促进肿瘤转移的分子机制。外泌体通过运输miR-199a-1-5p,增强寡灶型转移肿瘤细胞的miR-199a-1-5p的基因表达,从而抑制CDKN1B基因的表达水平,最终增强寡灶型转移肿瘤细胞的体外迁移、侵袭、克隆增殖能力,诱导G1期向S期转变。这一分子机制和以往外泌体通过运输miR-199a-1-5p抑制肿瘤转移的分子机制完全不同,首次证明了外泌体可以通过运输miR-199a-1-5p抑制CDKN1B的基因表达,诱导G1期向S期转变,促进肿瘤转移增殖。首次证明CDKN1B是寡灶型转移向多灶型转移的演变过程中的抑制因子。这为研究肿瘤转移,尤其是外泌体介导的肿瘤转移提供新的研究思路。3.本研究用的寡灶型转移和多灶型转移模型来源于M14黑色素瘤细胞,所以本研究首次证明miR-199a-1-5p可以通过抑制CDKN1B促进黑色素瘤转移增殖。
金治中[3]（2021）在《生物3D打印胶质瘤微环境：一个用于研究细胞互作和肿瘤治疗的多元胶质瘤模型》文中提出前言:胶质瘤是中枢神经系统最常见的颅内原发性肿瘤,占中枢神经系统肿瘤的50%以上,恶性程度高、侵袭能力强,并伴随较高的复发率和死亡率,特别是胶质母细胞瘤（GBM）恶性程度最高。目前胶质瘤的标准化治疗方案是手术最大程度切除,术后联合放化疗的Stupp方案,但治疗效果仍不尽如人意。传统的胶质瘤临床前研究大多只关注胶质瘤细胞本身,而忽略了胶质瘤微环境与肿瘤细胞间的相互调控,同时缺乏了符合体内的三维空间和有序排列。课题组前期研究发现体外生物3D打印的脑肿瘤模型增强了肿瘤细胞的干性,同时也增强了对于化疗药物的抵抗性,提示了生物3D打印的肿瘤模型对于研究肿瘤细胞行为学和肿瘤耐药的巨大潜力。本研究针对胶质瘤微环境中两大非肿瘤细胞组分,间充质干细胞及免疫细胞组分,细化探讨了在生物3D打印的胶质瘤微环境中,胶质瘤细胞与两种不同微环境细胞的互相调控以及胶质瘤微环境整体对胶质瘤进展的不同影响,旨在为体外三维胶质瘤微环境的建立和胶质瘤体外模型的多元化提供新的思路,达到通过体外三维模型实现研究肿瘤细胞和微环境细胞互相调控机制和药物筛选的目的。第一部分:体外3D模型研究胶质瘤细胞与间充质细胞互作目的:间充质干细胞作为肿瘤微环境中存在的组分,凭借其自身独有的趋瘤性,在胶质瘤治疗的临床前研究中时有提及并展现出一定的收益,但间充质干细胞本身对于肿瘤的进展或者抑制一直是科学争论的焦点问题,报道促胶质瘤和抑制胶质瘤的作用均有提及。本文报道一种体外构建的、呈三维排列的、间充质干细胞与胶质瘤细胞互作的模型建立,研究间充质干细胞对胶质瘤细胞的影响。方法:（1）自建立同轴挤出生物3D打印系统,同轴挤出制造壳-海藻酸钠/芯-GelMA材料包裹高密度细胞悬液的细胞线。其中外壳为2%海藻酸钠溶液包裹间充质干细胞或2%海藻酸钠溶液,内芯为GelMA包裹U87MG胶质瘤细胞,通过打印并交联形成壳-MSC/芯-U87MG或壳-无细胞/芯-U87MG的水凝胶纤;（2）使用活/死试剂和阿尔玛蓝试剂来评价打印后细胞的活性、增殖和抵抗化疗药物的能力,通过倒置显微镜和共聚焦显微镜观察细胞的大小和形态变化;（3）通过流式细胞仪和免疫荧光分析不同培养条件下U87MG细胞的CD133、CD105、OCT4、GFAP和Nestin蛋白表达;（4）提取不同培养条件下的U87MG细胞蛋白,使用Western blot检测与肿瘤侵袭相关的MMP2,与肿瘤进展有关的Notch1和与肿瘤EMT（上皮间质转化）有关的N-cadherin、Vimentin;（5）裸鼠体内注射细胞悬液验证不同环境中的U87MG的成瘤能力差异。结果:同轴生物打印平台构建的壳/芯水凝胶纤维在间充质干细胞的加持下,内芯的U87MG细胞明显地铺展开,展示出良好的空间网状结构,同时间充质干细胞提高了胶质瘤细胞的存活、增殖和化疗药物的抵抗能力,使U87MG细胞表达更多的Nestin、MMP2和Notch1。随着MSC细胞密度的增加,肿瘤细胞表达更多的N-cadherin和Vimentin,EMT能力与MSC的浓度呈正相关。最后我们发现,在成瘤能力的比较上,MSC加持的U87MG组能力强于没有MSC的组分。结论:本研究采用同轴挤压生物打印技术制备壳-MSC/芯-U87MG水凝胶微纤维,模拟间充质干细胞和细胞外基质组成的胶质瘤微环境。在这种微环境中,间充质干细胞在不接触U87MG的情况下具有促进肿瘤细胞侵袭的作用。与无间充质干细胞加持的芯-U87MG水凝胶微纤维相比,间充质干细胞可提高U87MG细胞的增殖、EMT、活性、侵袭、肿瘤发生和耐药能力,并维持其在壳-MSC/芯-U87MG微纤维中的干性。同时,我们发现了 GelMA是一种适用于内芯中观察肿瘤细胞形态、迁移和转移的生物材料,可以在体外建立同轴共培养的肿瘤微环境。该模型为体外肿瘤细胞与基质细胞共培养的研究提供了一个新的平台,以揭示非肿瘤细胞在体外细胞基质中的作用机制。第二部分:体外生物3D打印胶质瘤模型目的:通过生物3D打印的方法建立3D胶质瘤模型,评估生物3D打印胶质瘤细胞建立脑肿瘤模型的可行性;初步对比不同生物材料对于建立生物3D打印胶质瘤模型与2D培养模型的生物学特征和化疗敏感性的差异,为后续建立多元化多组份的胶质瘤微环境打下坚实的基础。方法:（1）建立以明胶/海藻酸钠为原料的水溶胶体系和以谷氨酰胺转氨酶（TGase）/氯化钙（CaCl2）为交联剂的生物打印的水凝胶材料体系;其中TGase交联明胶,CaCl2交联海藻酸钠;（2）建立以含有光引发剂（LAP）的甲基丙烯酸酰化明胶（GelMA）为原料的水溶胶体系,成型之后使用波长为405nm的蓝光交联;（3）建立以含有引发剂（LAP）的甲基丙烯酸酰化明胶（GelMA）/甲基丙烯酸化透明质酸（HAMA）为原料的水溶胶体系,成型之后使用波长为405nm的蓝光交联;（4）使用迈普医学的多喷头生物3D打印机（LivPrintTM）打印6*5*4mm3的类脑形状的网格状水凝胶支架;（5）使用荧光活/死染色试剂来评估细胞在水凝胶支架上的活性及增殖能力,使用扫描电镜观察细胞在水凝胶支架中的形态结构;（6）流式分析胶质瘤干细胞在三维环境下的不同生物材料中和2D条件下胶质瘤干细胞表面标记物CD90、EMT相关基因CD44和肿瘤血管生成能力相关的CD105;（7）使用label free分析3D环境下的肿瘤分泌蛋白与2D条件下肿瘤分泌蛋白在种类和数量上的差异;（8）二代测序（NGS）进行生物信息学分析。结果:（1）生物3D打印的生物材料水凝胶支架体系,不论是明胶/海藻酸钠体系、GelMA体系或GelMA/HAMA体系均可见多级孔结构,其中GelMA/HAMA体系中的胶质瘤干细胞或胶质瘤细胞可以实现“早期逃逸”,即肿瘤细胞可以通过分泌基质金属蛋白酶（MMP）或其他物质消化细胞外基质,实现肿瘤细胞的侵袭;（2）U87MG细胞在GelMA/HAMA体系中的增殖能力强于单独GelMA和明胶/海藻酸钠体系;（3）GelMA/HAMA中的胶质瘤干细胞（GSC23）与2D培养和明胶/海藻酸体系中的GSC23相比,高表达干性标记物CD90和成血管能力标志物CD105;（4）生物3D打印的胶质瘤模型与2D模型相比,分泌更多的POSTN、CSF-1、TGF-b1和Vimentin等细胞因子和蛋白,上调了 82种蛋白和因子的分泌同时下调了 19种;（5）生物3D打印的胶质瘤细胞在缺氧相关基因、EMT相关基因、细胞迁移、连接、成血管能力等相关基因均有所增高,在DNA复制和细胞周期调控、增殖等方面的相关基因表达弱于2D培养环境。结论:借助生物3D打印技术,通过不同组份的水凝胶体系进行打印,这种体外形成的“类脑”3D胶质瘤模型可以更好地模拟体内肿瘤微环境,反应更为真实的胶质瘤生物行为学特点,其中以GelMA/HAMA为基质材料构建的三维肿瘤模型具有更强的增殖、侵袭、EMT等能力,为体外研究三维胶质瘤微环境、三维排列的肿瘤细胞体外生物行为学提供了新的研究平台。第三部分:生物3D打印胶质瘤免疫微环境及肿瘤细胞-肿瘤相关巨噬细胞在三维微环境中的相互作用目的:肿瘤微环境由肿瘤细胞、肿瘤干细胞、免疫细胞和间充质细胞等组成,目前的研究结果表明胶质瘤相关巨噬细胞对于胶质瘤的进展具有重要的调控作用,但基本都是在2D共培养的条件下或PDX模型中完成的相关临床前研究,无法很好的模拟体内肿瘤微环境。我们通过建立一个以生物3D打印为基础,以多细胞、多生物材料为填充物的体外胶质瘤微环境模型,实现模拟体内的胶质瘤微环境的目的,从而进行肿瘤细胞-非肿瘤细胞在三维微环境中互相作用的研究。方法:（1）通过第二部分的实验结果比较,选用GelMA/HAMA作为细胞外基质生物材料,使用迈普医学的多喷头生物3D打印机（LivPrintTM）打印6*5*4mm3的类脑形状的网格状水凝胶支架,其中底层、外层为种上巨噬细胞的基底,其余部分为胶质瘤细胞或胶质瘤细胞与胶质瘤干细胞;（2）qPCR测定不同培养条件下的胶质瘤细胞/胶质瘤干细胞缺氧、干性、转化因子、体现侵袭能力的相关基因表达情况;（3）Western blot、流式、qPCR检测不同培养条件下的巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化的相关蛋白表达情况;（4）label free分析不同分组的蛋白种类和数量的差异;（5）Elisa试剂盒检测判断造成巨噬细胞极化M2型能力不同的原因;（6）二代测序（NGS）进行生物信息学分析;（7）观察不同成分的胶质瘤微环境对于不同化疗药物的敏感程度差异。结果:（1）使用多喷头生物3D打印的三维胶质瘤微环境通过光固化可以在细胞培养的环境中保持稳定的形态和固定的结构,胶质瘤细胞（U87MG）/胶质瘤干细胞（GSC23）/胶质瘤相关巨噬细胞（GAM）在打印后的第5天均有较高的存活率（大于80%）;（2）Western blot检测M2型巨噬细胞极化能力体现的标记物精氨酸酶-1（Arginase-1）,U87MG/GSC23/GAM>GSC23/GAM>U87MG/GAM>GAM,qPCR检测Arg-1、IL-10、CD163三种M2型巨噬细胞表达标志物也是同样的结论,流式检测CD206的结果也基本一致;（3）三维微环境中加入了 GAM后,qPCR检测到肿瘤细胞/肿瘤干细胞表达更多的TGF-b1,STAT3,IL-1b,FGF2等与肿瘤进展正向相关基因,同时高表达MMP2,MMP9两种主要的基质金属蛋白酶基因,高表达VEGFR成血管相关基因;（4）在CSF-1和TGF-b1两种细胞因子分泌检测中,我们得到了相同的结论,微环境成分越复杂,细胞因子分泌的越多;（5）通过label free蛋白组学质谱比较蛋白分泌,我们发现了加入GAM后,整体的蛋白分泌更多的Vim,SPP1,CXCL8等,提示肿瘤细胞EMT和成血管能力在巨噬细胞的加持下进一步增强;（6）三维微环境对于BCNU和TMZ的化疗作用相较于DOX更为明显,且成分越复杂,对于化疗药物的抵抗力越强。结论:三维胶质瘤微环境的成分越复杂,极化M2型巨噬细胞的能力越强,同时被极化的M2型胶质瘤相关巨噬细胞进一步增强微环境中胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞的增殖、侵袭、上皮间质转化、成血管等能力,且复杂的微环境在体外具有更高的仿生性。生物3D打印的肿瘤微环境模型为研究三维环境中的肿瘤细胞-非肿瘤细胞的相互作用和药物的开发与筛选提供了全新的思路和良好的平台。
夏开国[4]（2021）在《Ⅰ型胶原蛋白/纤维连接蛋白通过整合素αvβ3激活PI3K/AKT/SOX2信号通路促进胶质瘤的生长与增殖》文中研究表明目的:肿瘤的形成是一个极其复杂的细胞异常增殖过程,它形成的每个环节都受多种因素的影响,这包括肿瘤微环境和癌干细胞。脑胶质瘤在颅脑肿瘤中最为常见,而且高级别胶质瘤生存期短,复发率高,目前的治疗方案疗效有限。目前,亟待制定新的治疗策略去延长患者生命,所以,对于胶质瘤形成及进展机制的研究尤为重要。本研究旨在探索细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白和纤维连接蛋白在胶质瘤形成及进展中的作用。方法:本研究使用免疫组化染色检测患者胶质瘤组织中Ⅰ型胶原蛋白（Col-I）和纤维连接蛋白（FN）的表达情况。然后建立了三维Ⅰ型胶原蛋白/纤维连接蛋白培养体系模拟体内肿瘤微环境,通过LN229和T98G胶质瘤细胞体外培养分析Ⅰ型胶原蛋白/纤维连接蛋白与胶质瘤进展的关系及分子机制。使用蛋白质印迹法检测体外培养胶质瘤细胞中整合素αvβ3蛋白含量。免疫荧光法用来检测整合素αvβ3在不同肿瘤级别的胶质瘤组织中的表达和体外培养的胶质瘤细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。通过CCK-8法、Image J图像分析软件测定集落大小和平板克隆形成实验等方法来检测胶质瘤细胞的增殖及集落形成能力,进而研究PI3K/AKT信号通路相关蛋白的功能。用异种移植胶质瘤小鼠模型研究体外培养的LN229和T98G胶质瘤细胞成瘤能力及整合素抑制剂在体内的抗肿瘤效果。结果:本研究通过患者胶质瘤组织的免疫组化分析发现在高级别胶质瘤中Col-I和FN的表达较低级别胶质瘤的表达明显升高,而且二者之间存在高度相关性。在三维Ⅰ型胶原蛋白培养模型中加入纤维连接蛋白可以显着促进胶质瘤细胞生长,这说明Ⅰ型胶原蛋白与纤维连接蛋白协同向胶质瘤细胞传递促生存信号。在三维Ⅰ型胶原蛋白/纤维连接蛋白培养系统中培养的胶质瘤细胞在增殖、集落形成及成瘤能力均显着增强,表明在该培养模型中,胶质瘤细胞获得了致瘤潜能并显示出增殖能力变强。与普通培养瓶相比,在三维Ⅰ型胶原蛋白/纤维连接蛋白培养系统中αvβ3蛋白水平明显升高,这说明Ⅰ型胶原蛋白/纤维连接蛋白与αvβ3关系密切。通过免疫荧光检测患者胶质瘤组织中的αvβ3,发现其在高级别胶质瘤中比低级别胶质瘤表达更高。使用αvβ3抑制剂处理体外培养胶质瘤细胞后,PI3K或AKT蛋白表达明显降低,而且肿瘤细胞增殖、集落形成和成瘤能力均明显受抑,这表明αvβ3是通过PI3K/AKT进行信号转导的。同样地,使用PI3K或AKT抑制剂处理LN229胶质瘤细胞后,显着抑制了肿瘤细胞增殖、集落形成和成瘤能力,并且显着抑制了SOX2蛋白表达,表明SOX2是PI3K/AKT的下游调节因子。结论:本研究证明了Ⅰ型胶原蛋白和纤维连接蛋白通过整合素αvβ3激活PI3K/AKT/SOX2信号通路协同促进胶质瘤的进展。Ⅰ型胶原蛋白和纤维连接蛋白协同调节胶质瘤细胞的干细胞特性,进而诱导肿瘤细胞持续生长和复发。通过阻断整合素αvβ3可抑制胶质瘤生长和增殖,为根除肿瘤和减少胶质瘤复发提供了新的药物治疗方向。
魏小勇[5]（2020）在《MicroRNA-1305抑制肝脏肿瘤干细胞的机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的:研究MicroRNA-1305与UBE2T的相互作用及对肝癌干细胞的影响,并探讨其作用机制。研究方法:通过原位杂交、GEO芯片数据库对比分析了肝癌细胞和正常细胞的显着差异基因及共有基因,并绘制相互作用网络图。流式细胞仪、q RT-PCR和Western blot分析UBE2T在CD133+CD13+肝癌干细胞中的表达。通过沉默UBE2T基因观察对LCSCs的球形细胞形成能力、集落形成能力和增殖能力及接种裸鼠后肿瘤的体积和重量的影响。进一步采用荧光素酶报告基因系统验证miR-1305和UBE2T的相互作用。为了进一步验证miR-1305与UBE2T在LCSCs中的相互作用,将miR-1305和UBE2T共转染至LCSCs。观察miR-1305和UBE2T分别对LCSCs的球形细胞和集落形成能力、增殖能力和致瘤性的影响。为了进一步研究miR-1305与UBE2T相互作用对LCSCs信号通路的影响。q RT-PCR和Western blot分析miR-1305和UBE2T分别对Akt信号通路的磷酸化的p-Akt和p-GK3β的表达水平的影响。采用LYC294002 Akt信号通路抑制剂对Akt信号通路进行抑制,观察UBE2T和miR-1305分别对LCSCs中p-Akt和p-GSK3β蛋白的表达水平的影响。并用LY294002的处理观察UBE2T对LCSCs的球形细胞和集落细胞形成能力、细胞增殖和迁移能力及裸鼠肿瘤的体积和重量的影响。实验结果:通过原位杂交、GEO芯片数据库对比分析了肝癌细胞和正常细胞的显着差异基因及共有基因,并绘制相互作用网络图,UBE2T位于相互作用网络图的中心。流式细胞仪、q RT-PCR和Western blot分析发现UBE2T在CD133+CD13+肝癌干细胞中高表达,且其中干细胞自我更新能力相关的基因Oct4,Sox2,Nanog表达水平相比Huh7细胞显着提升。通过沉默UBE2T基因能显着抑制LCSCs的球形细胞形成能力、集落形成能力和增殖能力,还能显着减少LCSCs接种裸鼠后肿瘤的体积和重量（p<0.05）。进一步采用荧光素酶报告基因系统验证miR-1305和UBE2T的相互作用,miR-1305可以显着抑制UBE2T组相对荧光素酶的表达水平,但无法抑制UBE2Tmut组相对荧光素酶的表达水平,从而证实了两者的相互作用。为了进一步验证miR-1305与UBE2T在LCSCs中的相互作用,将miR-1305和UBE2T共转染至LCSCs。结果表明,miR-1305可以显着抑制LCSCs的球形细胞和集落形成能力、增殖能力和致瘤性,而UBE2T的过表达可以显着提升LCSCs的自我更新能力和致瘤性。为了进一步研究miR-1305与UBE2T相互作用对LCSCs信号通路的影响。q RT-PCR和Western blot分析结果表明,miR-1305和UBE2T可以分别显着降低和提升Akt信号通路的磷酸化的p-Akt和p-GK3β的表达水平（p<0.05）。本论文采用LYC294002 Akt信号通路抑制剂对Akt信号通路进行抑制。结果表明,UBE2T能显着上调LCSCs中p-Akt和p-GSK3β蛋白的表达水平,miR-1305能显着下调LCSCs中p-Akt和p-GSK3β蛋白的表达水平,LY294002也能显着下调UBE2T基因对LCSCs中p-Akt和p-GSK3β蛋白的表达的正调控作用。LY294002的处理能显着降低UBE2T过表达LCSCs的球形细胞和集落细胞形成能力、细胞增殖和迁移能力,还能显着降低接种UBE2T过表达LCSCs裸鼠肿瘤的体积和重量（p<0.05）。研究结论:miR-1305靶向UBE2T抑制Akt信号通路,从而抑制LCSCs的自我更新和致瘤性。这些发现可能会加强对miR-1305的理解,将其作为限制LCSCs进展的治疗靶点。本研究将为抑制肝癌干细胞的进展提供新型的小分子,并为肝癌细胞进展的分子机制解析提供科学依据。
李哲[6]（2020）在《靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒构建及感染性质分析》文中提出溶瘤病毒（Oncolytic viruses,Ovs）疗法是肿瘤生物治疗应用的一个热点,其原理是利用病毒的复制能力,选择性感染和裂解破坏肿瘤细胞,且正常细胞和组织无害,裂解的肿瘤细胞可以释放子代病毒和肿瘤相关抗原,刺激机体产生免疫反应进一步杀伤肿瘤细胞。此外,有研究表明:某些OVs（如溶瘤痘病毒）还能够特异性地感染并破坏肿瘤血管,间接引起未感染的肿瘤细胞凋亡或坏死。肿瘤新生血管（Tumor neo-vasculature）为肿瘤细胞的增殖和转移提供氧气和营养物质,OVs通过靶向感染和破坏肿瘤血管将进一步增强其肿瘤杀伤能力并抑制肿瘤的侵袭转移。溶瘤腺病毒,也被称为条件复制型腺病毒（conditionally replicating adenovirus,CRAd）是目前临床研究应用最多的溶瘤病毒之一。目前在研的溶瘤腺病毒主要是基于人血清5型腺病毒（Ad5）改造而来。Ad5的主要细胞受体是柯萨奇-腺病毒受体（CAR）,腺病毒通过其纤维蛋白（fiber）与受体结合,从而使其附着在细胞表面,并通过整合素受体内化。由于肿瘤血管内皮细胞表面CAR低表达或不表达,使得CRAd5缺乏感染肿瘤血管内皮细胞的能力,因而限制了溶瘤腺病毒通过破坏肿瘤血管增强其抗肿瘤作用的潜力。目前已发现60多种血清型的人腺病毒,并分为A-G七个亚群,不同血清型腺病毒因识别受体不同而感染不同的细胞类型。如C亚群的Ad5等血清型的细胞受体是CAR,而D亚群的Ad37则以唾液酸（SA）为受体。唾液酸是神经氨酸的乙酰化衍生物,唾液酸的含量与肿瘤的增值、转移、浸润等密切相关,不同形式的唾液酸与血管内皮细胞的黏附相关。因此,我们提出以下假设:1、肿瘤血管内皮细胞表面的唾液酸受体会呈现高表达。2、将Ad5纤维蛋白上识别受体的头节区（knob）替换为Ad37的knob,构建fiber嵌合型病毒,可以增强CRAd5感染肿瘤血管内皮细胞的能力。此外,有研究报道,在整合素高表达的肿瘤模型中,RGD修饰的溶瘤病毒可以增强靶向性和抗肿瘤活性。同时,RGD肽通过竞争细胞外基质整合素受体,抑制肿瘤血管的新生,降低肿瘤细胞对正常组织的浸润与黏附能力。因此,以RGD修饰fiber嵌合型病毒,将进一步增强CRAd5靶向感染肿瘤血管的能力。基于上述背景,本论文设计构建一种新型fiber嵌合型溶瘤腺病毒,以增强溶瘤腺病毒靶向感染肿瘤血管内皮细胞的能力。具体构建策略:首先,将CRAd5的knob替换为Ad37的knob构建CRAd5/K37;然后,在CRAd5/K37的knob或其它fiber区域突变或插入RGD肽进一步构建RGD修饰的嵌合溶瘤腺病毒CRAd5/K37-RGD。获得上述嵌合病毒后,深入分析其感染肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的能力和性质。本论文首先分析了靶向肿瘤血管溶瘤腺病毒修饰策略的可行性。通过流式细胞术检测发现,人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表面的唾液酸受体呈现高表达。同时在构建病毒载体之前,首先构建了两种修饰策略的嵌合fiber真核表达载体,通过Western Blot分析嵌合fiber的表达情况和三聚体形式。结果显示:嵌合fiber（F5/K37）能够正常表达并形成三聚体;在Ad37 knob区域的HI-loop环插入RGD肽影响嵌合fiber的表达和三聚体形成,进而会影响病毒包装;而在fiber的shaft区域突变插入RGD肽,不影响嵌合fiber的表达和三聚体的形成。随后,在上述设计和前期验证的基础上,构建了以肿瘤特异性启动子Survivin介导E1基因表达的fiber嵌合型溶瘤腺病毒CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD。通过腺病毒骨架质粒的构建以及病毒包装、筛选、纯化和滴度测定等步骤最终成功获得了上述两种新型溶瘤腺病毒。然后,通过Dot blot等实验验证了嵌合病毒纤维蛋白的型别变化。接下来,我们重点分析了嵌合型溶瘤腺病毒对人血管内皮细胞和肿瘤细胞的感染性质。分别以表达红色荧光蛋白（RFP）的CRAd5、CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD感染人血管内皮细胞（HUVEC）、人微脑血管内皮细胞（hCMEC/D3）、正常肝细胞和多种肿瘤细胞系,流式分析其细胞转导能力。结果表明:相比于未改造病毒CRAd5,CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD在人血管内皮细胞和多种肿瘤细胞系中的感染和表达能力得到了显着提升。对比两种嵌合病毒发现,尽管CRAd5/K37-S-RGD对一些肿瘤细胞系的感染能力低于CRAd5/K37,但其对肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的选择性更好,表明CRAd5/K37-S-RGD具有更好的安全性。然后,以人卵巢癌细胞系SKOV3为模型,通过knob蛋白阻断,进一步明确了嵌合病毒CRAd5/K37-S-RGD感染依赖的主要受体为CAR、SA及整合素等。之后,我们通过流式、RT-PCR、MTT等方法分析了溶瘤腺病毒对肿瘤血管的抑制能力。嵌合病毒CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD均能显着抑制HUVEC的细胞活力,同时,由于对肿瘤细胞的感染能力的提升,两种嵌合病毒均能显着性抑制具有促使肿瘤血管异常增生功能的肿瘤细胞旁分泌的VEGF。最后,通过在体外模拟嵌合溶瘤腺病毒感染的环境,hVEGF165能够显着提升CRAd5/K37-S-RGD的靶向感染肿瘤血管内皮细胞的能力。最后,我们以人卵巢癌细胞系SKOV3建立小鼠荷瘤模型,通过免疫荧光实验证实嵌合病毒CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD能够高效地感染小鼠肿瘤血管内皮细胞。随后,我们以鼠卵巢癌细胞系OVHM建立小鼠荷瘤模型,分析嵌合溶瘤腺病毒通过破坏肿瘤血管抑制肿瘤生长的能力。两种嵌合病毒并未能显着提升CRAd5的肿瘤生长抑制能力。分析原因,我们认为由于人腺病毒不能在鼠源细胞内有效复制,单纯的感染性增加未能对肿瘤血管产生足够的破坏进而显着抑制肿瘤细胞的生长。综上,本论文通过纤维蛋白改造成功构建了一种具有靶向感染肿瘤血管能力的新型溶瘤腺病毒,为溶瘤腺病毒载体在抗肿瘤血管生成基因治疗方面的研究和应用提供了良好的基础。
柳蕾[7]（2020）在《HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析》文中研究说明迄今为止,我们已发现了与人类疾病相关的8种疱疹病毒,其中单纯疱疹病毒2型（HSV-2）作为α疱疹病毒家族的一员,是引起生殖器疱疹的主要病原体。该病毒是嗜神经性病毒,其可沿神经轴突逆行至骶背根神经节建立潜伏感染,在体内环境出现特定变化时,该潜伏感染病毒可出现重激活。HSV-2能够编码多种蛋白,这些蛋白在病毒的原发性感染、潜伏感染以及复发感染中都有着重要的生物学意义。其中,ICP34.5蛋白是由HSV-2的RL1基因编码的重要功能性分子,可通过其神经毒力特点和抑制细胞诱导的应激性翻译阻滞功能参与病毒的病理过程。病毒的LAT基因与其潜伏相关,具有抑制神经细胞凋亡,提高神经细胞存活的能力,对HSV-2在神经组织中潜伏感染的形成、维持以及重激活起到了关键作用。而LAT基因的miRNA对应RL1基因的反义链,可调控RL1基因的表达。除此之外,目前还没有对以上两种嗜神经性基因之间相互作用关系的相关报道。本论文的工作围绕HSV-2病毒对神经细胞的感染能力以及病毒感染过程中相关的调控机制进行,首先我们选择“神经毒力因子”RL1基因,构建缺失突变株RL1-HSV-2,并对该突变株的增殖动力学及其在动物模型上的临床病理表现、诱导的细胞应激反应、增殖特性以及RL1基因参与病毒相关基因的调控过程做了相应的探索研究。在缺失RL1的基础上,我们又构建同时缺失LAT基因的RL1-LAT-HSV-2,并基于缺失LAT基因的LAT-HSV-2的生物学特征,对RL1-LAT-HSV-2在细胞和动物水平的增殖能力,在小鼠模型的急性感染、潜伏感染及所引起的免疫反应做了分析。在第一部分工作中,与野毒株HSV-2感染相比,缺失RL1基因的HSV-2突变株RL1-HSV-2感染小鼠导致更严重的临床病理表现,表现为类恶病质样综合征。但是,这种病理特征不是由于组织中的病毒增殖所致,RL1-HSV-2在小鼠组织中的病毒载量远低于野毒株感染组。我们的实验观察提示,ICP34.5蛋白的缺失很可能导致了宿主过度的应激反应,该应激反应使得某些组织的炎症反应和趋化因子水平上调,从而导致感染动物的全身衰竭。此外,ICP34.5蛋白的缺失使得病毒按照α、β、γ基因的陆续下调的事实表明,ICP34.5对病毒稳定增殖所必需的转录调控起重要作用。这些实验结果对ICP34.5的功能提出了新的认识。在第二部分工作中,我们观察到HSV-2突变株LAT-HSV-2和RL1-LAT-HSV-2表现了不同的生物学特性。RL1-LAT-HSV-2在神经细胞中的增殖能力明显降低,且在Vero细胞中形成的蚀斑小于LAT-HSV-2突变株和野毒株。对两个突变株以及野毒株感染小鼠的临床观察比较表明,与野生型毒株相比,突变株RL1-LAT-HSV-2具有减毒表型,其在急性感染和潜伏感染的中均具有较低的致病性,并可诱导更强的特异性免疫反应。然而在感染LAT基因缺失的LAT-HSV-2突变株的小鼠中未发现明显的减毒作用。进一步的观察提示RL1和LAT基因的同时缺失并不能完全限制病毒在神经细胞中的增殖,说明HSV-2病毒中存在其它基因参与病毒在神经细胞中的复制和感染。以上结果表明,HSV-2的RL1基因和LAT基因在病毒的感染增殖过程均具有涉及病毒致病机制的生物学特性,二者可能存在着某种相互制衡的关系,在相互调控的过程中亦在病毒与细胞相互作用的过程中表现了特定的病理学意义,使病毒与宿主之间呈现出共平衡的生存状态。这也是在HSV-2的嗜神经特性感染机制研究中对RL1和LAT基因之间相互作用关系的首次发现和探索。
贾瑞[8]（2020）在《SOX3基因突变在肺腺癌EGFR-TKI耐药中的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的肺癌是在全国乃至全世界范围内致死率最高的恶性肿瘤。近年来,以表皮生长因子受体（EGFR）突变为靶点的靶向治疗药物,对特定基因亚型的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的疗效十分明显,它不仅治疗效果好,而且毒副反应轻。但大部分接受第一代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的患者在中位数10-12个月后,会产生耐药性。研究表明,该耐药机制可分为原发性耐药和获得性耐药。原发性耐药主要是指首次采用TKI治疗,但未获益或获益不明显者。获得性耐药主要是指肿瘤具有已知的与TKI敏感相关的EGFR突变,并且先前接受过连续单药EGFR-TKI治疗,但疾病仍进展。获得性耐药的原因主要有:EGFR基因的二次突变（如T790M突变）,某些基因的通路失调（如c-MET扩增）等,但仍有约40%的获得性耐药机制不明。基于以上研究背景,我们在临床工作中收集了69例对第一代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药的IIIb-IV期的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤组织样本和血液样本,其中有21例进行了二次活检和二次血液取样。对这21例患者的标本进行检测,我们在排除T790M突变、c-MET基因的扩增、病理类型转化等原因后,发现了一些关键的突变基因,筛选出SOX3基因突变可能与肺腺癌对一代EGFR-TKI的耐药相关。所以,本课题旨在研究SOX3基因突变在肺腺癌EGFR-TKI获得性耐药中的作用,并探讨其可能的机制。研究方法1)通过慢病毒感染在PC9（含有EGFR 19DEL突变）、HCC827细胞（含有EGFR19DEL突变）中过表达SOX3基因及其突变体SOX3Mut,建立稳转细胞系。通过RT-q PCR（实时荧光定量PCR）、Western Blot（蛋白免疫印迹）实验,鉴定SOX3和SOX3Mut在细胞中过表达。2)通过MTT、平板克隆实验,对上述稳转细胞系进行细胞功能实验研究,评判SOX3基因突变是否影响细胞对EGFR-TKI的敏感性。3)通过Western Blot检测稳转细胞系中cleaved Caspase-3、cleaved PARP等与细胞凋亡相关的蛋白的表达,通过流式细胞术对稳转细胞系进行凋亡分析,观察并分析SOX3基因突变是否影响EGFR-TKI诱导的细胞凋亡。4)通过裸鼠皮下荷瘤体内实验,分析SOX3基因突变与EGFR-TKI耐药是否相关:构建裸鼠皮下移植瘤模型,给予EGFR-TKI治疗后,分析表达SOX3和SOX3Mut的肿瘤生长情况;通过对肿瘤组织进行HE染色及免疫组化染色,分析病理类型及Ki-67蛋白及cleaved caspase-3蛋白的表达状况。5)通过转录组测序和Western Blot分析SOX3基因突变可能影响的细胞信号通路,探索EGFR-TKI耐药相关的分子机制。研究结果1)在PC9、HCC827细胞中建立了稳定转染空载体对照、SOX3和SOX3Mut的细胞系。MTT实验分析表明与对照组相比,过表达SOX3Mut,增加了PC9和HCC827细胞对EGFR-TKI的抵抗,克隆形成实验显示过表达SOX3Mut的PC9和HCC827细胞在EGFR-TKI药物暴露下的克隆形成能力明显增强。2)与对照细胞相比,表达SOX3Mut的细胞在EGFR-TKI处理后,细胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白水平减少,Annexin V/PI流式细胞分析也证实,与对照细胞相比,EGFR-TKI诱导表达SOX3Mut的细胞凋亡能力下降。3)建立了裸鼠的皮下移植瘤模型,经EGFR-TKI治疗后,过表达SOX3Mut的实验组肿瘤的重量明显大于过表达SOX3和表达空载体的对照组;肿瘤生长曲线也显示,停用TKI治疗4周后,过表达SOX3Mut实验组的肿瘤生长比其他两组快。对肿瘤组织进行免疫组化分析发现,与过表达空载体、SOX3相比,过表达SOX3Mut的肿瘤组织中Ki67的表达上升,而cleaved caspase-3表达下降,说明过表达SOX3Mut的肿瘤组织中的细胞增殖能力升高,且细胞凋亡比例降低。这些体内实验结果与体外细胞实验的结果一致,都表明SOX3Mut导致肺腺癌细胞对EGFR-TKI抵抗。4)机制研究发现SOX3Mut导致肺腺癌细胞对EGFR-TKI耐药的机制可能是通过增加Erk蛋白的磷酸化,激活了MAPK信号通路。经转录组测序及生信分析显示Erk蛋白磷酸化可能进一步激活了JMJD7-PLA2G4B融合蛋白,促进肿瘤细胞的增殖和抑制肿瘤细胞的凋亡。结论经过相关的体外、体内实验的验证,我们推测SOX3基因突变是导致EGFR-TKI获得性耐药的新机制。SOX3基因突变可能是通过增强Erk蛋白的磷酸化,抑制了EGFR-TKI诱导的细胞凋亡,从而导致了一部分有敏感突变的NSCLC患者对EGFR-TKI的获得性耐药。
阚连宝[9]（2020）在《高粱乌米多糖提取纯化及对消化系统癌细胞抑制作用研究》文中进行了进一步梳理据ACancer Journal for Clinicians报道,2018年全球范围内将会有1810万癌症新发病率和960万癌症死亡病例,相比于其他国家,我国癌症发病率、死亡率均为全球第一。在1810万新增癌症病例中,我国占380.4万例;在960万癌症死亡病例中,我国占229.6万例。国际上许多化疗药物既杀伤肿瘤细胞,也损伤正常细胞,而多糖是一种能够杀伤肿瘤细胞且增加机体免疫功能的生物活性物质,因此多糖就成为国内外研究的热点之一。高粱乌米（Sporisorium reilianum）是一种植物病原真菌,高粱乌米具有多种生物学活性,高粱乌米活性成分（多糖）也被证明具有抗肿瘤、抗氧化等作用。本文从高粱乌米子实体中分离纯化得到中性多糖级分（WM-N）和酸性多糖级分（WM-A）,而酸性多糖级分得率与糖含量极低且难于纯化,故本文主要针对均一级分中性多糖的结构和生物活性展开研究,包括以下几方面:（1）本文利用热水浸提乙醇沉淀方法从高粱乌米子实体中提取高粱乌米粗多糖（WM）,经DEAE-纤维素离子交换柱层析分级、膜分离和醇沉纯化等分离纯化后获得均一级分的多糖,命名为WM-NP-60。采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定分子量,使用高效液相色谱法（HPLC）法分析单糖组成,多糖WM-NP-60分子量为15.6 kDa,且由Glc（93.3%）和Gal（6.7%）组成;紫外光谱显示多糖级分中不含蛋白质和核酸。多糖WM-NP-60的旋光度为右旋0.049。红外光谱（FT-IR）分析表明其具有吡喃糖结构。通过高碘酸氧化、Smith降解、核磁共振谱（1D/2D NMR）和甲基化法对多糖WM-NP-60的表征分析,我们可以推测出多糖WM-NP-60的结构是以β-1,6-D-Glcp作为主链,约3%主链上的糖基在3位形成分支连接侧链,侧链以线性β-1,3-D-Glcp为主,Gal可能多以末端形式作为侧链连接在主链上,或者连接在线性β-1,3-D-Glcp侧链上。（2）多糖WM-NP-60抗氧化作用研究结果显示,多糖WM-NP-60都具有显着地清除DPPH（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl）自由基、羟基自由基（·OH）、超氧负离子（O2-·）和过氧化氢（H2O2）的能力,螯合二价铁离子Fe2+和抑制邻苯三酚自氧化的能力,以及出色的还原力,表明其具有良好的抗氧化活性。（3）MTT实验证明多糖WM-NP-60对HepG2、SGC7901和HCT116细胞的抑制作用呈现浓度和时间依赖效应,且对HCT116细胞抑制作用最为显着;多糖WM-NP-60能够阻滞HepG2、SGC7901和HCT116细胞周期于G1期,从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡;荧光显微镜方便而直接地检测到磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）的外翻这一细胞凋亡的重要特征;透射电镜观察HepG2、SGC7901和HCT116细胞凋亡形态特征,可见典型的凋亡小体。（4）利用 TMT（Tandem Mass Tags）和 2D-LC-MSMS 技术鉴定分析了多糖 WM-NP-60处理对HCT116细胞中蛋白表达的影响,369个蛋白被鉴定为差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins,DEPs）,其中下调有 129 个,上调有 240 个;并进行了相应的生物信息学分析,发现 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集到15项差异显着的代谢通路（P<0.05）,其中Focal adhesion信号通路和TGF-β信号通路跟细胞周期和细胞凋亡相关;PPI（Protein-Protein Interaction）分析表明6个差异表达蛋白都处在关键节点上,qRT-PCR和Western blot验证实验发现在TGF-β信号通路上,多糖WM-NP-60上调了TGFβR1、p107和DP1基因表达,并下调了THBS1基因表达,从而阻滞细胞周期于G1期,抑制了 HCT116细胞增殖并诱导其凋亡;在Focal adhesion信号通路上,多糖WM-NP-60能上调ITGA7和Rap1基因,从而阻滞细胞周期于G1期。本研究首先利用热水浸提乙醇沉淀方法,从高粱乌米子实体中提取纯化得到均一多糖WM-NP-60;然后对多糖WM-NP-60的结构特征进行分析,推测出多糖WM-NP-60的结构;并研究证明多糖WMNP-60的抗氧化作用和对HepG2、SGC7901和HCT116细胞的抑制并诱导其凋亡;最后采用TMT和2D-LC-MSMS技术分析鉴定差异表达蛋白,结合细胞周期、细胞凋亡、生物信息学和相关蛋白验证实验推测多糖WM-NP-60抗肿瘤的分子机制。
鲁春鹤[10]（2020）在《S100A12及HAX-1在促进胶质瘤恶性进展中的作用及其机制研究》文中研究表明背景:胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,其特点是快速浸润性生长方式,使手术完全切除成为不可能。尽管在肿瘤诊断和治疗方面取得了进展,包括手术、放疗和化疗,但WHOⅡ级胶质瘤患者中位生存时间为5年,WHOⅢ级胶质瘤患者中位生存时间为2至3年,WHOⅣ级为14.6月。对胶质瘤细胞发生机制的研究对胶质瘤的治愈来说至关重要,研究发现S100A12蛋白及HAX-1蛋白在细胞内扮演着重要的作用,参与许多生命调节环节,目前,S100A12已经被证明是星形胶质细胞活化的标志物。HAX-1蛋白因为其具有广泛的生物活性而受到关注,其中包括如调节细胞迁移、抗细胞凋亡、和调节细胞内吞等这些生物学功能。其中,我们发现,其在不同类型肿瘤的机制研究中起到参与肿瘤细胞侵袭、转移以及与肿瘤细胞的发生、发展息息相关。但是,目前来说,蛋白S100A12和HAX-1蛋白在胶质瘤细胞中的调节机制研究较少,其作用机制尚未得到充分的解析。目的:1、S100钙结合蛋白A12（S100A12）作为S100蛋白家族成员之一,其在中性粒细胞中的大量表达,淋巴细胞和单核细胞低表达。S100蛋白家族参与调控许多器官恶性肿瘤病理过程中都有报道,如口咽部鳞状细胞癌、直肠癌等。然而,目前为止,S100A12在胶质瘤中的作用机制尚未得到解析。我们对81例胶质瘤组织中的S100A12进行了免疫组化研究,以确定S100A12在胶质瘤细胞中的表达,并评价S100A12在胶质瘤患者中的临床意义。2、由于HAX-1对下游信号通路转导中的作用的文章存在争议并且在胶质瘤中尚无报道,因此探究HAX-1基因对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制,以及评价其与患者临床预后的相关性具有创新性。其结果有望为胶质瘤的治疗打开新的篇章。方法:1.培养本研究中用到的各种胶质瘤细胞系;2.用实时荧光定量聚合酶链式反应来检测胶质瘤细胞中S100A12以及HAX-1基因的转录水平;3.通过使用免疫组化染色的方法来探究S100A12以及HAX-1蛋白的表达情况;4.通过使用western blot蛋白免疫印迹技术检测胶质瘤细胞以及正常脑组织中的S100A12以及HAX-1蛋白表达情况,以及检测构建S100A12以及HAX-1的基因沉默株之后,相关蛋白表达的变化情况;5.通过使用克隆形成实验来探究S100A12及HAX-1基因沉默前后细胞生长能力的变化。6.通过使用流式细胞检测技术测定此二种基因对胶质瘤细胞作用后生长周期以及细胞凋亡产生的变化情况。结果:研究发现,胶质瘤患者的肿瘤细胞内,S100A12的表达情况与患者的存活率直接相关,S100A12低表达患者的5年存活率超过50%,而S100A12的高表达患者的5年存活率不足10%,81名患者肿瘤细胞中肿瘤的大小与KPS值与患者的S100A12基因表达相关,S100A12高表达的患者中,IIIIV级的患者的数量显着升高。此外,通过检测S100A12在胶质瘤细胞中的表达情况,MTT结果显示,S100A12的表达程度与胶质瘤细胞的生长呈正相关。蛋白表达水平的western blot分析我们发现,S100A12可以影响胶质瘤细胞的凋亡。S100A12的沉默株中,细胞的凋亡数量显着低于未沉默株。Transwell实验结果表明,S100A12对胶质瘤细胞的侵袭和迁移都有显着的增强作用,其相较于S100A12的沉默株,增强大致约3倍。相似的结果也出现在HAX-1相关的实验中。WB及q PCR分析发现,HAX-1在胶质瘤细胞中过表达,且HAX-1在细胞中的表达与年龄、性别等其他因素无关。Transwell实验结果表明,HAX-1基因增加了胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力,此外还能够影响胶质瘤细胞的克隆形成能力,HAX-1过表达的细胞中,细胞侵袭能力是HAX-1沉默细胞的2.6倍。同时,我们对患者的临床数据进行分析发现,HAX-1的表达是胶质瘤患者的独立预后因素。此外,我们还对HAX-1基因及S100A12基因在胶质瘤细胞中的相关性进行分析,我们发现HAX-1基因和S100A12基因在细胞中呈现正表达的关系。结论:综上所述,S100A12及HAX-1蛋白对胶质瘤细胞的生长增殖均有促进作用,并且是胶质瘤的独立预后因素。且有望成为胶质瘤诊断的标志物。
二、瘤细胞转移能力分析的体外研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、瘤细胞转移能力分析的体外研究（论文提纲范文）
（1）SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黑色素瘤 |
| 1.1.1 黑色素瘤的发病机制 |
| 1.1.2 黑色素瘤化疗进展 |
| 1.2 白藜芦醇 |
| 1.2.1 白藜芦醇结构 |
| 1.2.2 白藜芦醇抗肿瘤的机制 |
| 1.3 SHC SH2 结构域连接蛋白1(SHCBP1) |
| 1.3.1 SHCBP1 基因结构 |
| 1.3.2 SHCBP1 与肿瘤发生发展 |
| 1.3.3 SHCBP1 表达调控及功能 |
| 1.4 研究意义 |
| 第2章 白藜芦醇对小鼠黑色素瘤细胞增殖影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 试剂耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂配置方法 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 实验抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 观察细胞形态变化 |
| 2.2.2 CCK-8 检测细胞活力 |
| 2.2.3 MTT检测 |
| 2.2.4 EdU掺入实验 |
| 2.2.5 细胞划痕实验 |
| 2.2.6 平板克隆形成实验 |
| 2.2.7 流式细胞术检测细胞增殖 |
| 2.2.8 细胞增蛋白提取 |
| 2.2.9 Western Blot检测 |
| 2.2.10 灰度分析 |
| 2.2.11 数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 白藜芦醇浓度及时间筛选 |
| 2.3.2 白藜芦醇对B16 细胞周期分布的影响 |
| 2.3.3 白藜芦醇抑制B16 细胞迁移和集落 |
| 2.3.4 白藜芦醇通过ERK和 AKT信号通路抑制B16 细胞增殖 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 基于转录组学分析SHCBP1 在小鼠黑色素瘤细胞中生物学功能 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 试剂、耗材 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 实验抗体 |
| 3.1.5 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞总蛋白提取 |
| 3.2.2 慢病毒干扰载体构建 |
| 3.2.3 慢病毒包装 |
| 3.2.4 稳定表达SHCBP1-sh RNA的细胞株筛选 |
| 3.2.5 实时荧光定量 PCR 检测 |
| 3.2.6 Western Blot 检测 |
| 3.2.7 B16(sh RNA-NC、sh RNA)细胞转录组测序 |
| 3.2.8 转录组测序数据GO与 KEGG分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SHCBP1 蛋白在B16 细胞中本底表达 |
| 3.3.2 重组p LK O.1-SHCBP1-sh RNA载体构建 |
| 3.3.3 稳定干扰SHCBP1 细胞株的建立 |
| 3.3.4 转录组测序结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 SHCBP1 通过ERK磷酸化促进小鼠黑色素瘤细胞进程 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验对象 |
| 4.1.2 试剂、耗材 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.1.5 实验抗体 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞转染 |
| 4.2.2 CCK-8 检测 |
| 4.2.3 EdU掺入实验 |
| 4.2.4 流式细胞术检测细胞周期 |
| 4.2.5 细胞划痕实验 |
| 4.2.6 细胞集落实验 |
| 4.2.7 蛋白提取 |
| 4.2.8 Western Blot实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 SHCBP1 超表达效率 |
| 4.3.2 SHCBP1 超表达/干扰影响B16 细胞活力 |
| 4.3.3 超表达/干扰SHCBP1 分析B16 细胞周期进程 |
| 4.3.4 SHCBP1 促进细胞迁移及集落形成 |
| 4.3.5 SHCBP1 影响细胞增殖相关信号通路 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 白藜芦醇通过SHCBP1/ERK和 AKT信号通路抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验对象 |
| 5.1.2 试剂、耗材 |
| 5.1.3 试剂配制 |
| 5.1.4 实验仪器 |
| 5.1.5 实验抗体 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 EdU掺入实验 |
| 5.2.2 细胞集落形成实验 |
| 5.2.3 Western Blot检测细胞增殖相关基因 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 B16 细胞增殖效应 |
| 5.3.2 细胞集落形成能力分析 |
| 5.3.3 白藜芦醇通过SHCBP1 调控B16 细胞增殖相关蛋白表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 I 主要试剂及材料 |
| 附录 II 实验仪器 |
| 攻读硕士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）多灶型转移肿瘤分泌的外泌体通过转运miR-199a-1-5p抑制CDKN1B来促进寡灶型转移到多灶型转移的进展（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1、实验材料和实验仪器 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肿瘤来源的外泌体影响黑色素瘤进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及参与的科研项目 |
（3）生物3D打印胶质瘤微环境：一个用于研究细胞互作和肿瘤治疗的多元胶质瘤模型（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:体外3D模型研究胶质瘤细胞与间充质细胞互作 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 海藻酸钠与GelMA水溶胶体系的选择与配制 |
| 2.4 同轴打印壳-MSC/芯-U87MG的水凝胶微纤维 |
| 2.4.1 材料准备 |
| 2.4.2 细胞准备 |
| 2.4.3 装载细胞的水溶液配置 |
| 2.4.4 同轴生物打印 |
| 2.4.5 打印后处理 |
| 2.5 体外生物学评价 |
| 2.5.1 细胞状态和形态观察 |
| 2.5.2 细胞增殖测定 |
| 2.5.3 水凝胶的溶解 |
| 2.5.4 细胞活性与细胞直径分析 |
| 2.5.5 体外耐药性评价 |
| 2.5.6 免疫荧光染色 |
| 2.5.7 流式细胞分析 |
| 2.5.8 蛋白质印迹分析 |
| 2.6 体内致瘤能力分析 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 壳/芯水凝胶微纤维的构建及胶质瘤细胞的生长特点 |
| 3.2 细胞活性和增殖能力评价 |
| 3.3 三维胶质瘤微纤维体外耐药性评价 |
| 3.4 细胞干性、成血管能力和恶性程度的改变 |
| 3.5 胶质瘤细胞迁移能力与上皮-间质转化(EMT)评价 |
| 3.6 体内致瘤性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:体外生物3D打印胶质瘤模型 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 海藻酸/明胶体系、GelMA体系、GelMA/HAMA水溶胶体系的选择与配制 |
| 2.4 生物3D打印胶质瘤模型 |
| 2.4.1 材料准备 |
| 2.4.2 细胞准备 |
| 2.4.3 装载细胞的水溶液配置 |
| 2.4.4 生物3D打印 |
| 2.4.5 打印后处理 |
| 2.5 体外生物学评价 |
| 2.5.1 细胞形态与支架的观察 |
| 2.5.2 细胞增殖分析 |
| 2.5.3 流式细胞术分析 |
| 2.5.4 DNA测序 |
| 2.5.5 生物信息学分析方法 |
| 2.5.6 定量组蛋白(label free)分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同生物材料中肿瘤细胞的行为学特点 |
| 3.2 细胞增殖能力评价 |
| 3.3 干性、黏附和成血管能力评价 |
| 3.4 细胞因子、蛋白分泌差异 |
| 3.5 三维细胞外基质对肿瘤模型的基因改变 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:生物3D打印胶质瘤免疫微环境及肿瘤细胞-肿瘤相关巨噬细胞在三维微环境中的相互作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 GelMA/HAMA生物材料的配制 |
| 2.4 生物3D打印胶质瘤模型 |
| 2.5 体外生物学评价 |
| 2.5.1 细胞形态与肿瘤微环境的观察 |
| 2.5.2 流式细胞术分析 |
| 2.5.3 蛋白质印迹分析 |
| 2.5.4 定量组蛋白(label free)分析 |
| 2.5.5 DNA测序与生物信息学分析 |
| 2.5.6 肿瘤微环境的耐药性评价 |
| 2.5.7 荧光定量PCR分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 胶质瘤微环境的制造 |
| 3.2 胶质瘤微环境成分的复杂程度的提升对巨噬细胞极化能力的提升评价 |
| 3.3 胶质瘤微环境维度的提升对巨噬细胞极化能力的提升及造成差异的可能原因的探究 |
| 3.4 微环境中的胶质瘤相关巨噬细胞反馈激活胶质瘤细胞 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 综述 生物3D打印与胶质瘤模型 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）Ⅰ型胶原蛋白/纤维连接蛋白通过整合素αvβ3激活PI3K/AKT/SOX2信号通路促进胶质瘤的生长与增殖（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 整合素αvβ3在胶质瘤中的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）MicroRNA-1305抑制肝脏肿瘤干细胞的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肝癌 |
| 1.1.1 肝癌分类 |
| 1.1.2 肝癌治疗方法进展 |
| 1.2 miRNA的介绍 |
| 1.2.1 miRNA的作用机制 |
| 1.2.2 miRNA对肿瘤的调控作用 |
| 1.3 miRNA与肝细胞癌干性的关系 |
| 1.3.1 肿瘤干细胞干性 |
| 1.3.2 肿瘤细胞干性的相关通路 |
| 1.4 miRNA对肝细胞癌(HCC)的调控作用 |
| 1.4.1 miRNA靶向Akt信号通路调节LCSCs |
| 1.4.2 miRNA靶向wnt信号通路 |
| 1.4.3 miRNA靶向TGF-β信号通路 |
| 1.4.4 miRNA靶向JAK/STAT信号通路调节LCSCs |
| 1.5 引出问题的研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 肿瘤细胞系 |
| 2.1.3 实验仪器及耗材 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因表达芯片分析 |
| 2.2.2 LCSC细胞培养、分选与鉴定 |
| 2.2.3 细胞的转染与处理 |
| 2.2.4 荧光定量PCR分析 |
| 2.2.5 Western blot分析 |
| 2.2.6 miRNA的表达与定位 |
| 2.2.7 miRNA干扰试验 |
| 2.2.8 UBE2T基因的沉默与过表达 |
| 2.2.9 miRNA-1305与UBE2T基因的相互作用验证 |
| 2.2.10 球形细胞形成能力分析 |
| 2.2.11 软琼脂平板分析集落形成能力 |
| 2.2.12 CCK-8 测试细胞增殖能力 |
| 2.2.13 对裸鼠致瘤性的分析 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 第3章 MicroRNA-1305与UBE2T在 LCSCs中的相互作用分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 肝癌及癌旁芯片中MicroRNA-1305 差异表达 |
| 3.3 UBE2T在 HCC细胞中高表达 |
| 3.4 HCC细胞中的分子标记分析 |
| 3.5 UBE2T的沉默降低肝癌细胞的自我更新能力和致瘤性 |
| 3.6 micro RNA-1305 靶基因的预测及验证 |
| 第4章 miR-1305 通过Akt细胞通路调节肿瘤细胞的干性及致瘤性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 miR-1305对UBE2T基因的体内外调控作用 |
| 4.3 通过恢复miR-1305 能够逆转UBE2T基因导致的干性 |
| 4.4 miR-1305 的存在能显着抑制肝癌干细胞的致瘤性 |
| 4.5 miR-1305对LCSCs中 Akt通路相关基因的影响 |
| 4.6 miR-1305 转染对于Akt信号通路相关基因表达水平 |
| 4.7 miR-1305 转染和LY294002 处理对于LCSCs致瘤性的影响 |
| 第5章 讨论与意义 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 MicroRNA与肝癌干细胞的调控作用 |
| 参考文献 |
（6）靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒构建及感染性质分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肿瘤血管简介 |
| 1.2 溶瘤腺病毒简介 |
| 1.2.1 溶瘤病毒定义 |
| 1.2.2 腺病毒简介 |
| 1.2.3 溶瘤腺病毒的基因工程修饰策略 |
| 1.3 溶瘤腺病毒在抗血管生成基因治疗中的应用 |
| 1.4 RGD肽在肿瘤抗血管生成治疗中的应用 |
| 1.5 论文设计 |
| 1.5.1 论文思路 |
| 1.5.2 实验设计 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌种、动物 |
| 2.1.2 主要材料和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受体表达分析 |
| 2.2.2 真核表达载体和腺病毒骨架质粒的构建 |
| 2.2.3 Western-Blot |
| 2.2.4 腺病毒包装、筛选、扩增、纯化及滴度检测 |
| 2.2.5 Dot-blot |
| 2.2.6 溶瘤腺病毒感染性质检测 |
| 2.2.7 溶瘤腺病毒抑制肿瘤血管能力检测 |
| 2.2.8 溶瘤腺病毒体内抗肿瘤活性检测 |
| 2.2.9 免疫荧光 |
| 2.2.10 数据统计分析 |
| 第3章 实验结果与讨论 |
| 3.1 靶向肿瘤血管的腺病毒载体修饰策略可行性分析 |
| 3.1.1 HUVEC细胞α2-3-SA表达分析 |
| 3.1.2 不同修饰策略的真核表达载体的构建 |
| 3.1.3 不同修饰策略的嵌合Fiber表达的验证 |
| 3.2 靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒的获得 |
| 3.2.1 腺病毒骨架质粒的构建 |
| 3.2.2 靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒的包装、筛选、纯化及鉴定 |
| 3.3 溶瘤腺病毒的感染性质分析 |
| 3.3.1 溶瘤腺病毒的转导能力分析 |
| 3.3.2 溶瘤腺病毒的溶瘤作用分析 |
| 3.3.3 溶瘤腺病毒的感染依赖的受体分析 |
| 3.4 .靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒抑制肿瘤血管能力分析 |
| 3.4.1 溶瘤腺病毒的抑制HUVEC能力分析 |
| 3.4.2 溶瘤腺病毒抑制VEGF作用分析 |
| 3.4.3 VEGF对 CRAd感染能力的影响 |
| 3.5 靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒体内靶向感染能力分析 |
| 3.5.1 溶瘤腺病毒体内靶向感染能力分析 |
| 3.5.2 溶瘤腺病毒体内抗肿瘤活性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| HSV-2概述 |
| HSV-2的基因组及其病毒生活史 |
| HSV感染引起的免疫反应以及免疫逃逸 |
| “神经毒力因子”ICP34.5 |
| ICP34.5介导宿主关闭蛋白合成的逆转 |
| ICP34.5可抑制Ⅰ型干扰素的产生 |
| ICP34.5抑制细胞自噬 |
| 潜伏相关转录因子—一LAT |
| HSV感染细胞引起应激颗粒形成 |
| HSV感染的动物模型 |
| HSV感染动物引起类似恶病质的临床症状 |
| 实验思路 |
| 第一部分 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建及其引起的类恶病质临床症状和相关的转录调控功能分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 质粒与载体 |
| 1.1.5 抗体 |
| 1.1.6 溶液和商品化试剂 |
| 1.1.7 主要设备仪器 |
| 1.1.8 主要耗材 |
| 1.1.9 引物 |
| 1.1.10 主要溶液及配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞传代 |
| 1.2.1.3 细胞计数 |
| 1.2.1.4 细胞冻存 |
| 1.2.2 病毒培养 |
| 1.2.2.1 病毒扩增及收获 |
| 1.2.2.2 病毒滴度测定 |
| 1.2.3 质粒构建 |
| 1.2.3.1 PX330质粒构建 |
| 1.2.3.2 pEGFP-RL1质粒的构建 |
| 1.2.3.3 pcDNA3.1(+)-RL1-/pcDNA3.1(+)-RL1质粒的构建 |
| 1.2.3.4 pGL-ICP0, pGL-ICP4, pGL-ICP22, pGL-US11质粒的构建 |
| 1.2.3.5 pGEM(?)-T-US4质粒的构建 |
| 1.2.3.6 感受态大肠杆菌转化 |
| 1.2.3.7 筛选目的单菌落 |
| 1.2.3.8 无内毒素质粒小量提取 |
| 1.2.3.9 质粒转染 |
| 1.2.4 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建和纯化 |
| 1.2.4.1 病毒感染 |
| 1.2.4.2 病毒收获 |
| 1.2.4.3 病毒基因组提取 |
| 1.2.4.4 病毒基因组PCR鉴定 |
| 1.2.4.5 分离病毒克隆 |
| 1.2.5 RL1-HSV-2补偿病毒的构建 |
| 1.2.5.1 质粒转染 |
| 1.2.5.2 病毒感染 |
| 1.2.5.3 补偿病毒中RL1分子表达量的检测 |
| 1.2.6 突变株RL1-HSV-2在细胞水平的生物学特性分析 |
| 1.2.6.1 病毒增殖动力学检测 |
| 1.2.6.2 Vero、VK2细胞蚀斑形态分析 |
| 1.2.6.3 VK2细胞中细胞因子、应激反应因子以及RL1相关病毒基因转录水平检测 |
| 1.2.6.4 突变株RL1-HSV-2细胞凋亡检测 |
| 1.2.7 突变株RL1-HSV-2以及野毒株HSV-2编码的RL1蛋白对基因ICP0,ICP4,ICP22,US11启动子的调控作用分析 |
| 1.2.8 突变株RL1-HSV-2在动物水平的生物学特性分析 |
| 1.2.8.1 突变毒株RL1-HSV-2的急性感染能力分析 |
| 1.2.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建和纯化 |
| 2.2 RL1-HSV-2突变株的生物学特性 |
| 2.2.1 RL1-HSV-2在细胞中的增殖动力学分析 |
| 2.2.2 RL1-HSV-2在VK2细胞和Vero细胞中的蚀斑形态分析 |
| 2.3 RL1-HSV-2补偿病毒的构建及其RL1分子表达量的分析 |
| 2.4 RL1-HSV-2感染动物后的临床病理特征 |
| 2.4.1 RL1-HSV-2感染动物后的临床表现 |
| 2.4.2 RL1-HSV-2感染小鼠后的组织病理分析 |
| 2.4.3 RL1-HSV-2感染小鼠后阴道周围肌肉组织的电镜分析以及神经组织和主要器官的组织化学分析 |
| 2.5 RL1-HSV-2引起的类似恶病质反应 |
| 2.5.1 RL1-HSV-2可引起类似恶病质的临床症状 |
| 2.5.2 RL1-HSV-2引起的类似恶病质的炎性因子及血生化水平分析 |
| 2.6 RL1-HSV-2感染细胞后的应激反应 |
| 2.7 RL1- HSV-2感染小鼠后急性感染期器官组织的病毒载量分析 |
| 2.8 ICP34.5参与病毒基因的转录 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 HSV-2突变株LAT-HSV-2和RL1-LAT-HSV-2的构建及其生物学特性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 本部分所用病毒、细胞、实验动物、质粒与载体、细胞培养、细胞培养用溶液、商品化试剂与溶液、主要溶液、耗材和设备同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.1.2 病毒 |
| 1.1.3 抗体 |
| 1.1.4 试剂盒 |
| 1.1.5 引物及肽段 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 本部分所用细胞培养、病毒培养、质粒构建、质粒转化及转染、突变株的构建、突变株在细胞水平的生物学特性分析均同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.2.2 病毒突变株LAT基因组PCR鉴定 |
| 1.2.3 突变株RL1-LAT-HSV-2以及LAT-HSV-2在动物水平的生物学特性分析 |
| 1.2.3.1 突变株感染小鼠后的急性感染能力分析 |
| 1.2.3.2 突变株感染小鼠后的潜伏感染能力分析 |
| 1.2.4 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 1.2.5 CD3+T细胞检测 |
| 1.2.6 IFN-γ Elispot检测 |
| 1.2.7 骶背根神经节离体重激活分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSV-2突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2的构建 |
| 2.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在细胞水平的生物学特性 |
| 2.2.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在细胞的增殖动力学 |
| 2.2.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在Vero细胞的蚀斑形态分析 |
| 2.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的急性感染生物学特性 |
| 2.3.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上的急性感染的临床表现特征 |
| 2.3.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上的急性感染的组织病理分析 |
| 2.3.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上感染部位的炎性因子水平变化 |
| 2.3.4 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上急性感染的组织载量分析 |
| 2.4 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染能力分析 |
| 2.4.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的组织载量分析 |
| 2.4.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的组织病理结果分析 |
| 2.4.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的骶背根神经节重激活能力分析 |
| 2.5 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的特异性免疫反应 |
| 2.5.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2感染小鼠后脾脏淋巴细胞中CD3+T淋巴细胞数量的变化 |
| 2.5.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2感染小鼠后脾脏淋巴细胞中IFN-γ特异性T淋巴细胞数量的变化 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 单纯疱疹病毒2型疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 论文中突变毒株的突变基因序列 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 研究生个人简历 |
（8）SOX3基因突变在肺腺癌EGFR-TKI耐药中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、过表达SOX3、SOX3_Mut细胞系的建立及其鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料与对象 |
| 1.1.1.1 过表达SOX3、SOX3_Mut质粒的合成及其引物的设计 |
| 1.1.1.2 质粒的转化、提取和纯化 |
| 1.1.1.3 细胞的复苏、培养与冻存 |
| 1.1.1.4 细胞转染 |
| 1.1.1.5 肺腺癌细胞总RNA的提取 |
| 1.1.1.6 肺腺癌细胞cDNA的合成 |
| 1.1.1.7 过表达SOX3、SOX3_Mut后的琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.1.1.8 实时荧光定量 PCR 验证 SOX3 和 SOX3_Mut 的表达 |
| 1.1.1.9 肺腺癌细胞蛋白的提取及定量 |
| 1.1.1.10 蛋白免疫印迹实验(Western Blot)验证 SOX3 和 SOX3_Mute 的表达 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.2.1 质粒合成与引物设计 |
| 1.1.2.2 质粒的转化、提取和纯化 |
| 1.1.2.3 细胞转染 |
| 1.1.2.4 肺腺癌细胞总RNA的提取 |
| 1.1.2.5 肺腺癌细胞cDNA的合成 |
| 1.1.2.6 过表达SOX3、SOX3_Mut后的琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.1.2.7 实时荧光定量 PCR 验证 SOX3 和 SOX3_Mut 的表达 |
| 1.1.2.8 肺腺癌细胞蛋白的提取及定量 |
| 1.1.2.9 蛋白免疫印迹实验(Western Blot) 验证 SOX3 和 SOX3_Mut 的表达 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 建立稳定转染SOX3、SOX3_Mut的细胞系 |
| 1.2.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.2.3 实时荧光定量 PCR 验证 SOX3 和 SOX3_Mut 的表达 |
| 1.2.4 蛋白免疫印迹实验(Western Blot) 验证 SOX3 和 SOX3_Mut 的表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、过表达SOX3_Mut增加肺癌细胞对EGFR-TKI的耐药性 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象与材料 |
| 2.1.2 CCK-8实验 |
| 2.1.3 细胞平板克隆形成实验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 过表达SOX3_Mut的肺腺癌细胞对EGFR-TKI的敏感性降低 |
| 2.2.2 过表达 SOX3_Mut 的肺腺癌细胞在 TKI 药物存在时克隆形成能力升高 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、SOX3_Mut抑制了EGFR-TKI诱导的肺癌细胞凋亡 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象与材料 |
| 3.1.1.1 凋亡蛋白免疫印迹实验的对象与材料 |
| 3.1.1.2 早期凋亡荧光观察的对象与材料 |
| 3.1.1.3 流式细胞术检测凋亡的对象与材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 凋亡蛋白免疫印迹实验 |
| 3.1.2.2 早期凋亡荧光观察 |
| 3.1.2.3 流式细胞术检测凋亡 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 EGFR-TKI 处理后,与过表达 SOX3 相比,过表达 SOX3_Mut 的肺癌细胞中凋亡蛋白的降解减少 |
| 3.2.2 EGFR-TKI 处理后,与过表达 SOX3 相比,过表达 SOX3_Mut 的肺癌细胞内早期凋亡蛋白的荧光水平降低 |
| 3.2.3 Annexin V/PI 凋亡分析证实在过表达 SOX3_Mut 的肺癌细胞中,EGFR-TKI诱导细胞凋亡的能力下降 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、体内实验证实SOX3_Mut增加肺腺癌细胞对EGFR-TKI的耐药 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验对象与材料 |
| 4.1.1.1 裸鼠皮下移植瘤模型构建的对象与材料 |
| 4.1.1.2 肿瘤组织实时荧光定量 PCR(RT-qPCR or qPCR) |
| 4.1.1.3 肿瘤组织Western blot鉴定 |
| 4.1.1.4 肿瘤组织HE染色的对象与材料 |
| 4.1.1.5 肿瘤组织免疫组化 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 裸鼠皮下移植瘤模型构建的实验方法 |
| 4.1.2.2 肿瘤组织实时荧光定量 PCR(RT-qPCR or qPCR) |
| 4.1.2.3 肿瘤组织Western blot鉴定 |
| 4.1.2.4 肿瘤组织HE染色 |
| 4.1.2.5 肿瘤组织免疫组化 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 过表达 SOX3_Mut 的 HCC827 细胞的移植瘤裸鼠对 Erlotinib 的耐药 |
| 4.2.2.通过 q PCR 实验验证肿瘤组织中 SOX3、SOX3_Mut 在转录水平的表达 |
| 4.2.3 通过 Western Blot 实验验证肿瘤组织中 SOX3、SOX3_Mut 在蛋白水平的表达 |
| 4.2.4 裸鼠肿瘤组织 HE 染色与细胞增殖、凋亡标志物的免疫组化分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、SOX3_Mut增强肺癌细胞对EGFR-TKI耐药的分子机制研究 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 实验对象与材料 |
| 5.1.1.1 肺腺癌细胞蛋白的提取及定量 |
| 5.1.1.2 蛋白免疫印迹实验(Western Blot) |
| 5.1.1.3 肺腺癌细胞总RNA的提取 |
| 5.1.1.4 mRNA文库的建立 |
| 5.1.1.5 上机测序 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.2.1 肺腺癌细胞蛋白的提取及定量 |
| 5.1.2.2 蛋白免疫印迹实验(Western Blot) |
| 5.1.2.3 肺腺癌细胞总RNA的提取 |
| 5.1.2.4 mRNA文库的建立 |
| 5.1.2.5 上机测序 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 SOX3_Mut并不影响EGFR-TKI抑制EGFR激活的能力 |
| 5.2.2 SOX3_Mut影响了EGFR-TKI抑制Erk激活的能力 |
| 5.2.3 表达谱分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 SOX基因家族在肿瘤中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）高粱乌米多糖提取纯化及对消化系统癌细胞抑制作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 真菌多糖的研究概况 |
| 1.1.1 真菌多糖的提取及纯化技术 |
| 1.1.2真菌多糖的结构分析及鉴定 |
| 1.1.3 真菌多糖的生物活性研究 |
| 1.2 食用真菌高粱乌米的研究概况 |
| 1.2.1 高粱乌米的来源 |
| 1.2.2 高粱乌米的化学成分及生理功能 |
| 1.2.3 食用真菌高粱乌米加工与利用 |
| 1.2.4 高粱乌米多糖的研究 |
| 1.3 多糖抗氧化与细胞凋亡 |
| 1.3.1 真菌多糖抗氧化 |
| 1.3.2 细胞凋亡的概述及主要途径 |
| 1.4 蛋白质组学的研究 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.5.1 研究的目的 |
| 1.5.2 研究的意义 |
| 2 高粱乌米多糖的提取 |
| 2.1 突验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 高效液相色谱仪及色谱柱 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 粗多糖的热水浸提 |
| 2.2.2 高粱乌米多糖有关性质测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 高粱乌米粗多糖的提取 |
| 2.3.2 Phenol-硫酸法测定糖含量 |
| 2.3.3 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 |
| 2.3.4 间羟基联苯法测定多糖的糖醛酸含量 |
| 2.3.5 碘显色法测定多糖淀粉含量 |
| 2.3.6 多糖灰分测定 |
| 2.3.7 多糖的单糖组成测定 |
| 2.3.8 多糖的分子量测定和均一性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 WM多糖的系统分级纯化及理化性质分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 高效液相色谱仪及色谱柱 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 WM多糖的离子交换分级 |
| 3.2.2 WM-N和WM-A多糖超滤膜与透析分级 |
| 3.2.3 WM-NP多糖的醇沉纯化 |
| 3.2.4 高粱乌米多糖有关理化性质测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 WM多糖的离子交换分级 |
| 3.3.2 WM-N和WM-A多糖超滤膜与透析分级 |
| 3.3.3 WM-NP多糖的醇沉纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 多糖WM-NP-60的结构特征研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 FT-IR分析 |
| 4.2.2 高碘酸氧化和Smith降解 |
| 4.2.3 1D/2D NMR分析 |
| 4.2.4 甲基化分析 |
| 4.2.5 旋光度测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 FT-IR分析 |
| 4.3.2 高碘酸氧化和Smith降解 |
| 4.3.3 1D/2D NMR分析 |
| 4.3.4 甲基化分析 |
| 4.3.5 旋光度结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 多糖WM-NP-60的抗氧化活性研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 有机自由基(DPPH)的清除能力测定 |
| 5.2.2 羟基自由基(·OH)清除能力的测定 |
| 5.2.3 超氧负离子(O~(2-)·)清除能力的测定 |
| 5.2.4 过氧化氢(H_2O_2)清除能力的测定 |
| 5.2.5 二价铁离子Fe~(2+)螯合能力的测定 |
| 5.2.6 还原力的测定 |
| 5.2.7 邻苯三酚自氧化抑制能力的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 DPPH的清除能力分析 |
| 5.3.2 羟基自由基的清除能力分析 |
| 5.3.3 超氧负离子的清除能力分析 |
| 5.3.4 过氧化氢(H_2O_2)的清除能力分析 |
| 5.3.5 二价铁离子的整合能力分析 |
| 5.3.6 还原力分析 |
| 5.3.7 1,2,3-苯酚自氧化的抑制能力分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 多糖WM-NP-60对癌细胞增殖与凋亡的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 细胞增殖抑制试验 |
| 6.2.3 细胞周期检测 |
| 6.2.4 细胞凋亡试验 |
| 6.2.5 细胞原位荧光检测 |
| 6.2.6 细胞凋亡形态检测电镜(TEM)试验 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 WM-NP-60对HepG2、SGC7901和HCT116细胞增殖抑制作用 |
| 6.3.2 WM-NP-60对HepG2、SGC7901和HCT116细胞周期的影响 |
| 6.3.3 WM-NP-60对HepG2、SGC7901和HCT116细胞凋亡的影响 |
| 6.3.4 细胞原位荧光检测观察HepG2、SGC7901和HCT116细胞凋亡特征 |
| 6.3.5 透射电镜观察HepG2、SGC7901和HCT116细胞凋亡形态 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 多糖WM-NP-60调控HCT116细胞的蛋白质组学研究 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 实验试剂 |
| 7.1.3 实验仪器 |
| 7.1.4 主要软件 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 蛋白质定量与定性分析 |
| 7.2.2 蛋白酶解 |
| 7.2.3 TMT标记 |
| 7.2.4 2D-LC-MSMS分析 |
| 7.2.5 蛋白的数据库搜索与筛选 |
| 7.2.6 生物信息学分析 |
| 7.2.7 qRT-PCR检测相关mRNA表达 |
| 7.2.8 Western blot检测相关蛋白表达 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 蛋白浓度及条带分析 |
| 7.3.2 差异表达蛋白的鉴定 |
| 7.3.3 生物信息学分析 |
| 7.3.4 mRNA与蛋白水平表达验证实验 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学 博士学位论文修改情况确认表 |
（10）S100A12及HAX-1在促进胶质瘤恶性进展中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 S100A12对细胞胶质瘤生长影响的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 患者与标本 |
| 2.2.2 细胞系 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 免疫组织化学 |
| 2.2.7 细胞mRNA的提取 |
| 2.2.8 逆转录PCR |
| 2.2.9 S100A12基因沉默 |
| 2.2.10 细胞增殖分析 |
| 2.2.11 组织和细胞总蛋白的提取 |
| 2.2.12 克隆形成实验检测shS100A12细胞增殖与克隆形成能力 |
| 2.2.13 细胞侵袭和迁移实验 |
| 2.2.14 流式细胞检测S100A12细胞周期 |
| 2.2.15 Western blot蛋白免疫印迹分析S100A12 的表达 |
| 2.2.16 数据统计分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 S100A12在胶质瘤组织中表达升高,且与不良预后相关 |
| 2.3.2 S100A12在体外增强胶质瘤的增殖 |
| 2.3.3 S100A12在体外调节胶质瘤的凋亡 |
| 2.3.4 S100A12增加了胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 HAX-1对细胞胶质瘤生长影响的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 患者与标本 |
| 3.2.2 细胞系 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.2.5 细胞培养 |
| 3.2.6 平板克隆形成实验检测shHAX-1的细胞增值能力和克隆形成能力 |
| 3.2.7 免疫组织化评估HAX-1蛋白表达 |
| 3.2.8 胶质瘤细胞中HAX-1 蛋白m RNA的提取 |
| 3.2.9 HAX-1 逆转录PCR |
| 3.2.10 HAX-1基因沉默 |
| 3.2.11 胶质瘤细胞HAX-1总蛋白的提取 |
| 3.2.12 Western blot评估不同等级胶质瘤中HAX-1 的表达 |
| 3.2.13 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HAX-1在星形胶质瘤组织中表达 |
| 3.3.2 HAX-1在胶质瘤组织和正常细胞中表达 |
| 3.3.3 HAX-1的表达与胶质瘤临床病理学相关性的研究 |
| 3.3.4 沉默HAX-1对U87和U251细胞克隆能力形成能力的影响 |
| 3.3.5 沉默HAX-1对U87和U251细胞侵袭能力的影响 |
| 3.3.6 HAX-1的表达与胶质瘤预后相关性的研究 |
| 3.3.7 胶质瘤中S100A12与HAX-1表达的相关性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 总结 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、瘤细胞转移能力分析的体外研究（论文参考文献）
- [1]SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究[D]. 孙志阳. 陕西理工大学, 2021
- [2]多灶型转移肿瘤分泌的外泌体通过转运miR-199a-1-5p抑制CDKN1B来促进寡灶型转移到多灶型转移的进展[D]. 赵棋汀. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]生物3D打印胶质瘤微环境：一个用于研究细胞互作和肿瘤治疗的多元胶质瘤模型[D]. 金治中. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]Ⅰ型胶原蛋白/纤维连接蛋白通过整合素αvβ3激活PI3K/AKT/SOX2信号通路促进胶质瘤的生长与增殖[D]. 夏开国. 西南医科大学, 2021(01)
- [5]MicroRNA-1305抑制肝脏肿瘤干细胞的机制研究[D]. 魏小勇. 南昌大学, 2020(01)
- [6]靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒构建及感染性质分析[D]. 李哲. 吉林大学, 2020(08)
- [7]HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析[D]. 柳蕾. 北京协和医学院, 2020(05)
- [8]SOX3基因突变在肺腺癌EGFR-TKI耐药中的作用和机制研究[D]. 贾瑞. 天津医科大学, 2020(06)
- [9]高粱乌米多糖提取纯化及对消化系统癌细胞抑制作用研究[D]. 阚连宝. 东北林业大学, 2020(01)
- [10]S100A12及HAX-1在促进胶质瘤恶性进展中的作用及其机制研究[D]. 鲁春鹤. 中国医科大学, 2020(01)