一、HLA-A*0201/BSP融合基因的构建与表达（论文文献综述）
吴静成[1]（2021）在《基于深度学习的肿瘤新生抗原预测方法研究》文中进行了进一步梳理癌症已经成为危害人类健康的重要疾病,近年来,以肿瘤免疫检验点抑制剂、抗体偶联药物、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法和个体化肿瘤疫苗为代表的肿瘤免疫治疗表现出前所未有的抗肿瘤治疗效果,成为抗肿瘤研究和临床治疗的热点。而肿瘤抗原靶点的选择是肿瘤免疫治疗能否成功的关键因素。肿瘤新生抗原被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶标,然而如何准确进行肿瘤新生抗原的鉴定仍是一个难题。本论文利用深度学习等新一代人工智能算法对肿瘤新生抗原形成过程中关键的生理过程,如多肽和主要组织相容性复合体（MHC）分子相互作用,多肽-MHC复合体（pMHC）与T细胞受体（TCR）相互作用进行了生物信息学预测方法研究,并通过肿瘤新生抗原预测软件构建、大规模肿瘤样本肿瘤新生抗原分析和肿瘤新生抗原数据库构建等方面开展了系统的肿瘤新生抗原预测研究。研究内容主要包括以下三部分:首先,本论文同时考虑了突变肽呈递的可能性和pMHC的潜在免疫原性,提出了一种基于循环神经网络（RNN）的新方法DeepHLApan用于高可信度新生抗原预测。我们证明了结合模型可以在未训练的MHC分型上获得良好的性能,并且在最新的IEDB基准数据集和独立的质谱数据集上具有与其他公认的工具相当的性能。在从Ko（?）alo（?）lu-Yal（?）（?）n等人收集的新生抗原数据集上使用免疫原性模型,我们证明了预测的免疫原性评分可以显着提高新生抗原的预测精度。最后,将DeepHLApan应用于能引起T细胞反应的突变上的结果表明,在每百万reads数中的转录本数（TPM）>2的情况下,其预测性能可与现有最佳的EDGE模型相媲美。其次,本论文对pMHC与TCR之间的相互作用进行了研究。针对四个结合TCR数量超过1000的pMHC复合体（A0301＿KLGGALQAK,B0801＿RAKFKQLL,A1101＿AVFDRKSDAK和A0201＿GILGFVFTL）的结合TCR进行序列特征分析发现,A0201＿GILGFVFTL结合TCR的序列特征最显着,以之为基础构建的pMHC限制性TCR预测模型具有较好的性能。该pMHC限制性模型随后被应用于指导TCR亲和力的改造。我们分别预测了突变对TCR-pMHC亲和力的影响,预测结果表明,单点突变中有6个突变可提高复合物的亲和力,且其中一个突变得到了实验的验证。除了pMHC限制性模型外,我们进一步探讨了HLA-A02:01分型限制性TCR预测模型的构建及应用。HLA-A02:01分型结合TCR的TRAV和TRBV基因频率分布显示其序列特征不如A0201＿GILGFVFTL结合TCR显着,但以该数据构建的HLA-A02:01分型限制性模型,在VDJdb数据库中799条阳性数据集上的性能优于基于A0201＿GILGFVFTL的pMHC限制性模型。在具有T细胞单细胞转录组数据的肿瘤样本上的应用表明,HLA-A02:01分型限制性模型结合DeepHLApan软件可以对肿瘤样本的肿瘤新生抗原进行预测,并能得到可能与肿瘤新生抗原相结合的对应TCR。最后,本论文利用开发的肿瘤新生抗原预测算法,针对肿瘤样本基因组数据,进行了软件构建、肿瘤新生抗原分布分析、数据库开发等工作。首先,我们利用开发的肿瘤新生抗原预测方法DeepHLApan与一系列肿瘤体细胞突变鉴定软件构建了一站式肿瘤新生抗原预测软件TSNAD V2.0,其可提供从全外显子组或全基因组出发预测肿瘤新生抗原的功能,是第一个提供完整流程的一站式集成软件,为肿瘤新生抗原预测的广泛应用提供了重大帮助。除了提供点突变（SNV）和小片段插入缺失（INDEL）来源的肿瘤新生抗原预测外,TSNAD V2.0还可在提供转录组测序数据的前提下进行基因融合（Fusion）来源的肿瘤新生抗原预测。为了方便TSNAD V2.0软件的使用,我们同时提供了本地安装的软件包和网络在线工具。利用肿瘤新生抗原筛选联盟（TESLA）提供的临床验证数据,验证了TSNAD V2.0的实际预测效果。分析结果表明,在23个既被TSNAD V2.0预测为高可信度肿瘤新生抗原组合又由TESLA验证的多肽-MHC组合中,有5个（21.7%）被验证是具有免疫原性的,显着高于TESLA在综合了28个软件的结果后从608个组合中得到37个免疫原性的组合（6.1%）的比例,体现了TSNAD V2.0的预测可靠性。我们进一步利用TSNAD V2.0对TCGA数据库中的大规模肿瘤样本进行SNV,INDEL和Fusion来源的肿瘤新生抗原分析。基于大规模肿瘤样本的肿瘤新生抗原分析结果,我们构建了肿瘤新生抗原数据库TSNAdb,该数据库存储了TCGA 7748例样本SNV来源的肿瘤新生抗原预测结果,研究者们可以借用该数据库研究不同肿瘤类型中SNV来源肿瘤新生抗原的分布情况;数据库还提供了高频突变（所有样本中至少发生3次）和高频MHC分型对应的肿瘤新生抗原预测结果,用于共有新生抗原的分析。综上所述,本论文从肿瘤新生抗原发挥作用过程中的多肽-MHC相互作用,TCR-pMHC相互作用两个关键步骤出发,利用深度学习算法构建了肿瘤新生抗原预测模型,并探讨了其在临床中的应用,为基于肿瘤新生抗原的免疫治疗提供了坚实的基础。
许涛[2]（2017）在《磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测》文中进行了进一步梳理当今医学检验试剂领域,病原体特异性基因、抗原和抗体的检测试剂盒很多,竞争性也很强,但是却没有厂家生产针对病原体特异性T细胞的检测试剂盒。抗原特异性T细胞（Antigen-specific Tcell,AST）是介导适应性免疫应答的核心细胞,在清除与控制病原体感染、监视和杀伤肿瘤细胞及自身免疫性疾病的免疫损伤中发挥着至关重要的作用。众所周知,在抗病毒感染和抗肿瘤中,细胞免疫比体液免疫更加重要,即T细胞的作用比B细胞产生的抗体更重要。抗原特异性T细胞数量的多少和功能的强弱直接反映了人体特异性细胞免疫的功能状态,在监测疾病进程、指导治疗方案、评价临床疗效、预测疾病慢性转归以及疫苗效果评估等方面都有着不同于抗体的重要参考价值。尽管抗原特异性T细胞的检测技术从最初的51Cr释放法、有限稀释法、细胞内细胞因子染色法到现在的ELISPOT法、pMHC多聚体流式分析法、蛋白芯片法等已经有了快速发展。尽管这些技术方法各有优点,但是各自的缺点也非常明显。目前临床上依然极少对患者进行抗原特异性T细胞数量和功能的监测。因此,进一步探索操作简便、无需特殊仪器、无需HLA基因分型、能同步检测抗原特异性T细胞数量和功能的新方法和新试剂非常重要和急迫,为精准医疗提供重要的诊疗手段。研究目的:将磁珠式人工抗原提呈细胞技术、ELISPOT技术、磁性细胞分选技术以及微孔反应板有机整合一体,建立特异性细胞免疫功能状态的检测平台:即磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板（aAPC-microplate）。首先,自制H-2Kb/OVA257-264单链三聚体（SCT）,利用aAPC-microplate同步检测OT-1转基因鼠中OVA257-264抗原特异性CD8+ T细胞的数量和功能,进行方法学评估;然后用同样技术制备HLA-A2/HBV peptide多聚体,利用aAPC-microplate技术对慢性乙肝患者和健康体检者的外周血中HBV特异性CD8+ T细胞的数量与功能进行同步检测,对该方法进行初步临床验证。研究方法:1)利用重叠延伸 PCR 技术将 OVA257-264、（GS4）3、β2m、（GS4）4和 H-2Kb （α1/α2/α3）依次串联为H-2Kb/OVA257-264单链三聚体基因（SCT）,联合同源重组克隆技术将其插入pET28a原核表达载体,制备pMHC单体和四聚体,验证其空间构象和与TCR的结合能力;然后包被磁珠,制备成人工抗原提呈细胞微孔反应板,同步检测OT-1转基因鼠中OVA257-264抗原表位特异性CD8+T细胞的频率和反应活性,进行特异性、准确性、灵敏度、重复性或精密度等方法学指标的评估,并与进口商品化H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体荧光流式检测法进行配对t检验和Pearson相关性分析,同时与传统ELISPOT法比较反应活性的检测;2)用金标准的PCR-Sequencing-Based Typing技术对86例健康体检人员血液样本和118例江苏地区汉族2型糖尿病血液标本分别进行HLA-A和HLA-B等位基因分型;利用基因重组克隆技术构建和表达所有频率大于1%的13种HLA-A等位基因重链重组质粒和8种常见HBV抗原表位与β2m轻链的重组质粒;利用6种在线表位预测数据库和软件对 HLA-A*01:01、A*03:01、A*30:01、A*31:01、A*32:01、A*33:03和A*6801等7种HLA-A等位基因分子限制性的HBV相关抗原表位肽进行预测;3)利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术构建和表达HLA-A*0201/HBc18-27、HLA-A*0201/HBs183-191、 HLA-A*0203/HBc18-27、 HLA-A *0203/HBs183-191、HLA-A*0206/HBc18-27等五种HLA-A2/HBVpeptide的单体和四聚体,包被磁珠,制备成制备成人工抗原提呈细胞微孔反应板;对临床慢性乙肝患者、健康体检者外周血中HBc18-27和HBs183-191抗原表位特异性CD8+ T细胞的数量与功能进行同步检测;并与进口商品HLA-A2-Ig二聚体的荧光流式分析法和传统ELISPOT法进行比较。研究结果:1)成功构建和表达H-2Kb/OVA257-264 SCT融合基因,制备成H-2Kb/OVA257-264 SCT单体,包被磁珠后用H-2Kb构象特异性荧光单抗染色和流式分析,证实能强烈结合,提示构象正确;制备成荧光标记的H-2Kb/OVA257-264 SCT四聚体,流式法检测4只OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA257-264抗原表位特异性CD8+T细胞频率。结果与进口商品化H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体的流式检测结果无统计学差异,证实H-2Kb/OVA257-264 SCT与TCR的结合能力;2) 7只OT-1鼠脾淋巴细胞群同时经aAPC-microplate法和H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体流式染色法检测OVA257-264表位特异性CD8+T细胞的频率,结果经配对t检验显示p=0.2464,表明无统计学差异,Pearson回归分析显示,相关系数r=0.946,P<0.01,相关方程为:Y=0.936X + 3.262,显示两种检测方法的吻合度很高;用H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体流式染色法检测aAPC-microplate孔内剩余细胞中OVA257-264特异性CD8+ T细胞的纯度,三次实验分别为92.35%、91.22%和92.10%,表明aAPC-microplate法的特异性达到90%以上;aAPC-microplate法检测7只OT-1鼠时,分析内 CV 值分别为 6.44%、4.01%、6.31%、9.08%、6.63%、4.24%和 3.11%,对其中1只进行三次独立重复检测,结果分别为25.47%、25.59%和24.49%,平均分析内CV值分别为3.11%、4.41%和10.62%,三次检测结果的分析间CV值为2.40%,平均分析内CV值均低于15%,表明该检测方法有良好的重复性或精密度,符合我国2000版生物制品鉴定标准;灵敏度分析显示,在5个不同稀释频率（10%, 1%,0.1%,0.05%,0.01%）的样品检测中 aAPC-microplate 法与 H-2Kb-Ig/OVA257-264 二聚体流式染色分析法的配对t检验无统计学差异,p=0.3973, Pearson分析的相关系数r=0.998,P<0.01,相关性方程为:Y=0.943X +0.21,aAPC-microplate方法可检测的频率下限低至0.01% - 0.05%,与传统的MHC多聚体染色加流式分析法相似,该灵敏度能满足临床标本检测的需要;3) 3只OT-1鼠脾淋巴细胞经aAPC-microplate检测频率后,分选后的OVA257-264特异性CD8+T细胞群经ConA刺激后分泌IFN-γ的反应活性比分别为43.83%、41.87%和48.99%;同时对3只OT-1鼠脾淋巴细胞用传统ELISPOT方法进行检测,在OVA257-264抗原肽刺激后脾淋巴细胞群中分泌IFN-γ的细胞比例经直线回归方程校正后分别为4.44%、4.01%和4.98%。由于原理和结果表现形式不同,两种方法的活性检测结果不能直接比较;4)在对人群血液标本进行HLA-A/B位点基因分型中,共获得所有频率大于1%的13种HLA-A等位基因型和32种HLA-B等位基因;成功构建和表达13种HLA-A等位基因的重链重组质粒和8种常见HBV抗原表位与β2m轻链的重组质粒;利用在线表位预测数据库预测获得 HLA-A*01:01、A*03:01、A*30:01、A*31:01、A*32:01、A*33:03和A*6801等7种等位基因型限制性的HBV抗原表位肽序列,每种等位基因均获得多个高亲和力的候选表位肽,分别来自HBsAg（P03138）、HBcAg（P03146）、HBpol（P03156）和HBx（P03165）等4种HBV抗原蛋白分子;5) 成功构建和表达HLA-A*0201/HBc18-27、HLA-A*0201/HBs183-191、HLA-A*0203/HBc18-27、HLA-A*0203/HBs183-191、HLA-A*0206/HBc18-27 等五种 HLA-A2/HBVpeptide的SCT分子,分别包被磁珠,制备成5种aAPC-beads,按照1:1的比例混合,制备成 HLA-A2 限制性、HBc18-27和 HBs183-191 表位特异性的 aAPC-microplate;6)用 aAPC-microplate 法和进口 HLA-A2-Ig/HBc18-27/HBs183-19 二聚体流式染色法对 10例HLA-A2阳性慢性乙肝患者、15例HLA-A2阴性慢性乙肝患者和15例HLA-A2阳性健康体检者的PBMC进行检测。配对t检验显示,两种方法对三组临床标本的检测结果均无统计学差异,p值分别为0.0821、0.0529和0.0594; Pearson相关性分析显示,相关系数r=0.980, P<0.01,相关性方程为:Y=0.984X-0.05,两者的吻合度很高;HLA-A2阳性慢乙肝患者外周血中HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+T细胞的频率明显高于两个对照组（0.1957% ± 0.0672% vs. 0.0176% ± 0.0068%,0.1957% ± 0.0672% vs. 0.0249% ± 0.0077%）;7) 10名HLA-A2阳性慢性乙肝患者的PBMC经aAPC-microplate法检测频率后,分选后的HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+T细胞群经PHA刺激后分泌IFN-γ的反应活性比为22.79%± 3.40%;而同时患者PBMC中整体T细胞群经PHA刺激后的反应活性比为36.35% ± 3.58%,明显高于HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+ T细胞群的反应活性。这些结果提示:慢性乙肝患者体内针对乙肝病毒的特异性CD8+T细胞尽管频率高于健康者人群,但是其针对HBV抗原刺激后的活化、增值和分化能力低下。这可能是导致患者感染HBV后慢性转化的重要原因。研究结论:利用自制MHC多聚体建立的aAPC-microplate技术能对OVA257-264抗原特异性CD8+T细胞的数量和功能进行同步检测,具有很好的准确性、特异性、灵敏度、重复性或精密度,可检测的比例下限低至0.01% - 0.05%;利用自制HLA-A2/HBc18-27/HBs183-191 SCT多聚体建立的aAPC-microplate技术能对慢性乙肝患者临床血液标本中的HBc18-27和HBs183-191抗原特异性CD8+ T细胞数量和功能进行同步检测,与传统的MHC多聚体流式染色法检测结果无显着性差异,两者吻合度极高。
许涛,李晓娥,吴优,Khawar Ali Shahzad,王伟,张雷,沈传来[3]（2016）在《利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术制备HLA-A* 0201/HBc18-27单链三分子复合体》文中研究指明目的:构建和表达HLA-A*0201/HBc18-27单链三分子复合体。方法:利用重叠延伸PCR将HBc18-27、（Gly4Ser）3、β2m、（Gly4Ser）4和HLA-A*0201胞外区依次串联为单链三聚体（single-chain trimer,SCT）融合基因,通过同源重组克隆技术插入到pET28a原核表达载体,用异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,采用金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白,通过稀释复性法折叠成HLA-A*0201/HBc18-27的复合单体,并生物素化,将单体包被到直径4.5μm的磁性微球,用构象特异性单抗（W6/32）进行荧光染色,流式细胞术分析其空间构象。结果:pET28a-HLA-A*0201/HBc18-27基因序列和蛋白大小与预测一致;纯化后融合蛋白纯度约93%;流式细胞术分析显示pET28a-HLA-A*0201/HBc18-27单体具有正确的空间构象。结论:利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术成功制备了HLA-A*0201/HBc18-27的单链复合体,无需限制性内切酶和连接酶,发展了主要组织相容性单链复合体技术,有效简化了pMHCⅠ类分子的制备过程。
李晓娥[4]（2016）在《磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞的初步检测》文中研究指明抗原特异性T细胞在机体抗感染、抗肿瘤以及自身免疫性疾病等方面发挥着至关重要的作用,其数量的多少和功能的强弱直接反映了人体特异性细胞免疫的功能状态。所以抗原特异性T淋巴细胞的动态监测在发病机制研究、治疗方案选择和疗效观察以及疫苗效果监测等方面都有着重要的参考价值。近20年来,抗原特异性T细胞的检测方法有了快速发展,从最初的Cr5’释放法、有限稀释法和胞内细胞因子染色法发展到了现在的金标准——pMHC多聚体荧光染色及流式分析法,最具特异性和准确性。但是目前临床上依然很少对患者进行抗原特异性T细胞数量和功能的监测,原因是pMHC多聚体价格昂贵,需要流式细胞仪等特殊仪器；针对各种HLA基因型以及各种病原体抗原、肿瘤抗原或自身抗原的商品化pMHC多聚体非常缺乏,不成系列,难以满足对各种HLA基因型别的患者以及针对特定病原体的多种抗原表位特异性T细胞进行检测的实际需要；不能高通量地同步进行数量和功能的分析等。所以进一步探索操作简便、无需特殊仪器、能同步检测抗原特异性T细胞数量和功能的新方法相当重要。本课题组前期以直径为4.5 μm的磁珠为载体,包被进口的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体制备磁珠式人工抗原提呈细胞（aAPC-beads）,在96孔板中同步检测OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA抗原特异性CD8+T细胞的数量和反应活性,建立了磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板技术（aAPC-microplate）并进行了方法学的评价,证明了该技术在无需特殊仪器条件下的可行性。为了进一步实现该技术的试剂盒化和国产化,本研究首先对pMHC多聚体制备技术进行改进,自制H-2Kb/OVA单链三聚体（SCT）,验证其构象与功能；然后用该蛋白替代进口的昂贵商品制备aAPC-beads,建立aAPC-microplate,同步检测OVA抗原特异性CD8+ T细胞的数量和功能,重新进行方法学论证；最后利用aAPC-microplate技术初步检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量,主要的结果如下：1、首次采用重叠延伸PCR和同源重组技术,无需限制性内切酶和连接酶,成功构建H-2Kb/OVA SCT匡组质粒,原核表达SCT蛋白,镍柱纯化,稀释复性折叠,继而通过链霉亲和素-生物素系统将生物素化的H-2Kb/OVA SCT蛋白包被磁珠,制备成H-2Kb/OVA SCT beads.通过H-2Kb构象特异性单抗荧光染色和流式分析验证了该SCT分子的正确空间构象；以该SCT分子为基础构建H-2Kb/OVA四聚体,流式检测OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA抗原特异性CD8+T细胞的比例,与进口的H-2Kb-Ig/OVA二聚体检测结果相似（38.09% vs.35.32%）,提示其与特异性TCR的有效结合能力。2、利用H-2Kb/OVA SCT beads,在96孔反应板中对OVA抗原特异性CD8+ T细胞进行磁性分选和计数,然后补加ConA培养24h,通过酶联斑点实验检测OVA抗原特异性CD8+ T细胞群中分泌IFN-γ的细胞比例,作为其反应活性比。本实验设置5个细胞接种数量组,每个数量组设置3个复孔,阳性细胞数比例由复孔的平均值表示,并对5个检测数量组的平均比例进行直线回归方程校正。方法学的准确性分析显示：aAPC-beads在不同细胞数量孔中与靶细胞的结合以及在磁场下的分选呈现良好的数量依赖关系和线性关系,R2值均达0.99以上；特异性分析显示：aAPC-microplate分选后,阳性细胞群中OVA抗原特异性CD8+ T细胞的比例为92.35%和86.39%（两次实验结果）；重复性分析显示：在5个检测数量组之间,阳性细胞比例的平均分析内CV值为6.44%和4.01%；对同一份OT-1鼠脾淋巴细胞群进行三次重复实验时,分析间CV值为3.22%,符合生物制品鉴定标准；与经典的pMHC多聚体流式分析法相比：两种方法对5只OT-1鼠的检测结果经配对t检验无统计学差异,p=0.2397,回归分析显示两种检测方法的吻合度有统计学意义,两组结果有显着相关性,相关方程为Y=2.229+0.815X,相关系数r=0.983,P<0.01。反应活性检测结果显示：2只OT-1鼠脾淋巴细胞群经aAPC-microplate分选后,OVA抗原特异性CD8+T细胞群的反应活性比分别为43.83%和41.87%。另外,传统ELISPOT检测OT-1鼠脾淋巴细胞群经OVA抗原肽刺激后分泌IFN-y的细胞比例分别为4.44%和4.01%,远低于aAPC-microplate方法和经典pMHC多聚体流式分析法的检测比例。3、利用课题组前期自制的HLA-A*0201/HBc18-27、A*0201/HBe183-191、A*0203/HBc18-27、 A*0203/HBe183-191和A*0206/HBc18-27五种单链三聚体蛋白,包被磁珠制成五种HLA-A2/HBV beads,利用aAPC-microp late方法对慢性乙肝患者PBMC中HBV抗原特异性CD8+ T细胞进行数量检测。初步结果有：运用流式分析和PCR-SBT方法对20余名慢性乙肝患者进行HLA-A2基因分型,得5例HLA-A2阳性患者。进口HLA-A2/HBV二聚体荧光染色和流式分析显示：HBc18-27和HBe183-191表位特异性CD8+ T细胞比例分别为0.15%、0.08%、0.25%、0.08%和0.28%:aAPC-microplate检测的相应比例为0.10%、0.11%、0.28%、0.10%和0.23%。配对t检验显示两组结果无统计学差异,p=0.9454,相关方程为Y=0.028+0.811X,相关系数r=0.893,P<0.01。本研究首先利用新技术方案自制了H-2Kb/OVA单链三聚体蛋白,具有正确构象与功能；然后用其替代昂贵的进口商品建立aAPC-microplate方法,同步检测OT-1鼠中OVA抗原特异性T细胞数量和功能,完成了方法学论证,提示了技术的可行性；最后利用aAPC-microplale技术初步检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量,结果与经典的进口HLA-A2/HBV多聚体流式分析法无统计学差异。本研究为下一步制备临床试剂盒奠定了基础。
周成城[5]（2013）在《应用二硫键捕获型单链三聚体技术制备PR1-HLA-A*0201四聚体》文中研究说明细胞毒T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes, CTL）是机体抗肿瘤、抗移植物及有效控制各种感染的重要免疫防御效应细胞,定量检测抗原特异性CTL一直是免疫学界努力目标之一。T细胞是通过TCR识别靶细胞或抗原递呈细胞表面MHC分子结合的特异性表位肽复合体,但这种特异性识别亲和力低,迅速发生解离。MHC-I四聚体技术正是基于TCR与抗原肽-MHC-I的特异性相互作用,利用生物素-亲和素结合的原理,在体外将MHC-I分子及其所递呈的抗原肽组装成抗原肽-MHC-I四聚体复合物。MHC-I四聚体复合物增强了MHC-I分子与T细胞受体的亲和力,借助流式细胞技术可以对结合有抗原肽-MHC-I四聚体的T细胞进行检测和分离。但后来发现传统四聚体制备流程复杂,成本高,加之复性效率低,特别是对于与MHC分子低亲和力的抗原肽,极难形成稳定的pMHC-I单体,这些缺陷限制了四聚体技术的应用。MHC-I单链三聚体技术（single chain trimer, SCT）的出现一举解决了上述问题,它是将抗原肽、β2m和MHC-I分子以适当的接头（linker）依次串联而成,只需克隆表达一次,纯化一次,大大简化了制备过程,而且得率较传统四聚体高得多,大大降低了成本。更为重要的是,MHC-I SCT可以使抗原肽与MHC分子的结合更加稳定,本质上是增加了一个再结合的过程,是一个补偿效应,这使得四聚体技术的使用范围扩大至某些与MHC分子较低亲和力的抗原肽。但是,如果抗原肽与SCT的抗原结合槽的结合能力低到一定程度,也会有被取代的危险。出于这方面的考虑,我们对SCT进行了改进,引入“二硫键”,使得抗原肽更牢固地锚定在抗原结合槽内。慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）是一种髓系造血干细胞恶性增生性疾病,目前仍缺乏有效的根治方法,过继性细胞免疫治疗成为了理想的方法。PR1为来自CML相关抗原蛋白酶3的HLA-A*0201限制性9肽（VLQELNVTV）,其诱导的CTLs可杀伤白血病细胞,但对正常骨髓细胞无毒性。本实验改造的PRl-HLA-A*0201-dtSCT四聚体旨在提高PR1特异性CTL的检出率,期望成为CML研究中的有力工具。本研究中,我们首先利用基因工程技术对实验室已有的PRl-HLA-A*0201SCT融合基因载体进行改造,在PR1肽、p2m及HLA*0201以柔性linker依次串联的基础上,运用SOE-PCR的方法将A2分子的“肽C末端结合区”的第84位氨基酸由酪氨酸（Tyr）突变为半胱氨酸（Cys）,同时在linker1中引入一个Cys,两个半胱氨酸残基形成一个二硫键,使抗原肽C末端更好地锚定,确保抗原肽和抗原结合槽的稳固结合。再将改造后的PRl-HLA-A*0201-dtSCT融合基因,克隆到pET22b载体中进行原核表达,通过洗涤包涵体获得大量改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT包涵体蛋白。然后对改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT包涵体蛋白进行纯化、折叠复性、超滤截留,再将其生物素化,根据生物素化效率,按照4.5：1摩尔比和PE标记的链霉亲和素结合,形成一个标记荧光素的PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚体。通过流式检测CML临床标本,发现PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚体在PR1-CTL的检出率上明显优于未改造的PR1-HLA-A*0201-SCT四聚体,并且治疗后的CML病人体内PR1-CTL的频数要比未经过治疗的病人高,两者存在显着性差异。在对PR1-CTL这群特异性细胞的分析中发现存在CD45RO和IFN-γ阳性细胞。
田卫伟[6]（2011）在《WT1抗原多表位基因疫苗设计及免疫原性研究》文中进行了进一步梳理目的WT1（Wilms’tumor gene 1）是最早发现与Wilms’肿瘤发生发展有关的基因,在成人仅在少量的正常组织表达,但在各型白血病、骨髓异常增生综合征及多种实体瘤呈高表达,并与疾病的不良预后有相关性。反义寡核苷酸抑制WT1表达,致使白血病细胞及实体瘤细胞生长停止,以及WT1能诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）反应均提示WT1可作为广谱性免疫治疗的理想靶原。迄今,基于WT1的表位肽疫苗已进入临床试验,并初见成效。然而目前研究者多采用单一CTL表位的疫苗,难免免疫原性差,且由于T细胞介导的免疫应答受主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）限制性,某一WT1的表位疫苗可能仅仅适用于少部分人类白细胞抗原（human leukocytes antigen,HLA）相合的患者,因此该疫苗的应用受到限制。构建多表位WT1的核酸疫苗可以弥补上述缺点,其优越性表现为:①内源性表位提呈可避免表位肽的降解,产生持久的细胞和体液免疫应答;②同时构建WT1的多个优势表位或受不同HLA限制性的表位,可有效应防止免疫逃逸和突破HLA限制;③同时构建WT1辅助性T细胞（helper T cell,Th）表位,其激发的CD4+T细胞,不仅可以更有效的激发和维持CTL免疫应答,而且可以产生特异性的抗肿瘤应答[1] ;④易于设计和构建,且制备和贮存方便。此外,根据具体需要,可以将免疫调节因子构建于载体使其共表达,诱导产生最适免疫应答。因此,多表位基因疫苗在WT1抗原免疫治疗中具有广泛应用前景。基因佐剂是提高基因疫苗免疫效果的有效手段,研究表明,结核分枝杆菌热休克蛋白HSP70（mHSP70）是良好的免疫佐剂,其羧基端HSP70359-610是其有效佐剂部位,可与CD40分子结合,通过p38信号通路诱导DC的成熟和极化Th1反应。而HSP70407-426是位于mHSP70多肽结合区p359-610的一个刺激表位,选择该区域能比HSP70更显着的刺激DCs成熟,且这种作用不会被HSP70抑制表位p457-496所抑制[2]。因此,mHSP70407-426作为天然免疫佐剂在基因疫苗开发中具有潜在应用价值。经查阅文献,目前国内外尚未见有WT1多表位基因疫苗的报道,本文拟利用基因工程的方法将WT1多个CTL和Th细胞表位克隆至真核表达质粒pcDNA3.1中,构建WT1抗原多表位基因疫苗pcDNA-WT1。为获得更好的免疫效果,同时以mHSP70的刺激表位p407-426作为免疫佐剂,尝试构建WT1多表位与热休克蛋白70刺激表位融合基因疫苗pcDNA-WT1-HSP70407-426,并探讨WT1抗原多表位基因疫苗及融合基因疫苗在小鼠诱导免疫应答的能力,研究其对荷瘤小鼠的抑瘤效应。此外,利用pcDNA-WT1-HSP70407-426转染的HLA-A*0201+外周血单个核细胞（PBMC）诱导自身淋巴细胞产生CTL,通过乳酸脱氢酶释放法检测HLA-A*0201+限制性的CTL反应。方法1 WT1多表位盒的设计与合成本研究在收集已发表WT1表位的基础上,筛选具有良好免疫原性的WT1 CTL与Th表位进行表位盒组建,并采用理论结合软件模拟的方法,通过蛋白酶体切割软件（PAProC和NetChop）和DNA疫苗在线预测工具（DyNAVacS）优化表位盒构成后进行人工合成。2 WT1多表位基因疫苗的设计与构建2.1质粒构建将WT1多表位片段插入T载体构建质粒pUC57-WT1,经测序验证后,进行酶切获得WT1多表位片段,然后将该片段克隆至真核表达质粒pcDNA3.1中,构建重组质粒pcDNA-WT1; PCR扩增pGEM-mHSP70质粒HSP70中刺激表位片段p407-426,插入真核表达质粒pcDNA3.1,构建质粒pcDNA-HSP70407-426;将上述获得的WT1多表位片段酶切插入质粒pcDNA-HSP70407-426刺激表位的上游,构建质粒pcDNA-WT1-HSP70407-426。上述质粒经酶切、PCR和测序鉴定。2.2转染293T和Hela细胞脂质体介导法瞬时转染293T细胞和Hela细胞,同时共转染pcDNA-EGFP荧光质粒,激光共聚焦显微镜下观察转染效果。2.3 RT-PCR和Westernblot验证转染293T和Hela细胞48小时后,提取293T细胞总RNA,RT-PCR检测多表位WT1和融合基因片段的表达;提取Hela细胞蛋白,Western blot法检测WT1相应功能蛋白的表达。3 WT1多表位基因疫苗的免疫原性研究3.1动物免疫C57BL/6雄性4-6周龄小鼠25只,随机分为5组,即PBS对照组、空质粒对照组、pcDNA- HSP70407-426对照组、pcDNA-WT1实验组和pcDNA-WT1-HSP70407-426实验组,每组5只。每只小鼠分别于0.25%盐酸布比卡因预处理双侧股四头肌48h后,注射质粒共50μg。每间隔2周注射一次,共免疫3次。最后一次免疫后10天,分离小鼠脾脏淋巴细胞。3.2免疫指标检测分离小鼠脾脏淋巴细胞后,通过MTT法检测小鼠T淋巴细胞增殖、流式细胞仪检测CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群、ELISPOT法检测WT1特异性的IFN-γ分泌频数和LDH法检测杀伤性T淋巴细胞（CTL）功能。3.3疫苗对肿瘤的治疗作用4-6周龄C57BL/6小鼠25只,每组5只,分别在左前肢皮下接种高表达WT1的FBL3细胞（2x106/只）。7d后,小鼠肌肉接种DNA疫苗,注射质粒共50μg,对照组注射PBS、空质粒和pcDNA- HSP70407-426。14d后加强免疫一次。待可触及肿瘤后,测量肿瘤体积,记录小鼠生存活动情况和存活率。3.4 HLA-A*0201限制性CTL反应分离健康HLA-A*0201患者外周血单个核细胞（PBMC）,将其中一部分转染pcDNA-WT1-HSP70407-426后,与未转染部分做混合淋巴细胞培养诱导自身淋巴细胞产生CTL,通过通过乳酸脱氢酶释放法检测HLA-A*0201限制性的CTL反应。结果1 WT1多表位盒的设计与合成1.1表位肽的选取选择的WT1表位除能诱发良好的CTL或/和Th反应外,需尽量能与更多MHC分子结合。被选取的CTL表位有:WT1.37（VLDFAPPGA;HLA-A*0201）、WT1.187（SLGEQQYSV;HLA-A*0201/HLA-A*0206）和WT1.235（CMWNQMNL;HLA-A*0201/HLA-A*2402）,Th表位有:WT1.121A（SGQAYMFPNAPYLPSCLES;HLA-DRB1*0401）和WT1.332（KRYFKLSHLQMHSRKH;HLA-DRB1*0405/HLA-DRB1*1501/HLA-DRB1*1502/HLA-DPB1*0901）,其中WT1.121A中隐藏CTL表位WT1.126m（下划线,HLA-A*0201/H2Db）,此外,为了使构建的表位能更好的突破MHC限制性,同时构建了通用Th表位PADRE（KFVAAWTLKAAA）。1.2表位盒的优化与合成为了使构建的表位能够发挥各自独立的功能,不同的CTL表位之间加入蛋白酶体切割喜好位点如AAY、KK、KAA、KAAA、AAA和NAAA,并根据蛋白酶体切割预测软件PAProC和NetChop优化各表位间间隔序列。不同的Th表位采用柔性连接表位“GPGPG”进行连接。在此基础上加入内质网信号引导序列IgK以促进蛋白分泌,并加入包含ATG启动信号和KOZAK序列,以引导正确的翻译。通过在线预测工具DyNAVacS将得到的核苷酸序列按照真核偏爱密码子进行优化,之后人工合成,最终获得理论上具有良好功能的WT1表位盒。2 WT1多表位基因疫苗的设计与构建2.1质粒构建经酶切、PCR和测序鉴定,pcDNA-WT1、pcDNA-HSP70407-426和pcDNA-WT1-HSP -70407-426构建成功。2.2脂质体转染重组质粒转染细胞24小时后,观察绿色荧光蛋白表达,结果未转染的对照细胞无荧光出现,而转染重质粒的细胞有荧光出现,表明重组质粒能够在真核细胞中成功表达。2.3 RT-PCR和Westernblot验证提取转有质粒pcDNA-WT1、pcDNA-HSP70407-426和pcDNA-WT1-HSP70407-426的293T细胞总RNA,经RT-PCR扩增得到WT1和HSP70407-426各基因片段,证实经质粒载体携带的基因及重组基因均已在真核生物中得到正确转录;提取转染有pcDNA-WT1-HSP70407-426质粒的Hela细胞总蛋白,WT1作为一抗,Western blot检测结果表明,重组质粒在相对分子质量约29 000KD处有一特异性的蛋白反应带,与预期大小一致。3 WT1多表位基因疫苗的免疫原性研究3.1免疫指标检测免疫小鼠后实验结果显示:①特异性T淋巴细胞增殖实验:pcDNA-WT1免疫组和pcDNA-WT1- HSP70407-426免疫组刺激指数同PBS、空质粒和pcDNA- HSP70407-426各对照组相比显着升高（P<0.01）,但两组间无明显差异（P>0.05）;②CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群:pcDNA-WT1免疫组和pcDNA-WT1-HSP70407-426免疫组CD4+、CD8+T淋巴细胞数和CD4+/CD8+比值均显着高于PBS、空质粒和pcDNA- HSP70407-426各对照组（p<0.01）,但两组之间无明显差异（p>0.05）;③WT1特异性的IFN-γ分泌频数:4条CTL表位肽混合物刺激各组脾脏淋巴细胞,ELISPOT检测结果显示,pcDNA-WT1免疫组和pcDNA-WT1-HSP70407-426免疫组脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数较PBS、空质粒和pcDNA- HSP70407-426各对照组显着增多（p<0.01）,但两组间无显着差异（p>0.05）;同时予4条CTL表位肽分别刺激pcDNA-WT1免疫组各小鼠脾脏淋巴细胞,均可检测到脾淋巴细胞特异性IFN-γ分泌,其中经WT1.235和WT1.126m多肽刺激组可检测到高水平的IFN-γ分泌,而经WT1.37或WT1.187多肽刺激组IFN-γ分泌水平较低,4组IFN-γ分泌水平均低于混合多肽刺激组（p<0.01）。④特异性杀伤实验显示:pcDNA-WT1免疫组和pcDNA-WT1- HSP70407-426组免疫的CTL杀伤活性高于PBS对照组、空质粒组和pcDNA- HSP70407-426组（p<0.01）,同样两组之间无明显差异（p>0.05）。3.2疫苗对肿瘤的治疗作用pcDNA-WT1免疫组和pcDNA-WT1-HSP70407-426免疫组接种的FBL3肿瘤体积显着小于PBS对照组、空质粒对照组和pcDNA- HSP70407-426对照组（p<0.01）,荷瘤小鼠生存期显着大于对照组（p<0.01）。3.3 HLA-A*0201限制性CTL反应pcDNA-WT1- HSP70407-426转染的PBMC能有效诱导自身淋巴细胞产生CTL,细胞杀伤实验显示其能特异杀伤高表达WT1的肿瘤细胞并具有HLA-A*0201限制性。结论1在收集WT1表位的基础上,采用理论结合软件模拟的方法成功构建了WT1表位盒。2成功构建了WT1多表位基因疫苗pcDNA-WT1和融合基因疫苗pcDNA-WT1- HSP70407-426。3构建的WT1多表位基因疫苗pcDNA-WT1能够有效诱导小鼠特异性免疫应答。4多表位基因疫苗pcDNA-WT1在小鼠体内具有抗瘤效应。5以mHSP70407-426作为免疫佐剂构建的融合基因疫苗pcDNA-WT1- HSP70407-426,与基因疫苗pcDNA-WT1相比,诱导的免疫应答及抑瘤效应无明显差别。6 WT1各CTL表位可以在多表位的模式下发挥各自功能。7 pcDNA-WT1-HSP70407-426转染HLA-A*0201+PBMC能有效诱导自身淋巴细胞产生CTL,该CTL能特异杀伤高表达WT1抗原的肿瘤细胞,并受HLA限制性。
李佳楠,董元火[7]（2010）在《小鼠H-2Db-BSP融合基因的构建与表达》文中指出目的:构建小鼠H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌中表达.方法:采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠淋巴细胞中扩增出H-2Db链的胞外段基因,经双酶切置换已构建的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列,使H-2Db与BirA酶底物肽（BSP）序列融合,构建H-2Db-BSP融合基因表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导融合蛋白表达.结果:构建的H-2Db-BSP融合基因插入正确且序列与GenBank一致;经1mmol/L浓度的IPTG诱导后4h蛋白表达达到高峰,且融合蛋白以包涵体形式存在.结论:成功构建H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步构建H-2Db四聚体,研究T细胞应答提供了物质基础.
赵艳霞[8]（2010）在《新型PR1-HLA-A*0201-SCT四聚体的制备及初步鉴定》文中研究指明MHCⅠ四聚体（major histocompatibility complexⅠtetramer）可以对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）进行检测和筛选,是了解机体细胞免疫功能、探索疾病机理和评价特异性免疫疗法的重要工具之一。由于具有敏感、特异、高效、对细胞无损伤等优点,MHCⅠtetramer技术一诞生就成为CTLs定量检测的金标准。但是传统MHCⅠ四聚体制备流程繁琐,蛋白复性时需要MHCⅠ及β2-microglobulin（β2m）两条肽链及抗原肽同时正确折叠,复性效率很低,对抗原肽的亲和力要求也高,亲和力低的抗原肽很难形成稳定的四聚体。由于存在上述不足,限制了MHCⅠtetramer技术的大规模应用,许多学者都试图对该技术进行改进。单链三聚体（single chain trimer, SCT）是将抗原肽、β2m和MHCⅠ分子以适当的接头（linker）依次串联而成,是对传统四聚体技术的重大改进,更有利于抗原特异性CTLs的检测。慢性髓细胞样白血病（Chronic myeloid leukemia, CML）是一种起源于造血干细胞的恶性增生性疾病。PR1为来自CML相关抗原蛋白酶3的HLA-A*0201限制性9肽（VLQELNVTV）,其诱导的CTLs可杀伤白血病细胞,但对正常骨髓细胞无毒性。本研究的目的是制备HLA-A*0201限制性的PR1-HLA-A*0201-SCT（以下简称PR1-SCT）四聚体,以联合流式细胞技术对PR1特异性CTLs进行研究,为CML的过继细胞免疫治疗奠定基础。本研究中,我们首先利用基因工程技术将PR1肽、β2m及HLA-A*0201以（G4S）n柔性linker依次串联,构建PR1-SCT融合基因,再克隆至pQE31载体中进行原核表达,通过洗涤包涵体获得大量PR1-SCT包涵体蛋白。接着我们利用pQE31载体中的6×His tag对PR1-SCT包涵体蛋白进行纯化,通过稀释复性使其恢复天然构象。通过在复性体系中引入2 mol/L尿素,大大提高了复性效率。我们进一步对复性的PR1-SCT蛋白进行生物素化,并根据生物素化效率,与PE标记的链霉亲和素按适当比率混合,制成新型PR1-SCT四聚体,并对其进行了初步鉴定,期望能为CML的临床和基础研究提供有力工具。
刘静[9]（2009）在《体外诱生PR1特异性细胞毒性T细胞的实验研究》文中指出慢性髓细胞性白血病（Chronic myeloid leukemia, CML）是一种起源于造血干细胞的恶性增生性疾病,目前仍缺乏有效的治疗方法,复发的根源是白血病微小残余病变（minimal residue disease, MRD）。利用T细胞进行过继性免疫治疗,是治疗病毒感染性疾病和肿瘤的理想方法,但是用于治疗的T细胞的特异性、亲和性、分化水平和数量等限制了其应用,如何获得特异、高效、一定数量的T细胞是目前亟待解决的问题。采用T细胞受体（T cell receptor TCR）基因转染的方法,将特异性高亲和力TCR转移到受体的T细胞中,可以特异性杀伤受体体内的肿瘤细胞。蛋白酶3是与人中性粒细胞颗粒形成相关的分化抗原,髓性白血病患者体内原始低分化的髓系白血病细胞持续高表达蛋白酶3,提示蛋白酶3是髓性白血病相关性抗原。PR1为来自蛋白酶3的HLA-A2限制性的9肽,其序列VLQELNVTV。PR1限制性CTL细胞可杀伤髓性白血病细胞,而且其杀伤毒性与白血病细胞内蛋白酶3的表达量明显相关,但对正常骨髓细胞无毒性。本研究的目的是制备可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体,优化PR1肽刺激产生的高亲和力T细胞条件,联合四聚体技术和流式细胞技术筛选PR1特异性高亲和力T细胞,为慢性髓细胞性白血病的过继治疗清除白血病微小残余病变奠定基础。一、可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体的制备本室在前期工作中已成功构建重链pQE31-HLA-A2-BSP和轻链pQE31-β2m,二者均可以在M15菌株中大量表达。将诱导、洗涤包涵体获得的重链、轻链蛋白与PR1肽以一定的比例加入折叠缓冲液中进行稀释复性,形成HLA-A*0201/肽复合物单体。用HLA-I构象特异性的W6/32单抗为一抗,间接ELISA法检测复性前后HLA-A*0201/抗原肽单体。然后,将复性后单体经Sephacryl-S300柱层析纯化,利用分子筛原理收集HLA-A*0201/肽复合物单体所在峰。以BirA酶作用于融合在HLA-A*0201蛋白C端BSP中的赖氨酸残基,使HLA-A*0201/肽复合物单体生物素化,再次经Sephacryl-S300柱层析纯化。生物素化的HLA-A*0201/肽复合物单体与荧光素（phycoerythrin或allophycocyanine）标记的链霉亲和素（含4个生物素化位点）按4∶1的比例结合,形成可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体。本实验成功地获得了可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体,为标记抗原特异性T细胞,进一步筛选研究CML相关的PR1特异性T细胞提供重要工具。二、体外诱生PR1特异性细胞毒性T细胞的研究首先,我们制备加载PR1抗原肽的T2细胞作为刺激细胞,体外刺激人外周血淋巴细胞（PBL）,用可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体检测PR1特异性细胞毒性T细胞,结果表明HLA-A*0201 /PR1四聚体具有PR1肽表位特异性,可以采用流式细胞分析技术体外分析或分选PR1特异性细胞毒T细胞。然后,用加载不同浓度PR1肽的T2细胞刺激HLA-A*0201阳性的正常人外周血淋巴细胞,进一步优化加载抗原量、刺激时间、刺激细胞与反应细胞比例等。实验发现当PR1肽加载浓度为0.5μmol/L和5μmol/L、刺激时间为21天、刺激细胞与反应细胞比例为1:10时,所获得的PR1特异性高亲和力CTLs比较多。用LDH释放实验对诱生PR1特异性细胞毒T细胞的功能进行初步验证,结果发现经体外诱生PBL特异性杀伤加载PR1肽T2靶细胞的能力明显增强,表明体外诱生的PR1特异性细胞毒T细胞具有特异性细胞毒杀伤能力。本实验为慢性髓细胞性白血病过继性免疫治疗奠定了基础。
钱亚云[10]（2008）在《可溶性HLA-A*0201/CAP-1四聚体的构建及其在结直肠癌研究中的初步应用》文中认为癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是一种高度糖基化、分子量为180 kDa的肿瘤相关抗原,在90%以上的结直肠癌以及许多肿瘤中高表达,在正常成人结肠上皮及其它内胚层来源的组织中呈低表达。有研究表明,联合应用CEA蛋白和佐剂、CEA多肽、抗CEA独特性抗体以及以CEA为基础的重组痘病毒疫苗均可诱导出CEA特异性CTLs。然而,作为自身蛋白及其所具有的免疫耐受性,CEA的免疫原性比较低,使得HLA/肽复合物与CTLs的亲和性比较低,找到高亲和力的CTLs就成为当今肿瘤免疫研究的热点之一。因此,我们选择CEA作为免疫治疗的“靶点”,考虑到HLA-A*0201等位基因在约50%的人群中表达及其与HLA-A*0201位点结合的CEA分子的多肽CAP-1被确认,故选择HLA-A*0201+ CEA+的结直肠癌患者作为研究对象。主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）编码的Ⅰ类分子分布在所有有核细胞表面,将细胞内经过加工的肽段提呈到细胞表面,激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）,在抗感染、抗肿瘤和自身免疫反应中起着重要作用。定量分析抗原特异性CTLs能为研究特异性免疫应答的发生、发展过程提供重要的信息。传统的定量CTLs的方法如51Cr释放实验、有限稀释法（limited dilution assays,LDA）等需要体外培养淋巴细胞,费时费力,敏感性低。可溶性HLA/肽四聚体具有敏感、特异和高效等特点,不仅能够直接计数抗原特异性CTLs,还能对其进行表型和功能分析,大大推进了抗原特异性CTLs的研究。本课题应用基因工程技术制备可溶性HLA-A*0201/FLUmp四聚体和HLA-A*0201/CAP-1四聚体。利用可溶性HLA-A*0201/FLUmp四聚体,进行生物学活性实验和检测抗原特异性CTLs条件的优化,寻求可溶性HLA-A*0201/肽四聚体检测的标记顺序和最适浓度、温度,进而运用可溶性HLA-A*0201/ CAP-1四聚体检测结直肠癌患者体内CEA抗原特异性CTLs的频率,为进一步分析CEA抗原特异性CTLs的表型和功能提供重要的研究工具,为研究CTLs在结直肠癌发生、转归中的确切作用机制奠定物质基础。本研究分为三部分内容。第一部分可溶性HLA-A*0201/CAP-1四聚体的构建目的:可溶性HLA/肽四聚体能够直接计数抗原特异性CTLs,还能对其进行表型和功能方面的分析,大大推进了抗原特异性CTLs的研究。为了检测CEA特异性CTLs,我们制备了可溶性HLA-A*0201/FLUmp四聚体和HLA-A*0201/CAP-1四聚体。方法:首先,应用基因工程技术表达和纯化可溶性HLA-A*0201重链和β2m轻链。利用RT-PCR技术分别从THP1细胞和U937细胞中扩增出HLA-A*0201细胞膜外部分和去除信号肽部分的β2m基因;以RT-PCR产物为模板,利用PCR方法将含有可供生物素化识别位点的15个氨基酸残基序列（substrate peptide for BirA-dependent biotinylation, BSP）和甘氨酸-丝氨酸接头的序列拼接在HLA-A*0201胞外区的COOH端。分别将HLA-A*0201-BSP和β2m基因克隆入pQE31表达载体进行原核表达并纯化蛋白。接着,将纯化好的HLA-A*0201-BSP融合蛋白、β2m以及特异性肽（CAP-1/ FLUmp）在氧化-还原谷胱甘肽系统中复性,形成HLA-A*0201/肽复合物单体。用HLA-I类分子构象特异性的W6/32单抗为一抗,间接ELISA法检测复性前后HLA-A*0201/抗原肽单体。然后,将复性后单体经Sephacryl-300柱层析纯化,利用分子筛原理收集HLA-A*0201/肽复合物单体所在峰。以BirA酶作用于融合在HLA-A*0201蛋白C端BSP中的赖氨酸残基,使HLA-A*0201/肽复合物单体生物素化,再次经Sephacryl-300柱层析纯化。生物素化的HLA-A*0201/肽复合物单体与藻红蛋白标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成四聚体。结果:酶切鉴定和测序结果表明获得pQE31-HLA-A*0201-BSP重链表达载体和pQE31-β2m轻链表达载体。诱导表达产物经SDS-PAGE电泳分析,分别在大约34 kDa和12 kDa处有一新生带,与预期结果相符。可溶性分析显示HLA-A*0201-BSP和β2m主要以包涵体的形式存在。蛋白表达的最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG于37℃诱导过夜。用洗涤包涵体的方法可获得大量蛋白,纯度达95%左右。Western blot鉴定HLA-A*0201-BSP的免疫学性质,杂交结果显示诱导菌体泳道中对应34 kDa分子量处有一条较强的杂交带,而未诱导菌体泳道没有此杂交带。将纯化好的HLA-A*0201-BSP融合蛋白、β2m以及特异性肽（CAP-1或FLUmp）在氧化-还原谷胱甘肽系统中复性,形成HLA-A*0201/肽复合物单体。W6/32单抗能特异性结合复性后的HLA-A*0201/CAP-1单体,并存在量效关系。HLA-A*0201-肽复合物单体经Sephacryl-300柱层析纯化后,用BirA酶使HLA-A*0201/肽复合物单体生物素化,并再次经Sephacryl-300柱层析纯化。生物素化的HLA-A*0201/肽复合物单体与藻红蛋白标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成四聚体。结论:获得pQE31-HLA-A*0201-BSP重链表达载体和pQE31-β2m轻链表达载体。经洗涤包涵体获得大量高纯度重、轻链蛋白。稀释法复性获得HLA-A*0201/FLUmp单体和HLA-A*0201/CAP-1单体并获得相应可溶性四聚体。第二部分可溶性HLA-A*0201/肽四聚体的生物学活性验证以及抗原特异性CTLs检测条件的优化目的:验证可溶性HLA-A*0201/肽四聚体的生物学活性以及优化检测抗原特异性CTLs的条件。方法:用1μg HLA-A*0201/FLUmp四聚体和2μl anti-CD8-FITC单抗,标记HLA-A*0201+健康志愿者外周血单个核细胞（PBMC）,比较标记物加入顺序的不同对特异性CTLs检测的影响,选择标记四聚体的最佳浓度和温度。在此基础上,分离HLA-A*0201+健康志愿者PBMC,与1μg HLA-A*0201/FLUmp四聚体25℃避光孵育1 h后,加入2μl anti-CD8-FITC单抗室温避光孵育1 h,经PBS洗涤、1%多聚甲醛固定,流式细胞仪检测流感病毒特异性CTLs的频率。为验证四聚体的稳定性,7 d后在相同的条件下重复本实验,共重复三次。结果:先标记anti-CD8-FITC单抗可阻断四聚体与抗原特异性CTLs的结合,而按四聚体、anti-CD8-FITC单抗的标记顺序,则不会影响四聚体与抗原特异性CTLs的结合。浓度为1μg的四聚体与特异性CTLs的亲和性最高,所检测到的双阳性细胞占总CD8+细胞数的3.8%。25℃标记时检测到的抗原特异性CTLs的频率略低,占总CD8+细胞数的0.9%,但其特异性较好。按照上述优化条件,流式细胞仪检测HLA-A*0201+健康志愿者外周血PBMC中流感病毒FLUmp特异性CTLs的频率。三次检测抗原特异性CTLs的频率分别占总CD8+细胞数的1.3%、1.6%和1.2%,说明所制备的可溶性四聚体具有比较稳定的生物学功能。结论:可溶性四聚体检测抗原特异性CTLs条件的优化,为抗原特异性CTLs的后续研究打下了坚实的基础。第三部分HLA-A*0201/CAP-1四聚体在结直肠癌研究中的初步应用目的:应用HLA-A*0201/CAP-1四聚体,对HLA-A*0201+正常人外周血淋巴细胞和HLA-A*0201+CEA+结直肠癌患者的外周血及癌旁肠系膜引流淋巴结的淋巴细胞进行染色,流式细胞仪分析HLA-A*0201限制的、CEA特异的CTLs的数量。方法:分离健康人（18例）PBMC和结直肠癌（23例）患者PBMC以及癌旁肠系膜引流淋巴结的淋巴细胞,以流式细胞仪检测PBMC表达HLA-A*0201的情况,用HLA-A*0201/CAP-1或HLA-A*0201/FLUmp四聚体检测CAP-1和FLUmp特异性CTLs的频率。结果:在25例HLA-A*0201+个体中,结直肠癌组和正常组外周血单个核细胞中HLA-A*0201/FLU四聚体+CD8+细胞的频率分别为0.671±0.421%和0.564±0.408%,两组之间无显着差异（P=0.525）。结直肠癌组和正常组外周血单个核细胞中HLA-A*0201/CAP-1四聚体+CD8+细胞的频率分别为2.409±2.385%和0.020±0.021%,两组之间有显着差异（P=0.008）。HLA-A*0201+结直肠癌患者外周血和无肿瘤细胞转移的淋巴结内淋巴细胞中HLA-A*0201/CAP-1四聚体+CD8+细胞频率分别为2.409±2.385%和2.685±2.332%,两组之间无显着差异（P>0.05）。结论:HLA-A*0201+结直肠癌患者PBMC和无肿瘤细胞转移的淋巴结中HLA-A*0201/CAP-1四聚体+CD8+细胞的频率升高,说明CEA特异性CTLs在结直肠癌患者的免疫监视功能中具有重要的作用。对存在针对肿瘤抗原的特异性CTLs却无法阻止肿瘤形成的具体机制需要更加深入的研究。
二、HLA-A*0201/BSP融合基因的构建与表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HLA-A*0201/BSP融合基因的构建与表达（论文提纲范文）
（1）基于深度学习的肿瘤新生抗原预测方法研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写、符号清单、术语表 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 多肽与MHC分子相互作用及其复合物pMHC免疫原性的预测方法研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 数据收集 |
| 2.2.2 模型训练 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 氨基酸表征方式和深度学习模型的选择 |
| 2.3.2 模型的框架 |
| 2.3.3 不平衡数据的处理 |
| 2.3.4 模型性能的评估 |
| 2.3.5 模型在临床样本中的预测效果 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 TCR与pMHC相互作用的预测方法研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 数据收集 |
| 3.2.2 模型训练 |
| 3.2.3 TCR-pMHC相互作用的亲和力鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 pMHC结合TCR的序列特征分析 |
| 3.3.2 A0201_GILGFVFTL限制性模型指导TCR亲和力优化 |
| 3.3.3 MHC分型限制性pMHC结合TCR的序列分析 |
| 3.3.4 HLA-A02:01分型限制性模型应用 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 肿瘤新生抗原预测方法的应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 数据收集 |
| 4.2.2 软件工具 |
| 4.2.3 网络在线工具和数据库的的构建方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 一站式肿瘤新生抗原预测软件TSNAD V2.0的构建 |
| 4.3.2 TCGA大规模样本肿瘤新生抗原预测分析 |
| 4.3.3 肿瘤新生抗原数据库的构建 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 总结与展望 |
| 主要创新点及不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 肿瘤新生抗原研究进展 |
| 肿瘤新生抗原在肿瘤免疫治疗的应用 |
| 肿瘤新生抗原的鉴定方法 |
| 肿瘤新生抗原体内生理过程的研究 |
| 肿瘤新生抗原研究相关资源 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间主要研究成果 |
（2）磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要英文缩写词 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 基于自制关键试剂的aAPC-microplate技术同步检测AST细胞数量和反应活性的方法学论证 |
| 前言 |
| 第一节 H-2K~b/OVA_(257-264)单链三聚体分子的构建、表达与验证 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 利用aAPC-m icroplate同步检测对OVA_(257-264)抗原特异性T细胞的数量和反应活性 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 HLA-1类等位基因的筛选和重组质粒构建以及HBV特异性抗原表位肽的预测 |
| 前言 |
| 第一节 HLA-A、-B等位基因分型与筛选 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 HLA-A等位基因重链与轻链重组质粒的构建与表达 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三节 HLA-A分子限制性HBV抗原表位肽的预测 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 利用aAPC-microplate技术同步检测HBV抗原特异性T细胞的数量和反应活性 |
| 前言 |
| 第一节 HLA-A2/HBc_(18-27)/HBs_(183-191)单链三聚体的构建、表达与验证 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 aAPC-microplate技术对HBV抗原特异性T细胞数量和功能检测 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术制备HLA-A* 0201/HBc18-27单链三分子复合体（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 HLA-A*0201/HBc18-27SCT融合基因的构建 |
| 1.4 p ET28a-HLA-A*0201/HBc18-27表达载体的构建 |
| 1.5 HLA-A*0201/HBc18-27单链重组蛋白的表达与纯化 |
| 1.6 HLA-A*0201/HBc18-27复合物单体的复性折叠 |
| 1.7 HLA-A*0201/HBc18-27复合物单体构象的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 HLA-A*0201/HBc18-27SCT融合基因的扩增与重组质粒的构建 |
| 2.2 HLA-A*0201/HBc18-27单链重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 HLA-A*0201/HBc18-27复合体构象鉴定 |
| 3 讨论 |
（4）磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞的初步检测（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写词 |
| 前言 |
| 文献综述 基于pMHC复合体的抗原特异性T细胞检测技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一节 H-2K~b/OVA单链三聚体分子的构建、表达与验证 |
| 引言 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 aAPC-microplate技术对OVA抗原特异性T细胞数量和功能的同步检测 |
| 引言 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三节 aAPC-microplate技术初步检测HBV抗原特异性T细胞的数量 |
| 引言 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）应用二硫键捕获型单链三聚体技术制备PR1-HLA-A*0201四聚体（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PR1-HLA-A~*0201二硫键捕获型单链三聚体原核表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 PR1-HLA-A~*0201 dtSCT四聚体的制备及初步鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 PR1-HLA-A~*0201-dtSCT四聚体检测Cml患者特异性CTL |
| 1 材料和仪器 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）WT1抗原多表位基因疫苗设计及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 WT1功能表位筛选与表位盒设计 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 WT1多表位重组基因疫苗的设计与构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 WT1多表位基因疫苗的免疫原性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（7）小鼠H-2Db-BSP融合基因的构建与表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 H-2Db-BSP融合基因的构建及鉴定 |
| 1.2.2 H-2Db-BSP融合基因的诱导表达8 |
| 1.2.3 H-2Db-BSP融合蛋白的细胞定位及分离纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 H-2Db-BSP融合基因表达载体的构建、筛选及鉴定 |
| 2.2 H-2Db-BSP融合蛋白的诱导表达及分离纯化 |
| 3 讨论 |
（8）新型PR1-HLA-A*0201-SCT四聚体的制备及初步鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建pQE31-PR1-HLA-A*0201-SCT 原核表达载体 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PR1-HLA-A*0201-SCT 融合蛋白的表达、纯化及复性 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 新型PR1-HLA-A*0201-SCT 四聚体的制备及初步鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 讨论与结语 |
| 1 讨论 |
| 2 结语 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
（9）体外诱生PR1特异性细胞毒性T细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 符号说明 |
| 第一部分 可溶性 HLA-A*0201/PR1 四聚体的制备 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体外诱生 PR1 特异性细胞毒性 T 细胞的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）可溶性HLA-A*0201/CAP-1四聚体的构建及其在结直肠癌研究中的初步应用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 可溶性HLA-A*0201/CAP-1 四聚体的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 可溶性HLA-A*0201/肽四聚体的生物学活性验证以及检测抗原特异性CTLs 的条件优化 |
| 1 材料 |
| 2 主要实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HLA-A*0201/CAP-1 四聚体在结直肠癌研究中的初步应用 |
| 1 材料 |
| 2 主要实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间完成的论文 |
四、HLA-A*0201/BSP融合基因的构建与表达（论文参考文献）
- [1]基于深度学习的肿瘤新生抗原预测方法研究[D]. 吴静成. 浙江大学, 2021(01)
- [2]磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测[D]. 许涛. 东南大学, 2017(02)
- [3]利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术制备HLA-A* 0201/HBc18-27单链三分子复合体[J]. 许涛,李晓娥,吴优,Khawar Ali Shahzad,王伟,张雷,沈传来. 东南大学学报(医学版), 2016(06)
- [4]磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞的初步检测[D]. 李晓娥. 东南大学, 2016(03)
- [5]应用二硫键捕获型单链三聚体技术制备PR1-HLA-A*0201四聚体[D]. 周成城. 扬州大学, 2013(04)
- [6]WT1抗原多表位基因疫苗设计及免疫原性研究[D]. 田卫伟. 山西医科大学, 2011(08)
- [7]小鼠H-2Db-BSP融合基因的构建与表达[J]. 李佳楠,董元火. 江汉大学学报(自然科学版), 2010(03)
- [8]新型PR1-HLA-A*0201-SCT四聚体的制备及初步鉴定[D]. 赵艳霞. 扬州大学, 2010(02)
- [9]体外诱生PR1特异性细胞毒性T细胞的实验研究[D]. 刘静. 扬州大学, 2009(01)
- [10]可溶性HLA-A*0201/CAP-1四聚体的构建及其在结直肠癌研究中的初步应用[D]. 钱亚云. 扬州大学, 2008(01)