一、Construction of the glucose isomerase deficient strain of Streptomyces M1033 by homologous recombination（论文文献综述）
吕斌娜[1]（2021）在《MAPK蛋白激酶基因和磷酸酶基因参与粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生作用的研究》文中提出粉红螺旋聚孢霉可寄生多种植物病原真菌,具有巨大的生防潜力,目前已完成全基因测序。课题组前期通过对高效菌株67-1寄生核盘菌转录组测序分析,获得显着上调表达的MAPK蛋白激酶基因Crmapk和细胞壁合成磷酸酶基因Cr Ssd1。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是真菌细胞信号转导过程中一类重要的蛋白激酶,可通过磷酸化级联反应调控真菌生长、产孢、致病等过程,我们前期研究也发现Crmapk在粉红螺旋聚孢霉寄生核盘菌过程中发挥了重要作用。为揭示Crmapk参与菌寄生作用的机制,本研究构建了粉红螺旋聚孢霉酵母双杂交文库,利用酵母双杂和Bi FC技术筛选、鉴定和验证了Crmapk互作蛋白,并对其中的6-磷酸葡萄糖差向异构酶CIP2和蛋白水解酶CIP11进行了功能分析。而蛋白磷酸酶主要是催化已经磷酸化的蛋白质分子去磷酸化的过程,本文通过基因敲除与回补和生物学测定,研究了细胞壁合成磷酸酶基因Cr Ssd1在粉红螺旋聚孢霉寄生菌核过程中的作用。具体结果如下:（1）明确了促分裂原活化蛋白激酶Crmapk在粉红螺旋聚孢霉67-1菌株中的亚细胞定位。通过原生质体转化方法将构建的Crmapk-GFP融合表达载体转入野生型菌株中,利用G418抗性筛选及PCR鉴定,获得Crmapk-GFP融合表达菌株。激光共聚焦显微镜观察发现,Crmapk蛋白定位于粉红螺旋聚孢霉细胞质中。（2）构建了粉红螺旋聚孢霉67-1菌株酵母双杂交文库。文库的总克隆数为1.6×107 CFU/m L,重组率为96%,平均插入片段长度>1 kb,质量较高,可用于67-1菌株互作蛋白和菌寄生机制的研究。（3）筛选和鉴定了Crmapk互作蛋白。构建了Crmapk-BD诱饵载体,检测证明该载体无自激活能力,筛库并一对一验证得到60个候选互作基因。通过生信分析结合寄生转录组数据库分析,预测到42个差异表达基因可能是Fus3/Kss1-MAPK通路的靶标基因。进而利用酵母双杂和双分子荧光互补（Bi FC）技术证明6-磷酸葡萄糖差向异构酶CIP2、信号复合体蛋白CIP3、蛋白水解酶CIP11与Crmapk存在互作。（4）明确了Crmapk互作蛋白6-磷酸葡萄糖差向异构酶CIP2和蛋白水解酶CIP11在粉红螺旋聚孢霉67-1寄生菌核过程中的功能。荧光定量PCR检测发现,CIP2和CIP11基因在寄生核盘菌的不同阶段均上调表达。分别敲除2个基因后,突变株ΔCIP2和ΔCIP11菌落均较为平坦,菌丝稀疏,产孢量显着下降,但对不同胁迫压力的敏感性无显着变化。基因缺失后生防菌株的拮抗能力和寄生能力下降,对大豆菌核病的防效分别为36.3%和31.6%,显着低于野生型水平（71.5%）,基因回补后生防作用恢复。（5）明确了细胞壁合成磷酸酶基因Cr Ssd1在粉红螺旋聚孢霉67-1寄生过程中的功能。本研究利用基因敲除和回补技术发现,敲除突变株ΔCrSsd1的菌丝稀薄,生长减缓,产孢量显着下降,并且几乎丧失产孢能力。突变株对灰霉菌的拮抗作用降低,寄生能力减弱,由3级降为1级,并且对大豆菌核病的防效降低60%。在多种压力胁迫的实验中,突变株对山梨醇和刚果红的敏感性上升。而回补菌株的各项能力均恢复到野生型水平。研究结果为揭示蛋白质磷酸化参与粉红螺旋聚孢霉菌寄生作用的分子机制奠定了理论基础,对进一步挖掘利用高效生防功能基因、提高病害防治水平具有重要的指导意义。
龙梦飞[2]（2021）在《系统代谢改造大肠杆菌高效合成反式-4-羟基-L-脯氨酸》文中研究表明氨基酸发酵是我国发酵工业的支柱产业。羟化氨基酸作为其中一类高附加值小品种氨基酸,其在食品、医药、材料化工等方面均有广泛的应用。羟脯氨酸是在其前体脯氨酸（L-proline,L-Pro）的五元环羟化后的衍生物,其中的反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline,trans-4-Hyp）是一种重要的手性氨基酸。trans-4-Hyp可作为碳青霉烯类抗生素等重要物质的前体,其在医药保健、食品等领域具有重要价值。trans-4-Hyp可利用微生物法生产,该方法具有极大的经济效应和环境效益。根据流加底物的不同,微生物法生产trans-4-Hyp可分为以葡萄糖等廉价碳源从头发酵生产,以及流加前体L-Pro生产两种方式。目前,微生物法生产trans-4-Hyp的研究主要为外源添加L-Pro发酵,这种生产方式需要外源添加大量的L-Pro作为底物,且发酵液中L-Pro与trans-4-Hyp的分离也大大增加了其工业化生产成本。以葡萄糖等廉价碳源的从头发酵生产trans-4-Hyp可实现原料低成本、产品高产出,其将逐渐成为适应工业化生产trans-4-Hyp的主流趋势。然而,高产羟化氨基酸生产菌株的改造面临三个问题:前体氨基酸底盘细胞的构建较复杂;共底物α-KG供应不足;以及氨基酸羟化酶的催化效率较低。本研究试图提出一种通用的微生物高效合成羟化氨基酸策略,以改造大肠杆菌生产trans-4-Hyp为研究目标,利用合成生物学、代谢工程以及蛋白质工程改造技术系统改造大肠杆菌生产trans-4-Hyp,主要研究结果如下:（1）构建了基于稀有密码子选择的L-Pro筛选系统。分别在kanR和apmR中替换不同数量的对应的L-Pro稀有密码子,并在大肠杆菌中构建诱变质粒MP6辅助进化的、基于稀有密码子选择的L-Pro筛选系统。筛选获得的突变菌株E.coli PM-14在摇瓶水平下的L-Pro含量达到0.816 g/L,且经5 L发酵罐补料分批发酵后L-Pro产量为18.2 g/L,生产强度为0.455 g/L/h。进一步在S.marcescens中验证该筛选系统,通过ARTP制备S.marcescens JNB5-1文库,并通过基于稀有密码子选择的L-Pro筛选,获得的突变株LK-18的灵菌红素的产量比出发菌株高3.3倍。对野生型菌株S.marcescens JNB5-1和突变菌株S.marcescens JNB5-1 LK-18中的pig I分别敲除后,后者的L-Pro产量是前者的2.6倍。（2）人工创制trans-4-Hyp新型合成路线,即首次尝试利用精氨酸-4羟化酶、精氨酸酶和鸟氨酸环化脱氨酶的级联反应创建trans-4-Hyp的全细胞级联催化策略。此外,首次将稀有密码子筛选策略用于酶定向进化。采用结合稀有密码子选择和pEvolvR的筛选策略对鸟氨酸环化脱氨酶进行改造,单突变体K205G、M86K和T162A酶活分别提高了70.3%,64.8%和55.7%。组合突变后,三突变体OCDM86K/T162A/K205G的活性提高了2.41倍,其kcat值是OCDWT的2.85倍。重组菌GAO-4经全细胞转化生成的trans-4-Hyp产物浓度达105.5 mg/L,是重组菌GAO-1的2.35倍。进一步基于Red Libs的智能RBS组合对多酶催化trans-4-Hyp途径进行优化,重组菌株EH#1的trans-4-Hyp产量达189.3mg/L,产量较优化前提高79.4%。在EH#1的基础上,引入氧化还原及辅酶自给循环,即共表达gox和cat以消除H2O2副产物,并共表达nox用于NAD+辅酶循环。经全细胞转化体系优化后,重组菌株GAO-5 trans-4-Hyp产量达269.2 mg/L。（3）利用比较转录组分析突变株PM-14的L-Pro相关合成途径,包括糖酵解、TCA循环、L-Pro合成途径和L-Pro转运系统的转录水平变化。与野生型菌株相比,PM-14中编码糖酵解酶的基因具有更高的转录水平。在PM-14的TCA途径中,编码异柠檬酸脱氢酶和乌头酸酶的icd和acn显示出明显增加的转录水平,这增强了α-KG的代谢通量。此外,限速酶基因proB在PM-14突变菌株中也具有更高的转录水平。进一步利用代谢工程对PM-14进行改造,即敲除putA、putP、proP和aceA基因,并对proB进行定点改造以消除反馈抑制。M10菌株中的L-Pro产量达37.5 g/L,为出发菌PM-14的L-Pro产量的2.06倍,生产强度为0.938 g/L/h。进一步将p DXW-10-Datp4h转化至M10菌株中,获得的重组菌HM10的trans-4-Hyp产量达15.7 g/L,但同时也导致了发酵液中L-Pro积累达18.1 g/L。（4）设计基于群体感应基因线路调控策略动态调控α-酮戊二酸脱氢酶活性。sucA基因的天然启动子被PesaS启动子取代,在不存在高丝氨酸内酯（Acyl-homoserine lactones,AHL）时可与转录调节子EsaRI70V结合后触发其转录。胞内逐渐积累的AHL破坏Pesa S启动子与EsaRI70V的结合并抑制ODHC活性。四个不同强度的Pbs启动子可驱动不同水平的esa I表达,从而可控制AHL的动态积累。因此,在不同时间下调PesaS启动子可获得较佳的α-KG代谢流。经验证,该群体感应基因线路调控系统可动态控制GFP表达。进一步将群体感应基因线路调控系统用于调节ODHC活性,HM14经补料分批发酵后的trans-4-Hyp产量达43.2 g/L,为对照菌的2.75倍。此外,HM14中残留的L-Pro较对照菌下降了76.6%,但仍积累了4.3 g/L的L-Pro。（5）以Dactylosporangium SP.RH1的脯氨酸羟化酶序列为参考,利用NCBI中的BLASTP选取几条假定的trans-P4H,经酶活测定筛选出具有最高羟化活力的UB2TP4H。根据结构比对分析,对UB2TP4H中的170和172位点共设计了四个单突变点。其中,单突变体UB2TP4HL170A和UB2TP4HP172N的酶活分别提高了16.1%和27.8%。组合突变后,双突变体UB2TP4HL170A/P172N的比活达115.5 U/mg,较UB2TP4HWT提高了38.2%。进一步的结构分析表明,L170A和P172N突变后与底物形成额外的氢键。利用Gromacs软件分别对UB2TP4HWT和双突变体UB2TP4HL170A/P172N的蛋白质复合物进行分子动力学模拟,双突变体UB2TP4HL170A/P172N的底物结合口袋较UB2TP4HWT大,且底物口袋的构象波动较UB2TP4HWT稳定,其loop170-175的RMSF也更低。Rosetta工具Cartesian＿ddg测定了酶与底物L-Pro之间的结合自由能ΔΔG,双突变体UB2TP4HL170A/P172N的ΔΔG为-3.27 KJ/mol。经5 L发酵罐发酵,双突变体重组菌HMH的trans-4-Hyp最终产量达54.8g/L,较HM14高26.9%,糖酸转化为0.236 g/g。此外,L-Pro残留量最终降至0.2 g/L。
张晶[3]（2021）在《天蓝色链霉菌中双组分信号转导系统SCO4155/SCO4156的生物学功能研究》文中研究表明链霉菌（Streptomyces）是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性细菌。它在复杂的生长发育过程中,能产生抗生素、活性酶、免疫抑制剂等次级代谢产物。这些产物种类多、活性高,在工农业、医药业及生物防治等领域被广泛应用,具有重要的应用和研究价值。链霉菌的模式菌株为天蓝色链霉菌,已于2002年完成全基因组测序,其基因组中不仅含有多个次级代谢产物的生物合成基因簇,同时还存在多个调控基因,可编码包含67对典型的双组分信号转导系统（Two-component Signal transduction system,TCSs）在内的多种调控因子。TCSs 通常由组氨酸激酶和应答调控蛋白组成,是一种跨膜信号系统。目前只有部分TCSs的功能得到阐释,在链霉菌生长发育、蛋白分泌、次级代谢等过程中发挥重要的调控作用,但是大部分TCSs的功能仍然是未知的。SCO4155/SCO4156是天蓝色链霉菌中一对典型的TCS,其中SCO4155是组氨酸激酶,SCO4156是OmpR家族的应答调控蛋白。此TCS与结核分枝杆菌中MprAB TCS具有较高的序列一致性。本研究对天蓝色链霉菌M145中SCO4155/SCO4156TCS的生物学功能进行了初步研究,探究该系统在链霉菌中的生物学作用。首先构建了用于sco4155/56突变的质粒,通过同源重组进行基因缺失,得到sco4155/56的缺失突变菌株△4155/56。通过比较M145与△4155/56的表型发现△4155/56气生菌丝的形成和放线紫红素的合成均提前。回补菌株C-△4155/56的表型接近野生型菌株,说明sco4155/56影响菌株生长发育和放线紫红素的生物合成。Real-time PCR分析结果显示突变菌株中β-酮酰基合酶基因sco5087（actI-1）的表达水平显着上调。利用生物信息学分析预测了调控蛋白SCO4156的识别位点。为了验证SCO4156对预测位点的结合,异源表达并纯化His-SCO4156蛋白。体外结合试验表明SCO4156直接结合sco4157、sco6287、sco7075、sco0574等基因的启动子序列的预测位点,说明这些基因是SCO4156的靶基因。sco4157编码一种HtrA-like丝氨酸蛋白酶。天蓝色链霉菌中存在四种HtrA-like蛋白酶。我们利用Real-time PCR定量分析了SCO4156的部分靶基因以及HtrA-like蛋白酶基因的表达情况,确定了突变菌株中各基因表达水平存在差异,其中sco4157表达水平显着上调。另外本研究探索了四种HtrA-like蛋白酶基因及四种调控蛋白基因在SDS条件下的表达情况。在SDS条件下,突变菌株中sco4157基因的表达水平显着提高,同时各靶基因在压力条件下也存在一定的表达差异,说明SDS可作为一种压力信号引起菌体基因表达的变化。由于SCO4156与SCO7075具有较高的序列一致性,且sco 7075为SCO4156的靶基因,为了研究sco 7075的功能,本研究构建了sco7075基因缺失菌株△7075以及回补菌株C-Δ7075。与M145相比,Δ7075表型变化不明显。我们构建了表达Flag标签融合蛋白的菌株F-Δ4155/56与F-△7075,为下一步搜索SCO4156和SCO7075的体内结合位点做准备。综上所述,SCO4155/SCO4156双组分系统对于链霉菌生长发育和放线紫红素的合成具有一定程度的影响。本研究预测并验证了SCO4156的部分靶基因,确定了SCO4156直接调控scO4157和sc0 7075的表达,说明SCO4155/SCO4156是一个重要的调控因子。
史海霞[4]（2021）在《四株放线菌中次级代谢产物的基因组挖掘》文中指出微生物天然产物是小分子药物的重要来源。尽管基因组研究表明微生物的次级代谢潜力巨大,但是大量未知基因簇在常规培养条件下处于“沉默”或低表达状态。因此,如何高效激活这些“沉默”基因簇是天然产物研究的热点方向之一。前期,本课题组分离获得了一系列含有AHBA（3-氨基-5羟基苯甲酸）合酶基因的放线菌资源,本论文围绕其中四株放线菌开展了基因组挖掘工作。前期,课题组已从链霉菌LZ35中鉴定了 16种类型共80多个化合物,但仍有20余个基因簇的产物未知。其中,基因簇sm42预测合成含有肉桂酰基的非核糖体肽类化合物（cinnamoyl-containing nonribosomal peptides,CCNPs）。我们通过对LZ35主产物敲除突变株SR111的培养基筛选、扩大发酵和产物追踪分离获得了 CCNP类化合物coprisamide A（1）和1个新开环衍生物（2）,明确了coprisamides的生物合成基因簇并提出了可能的合成途径。此外,对SR111进行产孢条件摸索时意外激活了基因簇sm2,分离鉴定了 2个新germicidin糖苷类衍生物 germicidin A-4-O-β-D-glucuronide（3）和 germicidin D-4-O-β-D-glucuronide（4）。上述4个化合物均无明显的抗菌和细胞毒活性。基因组序列分析表明链霉菌XZYN4含有一个编码非安莎新骨架的基因簇,我们采用体外重构与异源表达策略进行了该基因簇的产物挖掘工作。通过启动子筛选、Gibson拼接、BioBrick组装和位点特异性重组等策略的联合使用实现了该基因簇的体外重构,并在白色链霉菌J1074、变铅青链霉菌SBT5、链霉菌SR111和链霉菌S001中进行了异源表达。但是,与野生型相比,异源表达突变株均未检测到明显的差异产物。海洋疣孢菌NS0172预测含有一个合成新5酮安莎霉素的基因簇vas,前期从单调控基因过表达突变株中获得了多个生物合成中间体。为了获得完整的5酮安莎,我们构建了双调控基因过表达突变株,其代谢谱与野生型相比出现了多个差异峰,但产量较低。随后,我们通过饲喂AHBA前体（250 mg/L）将差异产物的产量提高了近8倍。但是,由于扩大发酵时产量不稳定,尚未获得足量差异产物进行结构鉴定。链霉菌S001中含有一个预测可能编码新Ⅱ型PKS的基因簇sm3,通过比较PKS敲除突变株与野生型的代谢谱,我们发现保留时间在12.5 min左右的两个峰消失（编号为A7和A8）,提示这两个化合物可能由sm3负责合成。通过扩大发酵、追踪分离和结构解析,我们确定了化合物A7和A8为PKS产物自发环化而成的SEK4和SEK4b。随后,我们尝试通过组成型表达调控基因以期激活sm3的环化酶及后修饰酶基因。与野生型相比,单调控基因过表达突变株有多个差异峰产生,有待进一步分离鉴定。此外,生物活性测定结果表明化合物SEK4对人宫颈癌细胞HeLa具有微弱细胞毒活性（IC50～14.4±0.25 μM）。综上所述,本论文通过对四株AHBA合酶阳性菌的基因组发掘,明确了CCNPs类化合物coprisamide的生物合成基因簇,获得了新germicidin糖苷衍生物,重构并异源表达了 XZYN4中的非安沙基因簇,激活了 NS0172中的新5酮安莎基因簇vas和S001中的Ⅱ型PKS基因簇sm3。上述研究为微生物天然产物的基因组挖掘提供了有益借鉴,为更有效激活策略的开发奠定了基础。
王逸飞[5]（2021）在《海洋微生物药物didemnin B生物合成基因簇的克隆研究》文中研究指明海洋微生物来源的天然产物具有丰富的结构与活性多样性,已成为新型药物研发的新热点。Didemnins为一类海洋微生物来源的天然产物,最早是从地中海海鞘（Aplidiumalbicans）发现的,具有复杂的环状缩肽结构,目前已鉴定的didemnins包括didemnin B,dehydrodidemnin B（aplidine）,nordidemnin B以及didemnin X/Y。它们由α-变形杆菌门的Tistrella mobilis（运动替斯崔纳菌）与Tistrella bauzanensis等细菌产生,具有抗肿瘤、抗病毒以及免疫抑制等活性。目前,aplidine已进入临床III期,主要适应症为多发性骨髓瘤、淋巴瘤等。Didemnins为非核糖体肽（NPRS）/聚酮合酶（PKS）杂合型化合物,用于合成didemnin B的生物合成基因簇已被克隆,大小约73kb左右。但由于这类细菌遗传操作困难,didemnins产量非常低,大大制约了这些药物的研发进度。创建微生物异源合成体系,实现didemnins高效合成,可以有效解决didemnins的药源问题。为此,本研究拟从运动替斯崔纳菌出发,运用RNA介导的CRISPR/Cas9核酸内切酶结合酵母转化依赖重组技术（TAR）（Cas9-TAR）进行didemnin B生物合成基因簇的克隆,为后续创建异源合成体系奠定基础。首先,我们对购买的2株运动替斯崔纳菌进行了PCR及发酵验证,经过PCR产物测序及发酵产物的LC-MS分析,证实这2株细菌都具有didemnin B合成能力。提取其中一株运动替斯崔纳菌的全基因组,运用Cas9-TAR进行完整didemnin B合成基因簇的一步法克隆,但多次尝试均告失败。为此,本研究改变策略,将基因簇分成2段（did L和did R）进行分别捕获,然后将它们拼接成完整didemnin B基因簇。以pCAP01为出发质粒,构建了分别含有did L上下游同源区域（各约1 kb）的捕获质粒pCAP-did L-HR和含有did R上下游同源区域（各约1 kb）的捕获质粒pCAP-did R-HR。为了后续2个片段的拼接,did L和did R之间设计有80 bp左右的重叠区。同时,设计、筛选可以引导Cas9高效切割基因组上did L和did R上下游DNA的sg RNA,通过sg RNA-Cas9切割基因组,以释放目标基因簇片段。通过原生质体转化,将获得的捕获质粒和经酶切的基因组同时导入酿酒酵母,经营养缺陷型筛选及PCR验证,鉴定获得已捕获did L和did R的阳性酵母克隆。提取质粒,转化大肠杆菌,经酶切、PCR及测序验证,获得含有did L和did R的重组质粒（pCAP-did L和pCAP-did R）。由于pCAP01可容纳的DNA比较有限,一般低于60 kb,因此,为了进行完整基因簇的拼接,本文在细菌人工染色体质粒pCC1BAC基础上,加入了酵母筛选和复制元件（ARSH4/CEN6-TRP1）以及用于在放线菌中进行基因组整合所需的抗性和位点特异性性重组元件（ΦC31-acc（3）IV）,构建了用于捕获大型基因簇的克隆载体pCL01。在此基础上,构建用于拼接did L和did R的重组质粒pCL01-HIS-HR（分别含有did L和did R的同源区,各1.5 kb）,其中HIS为组氨酸营养缺陷型筛选标记,通过该筛选标记,可以大幅降低载体自连背景。另外,为了降低因pCL01-HIS-HR载体未能有效酶切产生的背景,我们将载体拆分成3段,分别通过PCR扩增获得相应的线性片段,每个片段相邻区域以及与did L和did R两端含有约500 bp的重叠区。同时,将pCAP-did L和pCAP-did R进行Nhe I/Spe I双酶切,回收获得did L和did R基因簇片段。随后,将之前准备好的pCL01-HIS-HR线性片段（共3段）与did A和did B基因簇片段共同转化酿酒酵母。同样,通过营养缺陷型筛选及PCR验证,成功筛选到含有完整didemnin B生物合成基因簇的酵母克隆,转化大肠杆菌EPI300进行扩增,经过PCR、酶切及测序验证,获得含有完整基因簇的BAC质粒pCL01-didemin B。
宋超逸[6]（2021）在《开发新型基因编辑技术用于多杀菌素异源表达和结构衍生》文中指出多杀菌素（spinosad）是土壤放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的聚酮化合物,对鳞翅目、缨翅目等害虫具有高效杀虫活性,而对哺乳动物、鱼类、鸟类和非靶标昆虫毒性极低,由于其兼具生物农药的安全性和化学农药的速效性,已被美国陶氏益农公司（Dow Agrosciences）开发为生物农药,广泛应用于农业、园林和粮储害虫的防控,并于1999年获得了美国总统绿色化学挑战奖。除了多杀菌素的主要活性成分多杀菌素A/D（spinosyn A/D）,刺糖多孢菌发酵产生一系列多杀菌素类化合物,为了获得活性更好的衍生物,人们对3’-氧-脱甲基-多杀菌素A（spinosyn J）和3’-氧-脱甲基-多杀菌素D（spinosyn L）进行化学修饰获得了3’-氧-乙基-5,6-二氢-多杀菌素J（5,6-dihydro-3’-O-ethyl-spinosyn J）和3’-氧-乙基-多杀菌素L（3’-O-ethyl-spinosyn L）,其混合物被称为乙基多杀菌素（spinetoram）。乙基多杀菌素不仅保持了良好的环境兼容性和低哺乳动物毒性,且具有更高的杀虫活性、更广的杀虫谱及良好的水溶性和光稳定性,对多杀菌素难以防控的苹果蠹蛾和烟草夜蛾幼虫具有良好的杀灭效果。丁烯基多杀菌素（butenyl-spinosyn）原产于须糖多孢菌（Saccharopolyspora pogona）,主要活性成分为丁烯基多杀菌素A/D（butenyl-spinosynA/D）,是自然进化产生的多杀菌素高活性衍生物,其C-21上连接的是丁烯基而多杀菌素是乙基,其杀虫活性和杀虫谱与乙基多杀菌素类似,但尚未有应用的报道。我国多杀菌素产业正处于发展初始阶段,急需建立具有自主知识产权的高产技术。多杀菌素作为典型的聚酮化合物,分子结构复杂,化学合成困难,因此,基于微生物发酵的生物合成倍受青睐,然而多杀菌素原产菌株培养条件复杂,生长缓慢,且遗传操作困难,导致针对刺糖多孢菌的基因工程育种进展缓慢。因此,克隆多杀菌素生物合成途径并在易于遗传操纵的细菌中进行异源表达的策略,已成为多杀菌素高效生物制造的重要研究方向。多杀菌素基因簇长达74 kb,由5个聚酮合酶基因和18个后修饰基因组成,对如此复杂的基因簇进行克隆和改造非常有挑战性,需要进行基因编辑技术创新。基因编辑技术的发展为天然产物生物合成途径的克隆、组装与改造提供了便利,促进了天然产物合成生物学的发展,然而现有的基因编辑技术仍存在诸多局限。DNA多片段组装技术已成为重构天然产物基因簇的有效方法,然而,放线菌来源的聚酮基因簇GC含量通常高于65%且含有众多重复序列,现有Gibson和SLIC等体外组装方法以及TAR介导的体内组装方法对高GC片段和启动子片段的兼容性较差,可组装片段数量有限,无法满足大型基因簇表达载体构建及系统改造的需求。本研究利用直接克隆、DNA多片段组装和线环同源重组等基因编辑技术,成功从刺糖多孢菌染色体上抓取了完整的多杀菌素基因簇,构建了大肠杆菌-链霉菌穿梭载体,成功实现了多杀菌素在白色链霉菌J1074（Streptomycesa/bus J1074）、变铅青链霉菌 K4-114（Streptomyces lividans K4-114）和天蓝色链霉菌CH999（Streptomyces coelicolor CH999）中的异源表达。为了提高多杀菌素的产量,我们在多杀菌素基因簇中第一个聚酮合酶基因的上游插入组成型强启动子ErmE*p,使多杀菌素产量提高了2.1倍,这说明提高生物合成基因的转录水平可以促进多杀菌素的异源生物合成。要实现所有23个生物合成基因的高效表达,需要高效的DNA组装技术对基因簇进行重构。经过测试,本研究发现,ExoCET技术利用核酸外切酶介导的体外同源重组和RecET蛋白介导的细胞内同源重组,能够高效组装>13个高GC含量的DNA片段。于是,我们将多杀菌素生物合成涉及的23个基因按照功能分为5组,且每组基因均由色链霉菌J1074来源的组成型强启动子驱动,最终利用ExoCET多片段组装技术构建了由5个操纵子组成的人工基因簇。该多操纵子人工基因簇在白色链霉菌J1074中的摇瓶发酵产量达到了1.12mg/L,比原始基因簇提高了328倍。我们发现,ExoCET技术具有高效DNA组装效率的原因是,该技术中核酸外切酶介导的体外同源重组能将多片段部分串联起来,提高它们共同进入同一大肠杆菌细胞的几率;细胞内表达的RecET重组酶能将未环化的线状DNA片段通过末端同源臂进一步发生同源重组,最终形成环状重组质粒。我们比较了ExoCET多片段组装技术与商业化的Gibson试剂盒对GC含量大于65%的高GC含量DNA片段的组装能力,ExoCET技术对7个以下片段的组装正确率为100%,13片段的组装正确率也可达到60%,而Gibson技术仅能实现5个以下片段的高效组装,当片段数量大于5时,组装效率急剧下降,7片段组装效率已下降到30%,且不能实现7片段以上的高GC DNA组装,以上结果表明我们的ExoCET技术在高GC含量DNA片段的组装方面具有很好的优势。提高天然产物生物合成限速步骤相关基因的表达水平是提高天然产物产量的有效途径,本研究提出的多操纵子基因簇策略针对跨种属表达调控元件差异导致的异源基因表达水平低下,遵循宿主组成型强启动子过表达的思路,借助ExoCET多片段组装的技术优势,使所有生物合成基因均处于组成型强启动子的控制下,实现天然产物所有生物合成基因的高效表达,从而大幅提高目标化合物产量。上述成果于2019年以共第一作者（1/2）发表在 ACS Synthetic Biology。在以上工作基础上,我们计划对多杀菌素人工基因簇进行改造,以实现高活性衍生物丁烯基多杀菌素和3’-氧-脱甲基-多杀菌素的异源表达。然而,依赖于PCR的Agilent QuikChange或Takara MutanBest等商业化定点突变试剂盒受限于PCR有效扩增长度和模板GC含量,无法用于大型高GC生物合成基因簇的定点突变;生物信息学分析表明,多杀菌素基因簇中存在所有49种商业化lls核酸外切酶的识别位点,因此,依赖于lls型限制性内切酶偏移剪切的Golden Gate技术也无法用于该基因簇的无缝编辑;同时,在多杀菌素基因簇中,功能相同的结构域高度同源导致PKS基因中形成了68对长度大于35 bp的同向重复序列,Red 重组系统可以介导同向重复序列间的高效重组,而反向筛选却无法排除这些非特异性重组背景,导致基于Red重组系统和ccdB反向筛选的无缝定点改造技术无法直接操纵PKS基因;因此,为了改造人工多杀菌素基因簇,我们需要创新基因编辑技术。本研究开发了不受聚酮合酶基因中重复序列限制的RedEx基因编辑技术,该技术整合了Red重组系统介导的线环重组、ccdB反向筛选和核酸外切酶（Exonuclease）介导的体外退火,合理利用同源重组的灵活性和体外退火对DNA分子内部重复序列的高度兼容性,可以对大型复杂天然产物基因簇中任意位点进行精确的无缝插入、删除,替换和点突变等修饰。利用RedEx技术,我们将须糖多孢菌丁烯基多杀菌素基因簇busA基因的1b模块无缝定点插入到spnA基因中,重组基因簇在白色链霉菌中成功合成了多杀菌素高活性衍生物——丁烯基多杀菌素;通过无缝删除人工多杀菌素基因簇中编码3’-O-甲基化转移酶的spnK基因,使重组基因簇在白色链霉菌中成功合成了乙基多杀菌素化学合成原料——3’-氧-脱甲基-多杀菌素。聚酮化合物模块化、共线性的生物合成机制使其具有巨大的重编程潜力,生物合成途径的重编程已成为定向改造聚酮化合物结构的有效途径,然而,模块化的生物合成机制也导致了聚酮生物合成基因簇DNA序列的复杂性,模块间功能相同结构域高度同源,聚酮合酶基因重复序列密集,RedEx在改造此类基因簇上的巨大优势为天然产物合成生物学研究提供了新方法。上述成果于2020年以共同第一作者（1/2）发表在Nucleic Acids Research。综上所述,本研究通过开发ExoCET多片段组装技术,设计并构建了人工多杀菌素基因簇,实现了多杀菌素的高效异源表达,大幅提高了多杀菌素在链霉菌中的异源表达产量。通过开发RedEx无缝定点改造技术,定向改造多杀菌素化学结构,实现了高活性衍生物丁烯基多杀菌素和3’-氧-脱甲基-多杀菌素的异源表达。该研究构建的多杀菌素及其衍生物的高效异源表达菌株为诱变育种等传统育种方法提供优良的初始菌株,也为应用合成生物学策略开发多杀菌素衍生物,实现多杀菌素及其高活性衍生物的高效生物制造奠定了基础。ExoCET多片段组装技术和RedEx无缝定点改造技术丰富了合成生物学工具箱,为天然产物生物合成途径的构建和系统改造提供了新方法和新思路。
邱学良[7]（2020）在《产赤藓糖醇亚罗解脂酵母的耐热机制分析及组合策略改造》文中进行了进一步梳理赤藓糖醇是一种四碳多元醇,在食品生产中常用作低热量甜味剂。作为美国食品药品监督管理局认定的GRAS菌,亚罗解脂酵母是生产赤藓糖醇的首选菌株。由于该菌是好氧发酵,产热量较多,但发酵温度一般不超过30°C,因此夏季面临降温难题,导致停产、染菌倒罐等问题,成为推高生产成本的重要因素。另外,亚罗解脂酵母有多个自交系,染色体结构差异很大,代谢改造困难。本课题以提高亚罗解脂酵母热耐受性、提高发酵产量为目标,通过适应性进化获得耐热菌株,并经转录组分析挖掘到耐热的关键途径基因;对野生型菌株进行全基因组测序,并建立分子操作基础,通过耐热关键途径基因的分子改造验证,揭示了菌株耐热机理;基于转录因子Ery D构建响应赤藓糖醇的生物传感器,用作高产菌株的高通量筛选工具;通过建立突变体文库、开展高通量筛选、代谢工程改造组合策略,获得赤藓糖醇耐热高产菌株。主要结果如下:（1）通过适应性进化,筛选获得了可耐受发酵温度35°C的菌株BBE-18,但发酵周期延长。基于转录组学数据,从GO功能、KEGG途径以及中心碳代谢途径、氨基酸合成代谢途径、麦角固醇和海藻糖合成途径等多维度进行分析,阐述了BBE-18的耐热机制。这些途径主要关系到细胞物质和能量代谢,其代谢受阻是热胁迫抑制菌体生长的主要原因。硫胺素途径中,焦磷酸硫胺素是上述相关途径多个关键基因的辅因子,且胞内硫胺素含量直接影响ATP合成酶的蛋白丰度,因此挖掘硫胺素途径耐热相关基因有利于解决物质和能量代谢受阻问题。同时发现,酸性磷酸酶对于提高亚罗解脂酵母的热耐受性也具有一定作用。另外,丝状生长信号通路作为一种觅食反应,有利于菌体抵御胞内物质和能量不足。从上述三个方面入手,本研究共挖掘到12个耐热相关基因:YALI0E32681g、YALI0E35222g、YALI0A12573g、YALI0F26521g、YALI0E00110g、YALI0F25773g、YALI0C14938g、YALI0A08800g、YALI0D01331g、YALI0E23430g、YALI0C15609g、YALI0E33803g。（2）通过全基因组测序获得野生型菌株BBE-17的基因组序列,并通过共线性分析发现其基因组发生严重结构变异,为分子操作提供信息。在羟基脲的辅助下,敲除BBE-17中非同源末端连接关键基因KU70,为后续分子操作奠定基础。以5-氟乳清酸为筛选标记,敲除URA3,构建尿嘧啶营养缺陷型菌株。接下来,将转录组挖掘的12个耐热相关基因,在模式菌PO1f中以质粒p YLXP’为载体游离表达,除YALI0C14938g外,其他单基因表达均可以提高PO1f的热耐受性。将效果较好的YALI0E23430g、YALI0A08800g、YALI0E35222g组合表达,其中YALI0A08800g、YALI0E35222g串联组合表达耐热效果最为突出,在比正常培养温度（30°C）提高3°C的条件下,稳定期菌体OD为对照菌株的2.18倍。进一步对硫胺素途径进行优化,组合表达YALI0E32681g、YALI0A12573g、YALI0F26521g效果最好,33°C下生长稳定期菌体OD为对照菌株的3.70倍。将优选方案在野生菌BBE-17△KU70△URA3中表达,构建菌株BBE-17T,33°C下生长稳定期菌体OD为对照菌株BBE-17的2.5倍。（3）以来自布鲁氏杆菌（Brucella abortus）的转录调控因子Ery D为传感器,在骨架质粒p ET-22b（+）中插入e GFP报告基因,转化大肠杆菌E.coli BL21,构建以赤藓糖醇为效应物的生物传感器指示菌（SMB）。分析发现,Ery D的功能结构为四聚体,在赤藓糖醇的作用下,分解为两个二聚体,并从靶向位点脱落,暴露转录起始位点,启动基因转录。胞外热力学分析表明Ery D与DNA结合序列（DBS）及赤藓糖醇都有明显的亲和力,其结合主要受范德华力或氢键的影响。构建SMB时发现,在大肠杆菌中以含有DBS序列的启动子p DBS表达e GFP,荧光显微镜下无法观测到荧光。基于此,在质粒p ET-22b（+）中,用DBS和Ery D分别重组替换Lac O和Lac I。然后从DBS上游逐渐截短,当截短至104 bp时,构建成功。对SMB特性进行表征:在赤藓糖醇环境中,其响应精度为250-500 m M;在50-140 g·L-1葡萄糖影响下,其对赤藓糖醇的响应精度为5-250 m M。SMB的成功构建为后续高通量筛选奠定方法基础。（4）以耐热菌BBE-18为研究对象,采用复合诱变构建突变体文库。优化孔板发酵条件,使发酵液中赤藓糖醇含量在SMB响应范围内。然后,利用前面建立的高通量方法对突变体文库进行筛选,获得4株副产物比BBE-18降低84%的耐热高产菌株,摇瓶中相同发酵条件下,其中yli UA8的产量达到103 g·L-1,比原始菌株BBE-18的产量提高了1.4倍;在3-L发酵罐中,通过补料发酵,yli UA8的产量达到148 g·L-1。为防止菌体对赤藓糖醇的消耗,分别敲除EYK1、EYD1,发现敲除EYK1效果不明显,敲除EYD1则可以有效防止赤藓糖醇降解,且副产物消失。采用诱导型启动子p EYK1过表达糖异生途径关键基因FBP,减少碳代谢流下移,推动代谢流转向戊糖磷酸途径,然而赤藓糖醇产量达到10 g·L-1后,OD出现快速下降,无法提高赤藓糖醇产量。采用诱导型强启动子p EDK1过表达TKL,拉动代谢流进入戊糖磷酸途径,菌体生长良好,补料发酵赤藓糖醇产量达206 g·L-1,比yli UA8产量提高了39%。
吴元庆[8]（2020）在《代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究》文中进行了进一步梳理虾青素和β-胡萝卜素是两种重要的类胡萝卜素,均具有多种生物活性,被广泛用于水产业、畜牧业、医药保健业等。化学合成产品安全性不符合人体要求,直接从生物体提取产率低、成本高。随着生物技术的发展,构建高产微生物细胞工厂受到重视,多种微生物已能异源合成虾青素和β-胡萝卜素,其中大肠杆菌应用最多。本研究即是遗传改造工程大肠杆菌,使其高产这两种类胡萝卜素。首先,筛选不同来源的β-胡萝卜素羟化酶（Crt Z）基因和β-胡萝卜素酮化酶（Crt W）基因,优化设计了九个虾青素人工操纵子,转化入高产β-胡萝卜素的大肠杆菌ZF237T,获得九株重组ZF237T菌株,虾青素的产量从0.49 mg/L到8.07 mg/L。随后,基于产虾青素的操纵子,设计构建了Crt Z和Crt W的融合蛋白质,结果表明Crt Z在融合蛋白质的N-端时更有利于虾青素的生产,将不同的肽linker引入融合蛋白质,这一现象更明显,虾青素的产量也被提高,其中最优菌株ZF237T/Crt ZAs-（GS）1-WBs虾青素产量与菌株ZF237T/Crt ZAs-WBs和ZF237T/crt ZBsWPs相比分别提高了127.6%和40.2%,碳源优化后,该菌株虾青素产量达到26.16 mg/L。其次,在菌株ZF43Δgdh A中敲除zwf,所得菌株ECW1的生物量降低26.2%,β-胡萝卜素产量和胞内含量分别提高5.1%和32.5%。在菌株ECW1中敲除基因簇pts HIcrr,所得菌株ECW2的β-胡萝卜素产量提高61.8%,为197.44 mg/L,但β-胡萝卜素胞内含量降低。胞内辅因子含量测定表明,菌株ECW2胞内NADPH限制了其β-胡萝卜素胞内含量,随即,围绕NADPH的供给,多种组合被实施以提高菌株的β-胡萝卜素胞内含量,获得最优菌株ECW4/p5C-nad K,高细胞密度发酵,β-胡萝卜素最高产量2,579.1 mg/L。对菌株ECW1和ECW2进行了比较转录组学分析。zwf的敲除下调了菌株ECW1的嘌呤从头合成和核糖体大亚基合成途径,上调了菌株的TCA循环和回补途径而下调了糖酵解和磷酸戊糖途径大部分基因的表达,这些因素造成菌株ECW1生物量的下降;另一方面,zwf的敲除上调了ppc、pck、NADPH和异源途径相关基因的表达,这对提高菌株胞内β-胡萝卜素含量有利。zwf和pts HIcrr的双敲除下调了菌株ECW2中心碳代谢、能量代谢、辅因子代谢,使菌株的代谢网络达到一个新的平衡,协调了菌株碳流,有利于菌株的生物量和β-胡萝卜素的生产,而NADPH、MEP途径及异源途径相关基因的表达被显着下调是菌株ECW2的β-胡萝卜素产量下降的主要因素。最后,验证zwf的敲除提高了菌株ECW1的葡萄糖运输蛋白质基因pts G和gal P的相对转录水平后,通过启动子替换在菌株ECW1中过表达这两个基因,调整发酵方式,均提高了β-胡萝卜素产量和胞内含量。随后,将过表达引入菌株ZF43Δgdh A中,过表达pts G时,菌株β-胡萝卜素产量和胞内含量均提高。最后,利用过表达pts G和gal P的菌株生产芳樟醇,过表达pts G时菌株产量最高。证明大肠杆菌中过表达pts G有助于提高萜类化合物的生产。本文采用代谢工程策略,显着提高了工程大肠杆菌类胡萝卜素的产量,探寻了一般规律及菌株对改造的遗传响应,发现了新的可提高大肠杆菌萜类化合物产量的遗传改造位点。研究结果对其他天然产物的异源合成具有一定的指导意义,所得高产菌株具有一定的工业应用潜力。
赵淑丽[9]（2020）在《出芽短梗霉糖转运蛋白编码基因的预测、克隆及敲除》文中研究指明出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）又称黑酵母,是一种类酵母样真菌,在其发酵过程中会产生普鲁兰。普鲁兰是具有良好生物活性的大分子聚合物,在食品、医药、环保以及化妆品等众多领域都具有重要的应用价值。它的前体物质在细胞体内产生,在糖转运蛋白的帮助下分泌至胞外参与普鲁兰的合成。糖转运蛋白在微生物发酵过程中起着重要作用,不仅是参与细胞外糖分的吸收,还包括协助细胞中糖类代谢物的释放。本论文以出芽短梗霉（A.pullulans CCTCC M 2012259）为出发菌株,对其细胞中的糖转运蛋白进行了研究。我们预测其编码糖转运蛋白相关的基因信息,对这些基因进行敲除改造,筛选突变菌株,并从发酵过程、普鲁兰产量等方面与出发菌株进行比较,探究糖转运蛋白在出芽短梗霉合成胞外多糖过程中的作用。主要的研究内容及结果如下:1.在对本实验室一株出芽短梗霉进行全基因组测序的基础上,利用三种不同的生物信息学方法,即同源预测、从头预测以及基于RNA-seq的数据分析,将基因组信息与数据库中所有真菌已知的糖转运蛋白信息进行比对研究,初步筛选得到出芽短梗霉中可能的糖转运蛋白编码基因。接着采用GENSCAN软件对初步预测结果进行精确基因结构建模,得到包含启动子、外显子、内含子以及终止子的完整的基因信息。最后将预测得到的基因翻译成蛋白质序列,用blastp程序进行比对验证,最终确定出芽短梗霉的13个基因序列可能编码糖转运蛋白。得到的结构模型用ProcessOn软件进行基因序列以及蛋白质序列的可视化呈现。2.对预测的13个可能的糖转运蛋白基因序列进行克隆并构建相应的敲除载体。根据预测序列设计引物,将13个基因片段扩增到pMD19T载体上,测序得到包含内含子的全部序列,通过比对发现所有的外显子部分与预测序列完全匹配。接着在出芽短梗霉细胞中构建一个可以发挥功能的表达载体,包括启动子、终止子以及潮霉素筛选标记基因,即筛选元件PtrpC-hyg-TtrpC。最后通过酶切连接将有效元件插入到构建完成的13个糖转运蛋白候选基因的克隆载体上,完成用于同源重组的相应敲除载体的构建。3.利用基因工程手段对出芽短梗霉（A.pullulans CCTCC M 2012259）中糖转运蛋白编码基因进行敲除。首先考察了出芽短梗霉的生长状态。在YPD培养基中对出芽短梗霉进行培养,绘制相应的生长曲线,结果发现,培养25 h左右细胞处于对数生长期,可以用于后续的电转化实验。其次,要确定合适的潮霉素抗性筛选浓度。结果发现在100 μg/mL的潮霉素筛选平板上没有任何菌落生长的痕迹。因此,选择100 μg/mL的潮霉素浓度作为筛选阳性转化子的条件。然后用构建好的敲除片段对出芽短梗霉中相应的糖转运蛋白基因进行敲除,成功得到突变株。最后在摇瓶培养条件下对出发菌株以及所构建的突变株进行发酵生产普鲁兰性能的考察,结果发现和原始菌株相比,突变株的细胞干重有所提高,而普鲁兰的产量明显下降。以上结果表明,本文所考察的糖转运蛋白可能在普鲁兰胞外分泌过程中发挥作用,为进一步从分子水平改造出发菌株以提高普鲁兰合成效率提供了有利的证据。
高松[10]（2020）在《代谢工程改造酿酒酵母从头合成黄杉素》文中指出黄杉素（Taxifolin）是一种提取自落叶松或者花旗松中的黄酮类植物天然产物,是黄酮木质素和花青素等多种植物天然产物的重要前体之一,同时对人体也具有多种保健功效。包括黄杉素在内的多种黄酮类化合物一般只能通过植物提取法获得,但植物提取法高度受到植物生长周期和季节性等影响,因此限制了相关化合物的广泛应用。而微生物法合成这些化合物具有多重优势,如反应条件温和、可利用廉价碳源和具有手性催化特异性等,因而受到广泛关注。基于此,本研究以酿酒酵母为底盘微生物,系统探究了微生物法高效合成黄杉素及其重要中间产物的强化策略。以从头设计原则、模块化策略、启动子工程策略和定向进化策略为基础,结合生物信息学和高通量筛选技术等手段,逐步验证和消除了在酿酒酵母中合成黄杉素的限制因素,实现了黄杉素及其重要中间产物对香豆酸、柚皮素和圣草酚在酿酒酵母中高效从头合成。本研究中使用的策略和建立的工具对其他天然产物相关基因的挖掘、表达和优化也具有重要借鉴意义。本论文的主要研究内容及结果如下:（1）从头合成柚皮素菌株的构建与柚皮素合成限制因素的鉴定。柚皮素是黄杉素合成的重要前体,因此首先构建了一株从头合成柚皮素的酿酒酵母菌株,并鉴定出柚皮素合成过程中的限制因素。通过在酿酒酵母基因组上整合Flavobacterium johnsoniae的酪氨酸解氨酶（FjTAL）、Petroselinum crispum的4-香豆酰辅酶A连接酶（Pc4CL）、Petunia X hybrida的查耳酮合酶（PhCHS）和Medicago sativa的查尔酮异构酶（MsCHI）,获得了一株可以从头合成柚皮素的工程菌株。通过诊断表达相关基因,验证了莽草酸途径代谢通量低和PhCHS酶活低是限制柚皮素合成的两个重要限速因素。通过发酵优化最终的工程菌株可以从2.50 g·L-1对香豆酸合成648.63 mg·L-1的柚皮素。（2）利用梯度强度启动子优化柚皮素合成基因的表达水平。途径优化是调节菌体代谢通路的重要手段,异源基因在宿主中表达往往会导致宿主代谢不平衡、中间代谢产物积累从而导致终产物产量较低。为了在酿酒酵母中优化柚皮素合成基因表达水平,首先根据RNA-Seq数据库初步筛选了66个启动子。用所选启动子表达荧光蛋白,利用流式细胞荧光分选技术（FACS）精确测定对应菌株的荧光强度,从而确定启动子的表达强度,同时通过实时荧光定量PCR确定启动子的转录强度。从启动子文库中选择30个梯度强度的启动子,分别与柚皮素合成途径基因Pc4CL、PhCHS和MsCHI随机组装,随后通过高通量筛选方法获得最佳菌株,经过发酵优化,改造菌株的柚皮素产量提高到1.21g·L-1,为首次获得克级别的柚皮素积累。（3）基于启动子工程和定向进化技术强化圣草酚合成。圣草酚作为黄杉素的直接前体,可以由柚皮素经过黄酮3′-羟化酶（F3′H）)催化获得。但是作为P450酶的F3′H和P450还原酶CPR的催化机制并不清楚,因此在应用于催化柚皮素合成圣草酚时受到限制。在本研究中,从水飞蓟中鉴定出一个全新的高效SmF3′H和与之匹配的SmCPR,并通过启动子工程优化了SmF3′H和SmCPR的表达水平后,圣草酚的产量显着提高。同时为进一步提高催化效率,通过定向进化技术筛选获得了SmF3′H和SmCPR的高效突变体SmF3′HD284N和SmCPRI453V,并且在本研究中建立了一种圣草酚的高通量检测方法,成功应用于启动子优化实验和定向进化实验中高通量筛选。经过发酵优化,最佳菌株可以从5.00 g·L-1的柚皮素高效合成3.28 g·L-1的圣草酚,是目前已报道的最高产量。（4）水飞蓟来源黄酮3-羟化酶的鉴定实现黄杉素的高效合成。圣草酚经过黄酮3-羟化酶（F3H）的催化获得黄杉素。一直以来,由于圣草酚产量低、F3H催化效率低等因素,微生物法合成黄杉素的产量也一直处在较低水平。本研究从水飞蓟转录组中鉴定得到一个高效黄酮3-羟化酶SmF3H。发酵验证结果表明,SmF3H具有黄酮3位羟基化功能,且催化效率显着高于常用的来源于Solanum lycopersicum的Sl F3H。随后选取6个转录强度不同的启动子优化SmF3H的表达水平,发现PGAL7启动子起始转录SmF3H时黄杉素合成产量最高,在摇瓶中产量达到695.90 mg·L-1;经过发酵优化,最佳菌株可以高效合成3.54 g·L-1黄杉素,是目前已报道的最高产量。（5）构建高拷贝整合工具包并应用于黄杉素从头合成菌株的构建。在酿酒酵母中从头合成黄杉素需要表达至少七个外源基因及三个莽草酸途径相关的基因,而质粒表达系统并不稳定,因而建立基于酿酒酵母的多基因、多位点、整合型表达的工具包非常有必要。因此,本研究构建了一个用于酿酒酵母基因组高拷贝整合的工具包,可以实现上述需求。该工具包将5种酿酒酵母转座子Ty（Ty retrotransposons）整合位点与10种筛选标签组合,获得包括五十种组合的质粒表达包,然后通过荧光蛋白鉴定每种组合在基因组上整合能力和重组子表达强度的分布情况。最后将黄杉素合成的相关基因整合在三个不同的Ty位点,获得了一株从头合成黄杉素的菌株。经过在发酵罐水平进行发酵优化,可以从葡萄糖合成135.83 mg·L-1的黄杉素。
二、Construction of the glucose isomerase deficient strain of Streptomyces M1033 by homologous recombination（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Construction of the glucose isomerase deficient strain of Streptomyces M1033 by homologous recombination（论文提纲范文）
（1）MAPK蛋白激酶基因和磷酸酶基因参与粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物土传病害及生物防治 |
| 1.1.1 植物土传病害 |
| 1.1.2 生物防治 |
| 1.2 粉红螺旋聚孢霉研究进展 |
| 1.2.1 生物学特性 |
| 1.2.2 生防作用 |
| 1.2.3 生防作用机制 |
| 1.2.4 生防相关基因 |
| 1.3 蛋白质磷酸化 |
| 1.3.1 蛋白激酶与磷酸酶概述 |
| 1.3.2 MAPK信号传导途径 |
| 1.3.3 蛋白磷酸酶研究进展 |
| 1.4 蛋白质互作研究及其技术 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术 |
| 1.4.2 免疫共沉淀技术 |
| 1.4.3 双分子荧光互补技术 |
| 1.4.4 Pull down技术 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 粉红螺旋聚孢霉67-1 Crmapk互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 培养基及试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 粉红螺旋聚孢霉菌丝样品的准备 |
| 2.2.2 RNA提取与质量检测 |
| 2.2.3 mRNA的分离与纯化 |
| 2.2.4 酵母双杂初级文库的构建 |
| 2.2.5 酵母双杂次级文库的构建 |
| 2.2.6 酵母转化 |
| 2.2.7 Crmapk-GFP融合表达载体及菌株的构建 |
| 2.2.8 Crmapk-BD诱饵载体的构建 |
| 2.2.9 诱饵载体自激活和毒性检测 |
| 2.2.10 酵母双杂文库的筛选与验证 |
| 2.2.11 双分子荧光互补(Bi FC)验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Crmapk的生物信息学分析 |
| 2.3.2 Crmapk的亚细胞定位 |
| 2.3.3 粉红螺旋聚孢霉酵母双杂文库的构建 |
| 2.3.4 酵母双杂文库筛选 |
| 2.3.5 互作蛋白的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 粉红螺旋聚孢霉67-1 Crmapk互作蛋白CIP2和CIP11 的功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 培养基及试剂配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 粉红螺旋聚孢霉基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 粉红螺旋聚孢霉总RNA的提取 |
| 3.2.3 c DNA反转录 |
| 3.2.4 菌核诱导条件下CIP2和CIP11 表达量的检测 |
| 3.2.5 CIP2和CIP11 的生物信息学分析 |
| 3.2.6 CIP2和CIP11 基因敲除载体的构建 |
| 3.2.7 CIP2和CIP11 基因回补载体的构建 |
| 3.2.8 原生质体的转化 |
| 3.2.9 转化子的筛选及验证 |
| 3.2.10 突变株生长表型测定 |
| 3.2.11 胁迫压力敏感性测定 |
| 3.2.12 拮抗能力的测定 |
| 3.2.13 对大豆核盘菌菌核寄生能力测定 |
| 3.2.14 盆栽防治大豆菌核病实验 |
| 3.2.15 统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 CIP2和CIP11 的生物信息学分析 |
| 3.3.2 菌核诱导条件下CIP2和CIP11 表达量的检测 |
| 3.3.3 CIP2和CIP11 基因的敲除和回补 |
| 3.3.4 突变株生长表型测定 |
| 3.3.5 胁迫压力敏感性测定 |
| 3.3.6 拮抗能力测定 |
| 3.3.7 对大豆核盘菌菌核寄生能力测定 |
| 3.3.8 盆栽防治大豆菌核病实验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 粉红螺旋聚孢霉67-1 细胞壁合成磷酸酶基因CrSsd1 的功能研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 培养基及试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CrSsd1 的生物信息学分析 |
| 4.3.2 菌核诱导条件下CrSsd1 表达量的检测 |
| 4.3.3 CrSsd1 基因的敲除和回补 |
| 4.3.4 突变株生长表型测定 |
| 4.3.5 胁迫压力敏感性测定 |
| 4.3.6 对灰霉菌拮抗能力测定 |
| 4.3.7 对大豆核盘菌菌核寄生能力测定 |
| 4.3.8 盆栽防治大豆菌核病实验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 引物列表 |
| 附录 B 利用酵母双杂筛选与Crmapk互作的蛋白信息列表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）系统代谢改造大肠杆菌高效合成反式-4-羟基-L-脯氨酸（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 反式-4-羟基-L-脯氨酸及其生产方法 |
| 1.1.1 反式-4-羟基-L-脯氨酸性质 |
| 1.1.2 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生理功能及应用 |
| 1.1.3 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法 |
| 1.2 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生物合成 |
| 1.2.1 L-脯氨酸的生物合成及调控 |
| 1.2.2 脯氨酸-4-羟化酶 |
| 1.3 反式-4-羟基-L-脯氨酸工程菌株改造研究进展 |
| 1.4 本论文主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据与研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 基于稀有密码子筛选策略筛选L-脯氨酸生产底盘细胞 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 2.2.3 微生物培养 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 质粒及菌株构建 |
| 2.2.6 突变文库构建 |
| 2.2.7 重组酶制备和纯化 |
| 2.2.8 酶活测定 |
| 2.2.9 鸟氨酸环化脱氨酶动力学参数研究 |
| 2.2.10 产物分析 |
| 2.2.11 结构及分子动力学模拟分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 基于稀有密码子筛选的L-脯氨酸生产菌筛选系统验证 |
| 2.3.2 基于稀有密码子筛选的L-脯氨酸生产菌筛选系统构建 |
| 2.3.3 基于稀有密码子选择的鸟氨酸环化脱氨酶定向进化用于新型反式-4-羟基-L-脯氨酸生物合成 |
| 2.3.4 全细胞转化合成反式-4-羟基-L-脯氨酸体系的优化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 代谢工程改造脯氨酸底盘细胞合成反式-4-羟基-L-脯氨酸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 3.2.3 微生物培养 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 菌株构建 |
| 3.2.6 酶的制备和纯化 |
| 3.2.7 产物分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 L-脯氨酸合成相关差异基因分析 |
| 3.3.2 代谢改造PM-14 提高L-Pro合成 |
| 3.3.3 过表达脯氨酸羟化酶生产反式-4 羟基-L-脯氨酸 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于群体感应基因线路动态调控α-酮戊二酸代谢流 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 4.2.3 微生物培养 |
| 4.2.4 分子生物学操作 |
| 4.2.5 菌株构建 |
| 4.2.6 产物测定 |
| 4.2.7 酶活测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 群体感应基因线路调控系统的构建 |
| 4.3.2 群体感应基因线路调控系统的验证 |
| 4.3.3 群体感应基因线路动态调控ODHC活性 |
| 4.3.4 补料分批发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 通过理性设计提高脯氨酸羟化酶催化活性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 5.2.3 微生物培养 |
| 5.2.4 菌株构建 |
| 5.2.5 酶活测定 |
| 5.2.6 酶学性质测定 |
| 5.2.7 酶的制备和纯化 |
| 5.2.8 产物分析 |
| 5.2.9 脯氨酸羟化酶动力学参数研究 |
| 5.2.10 结构及分子动力学模拟分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 新型脯氨酸羟化酶挖掘与表征 |
| 5.3.2 脯氨酸羟化酶及其突变体酶动力学研究 |
| 5.3.3 脯氨酸羟化酶及其突变体酶结构分析 |
| 5.3.4 脯氨酸羟化酶及其突变体酶分子动力学模拟及Rosetta分析 |
| 5.3.5 补料分批发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文与专利 |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
（3）天蓝色链霉菌中双组分信号转导系统SCO4155/SCO4156的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 链霉菌属(Streptomyces) |
| 1.1.1 简介 |
| 1.1.2 链霉菌的生理学研究 |
| 1.1.2.1 链霉菌的生长发育 |
| 1.1.2.2 链霉菌的次级代谢产物 |
| 1.2 双组分信号转导系统 |
| 1.2.1 双组分信号转导系统简介 |
| 1.2.2 组氨酸激酶 |
| 1.2.3 应答调控蛋白 |
| 1.2.4 链霉菌中双组分信号转导系统的研究 |
| 1.3 链霉菌的分泌系统 |
| 1.3.1 Sec途径 |
| 1.3.2 Tat途径 |
| 1.3.3 Ⅶ型分泌系统(T7SS) |
| 1.4 蛋白分泌压力应答 |
| 1.4.1 CpxRA TCS |
| 1.4.2 CssRS TCS |
| 1.4.3 MprAB TCS |
| 1.5 立题依据与研究内容 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 培养基及缓冲液 |
| 2.1.4 抗生素保存和使用浓度 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 链霉菌的菌种保藏及培养 |
| 2.2.2 天蓝色链霉菌总基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 突变株Δ4155/56的构建、筛选和验证过程 |
| 2.2.3.1 突变质粒pD-SCO4155/56的构建 |
| 2.2.3.2 大肠杆菌与链霉菌的接合转移获得突变接合子 |
| 2.2.3.3 突变株△4155/56的筛选与验证 |
| 2.2.4 回补菌株C-△4155/56构建、筛选和验证过程 |
| 2.2.5 天蓝色链霉菌的表型观察 |
| 2.2.5.1 天蓝色链霉菌固体培养观察 |
| 2.2.5.2 各菌株菌体生物量及ACT、RED的相对含量测定 |
| 2.2.6 天蓝色链霉菌总RNA的提取操作 |
| 2.2.7 Real-time PCR分析M145与△4155/56菌株中的表达差异基因 |
| 2.2.8 SCO4156蛋白的异源表达和纯化 |
| 2.2.8.1 表达质粒pET15b-4156及菌株的构建 |
| 2.2.8.2 His-4156融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2.8.3 His-4156融合蛋白的纯化 |
| 2.2.9 目的蛋白的SDS-PAGE检测及浓度测定 |
| 2.2.9.1 SDS-PAGE检测 |
| 2.2.9.2 BCA法检测蛋白浓度 |
| 2.2.10 SCO4156的体外结合验证—凝胶迁移试验 |
| 2.2.11 Flag标签回补菌株的构建及检测 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 双组分信号转导系统SCO4155/SCO4156的生物信息学分析 |
| 3.1.1 序列保守性分析 |
| 3.1.2 蛋白质相互作用分析 |
| 3.2 基因缺失突变菌株Δ4155/56的构建 |
| 3.2.1 突变质粒pD-SCO4155/56的构建 |
| 3.2.2 双交换突变菌株△4155/56的筛选和验证 |
| 3.2.3 突变菌株△4155/56的初步观察 |
| 3.3 回补菌株C-△4155/56的构建 |
| 3.3.1 回补质粒pCom-4155/56的构建 |
| 3.3.2 回补菌株C-△4155/56的筛选与验证 |
| 3.4 M145、△4155/56、C-Δ4155/56的表型分析 |
| 3.5 SCO4156蛋白的表达 |
| 3.6 SCO4156的体外结合试验 |
| 3.6.1 SCO4156与结构基因启动子的体外结合 |
| 3.6.2 SCO4156与调控基因启动子的体外结合 |
| 3.7 基因表达的定量分析(Real-time PCR) |
| 3.7.1 HtrA-like蛋白酶编码基因的定量分析 |
| 3.7.2 预测潜在调控基因的定量分析 |
| 3.8 SDS条件下基因表达的定量分析(Real-time PCR) |
| 3.8.1 HtrA-like蛋白酶编码基因的定量分析 |
| 3.8.2 预测潜在调控基因的定量分析 |
| 3.9 SCO4155/SCO4156影响次级代谢产物合成 |
| 3.9.1 菌体生长曲线测定 |
| 3.9.2 放线紫红素(ACT)的相对含量测定 |
| 3.9.3 十一烷基灵菌红素(RED)的相对含量测定 |
| 3.9.4 酪蛋白水解圈的初步测定 |
| 3.9.5 act基因的定量分析 |
| 3.10 基因缺失突变菌株Δ7075的构建、回补及表型分析 |
| 3.10.1 sco7075的敲除 |
| 3.10.2 回补菌株C-△7075的构建 |
| 3.10.3 M145、Δ7075和C-△7075的表型分析 |
| 3.11 Flag-tag回补菌株的构建和检测 |
| 3.11.1 Flag-tag回补菌株的构建 |
| 3.11.2 Flag-tag回补菌株的标签检测 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 展望 |
| 附录 MprA在天蓝色链霉菌M145中的潜在结合位点 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）四株放线菌中次级代谢产物的基因组挖掘（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词及符号说明 |
| 第一章 微生物天然产物的基因组挖掘 |
| 1. 基于结构预测挖掘新天然产物 |
| 1.1 生物信息学工具的发展 |
| 1.2. 预测底物或产物结构 |
| 2. 基于代谢组比较挖掘新天然产物 |
| 3. 基于调控激活沉默基因簇 |
| 3.1 正调控基因的过表达 |
| 3.2 负调控基因的敲除 |
| 3.3 启动子的置换 |
| 3.4 营养及小分子调控 |
| 4. 基于异源表达激活沉默基因簇 |
| 5. 基于新微生物资源的基因组挖掘 |
| 6. 本课题研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 链霉菌LZ35中代谢产物的挖掘与生物合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 培养基及试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌株SR111的培养基筛选 |
| 2.3.2 SR111及相关突变株发酵产物的提取与检测 |
| 2.3.3 菌株SR111的SG液体培养基扩大发酵及产物的分离纯化 |
| 2.3.4 菌株SR111的SCAS固体培养基扩大发酵及产物分离纯化 |
| 2.3.5 化合物绝对构型的确定 |
| 2.3.5.1 Marfey法确定化合物1中氨基酸的绝对构型 |
| 2.3.5.2 酸水解法确定化合物3的绝对构型 |
| 2.3.6 基因簇sm42敲除突变株的构建 |
| 2.3.7 化合物的生物活性测定 |
| 2.3.7.1 抗菌活性测定 |
| 2.3.7.2 抑制鼠伤寒沙门菌T3SS毒性蛋白分泌测定 |
| 2.3.7.3 细胞毒活性测定 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 SR111的培养基筛选结果 |
| 2.4.2 环脂肽coprisamides的发现 |
| 2.4.2.1 化合物1和2的结构鉴定 |
| 2.4.2.2 coprisamides生物合成基因簇的确定 |
| 2.4.2.3 coprisamides的生物合成途径 |
| 2.4.3 新gemicidin糖苷的发现 |
| 2.4.3.1 化合物3和4的结构解析 |
| 2.4.3.3 新germicidin糖苷的生物合成 |
| 2.4.4. 化合物的生物活性评价 |
| 2.4.4.1 抗菌活性 |
| 2.4.4.2 抑制沙门菌T3SS毒性蛋白分泌活性 |
| 2.4.4.3 细胞毒活性 |
| 2.5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 链霉菌XZYN4中非安莎新骨架化合物的定向挖掘 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基和试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 用于基因簇体外重构启动子活性评价质粒的构建 |
| 3.3.2 链霉菌高活性启动子在大肠杆菌中的活性测定 |
| 3.3.3 nonansa基因簇的体外重构与异源表达 |
| 3.3.4 复制性重组质粒的构建 |
| 3.3.5 野生型与异源表达突变株的发酵培养与产物提取 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 链霉菌高活性启动子在大肠杆菌中的活性评价 |
| 3.4.2 异源表达突变株的验证结果 |
| 3.4.2.1 整合型重组质粒的验证 |
| 3.4.2.2 复制型重组质粒的验证 |
| 3.4.3 异源表达突变株发酵产物的检测结果与分析 |
| 3.5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 疣孢菌NS0172中5酮安莎霉素的定向挖掘与链霉菌S001中Ⅱ型PKS的发现 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 NS0172中5酮安莎霉素的定向挖掘 |
| 4.3.1.1 正调控基因共表达突变株的构建 |
| 4.3.1.2 野生型与共表达突变株的小发酵培养与产物提取 |
| 4.3.1.3 共表达突变株的产量优化条件摸索 |
| 4.3.1.4 NS0172-SL中未知化合物的分离纯化 |
| 4.3.2 S001中Ⅱ型PKS化合物的发现 |
| 4.3.2.1 链霉菌S001及相关突变株的发酵与产物提取 |
| 4.3.2.2 培养基最适pH条件摸索 |
| 4.3.2.3 S001的扩大发酵及产物的分离纯化 |
| 4.3.2.4 基因簇sm3的正调控基因过表达质粒的构建 |
| 4.3.2.5 化合物的生物活性测定 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 NS0172中5酮安莎霉素的定向挖掘 |
| 4.4.1.1 野生型与共表达突变株发酵产物的检测结果与分析 |
| 4.4.1.2 饲喂AHBA前体提高NS0172-SL中未知化合物的产量 |
| 4.4.1.3 NS0172-SL中未知化合物的分离纯化结果 |
| 4.4.2 S001中Ⅱ型PKS化合物的发现 |
| 4.4.2.1 基因簇sm3的生物信息学分析 |
| 4.4.2.2 S001发酵培养基最适pH的确定 |
| 4.4.2.3 链霉菌S001扩大发酵产物的结构鉴定 |
| 4.4.2.4. 化合物A7和A8的生物合成 |
| 4.4.2.5 野生型与单调控基因过表达突变株发酵产物的检测结果与分析 |
| 4.4.2.6 化合物的生物活性评价 |
| 4.5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 附录 |
| 附录1: 通用基础实验方法 |
| 附录2: 引物列表 |
| 附录3: HPLC检测的洗脱条件 |
| 附录4: 基因功能注释表 |
| 附录5: 突变株NS0172-SL液体培养基筛选HPLC检测图 |
| 附录6: 化合物谱图及NMR数据 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文及资助情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）海洋微生物药物didemnin B生物合成基因簇的克隆研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 Didemnin概述 |
| 1.2 Didemnins的结构及其生物合成 |
| 1.3 大片段DNA克隆方法的概述 |
| 1.3.1 构建基因组文库 |
| 1.3.2 线性片段之间的同源重组 |
| 1.3.3 Bio Brick或者Bgl Brick |
| 1.3.4 酵母转化偶联重组 |
| 1.3.5 MASTER连接和Golden gate |
| 1.3.6 DNA assembler |
| 1.3.7 基于位点特异性重组的串联组装 |
| 1.3.8 Gibson等温一步法 |
| 1.4 论文研究概述 |
| 第二章 运动替斯崔纳菌的发酵及didemnin B合成能力的初步验证 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 运动替斯崔纳菌中didemnin B合成基因的PCR扩增 |
| 2.4.2 运动替斯崔纳菌发酵及didemnin B的 LC-MS分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Didmnin B生物合成基因簇的克隆 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 引物 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 大肠杆菌的培养及其化学感受态的制备和使用 |
| 3.3.2 菌种保存 |
| 3.3.3 电转感受态细胞的制作及使用 |
| 3.3.4 大肠杆菌/天蓝链霉菌属间接合转移方法 |
| 3.3.5 Cas9-TAR介导的didemnin B生物合成基因簇的分子克隆与鉴定 |
| 3.3.6 用Cas9-TAR方法分两段克隆didemnin B生物合成基因簇 |
| 3.3.7 Gibson一步法介导的didemnin B生物合成基因簇的拼接 |
| 3.3.8 质粒pCL01-HIS-did L+R-HR构建及基于TAR的 didemnin B生物合成基因簇拼接 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Didemnin B生物合成基因簇的分段捕获 |
| 3.4.2 Didemnin B生物合成基因簇的拼接 |
| 3.5 本章小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 缩写汇编 |
| 致谢 |
（6）开发新型基因编辑技术用于多杀菌素异源表达和结构衍生（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1. 多杀菌素 |
| 1.1.1. 多杀菌素及其衍生物 |
| 1.1.2. 多杀菌素生物合成基因簇 |
| 1.1.3. 多杀菌素生物合成 |
| 1.1.4. 多杀菌素产量提高策略 |
| 1.2. 基因编辑技术 |
| 1.2.1. DNA体外组装技术 |
| 1.2.2. DNA体内同源重组技术 |
| 1.3. 立项依据和研究内容 |
| 第二章 多杀菌素生物合成基因簇的直接克隆和异源表达 |
| 2.1. 实验材料 |
| 2.1.1. 菌种和质粒 |
| 2.1.2. 生物化学与分子生物学试剂 |
| 2.1.3. 重组引物和DNA测序 |
| 2.2. 仪器设备 |
| 2.3. 实验方法 |
| 2.3.1. 菌种培养及保藏 |
| 2.3.2. DNA制备与纯化方法 |
| 2.3.3. 大肠杆菌DNA同源重组工程标准操作程序 |
| 2.3.4. 重组克隆鉴定 |
| 2.3.5. ExoCET直接克隆技术标准操作程序 |
| 2.3.6. 链霉菌接合转移 |
| 2.3.7. 链霉菌发酵和产物分析 |
| 2.4. 实验过程与结果分析 |
| 2.4.1. 多杀菌素生物合成基因簇载体的构建 |
| 2.4.2. 多杀菌素链霉菌异源表达菌株的构建 |
| 2.4.3. 多杀菌素链霉菌异源表达菌株的发酵产物分析 |
| 2.5. 小结与讨论 |
| 第三章 开发DNA多片段组装技术构建多操纵子人工基因簇提高多杀菌素产量 |
| 3.1. 实验材料 |
| 3.1.1. 菌种和质粒 |
| 3.1.2. 生物化学与分子生物学试剂 |
| 3.1.3. 重组引物 |
| 3.2. 仪器设备 |
| 3.3. 实验方法 |
| 3.3.1. ExoCET多片段组装标准操作程序 |
| 3.3.2. Gibson多片段组装 |
| 3.3.3. 实时荧光定量PCR |
| 3.4. 实验过程与结果分析 |
| 3.4.1. 过表达多杀菌素PKS基因提高多杀菌素产量 |
| 3.4.2. 人工多杀菌素基因簇的设计 |
| 3.4.3. ExoCET多片段组装构建人工多杀菌素基因簇 |
| 3.4.4. 人工多杀菌素基因簇的异源表达 |
| 3.5. 小结与讨论 |
| 第四章 开发RedEx基因编辑技术用于多杀菌素结构衍生 |
| 4.1. 实验材料 |
| 4.1.1. 菌种和质粒 |
| 4.1.2. 生物化学与分子生物学试剂 |
| 4.1.3. 重组引物 |
| 4.2. 仪器设备 |
| 4.3. 实验方法 |
| 4.3.1. RedEx基因编辑技术标准操作程序 |
| 4.3.2. 多杀菌素衍生物的分离纯化 |
| 4.4. 实验过程与结果分析 |
| 4.4.1. 丁烯基多杀菌素基因簇的设计 |
| 4.4.2. RedEx基因编辑技术的建立及其在丁烯基多杀菌素基因簇构建中的应用 |
| 4.4.3. RedEx技术无缝敲除spnK基因构建多杀菌素JL基因簇 |
| 4.4.4. RedEx与其他基因编辑技术的比较 |
| 4.5. 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）产赤藓糖醇亚罗解脂酵母的耐热机制分析及组合策略改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 赤藓糖醇概述 |
| 1.1.1 赤藓糖醇在食品中应用的健康特性 |
| 1.1.2 赤藓糖醇在工业领域的应用 |
| 1.1.3 微生物法合成赤藓糖醇 |
| 1.2 亚罗解脂酵母的研究 |
| 1.2.1 亚罗解脂酵母简述 |
| 1.2.2 遗传操作 |
| 1.2.3 代谢工程改造生产赤藓糖醇 |
| 1.3 酵母耐热机制及优化策略 |
| 1.3.1 酵母的耐热机制 |
| 1.3.2 提高酵母热耐受性 |
| 1.4 生物传感器 |
| 1.4.1 在高通量筛选中的应用 |
| 1.4.2 在代谢调控中的应用 |
| 1.5 本论文主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据及研究意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 耐热亚罗解脂酵母的选育及机制分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与培养基 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 适应性进化 |
| 2.2.4 转录组测序 |
| 2.2.5 差异基因分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 适应性进化选育耐热菌株 |
| 2.3.2 耐热菌株与原始菌株的差异表达基因分析 |
| 2.3.3 差异表达基因的GO分析 |
| 2.3.4 差异表达基因的KEGG Pathway分析 |
| 2.3.5 中心碳代谢差异基因分析 |
| 2.3.6 氨基酸代谢差异基因分析 |
| 2.3.7 耐热功能性成分的合成途径分析 |
| 2.3.8 耐热途径靶点基因的挖掘 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 野生型亚罗解脂酵母遗传背景分析及耐热机制验证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株及基因操作材料 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 |
| 3.2.4 主要仪器设备 |
| 3.2.5 亚罗解脂酵母基因组提取 |
| 3.2.6 基因组测序 |
| 3.2.7 △KU70菌株的构建 |
| 3.2.8 酵母菌落PCR |
| 3.2.9 Gibson组装与酶切连接 |
| 3.2.10 DNA片段纯化 |
| 3.2.11 抗生素的筛选 |
| 3.2.12 ATP的检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 基因组结构及拷贝数变异分析 |
| 3.3.2 全基因组变异图谱及关键途径基因变化分析 |
| 3.3.4 基因组注释与比较分析 |
| 3.3.5 适用抗生素的筛选 |
| 3.3.6 KU70的敲除 |
| 3.3.7 尿嘧啶缺陷型菌株的构建 |
| 3.3.8 耐热途径基因的改造验证 |
| 3.3.9 优选耐热基因在野生型菌株中的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 赤藓糖醇生物传感器的构建与表征 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株、质粒和培养基 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 EryD的制备与纯化 |
| 4.2.4 等温滴定量热法测定结合亲和力 |
| 4.2.5 生物传感器的构建 |
| 4.2.6 荧光信号和赤藓糖醇的检测 |
| 4.2.7 生物传感器的表征 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 EryD蛋白的表达与纯化 |
| 4.3.2 EryD结构分析 |
| 4.3.3 EryD结合特性的热力学分析 |
| 4.3.4 生物传感器的构建 |
| 4.3.5 EryD生物传感器的表征 |
| 4.3.6 生物传感器SMB研究拓展 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 耐热高产赤藓糖醇菌株的高通量筛选及代谢改造 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和培养基 |
| 5.2.2 质粒和引物 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.2.4 KU70及URA3的敲除 |
| 5.2.5 紫外和常压室温等离子体诱变 |
| 5.2.6 高通量发酵 |
| 5.2.7 赤藓糖醇生产菌株的高通量筛选 |
| 5.2.8 优选菌株的发酵效果验证 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 孔板高通量发酵 |
| 5.3.2 菌株突变体文库的构建 |
| 5.3.3 基于生物传感器SMB筛选赤藓糖醇高产菌 |
| 5.3.4 高产菌株的发酵验证 |
| 5.3.5 敲除赤藓糖醇分解代谢基因EYK1和EYD1 |
| 5.3.6 赤藓糖醇合成途径的强化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者在攻读博士学位期间发表的论文及成果清单 |
（8）代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 萜类化合物的天然生物合成途径 |
| 1.2.1 异戊二烯单元的生物合成途径 |
| 1.2.2 萜类化合物生物合成的下游途径 |
| 1.3 萜类化合物合成的生物技术 |
| 1.3.1 天然宿主萜类化合物的生物合成 |
| 1.3.2 异源微生物合成萜类化合物 |
| 1.3.3 萜类化合物的无细胞体系合成 |
| 1.4 类胡萝卜素 |
| 1.4.1 类胡萝卜素的概述 |
| 1.4.2 β-胡萝卜素 |
| 1.4.3 虾青素 |
| 1.5 选题背景及研究内容 |
| 1.5.1 大肠杆菌中组合生物合成调控虾青素生产 |
| 1.5.2 大肠杆菌碳代谢扰动提高β-胡萝卜素的生产 |
| 第2章 虾青素操作子的构建和表征 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌的CaCl_2转化法感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.2 大肠杆菌电转化感受态的制备和电转化 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.4 DNA片段的PCR扩增 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 DNA片段的纯化和回收 |
| 2.2.7 DNA片段的切胶回收 |
| 2.2.8 DNA片段的酶切反应和连接反应 |
| 2.2.9 菌液PCR |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.2.11 菌株的培养及摇瓶发酵 |
| 2.2.12 AX的定量检测 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 大肠杆菌生产AX初探 |
| 2.3.2 AX操纵子的优化再设计与构建 |
| 2.3.3 优化的AX操纵子发酵表征 |
| 2.3.4 优化的AX操纵子表达分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 β-胡萝卜素羟化酶与β-胡萝卜素酮化酶的融合 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重叠延伸PCR |
| 3.2.2 同源建模 |
| 3.2.3 菌株的碳源优化发酵 |
| 3.2.4 高效液相色谱检测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 融合蛋白质的设计与构建 |
| 3.3.2 融合蛋白质中添加肽linker对AX生产的影响 |
| 3.3.3 菌株ZF237T/Crt Z_(As)-(GS)_1-W_(Bs)发酵碳源的优化 |
| 3.3.4 融合蛋白的同源建模 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 中心碳代谢扰动与NADPH供应提高β-胡萝卜素生产 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 大肠杆菌中I-Sce I介导的λ-red重组系统无痕敲除基因 |
| 4.2.2 大肠杆菌中的MAGE技术 |
| 4.2.3 大肠杆菌生理参数的测定 |
| 4.2.4 辅酶Ⅰ和II胞内含量检测 |
| 4.2.5 菌株ECW4/ p5C-nad K的高细胞密度发酵 |
| 4.2.6 定量测定 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 中心碳代谢途径的阻断对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.2 PTS系统失活对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.3 中心碳代谢扰动菌株的生理参数测定 |
| 4.3.4 菌株ECW1和ECW2 的还原力分析 |
| 4.3.5 增加NADPH的供应对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.6 菌株ECW4/p5C-nad K的高细胞密度发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 菌株ECW1和ECW2 的转录组分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 溶液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 菌株培养 |
| 5.2.2 转录组学 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 基因表达水平相关性分析 |
| 5.3.2 基因差异表达分析 |
| 5.3.3 菌株ECW1与ZF43ΔgdhA的比较转录组学分析 |
| 5.3.4 菌株ECW2转录组学分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 过表达葡萄糖运输蛋白对萜类化合物的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.1.5 溶液 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 大肠杆菌基因组上过表达基因 |
| 6.2.2 β-胡萝卜素的生成 |
| 6.2.3 芳樟醇的生成 |
| 6.2.4 β-胡萝卜素和芳樟醇的测定 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 zwf的敲除对基因ptsG和 galP转录的影响 |
| 6.3.2 菌株ECW1中过表达ptsG、galP对 β-胡萝卜素生产的影响 |
| 6.3.3 在菌株ZF43ΔgdhA中过表达ptsG和 galP |
| 6.3.4 葡萄糖运输蛋白基因的过表达对芳樟醇合成的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（9）出芽短梗霉糖转运蛋白编码基因的预测、克隆及敲除（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 出芽短梗霉 |
| 1.1.1 出芽短梗霉的形态 |
| 1.1.2 出芽短梗霉的代谢产物 |
| 1.2 普鲁兰 |
| 1.2.1 普鲁兰的概述 |
| 1.2.2 普鲁兰的应用 |
| 1.3 基因敲除 |
| 1.3.1 基因敲除的概述 |
| 1.3.2 各种基因敲除技术的优缺点 |
| 1.3.3 基因敲除技术在微生物代谢工程中的应用 |
| 1.4 糖转运蛋白 |
| 1.4.1 糖转运蛋白的概述 |
| 1.4.2 糖转运蛋白在出芽短梗霉中的作用 |
| 1.5 本论文的研究意义以及主要内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 主要内容 |
| 第二章 出芽短梗霉中糖转运蛋白编码基因的预测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 数据资源和分析工具 |
| 2.2.3 分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 编码糖转运蛋白的基因初步预测 |
| 2.3.2 编码糖转运蛋白的基因精确建模 |
| 2.3.3 GENSCAN建模结果的评估 |
| 2.3.4 编码糖转运蛋白的基因建模结果可视化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 出芽短梗霉中糖转运蛋白编码基因的克隆 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 载体及菌种 |
| 3.2.2 培养基与其他配置试剂 |
| 3.2.3 工具酶与试剂 |
| 3.2.4 常用仪器 |
| 3.2.5 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 出芽短梗霉中糖转运蛋白编码基因的克隆 |
| 3.3.2 出芽短梗霉中糖转运蛋白编码基因的测序 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 糖转运蛋白编码基因敲除载体的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 工具酶与试剂 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.2.5 潮霉素筛选元件的构建 |
| 4.2.6 同源重组敲除载体的构建 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 筛选元件的构建 |
| 4.3.2 糖转运蛋白编码基因相关敲除载体的构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 糖转运蛋白编码基因敲除突变株的筛选 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 出芽短梗霉生长曲线的测定 |
| 5.2.4 潮霉素抑制出芽短梗霉生长的适宜浓度的确定 |
| 5.2.5 电击转化出芽短梗霉 |
| 5.2.6 出芽短梗霉发酵培养方法 |
| 5.2.7 普鲁兰产量分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 出芽短梗霉的生长曲线 |
| 5.3.2 最佳潮霉素筛选浓度 |
| 5.3.3 出芽短梗霉基因敲除突变株的筛选 |
| 5.3.4 出发菌株与突变株的形态比较 |
| 5.3.5 出发菌株与突变株的摇瓶培养 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 基于Processon的基因建模可视化 |
| 附录三 糖转运蛋白编码基因序列 |
| 致谢 |
（10）代谢工程改造酿酒酵母从头合成黄杉素（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 植物天然产物与医药健康 |
| 1.1.2 黄酮类化合物简介 |
| 1.1.3 黄杉素及其微生物法合成 |
| 1.2 微生物法合成黄杉素的现状与趋势 |
| 1.2.1 对香豆酸合成途径及其强化策略 |
| 1.2.2 柚皮素合成途径及其强化策略 |
| 1.2.3 圣草酚/黄杉素合成途径及其强化策略 |
| 1.2.4 丙二酰辅酶A途径及其强化策略 |
| 1.3 立项依据和研究意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 第二章 从头合成柚皮素及限速步骤鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株、基因、质粒和试剂 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 水飞蓟来源查尔酮合酶的获得 |
| 2.2.5 质粒和菌株的构建 |
| 2.2.6 菌株的构建 |
| 2.2.7 培养条件 |
| 2.2.8 分析与检测条件 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 柚皮素从头合成菌株的构建 |
| 2.3.2 莽草酸途径对柚皮素积累的影响 |
| 2.3.3 外源基因表达强度对柚皮素积累的影响 |
| 2.3.4 发酵罐水平优化柚皮素积累 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于启动子文库优化基因表达水平高效合成柚皮素 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、基因、质粒和试剂 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 出发质粒和菌株的构建 |
| 3.2.5 RNA-Seq |
| 3.2.6 构建启动子文库 |
| 3.2.7 通过流式细胞仪鉴定启动子的翻译强度 |
| 3.2.8 通过RT-PCR检测启动子的转录强度 |
| 3.2.9 基于启动子库的柚皮素合成途径优化 |
| 3.2.10 高通量筛选方法 |
| 3.2.11 培养条件 |
| 3.2.12 分析与检测条件 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 从S288c扩增启动子序列 |
| 3.3.2 启动子转录和翻译强度的确定 |
| 3.3.3 启动子库相对翻译强度的确定 |
| 3.3.4 基于启动子文库的基因表达水平优化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于启动子工程和定向进化策略高效合成圣草酚 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株、基因、质粒和试剂 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 仪器设备 |
| 4.2.4 预测Sm F3′H/SmCPR |
| 4.2.5 扩增和鉴定SmF3′H/SmCPR |
| 4.2.6 基于启动子的SmF3′H/SmCPR表达水平优化 |
| 4.2.7 SmF3′H和 SmCPR定向进化 |
| 4.2.8 培养条件 |
| 4.2.9 高通量检测方法 |
| 4.2.10 分析与检测条件 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 圣草酚高通量检测技术 |
| 4.3.2 Sm F3′H/SmCPR催化活性验证 |
| 4.3.3 Sm F3′H/SmCPR的基因表达水平优化 |
| 4.3.4 Sm F3′H/SmCPR的定向进化 |
| 4.3.5 最佳菌株生产圣草酚的发酵优化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 高效黄酮3-羟化酶鉴定与黄杉素发酵优化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂、菌种和质粒 |
| 5.2.2 培养基与缓冲液 |
| 5.2.3 仪器设备表 |
| 5.2.4 预测水飞蓟来源黄酮3-羟化酶 |
| 5.2.5 扩增SmF3H并构建SmF3H的表达菌株 |
| 5.2.6 基于启动子优化基因表达水平 |
| 5.2.7 培养条件 |
| 5.2.8 分析与检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 SmF3H的序列分析 |
| 5.3.2 SmF3H的功能鉴定 |
| 5.3.3 基于启动子优化SmF3H表达水平 |
| 5.3.4 在5-L发酵罐水平进行黄杉素发酵优化 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 构建从头合成黄杉素菌株 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试剂、菌种和质粒 |
| 6.2.2 培养基 |
| 6.2.3 仪器设备 |
| 6.2.4 酿酒酵母菌株的构建 |
| 6.2.5 构建Ty表达包 |
| 6.2.6 Ty表达包的整合能力验证 |
| 6.2.7 单位点Ty整合菌株构建 |
| 6.2.8 双位点Ty整合菌株构建 |
| 6.2.9 丙二酰辅酶A途径强化菌株的构建 |
| 6.2.10 三位点Ty整合菌株构建及拷贝数验证 |
| 6.2.11 培养条件 |
| 6.2.12 检测方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 Ty表达包整合能力的验证 |
| 6.3.2 单位点Ty整合菌株生产能力的鉴定 |
| 6.3.3 双位点Ty整合菌株生产能力的鉴定 |
| 6.3.4 丙二酰辅酶A途径对柚皮素和黄杉素积累的影响 |
| 6.3.5 三位点Ty整合菌株从头合成黄杉素能力 |
| 6.3.6 在5-L发酵罐中从头合成黄杉素 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 I:作者在攻读博士学位期间发表论文及专利申请 |
| 附录 II:引物与基因序列 |
| 附录 表1 第二章所用引物 |
| 附录 表2 第三章用于菌株构建和RT-PCR所用引物 |
| 附录 表3 第三章用于从S288c扩增启动子序列的引物 |
| 附录 表4 第三章用于组装EGFP表达框的引物 |
| 附录 表5 第三章中启动子荧光强度、转录强度和FPKM值 |
| 附录 表6 第三章用于途径基因优化的引物 |
| 附录 表7 第三章中启动子特性 |
| 附录 表8 第四章中所用引物 |
| 附录 表9 第五章中所用引物 |
| 附录 表10 第六章中所用引物 |
| 附录 表11 本论文涉及到基因的DNA序列 |
四、Construction of the glucose isomerase deficient strain of Streptomyces M1033 by homologous recombination（论文参考文献）
- [1]MAPK蛋白激酶基因和磷酸酶基因参与粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生作用的研究[D]. 吕斌娜. 中国农业科学院, 2021
- [2]系统代谢改造大肠杆菌高效合成反式-4-羟基-L-脯氨酸[D]. 龙梦飞. 江南大学, 2021(01)
- [3]天蓝色链霉菌中双组分信号转导系统SCO4155/SCO4156的生物学功能研究[D]. 张晶. 山东大学, 2021(09)
- [4]四株放线菌中次级代谢产物的基因组挖掘[D]. 史海霞. 山东大学, 2021
- [5]海洋微生物药物didemnin B生物合成基因簇的克隆研究[D]. 王逸飞. 上海师范大学, 2021(07)
- [6]开发新型基因编辑技术用于多杀菌素异源表达和结构衍生[D]. 宋超逸. 山东大学, 2021(11)
- [7]产赤藓糖醇亚罗解脂酵母的耐热机制分析及组合策略改造[D]. 邱学良. 江南大学, 2020(04)
- [8]代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究[D]. 吴元庆. 天津大学, 2020(01)
- [9]出芽短梗霉糖转运蛋白编码基因的预测、克隆及敲除[D]. 赵淑丽. 苏州大学, 2020
- [10]代谢工程改造酿酒酵母从头合成黄杉素[D]. 高松. 江南大学, 2020