一、膀胱移行上皮癌组织端粒酶活性的检测及意义（论文文献综述）
段宇奇[1]（2021）在《尿液NMP22、BLCA-4在膀胱癌诊断中的应用效果分析》文中研究指明
康维亭[2]（2021）在《长链非编码RNA PlncRNA-1通过启动子区的低甲基化调控miRNA-136-5p/Smad3轴促进膀胱癌进展的机制研究》文中进行了进一步梳理1.研究背景膀胱癌（bladdercancer,BC）是我国泌尿外科临床上最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最为常见的组织学类型。在我国范围内,膀胱癌的发病率位居全身恶性肿瘤的第13位,其中男性膀胱癌患者的发病率位居第七位,女性膀胱癌患者的发病率居位第17位。而在全身恶性肿瘤中,膀胱癌的死亡率位居第13位,其中男性膀胱癌的死亡率位居1 1位,女性膀胱癌的死亡率位居16位。根据肿瘤细胞浸润膀胱肌层的程度可将膀胱癌分为两类:非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）。NMIBC是膀胱癌中最为常见的类型,约占膀胱癌患者的70%-75%,其余25%-30%的膀胱癌患者为肌层浸润性膀胱癌,甚至部分膀胱癌患者出现远处转移。NMIBC的主要治疗方式是经尿道膀胱肿瘤切除术,当具有复发和进展高危因素时可术后膀胱内灌注免疫制剂或化疗药物来预防肿瘤复发和进展。经尿道切除肿瘤联合膀胱内灌注卡介苗是NMIBC患者最常见的治疗策略,但是超过50%的患者会复发,10%至30%的NMIBC会发展成MIBC,甚至发生转移。而MIBC恶性程度高,其5年生存率仅为25%。然而,目前膀胱癌的发病机制仍未阐明,需要进一步的基础研究寻找新的靶点,为膀胱癌的治疗提供理论依据。上皮-间质转化（EMT）是一个多步骤过程,其中上皮细胞失去其上皮特性并获得间充质特性,从而使细胞具有迁移和侵袭特性。大量的体外和体内研究表明,EMT是包括膀胱癌在内的各种恶性肿瘤侵袭和转移的初始事件。EMT的启动和发展涉及不同的信号通路和信号串扰,在转录、转录后、翻译和翻译后水平受到调控。转化生长因子-β（TGF-β）通过SMAD途径和非SMAD途径来诱导EMT。其中TGF-β通过由Ⅰ型和Ⅱ型受体组成的四聚体复合物激活Smad2和Smad3,然后与Smad4结合。三聚体Smad复合体易位到细胞核中,并与转录调节因子协同作用,抑制或激活EMT转录因子。研究发现TGF-β通过Smad3/Smad4复合物介导Snail、E-cadherin、Zeb1和Twist等基因的表达。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,是涉及多种生物学过程的新兴调节剂之一。研究发现lncRNA通过多种途径参与广泛的生物学过程,包括增殖、粘附、侵袭、转移、干性、细胞凋亡、基因组不稳定性以及EMT。越来越多的证据表明多种lncRNA通过不同的途径参与膀胱癌的EMT。我们前期研究发现前列腺相关长链非编码RNA-1（PlncRNA-1）在前列腺癌组织及前列腺癌细胞中高表达。PlncRNA-1作为内源性竞争RNA通过miRNA-297-3p和miRNA-34c-5p调控雄激素受体的表达促进前列腺癌的发生发展。此外,PlncRNA-1还可通过TGF-β1调控前列腺癌的增殖和EMT。然而,目前缺乏PlncRNA-1在膀胱癌中的表达水平、生物学功能以及其作用机制的相关研究。在本研究中,我们旨在探讨PlncRNA-1在膀胱癌中的表达水平及其生物学功能,进一步阐释PlncRNA-1发挥调控作用的分子机制,为膀胱癌的临床诊断和预后提供潜在的分子标志物,同时为膀胱癌的靶向治疗及药物开发奠定了实验及理论基础。2.实验方法1)探讨PlncRNA-1的表达水平与膀胱癌患者的年龄、性别、病理分级和分期等临床资料的相关性。2)功能实验研究明确PlncRNA-1调控膀胱癌细胞增殖、EMT等生物学功能。3)探讨PlncRNA-1的表达水平受其基因启动子区域甲基化的调控。4)探讨PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展,为膀胱癌的诊疗提供新策略和新靶点。3.实验方法3.1 PlncRNA-1在膀胱癌组织中的表达及其预测价值1)收集28对膀胱癌组织和癌旁组织,应用液氮冻存或者福尔马林固定组织。同时,收集患者的各种临床信息。2)应用Trizol提取冰冻组织中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析PlncRNA-1在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。3)应用R语言进行统计分析。T检验分析PlncRNA-1在各亚组中的差异表达。应用卡方检验分析PlncRNA-1高表达组和低表达组在不同亚组的差异分布。3.2 PlncRNA-1调控膀胱癌细胞的增殖和EMT1)应用Trizol提取多株膀胱癌细胞（5637、T24、J82和RT4）中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测PlncRNA-1在多株膀胱癌细胞中的表达水平。2)设计和合成PlncRNA-1的小干扰RNA（siPlncRNA-1）,应用RT-qPCR验证siPlncRNA-1的干扰效率。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达水平,应用CCK-8实验检测细胞的增殖能力、克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力、划痕实验检测P细胞的迁移能力、Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。4)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达水平,应用Western blot检测在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后EMT标志物蛋白的表差异达。5)在体内检测敲低PlncRNA-1对膀胱癌细胞增殖的调控。应用裸鼠进行皮下植瘤,称量种植瘤的体积和重量,绘制生长曲线,同时利用免疫组织化学技术（IHC）检测种植瘤中细胞增殖相关蛋白Ki-67的表达水平。3.3 PlncRNA-1启动子区的低甲基化可促进其表达1)生物信息学分析:应用Wanderer和Mexpress分析PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化修饰水平及其甲基化水平与表达水平之间的相关性。2)应用亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）探索PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化修饰位点。3)应用不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞苷（AZA）处理膀胱癌细胞,提取细胞DNA,应用亚硫酸氢盐转化试剂盒将胞嘧啶转化为尿嘧啶,然后进行一代测序,检测PlncRNA-1的基因启动子区域131位点的甲基化水平。同时提取细胞总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测AZA对PlncRNA-1表达水平的调控作用。4)随机选取6对膀胱癌组织,提取组织DNA,应用亚硫酸氢盐转化试剂盒将胞嘧啶转化为尿嘧啶,应用重亚硫酸盐测序法（BSP）联合一代测序,检测在膀胱癌组织中PlncRNA-1基因启动子区域131位点的甲基化水平。同时提取上述选取6对膀胱癌组织的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测在膀胱癌组织中PlncRNA-1的表达水平。3.4 PlncRNA-1通过调控miRNA-136/smad3轴促进膀脱癌的进展1)应用Trizol提取28对冰冻组织中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR分析Smad3 mRNA在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。应用Pearson相关系数检测Smad3 mRNA和PlncRNA-1在膀胱癌组织中表达水平的相关性。同时应用IHC分析Smad3蛋白在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。2)应用FISH对PlncRNA-1在膀胱癌细胞中的亚细胞结构进行定位。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达后,应用RT-qPCR检测Smad3 mRNA的表达水平,同时应用Western blot检测Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。同时应用miRNA-seq检测敲低PlncRNA-1的表达后miRNA的差异改变,并对miRNA的预测靶标进行GO富集分析和KEGG富集分析。4)应用Trizol提取28对冰冻组织中的miRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR分析miRNA-136在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。5)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达后,应用RT-qPCR检测miRNA-136的表达水平。6)在膀胱癌细胞中敲低或过表达miRNA-136,应用RT-qPCR验证敲低或过表达的效率,应用RT-qPCR检测PlncRNA-1和Smad3 mRNA的表达水平,同时应用Western blot检测Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。7)构建PlncRNA-1野生型和突变型的质粒,在293T细胞中双转染质粒和miRNA-136模拟物,双荧光素酶实验验证PlncRNA-1可作为miRNA-136的竞争性内源 RNA。8)挽救实验:在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后,再敲低miRNA-136,应用Western blot检测Smad3蛋白、磷酸化Smad3蛋白和EMT标志物蛋白的表达水平。4.实验结果4.1 PlncRNA-1在膀胱癌组织中的表达及其预测价值1)与配对的癌旁组织相比,发现PlncRNA-1在71.43%（20/28）的膀胱癌组织中明显高表达。2)亚组分析显示,PlncRNA-1在≥65岁组（p=0.048）、单发肿瘤组（p=0.049）、MIBC组（p=0.0075）和T3-T4分期组（p=0.019）中高表达。3)在膀胱癌组织中,根据PlncRNA-1表达水平的中位数,将膀胱癌分为PlncRNA-1高表达组和低表达组。在PlncRNA-1低表达组中,T1-T2分期占100%（14/14）,而MIBC分期占42.86%（6/14）。在PlncRNA-1 高表达组中,T1-T2分期占57.14%（8/14）,而MIBC分期占85.71%（12/14）。根据PlncRNA-1的表达水平,可以预测膀胱癌患者的肿瘤浸润程度和T期。4.2 PlncRNA-1调控膀胱癌细胞的增殖和EMT1)在不同的膀胱癌细胞系中PlncRNA-1的表达水平存在差异,在5637细胞中表达水平最高,在T24细胞中表达水平最低。2)设计和合成PlncRNA-1的干扰RNA。与对照组相比,siPlncRNA-1可有效降低T24和5637细胞中PlncRNA-1的表达水平。3)PlncRNA-1可抑制膀胱癌细胞的增殖和克隆形成能力:CCK-8实验证明在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显抑制细胞的增殖能力。克隆形成实验进一步表明,敲低PlncRNA-1可明显抑制细胞克隆形成能力。4)PlncRNA-1可抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力:应用划痕实验证明敲低PlncRNA-1可明显抑制膀胱癌细胞的迁移能力。Transwell实验证明敲低PlncRNA-1可明显抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。5)PlncRNA-1可调控EMT相关蛋白的表达水平:与对照组相比,敲低PlncRNA-1可明显下调N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的表达,上调E-cadherin蛋白的表达。6)体内研究表明敲低PlncRNA-1可明显抑制肿瘤的生长,降低肿瘤的重量,减小肿瘤的体积。免疫组织化学染色分析表明敲低PlncRNA-1可明显降低Ki-67蛋白的表达。4.3 PlncRNA-1启动子区的低甲基化可促进其表达1)应用Wanderer和Mexpress在线工具发现,在膀胱癌组织中PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化水平降低,且PlncRNA-1启动子区域的甲基化水平与PlncRNA-1的表达水平呈负相关。2)在膀胱癌T24和5637中,应用BSAS分析PlncRNA-1基因的转录起始位点（TSS,上游2000bp和下游1000bp）的甲基化水平。研究发现PlncRNA-1启动子的131位（位于21号染色体的36157603位）甲基化水平较高,且两株细胞的甲基化水平存在明显差异。3)BSP联合一代测序显示不同浓度的AZA处理膀胱癌细胞后可明显抑制PlncRNA-1启动子区域的甲基化。同时对BSP扩增的产物随机挑取10个单克隆进行一代测序,发现随着AZA浓度的升高,甲基化的单克隆数目越少。因此,AZA可以有效抑制PlncRNA-1启动子的甲基化水平。4)应用不同的AZA浓度处理膀胱癌细胞后,研究发现随着AZA浓度的升高,PlncRNA-1的表达水平也逐渐升高。5)随机选取6对膀胱癌组织和癌旁组织进行BSP和一代测序,发现在膀胱癌组织中PlncRNA-1启动子的131位甲基化水平明显低于癌旁组织。6)应用上述选取6对膀胱癌组织和癌旁组织进行提取总mRNA,进行RT-qPCR。发现在膀胱癌组织中PlncRNA-1的表达水平明显高于癌旁组织。4.4 PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展1)在膀胱癌组织中Smad3mRNA和蛋白的表达水平明显高于癌旁组织。相关性分析表明,在膀胱癌组织中PlncRNA-1和Smad3 mRNA的表达水平存在强正相关（R=0.82,p=9.7e-08）。2)应用FISH发现PlncRNA-1主要分布在膀胱癌细胞的细胞核中,部分分布在细胞质中。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显下调Smad3 mRNA、Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。4)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后进行miRNA测序,发现有36个miRNA差异表达,其中has-miRNA-136-5p是差异倍数最大的miRNA。对miRNA的靶基因进行GO富集分析和KEGG富集分析发现,miRNA靶基因调节的生物学过程包括:转录,经典Wnt信号传导和细胞内信号转导。miRNA靶基因主要位于细胞核和细胞质。miRNA靶基因的主要分子功能包括蛋白质和DNA结合以及转录活性。miRNA靶基因主要参与的通路包括多个癌症途径、粘着斑、肌动蛋白细胞骨架的调节、mTOR信号传导途径、Wnt信号传导途径和转录活性。5)miRNA-136在膀胱癌组织中的表达明显低于癌旁组织相比（p=0.0078）。6)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显上调miRNA-136的表达。7)在膀胱癌细胞中敲低或过表达miRNA-136,RT-qPCR验证发现敲低或过表达miRNA-136的效果明显。同时发现敲低或过表达miRNA-136的表达可明显调控PlncRNA-1 mRNA、Smad3mRNA、Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。8)双荧光素酶报告基因检测发现miRNA-136可以与PlncRNA-1直接结合。9)挽救实验:在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后再次敲低miRNA-136。挽救实验发现敲低miRNA-136可部分恢复PlncRNA-1下调诱导的Smad3蛋白、磷酸化Smad3蛋白和EMT标志蛋白表达的变化。5.实验结论1)PlncRNA-1作为癌基因,在膀胱癌组织中过表达,其表达水平与肿瘤浸润、T分期、年龄和肿瘤数目相关。PlncRNA-1的表达水平可以在一定程度上用作膀胱癌患者肿瘤侵袭程度和T分期的预测指标。2)功能研究证实PlncRNA-1可调控膀胱癌细胞的增殖和EMT。3)在膀胱癌组织中PlncRNA-1启动子的131位点（21号染色体上的36157603）存在低甲基化修饰,而PlncRNA-1启动子的低甲基化可促进其自身表达的上调。4)机制研究发现PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展,为膀胱癌的诊疗提供新策略和新靶点。
黄厚锋[3]（2021）在《KNTC1在膀胱癌发生发展中的作用及初步机制研究》文中研究指明[目的]探讨KNTC1基因在膀胱癌发生发展中的作用及可能机制。[方法]使用包括46例患者的膀胱尿路上皮癌组织和癌旁移行上皮组织以及13例其他患者的膀胱尿路上皮癌组织的膀胱癌组织芯片,采用免疫组化方法检测KNTC1在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达水平,并分析KNTC1表达水平与膀胱癌病例各种临床特征之间及总生存的相关性。采用RNA干扰技术敲低EJ和T24膀胱癌细胞系KNTC1表达,通过MTT实验检测细胞增殖能力,通过流式细胞仪检测凋亡细胞和细胞周期,通过划痕实验检测细胞迁移能力,通过Transwell实验检测细胞侵袭能力。通过动物体内成瘤实验,检测敲低KNTC1表达的T24膀胱癌细胞系在裸鼠体内成瘤情况。采用蛋白抗体芯片和Western blot检测KNTC1基因敲低后相关蛋白表达水平的变化,探讨其可能的调控机制。[结果]免疫组化结果显示,KNTC1在膀胱癌组织中表达显着高于癌旁组织,在不同病理分级（Ⅱ级和Ⅲ级）、不同T分期（Tis/T1/T2期和T3/T4期）以及不同临床分期（Ois/1/2期和3/4期）的表达有显着性差异,更高级别的病理分级、T分期和临床分期KNTC1表达高于低级别的病理分级、T分期和临床分期。KNTC1基因的高表达是总生存的危险因素,高表达的死亡风险是低表达的3.139倍。细胞功能实验结果显示,与对照组相比,KNTC1敲低组膀胱癌细胞增殖显着减慢,凋亡显着增加,G2期细胞百分率显着升高,迁移侵袭能力显着受到抑制。体内成瘤实验结果显示,与对照组相比,KNTC1敲低组T24细胞的致瘤能力受到明显抑制。蛋白抗体芯片检测结果显示,KNTC1基因敲低后Caspase3,Fas的表达水平显着上调,蛋白Bcl-2,Bcl-w,CD40,clAP-2,HSP60,IGF-Ⅰ,IGF-1sR,Livin,sTNF-R2,TNF-α,TNF-β,XIAP的表达水平显着下调。Western blot检测结果显示,蛋白MAPK9表达上调,蛋白P-Akt,CDK6,PIK3CA表达下调。[结论]KNTC1在膀胱癌中高表达,与临床病理特征和预后显着相关。敲低KNTC1表达可抑制膀胱癌细胞的增殖,增加凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,并抑制肿瘤生成,提示KNTC1在膀胱癌的发生发展中起着重要的作用,可作为膀胱癌的一种生物标志物和潜在的治疗靶点。KNTC1基因敲低可改变凋亡信号通路蛋白的表达水平,提示KNTC1通过影响凋亡信号通路发挥作用。
王子龙[4]（2021）在《肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织中PSMA表达的研究》文中研究说明一、研究背景膀胱癌90%以上病理类型为移行细胞癌。随着人口老龄化加剧以及环境污染日益严重,膀胱癌已成为严重危害人类健康的恶性肿瘤。尽管非肌层浸润性移行细胞癌（NMIBC）为大多数患者的初诊类型,但肌层浸润性移行细胞癌（MIBC）的进展率为30%,膀胱全切术后5年生存率约为50%、10年生存率约为36%。由此可见,深入研究膀胱癌精准靶向治疗方案具有非常紧迫的现实意义。巨噬细胞（macrophages,MΦ）是固有免疫以及适应性免疫系统的主要免疫细胞,而肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中的重要组成部分,具有两种亚型:由脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFN-y）通过STAT1和STAT3磷酸化诱导的M1型Mφ,以及由IL-4和IL-13通过STAT6磷酸化诱导的M2型Mφ。然而,TAM及其极化状态与前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSMA）表达之间的关系,未发现有明确研究。因此,本研究对肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织新生血管中PSMA表达进行相关的研究。前列腺特异性膜抗原（PSMA）是主要表达在前列腺癌上皮细胞上的Ⅱ型跨膜糖蛋白,同样也在肾癌、甲状腺癌、乳腺癌等实体肿瘤的新生血管内皮细胞中表达,但PSMA在膀胱移行细胞癌新生血管上皮细胞中表达的研究却具有争议:Samplaski等对167例膀胱癌患者的病理切片进行研究发现,PSMA在浸润性膀胱癌组织中的表达量与肿瘤病理分型相关,但所有类型的肿瘤新生血管内皮细胞中均表达PSMA,预示PSMA与肿瘤血管生成和预后密切相关。然而,Campbell等对3例转移性膀胱癌患者进行影像学和病理学分析,PSMA在膀胱癌中低表达导致PSMAPET/CT的影像学诊断受限,但由于样本数量少且病例数量只有3例导致争议和临床不确定性。因此针对这一争议,探究PSMA在浸润性膀胱移行细胞癌中的表达及与肿瘤新生血管之间的关系,寻找PSMA抑制剂抗新生血管靶向治疗的机制,具有重要的临床意义。二、研究目的本研究应用人膀胱移行细胞癌细胞系T24与人单核巨噬细胞系THP-1作为共培养细胞模型,建立人膀胱移行细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型,收集人浸润性膀胱移行细胞癌病理标本,探讨膀胱癌表达和分泌IL-4,激活肿瘤微环境（TME）巨噬细胞中STAT6磷酸化促进其向M2型Mφ极化,M2型Mφ通过分泌内皮素4D（Sema4D）促进TME中CD31表达,导致PSMA表达增高的机制;应用PSMA抑制剂2-PMPA可以抑制肿瘤组织中CD31表达,探讨抑制膀胱移行细胞癌的生长和增殖的机制。三、材料与方法1、膀胱移行细胞癌细胞通过分泌IL-4促进STAT6磷酸化诱导巨噬细胞向M2表型极化的机制研究（1）将人单核巨噬细胞系THP-1细胞应用佛波酯（PMA）诱导为M0型Mφ,向M0型Mφ中加入重组LPS及IFN-γ诱导为M1型Mφ,向M0型Mφ中加入重组人IL-4及IL-13诱导为M2型Mφ。（2）人膀胱移行细胞癌细胞系T24与M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组共培养。（3）Western blot、实时荧光定量PCR检测M0、M1、M2型Mφ与共培养M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组中生物标志物CD80、iNOS、CD163、Arg-1、pSTAT6、Sema4D的表达。（4）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测M0、M1、M2型Mφ与共培养M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组中IL-4、Sema4D的表达。2、PSMA抑制剂2-PMPA下调CD31与Sema4D表达的裸鼠皮下移植瘤模型研究（1）应用膀胱移行细胞癌细胞系T24构建人膀胱移行细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。并随机将10只裸鼠分为实验组（2-PMPA）和对照组,每组5只。每5日用游标卡尺测量裸鼠皮下肿瘤的最大径和用电子质量称测量裸鼠重量。在给药第30天实验结束时,颈椎脱臼处死裸鼠,剥取皮下肿瘤进行下一步实验。（2）免疫组化测量实验组和对照组肿瘤中PSMA、CD31、Sema4D、Plexin-B1的表达量。（3）免疫荧光双标法测量实验组和对照组肿瘤中CD163与Sema4D、CD31与PSMA的表达量。3、PSMA与CD31表达在膀胱移行细胞癌分期和预后中的临床研究（1）收集行根治性膀胱全切除术治疗的原发性膀胱移行细胞癌的患者37例。收集患者的年龄、CTU、泌尿系超声、膀胱镜检查、肿瘤大小、病理分级、TNM分期及所用化疗药物等临床资料,收集患者肿瘤组织和癌旁正常组织的空白病理标本和切片进行后续实验。（2）免疫组化染色法测量肿瘤及癌旁正常组织中PSMA、CD31、IL-4、pSTAT6、CD 163、Sema4D、Plexin-B1的表达量。（3）免疫荧光双标法测量肿瘤及癌旁正常组织中Ki-67与IL-4、CD163与Sema4D、CD31 与Plexin-B1、CD31 与PSMA的表达量。四、结果1、膀胱移行细胞癌细胞系通过分泌IL-4促进STAT6磷酸化诱导巨噬细胞极化为M2型 Mφ。光学显微镜观察发现THP-1细胞为悬浮细胞,表现为形态规则、大小一致、无伪足的小圆形细胞。M0型Mφ为贴壁细胞,表现为形态不规则的多边形细胞,体积略增大。M1型Mφ细胞表现为体积增大、多角的长梭形细胞。M2型Mφ细胞表现为体积增大的枝杈状细胞。Western blot、RT-PCR检测M1型Mφ中CD80和iNOS表达增加,CD163和Arg-1表达较低;M2型Mφ和T24+M0共培养组中CD163和Arg-1表达增加,CD80和iNOS表达较低。加入IL-4R和STAT6抑制剂AS1517499后,CD163表达降低。ELISA结果显示M2以及T24+M0组细胞培养上清液中IL-4含量较高,M0和M1组中IL-4含量均较低。2、M2型Mφ促进促血管生成因子Sema4D的表达和分泌。RT-PCR、ELISA检测M2、T24+M0组中Sema4D表达升高,加入IL-4R或AS1517499后Sema4D表达降低。免疫组化结果显示肿瘤组织中Sema4D表达率明显高于癌旁正常组织。免疫荧光结果表明,CD163+细胞（M2型Mφ）中Sema4D在肿瘤组织中表达率明显高于癌旁正常组织。3、PSMA抑制剂2-PMPA抑制肿瘤组织中CD31表达和M2型Mφ浸润性及其Sema4D 表达。应用PSMA抑制剂2-PMPA,移植瘤中位增长体积和重量明显低于对照组,30天后实验组裸鼠移植瘤体积明显低于对照组。免疫组化染色法显示实验组中CD31、Plexin-B1、CD163、Sema4D表达率明显低于对照组,免疫荧光双标法显示,实验组中PSMA在CD31+肿瘤新生血管表达率明显低于对照组,Sema4D在CD163+M2型Mφ中表达率明显低于对照组,表明2-PMPA可以减少肿瘤组织中微血管密度（CD31+细胞）以及M2型Mφ浸润性及其Sema4D表达。4、膀胱癌组织中PSMA和CD31表达率与肿瘤TNM分期和病理分级呈正相关,可能是膀胱癌患者预后的影响因素。免疫组化结果表明,高级别病理分级肿瘤患者中CD31+细胞计数明显高于低级别,且CD31+细胞计数随T分期增加而增加,即T4期最高,T3期次之,T2期最低。免疫荧光双标法结果揭示肿瘤新生血管中PSMA表达呈现相同的结果,高级别患者中PSMA表达率明显高于低级别,且T4期PSMA表达率最高,T3期和T2期较低。单因素和多因素分析显示,PSMA和CD31表达率是影响膀胱癌患者预后的影响因素,但彼此之间有相互影响作用。5、T2和T3期膀胱癌组织中M2型Mφ上调CD31和PSMA表达,而T4期中上皮-间质转化（EMT）程度上调CD31和PSMA表达。免疫组化结果显示T3期中CD163+细胞计数最高,而T2、T4期较低,表明M2型Mφ浸润程度在T3期最高,T2和T4期较低。免疫荧光显示N-cadherin/ZO-1比例在T4期最高,T3和T2期较低,表明T4期肿瘤发生上皮-间质转化（EMT）。因此,结合PSMA与CD31表达率在T分期中的表达规律,T2和T3期中M2型Mφ上调CD31和PSMA表达,T4期中上皮-间质转化（EMT）程度促进CD31和PSMA表达。五、结论1、膀胱移行细胞癌细胞分泌IL-4,促进肿瘤微环境巨噬细胞中STAT6磷酸化,上调Arg-1表达,诱导极化为M2型Mφ,从而表达和分泌Sema4D。2、PSMA表达与肿瘤组织中CD31表达密切相关,从而辅助评估膀胱移行细胞癌患者的预后。3、T2期和T3期,M2型Mφ通过分泌Sema4D并表达Plexin-B1,上调肿瘤组织中CD31和PSMA表达。而在T4期,上皮-间充质转化（EMT）程度上调肿瘤组织中CD31和PSMA表达。
姚志强[5]（2021）在《基于生物信息学鉴定CTSV作为膀胱癌诊断和预后的标志物及预后nomogram的构建》文中研究说明目的:本研究通过生物信息学探索膀胱癌发生发展过程中的核心基因、生物标志物及潜在治疗的小分子药物。方法:从TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库下载膀胱癌m RNA表达谱数据及临床数据,并从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库下载膀胱癌高通量测序表达谱数据集GSE133624,利用R软件limma包进行差异基因（Differentially expressed genes,DEGs）分析。通过Venn Diagram包对两个数据集的差异DEGs取交集并进行可视化,对交集的DEGs进行功能富集分析（Gene Ontology,GO;Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）寻找潜在的作用机制。利用STRING数据库构建蛋白互作网络,然后通过Cytoscape3.8.0软件中的cyto Hubba插件筛选核心基因后进行生存分析和相关性分析,利用Oncomine肿瘤数据库对其m RNA表达水平进行验证。最后使用CMap数据库探索膀胱癌潜在治疗的小分子药物并通过Pub Chem数据库对其结构及分子式予以展示。结果:差异基因分析共获得777个DEGs,包括194个上调基因,583个下调基因。GO分析表明,DEGs参与细胞外基质组织、细胞外结构组织、细胞器裂变、核分裂、肌肉系统过程的调节、轴突生成、涉及有丝分裂的微管细胞骨架组织、染色体分离的调节、纺锤体组装等生物过程。KEGG分析表明,DEGs主要通过血管平滑肌收缩、钙信号通路、细胞周期、c GMP-PKG信号通路、细胞粘附分子、ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、Apelin信号通路等调控膀胱癌的进展。此外,筛选出7个与预后显着相关的核心基因（ANLN、CCNB1、CDC20、CTSV、OIP5、IGF1和PLK1）,这些基因之间具有显着的相关性。最后还筛选了5个潜在膀胱癌治疗的小分子药物,包括酚苄明（phenoxybenzamine）、曲古菌素A（trichostatin A）、芹菜素（apigenin）、吲哚酮（GW-8510）和硫基鸟嘌呤（thioguanosine）。结论:本研究结果表明,ANLN、CCNB1、CDC20、CTSV、OIP5、IGF1和PLK1与膀胱癌患者的预后显着相关,其可作为膀胱癌早期诊断和改善预后的标志物以及治疗的分子靶点。c GMP-PKG、PI3K-Akt、Apelin等信号通路在膀胱癌的发生发展中起着关键作用。此外,酚苄明、曲古菌素A、芹菜素、吲哚酮和硫基鸟嘌呤可能是膀胱癌治疗的潜在药物。目的:本研究旨在探讨CTSV（cathepsin V）在膀胱癌中的表达水平及临床意义,构建nomogram预后模型并对其效能进行评价,探究该模型对制定临床治疗方案的指导意义。方法:基于第一部分研究结果,选择CTSV作为靶基因进行本部分的研究。基于TCGA数据库评估膀胱癌组织和癌旁组织中CTSV的表达水平,并利用GEPIA在线数据库、GSE13507数据集、Oncomine数据库以及膀胱癌组织对其表达进行验证。使用Wilcoxon符号秩检验分析CTSV与临床病理特征的相关性。根据CTSV表达的cutoff值（基于R软件中survminer包）将膀胱癌患者分为高表达组和低表达组,并利用logistic回归分析CTSV表达水平与临床病理变量的相关性。使用Kaplan–Meier生存分析比较高CTSV组和低CTSV组间的总生存率。使用Pearson检验分析CTSV与其他预后相关核心基因的相关性。使用STRING数据库构建了一个与CTSV相关的蛋白互作（Protein-protein interaction,PPI）网络,并利用GESA识别CTSV相关的信号通路。然后采用单因素和多因素Cox回归分析CTSV及临床变量与生存的关系。最后基于多因素Cox有意义的因素构建预后nomogram并对其模型进行验证及评价。结果:从TCGA数据库中获得408例膀胱癌样本和19例癌旁组织样本。结果表明,CTSV在膀胱癌中的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）,而且高表达CTSV的膀胱癌患者生存时间明显短于低表达CTSV患者（P=0.0062）。CTSV的表达量与性别（P=0.046）,组织学分级（P<0.001）,种族（P=0.0039）和T分期（P=0.043）显着相关。单变量logistic回归分析表明,CTSV的高表达与种族（OR=2.519 for white vs.others）,组织学分级（OR=1.662 for low vs.high）,临床分期（OR=1.589 for I-II vs.III-IV）,状态（OR=1.435 for normal vs.tumor）,T分期（OR=1.589 for T1-2 vs.T3-4）和M分期（OR=4.499 for M0 vs M1）显着相关（P<0.05）。Person相关性分析表明,ANLN（R=0.56）、CCNB1（R=0.46）、CDC20（R=0.53）、OIP5（R=0.5）和PLK1（R=0.53）与CTSV呈正相关（P<0.05）,而ADCY5（R=-0.18）与CTSV呈负相关（P<0.05）。CTSV相关的PPI网络表明,CTSV与CTSL、CTSA、MMP、HLA家族等密切相关。GSEA分析结果表明,在高CTSV表达的表型中,细胞周期、肌动蛋白细胞骨架的调节、紧密连接、细胞基质粘附、Wnt信号通路、MAPK信号通路、细胞粘附分子、JAK-STAT信号通路、胰岛素信号通路等通路显着富集。多因素Cox回归分析显示,年龄（HR:1.033,95%CI:1.016-1.050,P<0.001）、T分期（HR:1.459,95%CI:1.088-1.958,P=0.012）、N分期（HR:1.433,95%CI:1.075-1.909,P=0.014）和CTSV（HR:1.495,95%CI:1.069-2.089,P=0.019）是膀胱癌患者预后的独立危险因素。基于多因素Cox回归有意义的变量构建预后nomogram,1年、3年和5年的ROC曲线下面积分别为0.729、0.701和0.709,内部验证模型的C-index为0.669（95%CI:0.624-0.714）,校准曲线显示生存率预测值与实际值具有较好的校准度,决策曲线分析显示净获益率在35-80%之间都是有用的,该模型具有较好的区分度、一致性和临床实用性。结论:本研究结果表明,CTSV在膀胱癌组织中的表达显着高于癌旁组织,并且CTSV高表达的膀胱癌患者预后更差。高表达的CTSV与晚期临床病理特征显着相关,如病理分级（高级别）、临床分期（III-IV）、T分期（T3-T4）和M分期（M1）。年龄、T分期、N分期和CTSV为影响膀胱癌患者生存的独立危险因素。预后预测nomogram模型具有较好的区分度、校准度和临床效能。
刘俐来[6]（2021）在《MEG3在膀胱癌T24细胞中甲基化状态对细胞增殖活性的影响》文中认为目的:膀胱癌作为泌尿系常见肿瘤之一,其高复发率及高死亡率为患者的身心均带来了巨大的影响。目前对膀胱癌的检测金标准仍然是膀胱镜检,但仍有可能漏掉10%的乳头状肿瘤。因此寻求膀胱癌的有效早期检测手段以及新的治疗方法已成为临床上急需解决的问题。本研究拟通过观察膀胱癌T24细胞经甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2’脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理后细胞增殖的抑制情况以及细胞中MEG3基因甲基化状态的变化,进一步探求MEG3基因在膀胱癌发生、发展过程的作用机制,以及寻求新的检测及治疗膀胱癌的方案。方法:本实验通过不同浓度的5-杂氮-2’脱氧胞苷（5-Aza-Cd R）分别处理膀胱癌T 24细胞24h、48h、72h后使用MTT法检测膀胱癌T 24细胞的增殖情况。共设置调零组、空白对照组、5μmol/L组、10μmol/L组、15μmol/L组、20μmol/L组、25μmol/L组、30μmol/L组、35μmol/L组、40μmol/L组10个组别。然后使用抑制率公式抑制率=[（对照组OD-调零组OD）/（实验组OD-调零组OD）]*100%计算出各用药组膀胱癌T24细胞的增殖抑制率,以探究5-Aza-CdR对膀胱癌T24细胞增殖的影响。使用亚硫酸氢盐处理后测序（BSP）法检测对照组（未经5-Aza-CdR处理）与30μmol/L组（经30μmol/L 5-Aza-Cd R处理）在培养48h后膀胱癌T24细胞中MEG3基因的甲基化状态的变化情况。结果:（1）经不同浓度5-Aza-CdR处理后的膀胱癌T24细胞增殖均受到不同程度的抑制,各浓度组计算出的抑制率均>0。（2）经检测发现,在相同作用时间下,随着5-Aza-Cd R浓度的增加（5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、35μmol/L、40μmol/L）,膀胱癌T24细胞的增殖抑制率也是逐步上升的,并且在5-Aza-CdR浓度为40μmol/L时达到最高值,但部分相邻各组间差异不显着（P>0.05）;而在相同5-Aza-CdR作用浓度下,随着作用时间的增加,膀胱癌T24细胞的增殖抑制率也随之增加。故膀胱癌T24细胞增殖抑制情况与5-Aza-CdR的浓度及其作用时间成正相关性。（3）BSP法检测正常条件培养及经30μmol/L5-Aza-CdR处理后培养48h后的膀胱癌T24细胞中MEG3基因甲基化状态结果显示:经30μmol/L 5-Aza-Cd R处理后的膀胱癌T24细胞中MEG3基因甲基化率较正常条件培养下的甲基化率低（P<0.01）。提示5-Aza-Cd R能够逆转MEG 3基因启动子的甲基化。结论:（1）5-Aza-CdR能够有效抑制膀胱癌T24细胞的增殖。（2）5-Aza-Cd R对膀胱癌T24细胞的增殖抑制作用具有浓度及时间依赖性。（3）5-Aza-Cd R能够逆转MEG3基因启动子的甲基化。（4）MEG3基因启动子的低甲基化能够降低膀胱癌T24细胞的增殖。
郑雪[7]（2020）在《TP63基因启动子DNA甲基化与宫颈癌的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的探讨不同病理子宫颈组织TP63基因启动子区的DNA甲基化状态,TP63、survivin和RUNX2的表达以及RUNX2在两组子宫颈组织中TP63基因启动子DNA甲基化特异位点的结合情况,统计分析宫颈癌组织中TP63基因启动子DNA甲基化状态与临床病理参数之间的关系。方法选取2015年9月～2018年9月唐山市工人医院收治的因宫颈病变及其他良性疾病行手术治疗的标本共85例,严格按照标本的纳入及排除标准进行选取,所有标本均由实验人员与医院病理科医师共同确认病理分级和类型,其中宫颈癌患者40例（CC）和因子宫良性病变行全子宫切除术的患者45例（Control）宫颈组织。采用全基因组DNA甲基化分析（WGBS）和RNA sequence联合筛查CC和年龄相匹配的Control组织（各3例）的DNA甲基化度和m RNA表达;采用亚硫酸氢盐测序法（BSP）和实时定量PCR（q PCR）方法检测TP63基因启动子区DNA甲基化和RUNX2、TP63、survivin的m RNA表达;采用染色质免疫共沉淀技术（CHIP）检测RUNX2在宫颈组织中与TP63基因启动子的结合情况,并分析TP63基因启动子DNA甲基化状态与宫颈鳞癌病理参数的关系。结果1 WGBS和RNA-seq联合筛查发现TP63启动子DNA甲基化水平升高与其m RNA表达减少相关;2 BSP结果表明与Control组比较,CC组中TP63基因启动子区-688 Cp G位点DNA甲基化率显着升高,差异具有统计学意义（77.5%（31/40）vs.31.1%（14/45）,P<0.05）;3 q PCR结果显示与Control组比较,CC组中RUNX2和survivin的m RNA表达上调,TP63 m RNA表达下调（均P<0.05）;4 Ch IP证实CC组TP63基因启动子区存在转录因子RUNX2结合序列,且-688Cp G位点DNA甲基化修饰影响RUNX2的结合。5相关性分析显示TP63基因DNA甲基化与肿瘤大小、病理分级和临床分期均相关（均P<0.05）,而与患者的年龄无关（P>0.05）。结论1 TP63基因启动子DNA甲基化抑制其表达参与宫颈癌的发生发展。2TP63基因有望成为子宫颈癌患者临床评估的重要的预后指标以及宫颈癌治疗的重要分子靶点。图6幅;表5个;参148篇。
陈绵川[8]（2020）在《TRPM7在膀胱移行细胞癌中的表达及意义》文中提出目的:通过检测TRPM7在BTCC及对应癌边组织中的差异表达,并结合BTCC的临床特点,分析TRPM7与BTCC的关系。方法:收集2017年～2019年在海南医学院第二附属医院泌尿外科诊断BTCC的患者术后标本共60例及对应癌边组织标本。在60例标本中,经尿道膀胱电切术28例,膀胱部分切除术5例,根治性膀胱全切术27例。根据术后病理结果,按分化程度分为高分化（低级别）、低分化（高级别）。采用免疫组织化学技术检测各组织中TRPM7的表达情况。使用光学显微镜在400倍镜下和适当的曝光环境下截取图片,并用Image J图像软件分别分析并获得癌边组织、低级别（高分化）癌组织、高级别（低分化）癌组织中表达TRPM7的平均阳性细胞面积。结合BTCC的临床特点,分析TRPM7与临床病理参数之间的关系。结果:癌组织中的阳性细胞面积占比高于癌边组织,并且低分化（高级别）高于高分化（低级别）,差异有统计学意义（P<0.05）。单因素分析中,TRPM7的表达与吸烟及BTCC的TNM分期、肿瘤分化程度、脏器转移等相关（P<0.05）,与肿瘤大小、数目、年龄、性别、部位、淋巴结转移等无相关性（P>0.05）。多因素Logistic回归分析中,吸烟和肿瘤的分化程度是TRPM7表达的直接相关因素（P<0.05）。结论:TRPM7在BTCC中高表达,可能与BTCC的发生相关;TRPM7在不同TNM分期以及分化程度的BTCC组织中表达不同,可能与BTCC的分化程度、TNM分期、脏器转移相关;其中,肿瘤的分化程度与TRPM7的表达两者之间的关系较密切。
缪立英[9]（2019）在《LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究》文中提出膀胱癌（bladder cancer,BC）是一种泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率居高不下,严重威胁人体健康。近年来,随着科学技术的发展,我们对BC的认识愈加深入,对其致病机制及发生发展有了更深的理解,在治疗方面也取得了较大的进展,但是BC的预后仍不理想,尤其是晚期患者,无法显着改善其生存情况,因此,深入研究BC发生和发展的分子机制,筛选特异性标志物具有十分重要的理论意义和临床价值。长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是非编码RNA,长度超过200个核苷酸,可影响调节基因的表达。LncRNA缺乏完整的开放阅读框,没有蛋白编码功能。哺乳动物基因组序列中多达4-9%的序列可以产生LncRNA。LncRNA最初被认为是基因组转录的“暗物质”或“噪音”,没有生物学功能。后来的研究表明,LncRNA参与了许多重要的细胞功能,如X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活或抑制等,可以促进相关信号通路的分子功能改变,改变细胞的生命活动。上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）是上皮来源的恶性细胞由于迁移和侵袭能力增强,向间充质细胞转化的生物学过程。EMT的特征性改变包括上皮细胞极性的丧失、细胞间连接的降解、细胞骨架结构重组引起的细胞形态学改变、上皮基因表达下调伴间充质基因表达上调。这些变化使细胞具有更强的迁移、侵袭和降解细胞外基质的能力。竞争性内源性 RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）是 LncRNA 的一种重要的调控机制。LncRNA通过吸收多种微小RNA（microRNA,miRNA）,调节靶基因的表达水平。目前LncRNA在BC中已有一些研究,但作为ceRNA在BC的发生发展以及与上皮-间充质转化相关的转移侵袭中的作用仍不明确,有待进一步研究。本研究分为三个部分,第一部分通过LncRNA芯片筛选BC和癌旁组织中差异性表达的LncRNA,检测其在BC组织和细胞中的表达水平,并通过体外实验和体内实验明确其在BC中的生物学功能;第二部分通过体外实验及体内实验明确LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络对BC发生发展的调控作用;第三部分通过体外实验阐明LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的影响。第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响[目的]明确BC组织与癌旁组织中LncRNA的表达谱,筛选表达差异最显着的LncRNA,并研究其在BC中的生物学功能。[方法]通过LncRNA微阵列分析,分析13个BC组织与8个癌旁非肿瘤组织中LncRNA的表达差异,选取表达差异最显着的LncRNA,并在BC组织及BC细胞株中应用实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应（quantitative reverse transcript-ion-polymerase chain reaction,qRT-PCR）及原位杂交（In Situ Hybridization,ISH）实验进行验证。核质分离实验及荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization,FISH）确定其亚细胞定位。CCK8、集落形成及Transwell实验明确体外LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。裸鼠成瘤实验及生物荧光体外成像技术验证体内LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。[结果]选择前60个在BC组织与癌旁组织中差异表达显着的LncRNA（Fold Change>1.5,P<0.01）,其中LINC00612差异表达最显着。BC组织中LINC00612的表达水平明显高于癌旁组织,BC细胞中LINC00612的表达水平明显高于膀胱上皮永生细胞。LINC00612主要定位于细胞质中。体外实验显示:在BC细胞中过表达LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力增强;下调LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力下降。上述结果在体内实验中得到了证实。[结论]LINC00612在BC组织和细胞中表达异常上调,并且在BC中作为促癌基因发挥增强细胞增殖与侵袭能力的作用。第二部分 LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究[目的]鉴定LINC00612调控的下游miRNA及靶基因,阐明LINC00612构成ceRNA网络调控BC发生发展的机制。[方法]通过生物信息学方法筛选LINC00612可能结合的miRNA,RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）、RNA pull down及双荧光素酶报告基因实验验证LINC00612与目标miRNA的结合关系。调节BC细胞中LINC00612的表达,观察目标miRNA水平的变化。应用生物信息学方法筛选目标miRNA可能调控的下游靶基因,qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证目标miRNA与靶基因的结合关系。调节BC细胞中目标miRNA的表达,qRT-PCR和western blotting检测靶基因在mRNA和蛋白水平的表达。细胞功能回复实验（挽救实验）和体内实验验证上述结果。[结果]生物信息学方法筛选miR-590是LINC00612下游的目标miRNA,RIP、RNA pull down和双荧光素酶报告实验证明,LINC00612和miR-590可以直接结合。BC细胞中调节LINC00612的表达,miR-590的表达变化呈负性相关。生物信息学方法筛选miR-590下游靶基因,经qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证,PHF-14是miR-590下游的靶基因。BC细胞中调节miR-590的表达,PHF-14的表达变化呈负性相关。细胞功能回复实验显示LINC00612/miR-590/PHF-14轴可调控BC细胞的增殖及侵袭,该结果在体内实验中也获得了进一步证实。[结论]LINC00612通过海绵样吸附miR-590进一步调控下游靶基因PHF-14的表达,并由此影响BC细胞的增殖及侵袭能力,LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控BC的发生发展。第三部分 LINC00612/miR-590/PHF-14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究[目的]研究LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的调控作用。[方法]通过western blotting及FISH实验检测LINC00612/miR-590/PHF-14轴对E-cadherin、N-cadherin和vimentin表达水平的影响。[结果]LINC00612 下调增强了 E-cadherin 的表达,削弱了 N-cadherin 和 vimentin 的表达,LINC00612过表达抑制了E-cadherin的表达,而N-cadherin和vimentin表达增加,PHF14可以取消LINC00612对E-cadherin和vimentin表达的调控作用。[结论]LINC00612/miR-590/PHF-14轴通过ceRNA机制调控BC细胞上皮-间充质转化。
耿春阳[10]（2019）在《基于微流控芯片的膀胱移行上皮癌检测》文中研究指明背景:膀胱癌是十大恶性肿瘤之一,其中约95%为移行上皮癌。膀胱移行上皮癌细胞会脱落进入尿液,同时尿液中膀胱癌标志性蛋白的含量也会明显增加,为癌症检测提供了可行的诊断指标。临床检测膀胱癌的方法主要有尿常规检查、膀胱镜检查、尿脱落细胞学检查、静脉尿路造影术和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术等。然而,这些方法各有一定的不足之处,如有创、假阳性率高、易受干扰和费用昂贵等等。目前,临床上缺少一种同时具备高敏感性、高特异性以及低成本等优势的无创检测方法。材料与方法:本研究设计了一种用于膀胱移行上皮癌检测的新型微流控芯片。通过COMSOL Multiphysics软件对微流控芯片的结构进行仿真和优化,筛选出流场更优的微柱阵列;通过硅烷化修饰芯片表面以固定特异性抗体,确定更佳的预处理条件;基于微柱阵列和抗原抗体免疫吸附原理,通过芯片检测尿液样本中癌细胞和蛋白标志物核基质蛋白22（nuclear matrix protein22,NMP22）、膀胱肿瘤抗原（bladder tumor antigen,BTA）以及纤维蛋白降解产物（fibrin degradation products,FDP）,对膀胱移行上皮癌进行诊断,并通过联合检测提高芯片检测性能。利用稀释后的尿液样本和长期冻存的芯片探究其灵敏度和时效性。结果:矩形阵列拥有更好的仿真结果,可用于后续芯片设计和制备;硅烷化时间为30 min时,芯片内特异性抗体的固定效果更好;该芯片能够检测出患者组和志愿者组的尿液样本之间膀胱移行上皮癌细胞和膀胱癌蛋白标志物含量的差异;经过多指标联合检测,提高了芯片检测的敏感性和特异性;此外,利用芯片对稀释到2/3的患者尿液样本进行检测,发现了尿液样本和对照组之间的显着性差异,说明芯片具有良好的灵敏度;最后,在-20℃环境下冻存180天的芯片的检测性能仍没有发生明显改变,说明芯片具有很好的时效性。结论:本研究设计了一种无创检测膀胱移行上皮癌的新型微流控芯片,具有相对优越的阵列结构和预处理条件。通过芯片微柱阵列抓捕膀胱移行上皮癌细胞并同时检测蛋白标志物NMP22、BTA以及FDP,成功实现基于微流控芯片对膀胱移行上皮癌进行诊断。如果基于最大Youden指数求得预测概率的阈值为67.18%时,全指标联合检测的敏感性和特异性可达到85.7%和100%。本研究设计的微流控芯片为临床诊断提供了一个有力的工具,具有早期检测的潜力,在市场化推广方面具备一定的应用前景。
二、膀胱移行上皮癌组织端粒酶活性的检测及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、膀胱移行上皮癌组织端粒酶活性的检测及意义（论文提纲范文）
（2）长链非编码RNA PlncRNA-1通过启动子区的低甲基化调控miRNA-136-5p/Smad3轴促进膀胱癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 PlncRNA-1在膀胱癌组织中的表达及其预测价值 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 PlncRNA-1调控膀胱癌细胞的增殖和EMT |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 PlncRNA-1启动子区的低甲基化可促进其表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 PlncRNA-1通过调控miRNA-136/smad3轴促进膀胱癌的进展 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（3）KNTC1在膀胱癌发生发展中的作用及初步机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 第一部分 KNTC1在膀胱癌组织中的表达以及和临床病理特点的关系 |
| 第二部分 KNTC1体外体内核心功能验证 |
| 第三部分 细胞信号通路蛋白的检测 |
| 结果 |
| 第—部分 KNTC1在膀胱癌组织中的表达以及和临床病理特点的关系 |
| 第二部分 KNTC1体外体内核心功能验证 |
| 第三部分 细胞信号通路蛋白的检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 膀胱癌分子标志物的研究进展及临床应用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织中PSMA表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 膀胱移行细胞癌细胞通过分泌IL-4促进STAT6磷酸化诱导巨噬细胞向M2表型极化的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二章 PSMA抑制剂2-PMPA下调CD31与Sema4D表达的裸鼠皮下移植瘤模型研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三章 PSMA与CD31表达在膀胱移行细胞癌分期和预后中的临床研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 研究总结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）基于生物信息学鉴定CTSV作为膀胱癌诊断和预后的标志物及预后nomogram的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 基于TCGA和 GEO数据库筛选膀胱癌潜在的生物标志物及小分子药物 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 数据下载和整理 |
| 2.1.2 软件及工具 |
| 2.2 差异表达基因的筛选 |
| 2.3 差异基因功能富集分析 |
| 2.4 蛋白互作网络分析和核心基因的筛选 |
| 2.5 核心基因的生存分析 |
| 2.6 生存相关核心基因的相关性分析 |
| 2.7 生存相关核心基因的表达验证 |
| 2.8 差异基因相关小分子药物的筛选 |
| 2.9 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 差异表达基因的筛选 |
| 3.2 差异基因功能富集分析 |
| 3.2.1 差异基因的GO分析 |
| 3.2.2 差异基因的KGGG分析 |
| 3.3 蛋白互作网络分析和核心基因的筛选 |
| 3.4 核心基因的生存分析 |
| 3.5 生存相关核心基因的相关性分析 |
| 3.6 生存相关核心基因的表达验证 |
| 3.7 差异基因相关小分子药物的筛选 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献Ⅰ |
| 第二部分 CTSV在膀胱癌中的表达、临床意义及预后nomogram的构建和评价 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 数据下载和整理 |
| 2.1.2 膀胱癌组织样本 |
| 2.1.3 软件及工具 |
| 2.2 CTSV在膀胱癌中表达及生存的验证 |
| 2.2.1 公共数据库中的验证 |
| 2.2.2 膀胱癌临床标本组织中的验证 |
| 2.3 CTSV的表达与临床病理变量的相关性 |
| 2.4 CTSV与其他核心基因的相关性分析 |
| 2.5 蛋白质互作网络构建 |
| 2.6 基因集富集分析 |
| 2.7 单因素和多因素Cox生存分析 |
| 2.8 预后nomogram的构建和评价 |
| 2.9 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 在TCGA队列中膀胱癌患者的基线资料 |
| 3.2 膀胱癌患者中CTSV的差异性表达 |
| 3.3 CTSV表达水平及生存的验证 |
| 3.4 在TCGA队列中CTSV的表达与临床病理特征的相关性 |
| 3.5 CTSV与其他基因的相关性分析 |
| 3.6 蛋白质互作网络构建 |
| 3.7 使用GESA识别CTSV相关的信号通路 |
| 3.8 临床病理变量的单因素和多因素生存分析 |
| 3.9 预后预测nomogram的构建 |
| 3.10 预后预测nomogram的验证及评价 |
| 3.10.1 区分度评价及模型的内部验证 |
| 3.10.2 一致性分析 |
| 3.10.3 决策曲线分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献Ⅱ |
| 综述 半胱氨酸蛋白酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献Ⅲ |
| 中英文缩略词对照表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）MEG3在膀胱癌T24细胞中甲基化状态对细胞增殖活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| MEG3在恶性肿瘤发生中的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）TP63基因启动子DNA甲基化与宫颈癌的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 宫颈组织标本 |
| 1.1.2 实验主要试剂 |
| 1.1.3 实验仪器和设备 |
| 1.1.4 实验试剂的配置 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 DNA和总RNA的提取 |
| 1.2.2 WGBS和 RNA-seq联合筛查分析 |
| 1.2.3 亚硫酸氢盐测序法(BSP)操作步骤 |
| 1.2.4 实时定量PCR(q PCR)法操作步骤 |
| 1.2.5 染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP) |
| 1.3 统计学处理 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 研究对象一般情况的分析 |
| 1.4.2 宫颈组织中TP63 基因启动子DNA甲基化的WGBS检测 |
| 1.4.3 人宫颈组织的RNA-seq检测及q PCR验证 |
| 1.4.4 BSP法检测宫颈组织中TP63 基因的DNA甲基化度 |
| 1.4.5 TP63基因启动子区生物信息学分析 |
| 1.4.6 CHIP检测RUNX2 在两组中TP63 基因启动子DNA甲基化特异位点的结合情况 |
| 1.4.7 TP63基因DNA甲基化与宫颈癌临床病理参数的关联性分析 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 TP63的结构特征、功能及调节作用 |
| 2.1.1 TP63的结构特征与功能 |
| 2.1.2 TP63的调节作用 |
| 2.2 TP63在不同恶性肿瘤中的研究进展 |
| 2.2.1 TP63在下咽鳞状细胞癌中的研究进展 |
| 2.2.2 TP63在乳腺癌中的研究进展 |
| 2.2.3 TP63在膀胱尿路上皮癌中的研究进展 |
| 2.2.4 TP63基因在其他肿瘤中的研究进展 |
| 2.3 TP63基因与宫颈癌 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（8）TRPM7在膀胱移行细胞癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.标本 |
| 2.一般资料 |
| 3.主要实验仪器 |
| 4.主要实验试剂 |
| 5.实验方法及步骤 |
| 6 结果判定 |
| 7.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.Image J图像软件分析结果 |
| 2.TRPM_7 在 BTCC 中的表达与临床病理参数之间的关系 |
| 3.多因素Logistic回归分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 TRPM_7 与疾病相关研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LINC00612/miR-590/PHF14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LINC00612/miR-590/PHF 14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 展望 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在膀胱癌中表达的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 已发表英文论文 |
| 致谢 |
（10）基于微流控芯片的膀胱移行上皮癌检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 微流控芯片检测癌症概述 |
| 1.2.1 微流控芯片概述 |
| 1.2.2 不同种类的膀胱癌检测芯片 |
| 1.3 本章小结 |
| 2 膀胱癌检测微流控芯片的设计、制备与预处理 |
| 2.1 微流控芯片的设计与仿真 |
| 2.1.1 微流控芯片的设计 |
| 2.1.2 微流控芯片的仿真 |
| 2.2 微流控芯片的制备 |
| 2.2.1 材料与仪器 |
| 2.2.2 制备方法 |
| 2.3 微流控芯片的预处理 |
| 2.3.1 材料与仪器 |
| 2.3.2 预处理方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 微流控芯片仿真结果 |
| 2.4.2 微流控芯片制备结果 |
| 2.4.3 微流控芯片预处理结果 |
| 2.5 讨论 |
| 3 微流控芯片功能实现 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 膀胱移行上皮癌细胞的抓捕和检测 |
| 3.2.2 定量检测膀胱癌蛋白标志物 |
| 3.2.3 芯片灵敏度检验 |
| 3.2.4 芯片时效性检验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 膀胱移行上皮癌细胞的抓捕和检测结果 |
| 3.3.2 膀胱癌蛋白标志物定量检测结果 |
| 3.3.3 联合检测结果 |
| 3.3.4 芯片灵敏度检验结果 |
| 3.3.5 芯片时效性检验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 处理荧光图像的MATLAB程序 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
四、膀胱移行上皮癌组织端粒酶活性的检测及意义（论文参考文献）
- [1]尿液NMP22、BLCA-4在膀胱癌诊断中的应用效果分析[D]. 段宇奇. 华北理工大学, 2021
- [2]长链非编码RNA PlncRNA-1通过启动子区的低甲基化调控miRNA-136-5p/Smad3轴促进膀胱癌进展的机制研究[D]. 康维亭. 山东大学, 2021(11)
- [3]KNTC1在膀胱癌发生发展中的作用及初步机制研究[D]. 黄厚锋. 北京协和医学院, 2021
- [4]肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织中PSMA表达的研究[D]. 王子龙. 山东大学, 2021(11)
- [5]基于生物信息学鉴定CTSV作为膀胱癌诊断和预后的标志物及预后nomogram的构建[D]. 姚志强. 兰州大学, 2021(12)
- [6]MEG3在膀胱癌T24细胞中甲基化状态对细胞增殖活性的影响[D]. 刘俐来. 西南医科大学, 2021(01)
- [7]TP63基因启动子DNA甲基化与宫颈癌的相关性研究[D]. 郑雪. 华北理工大学, 2020(02)
- [8]TRPM7在膀胱移行细胞癌中的表达及意义[D]. 陈绵川. 海南医学院, 2020(01)
- [9]LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究[D]. 缪立英. 苏州大学, 2019(06)
- [10]基于微流控芯片的膀胱移行上皮癌检测[D]. 耿春阳. 大连理工大学, 2019(02)