一、抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析（论文文献综述）
许永亮[1]（2020）在《F型肉毒毒素单克隆抗体的制备及鉴定》文中研究说明肉毒毒素（Botulinum neurotoxin,BoNT）是目前已知毒性最强的天然物质之一,是一种可致死的毒素。BoNT中毒后会抑制处于神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放,造成肌肉松弛性麻痹。BoNT根据其血清型可以分为A～G 7种血清型。人类中毒是由BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F四种血清型引起的。目前没有有效的小分子药物能够治疗BoNT中毒。本研究的目的是制备BoNT/F的单克隆抗体,为开发BoNT/F的有效治疗药物提供了一定的实验依据。本文通过杂交瘤技术和噬菌体抗体库技术来制备针对于BoNT/F的单克隆抗体。首先,以F型肉毒毒素的重链C端（heavy chain carboxy terminal of BoNT serotype F,BoNT/FHc）蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测3次免疫后的小鼠尾血效价,取尾血效价最高小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞,在聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）的作用下进行细胞融合来制备杂交瘤细胞。细胞融合14 d后,利用间接ELISA筛选能够分泌单克隆抗体的阳性细胞孔。获得阳性细胞后,采用有限稀释法对其进行克隆化。利用试剂盒检测杂交瘤细胞上清中分泌抗体的亚型。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞的方法制备单克隆抗体,并利用protein G柱对腹水中的抗体进行纯化。Lowry法测定抗体的浓度,小鼠中和实验测定单克隆抗体的中和效价。然后,间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清效价最高的单克隆抗体1F4和中和效价最高的单克隆抗体1E2（A）这两株单克隆抗体的亲和力常数。通过IgBLAST分析单克隆抗体的可变区氨基酸序列。采用酶切连接的方式将鼠源抗体1E2（A）的可变区基因连接到人源化质粒中,构建嵌合型人源化质粒。最后,利用噬菌体抗体库来筛选BoNT/F的单克隆抗体。噬菌体抗体库构建完成后,以BoNT/FHc为抗原进行筛选,获得单链抗体片段（single-chain antibody fragment,scFv）基因,并分析其序列。BALB/c小鼠经过抗原BoNT/FHc蛋白3次免疫后,小鼠尾血效价均达到1:16000,2号小鼠的效价最高,达到1:32000。细胞融合率为74.47%,阳性率为8.59%。阳性细胞孔经过克隆化之后获得了7株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株1F4、1E2（A）、4B7（A5）、4B7（B2）、4B7（G3）、1E2（B）、4B7（F1）。7株单克隆抗体的重链均为IgG1型,轻链均为κ型。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）电泳结果表明7株杂交瘤细胞在小鼠腹腔内均产生了抗体,经protein G柱纯化后的抗体纯度均大于90%。Lowry法测定纯化后抗体的浓度分别为2.0 mg/mL、1.8 mg/mL、0.5mg/mL、2.7 mg/mL、2.1 mg/mL、2.5 mg/mL、2.8 mg/mL。动物实验结果表明单克隆抗体的中和效价分别为0 LD50/mg、1200 LD50/mg、0 LD50/mg、200LD50/mg、400 LD50/mg、200 LD50/mg、800 LD50/mg。抗体1F4的亲和力常数为1.08×10-8 mol/L,抗体1E2（A）的亲和力常数为8.45×10-5 mol/L。抗体1F4的轻链可变区CDR3序列为QQHYSTPWT,重链可变区CDR3序列为TRHGYFPSWFAY;抗体1E2（A）的轻链可变区CDR3氨基酸序列和重链可变区CDR3氨基酸序列是保密信息。利用分子生物学的方法成功构建了1E2（A）的嵌合型人源化质粒。提取1号小鼠的脾脏RNA,逆转录成cDNA,扩增出300bp左右的抗体轻重链可变区基因,并通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增出750 bp的scFv序列,获得了库容量为1.2×104的鼠源噬菌体单链抗体库。以BoNT/FHc为抗原对获得的抗体库进行筛选,获得了小鼠重链可变区的FR1序列。本研究最终获得了7株单克隆抗体。抗体1F4的亲和力常数为1.08×10-8mol/L,抗体1E2（A）的中和效价为1200 LD50/mg,这为BoNT/F的检测提供新的方法,也为BoNT/F中毒后的治疗奠定了基础;同时,构建了1E2（A）嵌合型质粒,为1E2（A）的人源化及抗体的表达提供了质粒、序列等相关实验数据。
李卓[2]（2017）在《人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定》文中指出肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是一种以发热、出血、急性肾功能损害为特征的急性传染病,通常由汉坦病毒（Hantaviruses,HTV）感染引起,在世界范围内广泛分布,中国是世界上发病人数最多的国家,而陕西省为我国HFRS的高发地区之一。长期以来,我国通过对重点疫区人群进行疫苗接种预防HFRS的发生,因此需要对HFRS疫苗的免疫效果进行定期评价。抗汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）抗体特别是中和抗体（neutralizing antibody,NAb）可直接与HTNV结合,参与机体对病毒的免疫清除。鼠源性抗体因为异源性反应很难应用于人体,目前很少有人源性抗体用于HFRS的紧急预防和治疗,因此,制备具有潜在中和活性的人源性抗体十分必要。本研究在评价了HFRS抗体检测试剂盒和疫苗接种者免疫接种效果的基础上,建立了疫苗接种者的B淋巴母细胞系（Blymphoblastoid cell lines,BLCLs）。将NAb阳性的疫苗接种者和HFRS患者的BLCLs抗体基因重组到噬菌体载体上,建立噬菌体Fab抗体库,筛选HTNV特异性抗体和中和活性抗体,经表达、纯化和鉴定获得了具有潜在中和活性的人源性抗HTNV Fab抗体,为HFRS的紧急预防、治疗以及疾病的诊断提供新的途径。为此,我们进行了以下实验:第一部分:HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化首先,基于HTNV抗体检测的需要,评价了国产与进口HFRS IgG抗体ELISA试剂盒的性能,结果表明国产试剂盒敏感性高,进口试剂盒特异性强。然后,采集疫苗接种者的血液标本,应用EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）转化技术建立了70株疫苗接种者BLCLs,检测了疫苗接种者的血清标本和BLCLs培养上清中HTNV特异性抗体,评价了咸阳地区HFRS疫苗接种的免疫效果。疫苗接种人群血清中HTNV核蛋白（nucleocapsid protein,NP）特异的IgM、IgG抗体以及HTNV NAb的水平和阳性率明显升高,三者具有较好的相关性;最强烈的抗体分泌反应发生在接种疫苗后3个月,与血清检测结果一致,表明针对HFRS的疫苗免疫接种计划在中国西北地区人群中可以有效地诱导体液免疫应答。最后,明确了NAb阳性的BLCLs（占44%）并对BLCLs进行了克隆化,NAb阳性的35株BLCLs（HFRS疫苗接种者与科室保存的患者BLCLs）为构建具有潜在中和活性的噬菌体抗体库提供基因资源;BLCLs的成功克隆化有望为单克隆抗体制备开辟新的途径。第二部分:抗HTNV噬菌体Fab抗体库的构建和筛选提取NAb阳性BLCLs的mRNA并合成cDNA,应用噬菌体展示技术建立了库容量为1.3×109的抗HTNV噬菌体Fab抗体库,Fab的阳性插入率为95%,抗体序列正确率为68%。以HTNV全抗原为靶分子,用固相筛选法经过4轮“吸附-洗脱-扩增”,对洗脱的噬菌体滴度进行测定,结果显示回收率明显增加。筛选前随机克隆测序正确率为68%,第4轮筛选后随机克隆测序正确率为81%;筛选前多样性为95%,第4轮筛选后多样性为31%。经Phage-ELISA检测,最终从第3、4轮筛选的50个克隆中选出了15个序列正确的特异性强的HTNV噬菌体Fab抗体。通过此部分实验,我们成功构建了抗HTNV噬菌体Fab抗体库并对其进行了筛选。第三部分:人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达和中和活性检测将第二部分筛选获得的特异性HTNV Fab噬菌体转染Ecoli.HB2151,诱导表达制备可溶性HTNV Fab抗体,并应用亲和层析法进行纯化。表达及纯化产物经还原电泳检测分析,发现在约25kDa处出现明显目的条带,与Fab的预期大小相符。间接ELISA表明这些可溶性HTNV Fab抗体均能与HTNV特异性结合。病毒中和实验结果显示3个Fab抗体具有中和活性。测序分析了15个Fab抗体轻链和重链可变区氨基酸序列,结果表明这些Fab抗体分属于6个抗体家族,大多数轻链和重链属于V3和V4家族,以IGKV3-20*01、IGHV4-59*01家族为主。同源性分析显示,3个具有中和活性的Fab抗体基因序列来自人胚系基因,未发现与其完全相同的抗体基因序列。第四部分:HTNV感染巨噬样人急性单核细胞白血病细胞系（differentiated THP-1,dTHP-1）诱导内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）反应HTV感染机体后可诱导强烈的免疫应答,但其致病机制尚未明确,我们从ER stress的角度,初步观测了HTNV感染对dTHP-1内质网应激的影响。检测结果显示HTNV感染dTHP-1细胞后,其内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白（78kDa glucose-regulated protein,GRP78）的mRNA和蛋白水平、X盒结合蛋白1（X box-binding protein 1,XBP-1）的mRNA水平均明显升高,表明HTNV感染可以诱导dTHP-1启动ER Stress。而在病毒感染后2h,C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）的mRNA水平在病毒感染组与未感染组无明显差异;凋亡检测结果显示,HTNV感染dTHP-1 12h后细胞未发生明显凋亡;这些结果提示HTNV诱导的ER Stress在病毒感染早期（12h内）并未直接导致dTHP-1凋亡。
于颖,王刚,宋腾飞,孔宁,马晓春,姚永红,肖一红,周恩民[3]（2011）在《PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定》文中指出为制备只包含抗体可变区片段（Fv）的MAb2-5G2单链抗体（scFv）,本研究从分泌MAb2-5G2的杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录制备cDNA作为模板扩增重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。以VH-linker-VL的形式通过重叠PCR制备scFv基因,构建重组表达质粒pEasy-scFv,并在大肠杆菌中获得正确表达。通过western blot和间接免疫荧光鉴定表明scFv蛋白能够被兔抗MAb2-5G2的抗体（Ab3）识别,复性后的scFv蛋白能够特异性结合Marc-145细胞。该研究结果为进一步明确MAb2-5G2结合Marc-145细胞功能区域奠定了物质基础。
张黎[4]（2011）在《人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究》文中研究表明肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒A属,主要引起婴幼儿的手足口病,重症者出现病毒性脑炎、脑膜炎、肺水肿、肺出血,个别病例进展快速,迅速导致死亡。EV71病毒从1969年在美国加尼福尼亚最早被发现以来,至今一共引起了10多次的世界范围的爆发和流行,其中又有四次大的流行。从2008年安徽阜阳爆发EV71以来,卫生部发布《手足口病预防控制指南》并将手足口病纳入丙类传染病来管理。在丙类传染病中手足口病发病数位于第三,而死亡数为第一位。对EV71的感染临床上主要采用广谱抗病毒药物以及对症治疗,但目前没有针对EV71特效抗病毒药物,疫苗正处于研制阶段。所以研究EV71作为一种微生物致病原所引发的机体免疫应答,对明确发病机制、制定预防诊治策略具有重要意义。在EV71抗体的研究方面,目前仅有鼠源的单克隆中和性抗体的报道,而鼠源抗体本身就存在很多缺陷,从而限制了其很多的应用。本文采用了pHAL14系统,构建了人源抗EV71病毒sc-Fv单链抗体基困库,并利用原核表达纯化的VP1蛋白筛选获得了1株抗EV71病毒特异性人源sc-Fv单克隆抗体,并将其分别构建表达成为单链-Fc和IgG形式的全抗体,为进一步研究病毒免疫和抗体结合表位奠定了基础。本研究以噬菌体表面展示技术为平台,筛选人源抗EV71病毒抗体,实验有以下两部分：一,人源抗EV71病毒scFV（?）笨菌体抗体库的构建与筛选采集9位EV71引起的手足口病患儿恢复期外周全血,分离淋巴细胞,然后提取总RNA并反转录成cDNA,接着用特异性的PCR引物经过两轮扩增特异性轻链和重链可变区基因,在对PCR产物鉴定和纯化后,用轻链基因与噬菌粒pHAL14构建了轻链库,随后将重链基因克隆入轻链库中构建scFv噬菌体抗体库。最后使用辅助噬菌体对scFv噬菌体抗体库进行包装,检测库容量,结果表明我们所构建scFV（?）噬菌体抗体库的容量为4.0×108,轻链插入率和重链插入率均为100%,满足筛库的需要。在成功构建scFv噬菌体抗体库的基础上,用原核表达纯化的VP1蛋白对噬菌体抗体库进行富集筛选,利用ELISA、IFA以及Western Blot对所获人源单克隆抗体的功能特性进行鉴定,并通过序列测定确定所获抗体的基因序列,然后与Genebank报道的抗体序列进行比较,根据抗体基因序列推断出其氨基酸序列,与vbase database中抗体序列信息比较,确定其CDR区。结果获得1株scFv抗体,一系列功能试验均证明该抗体是特异针对EV71 VP1蛋白。二,人源抗EV71病毒全抗体表达及功能鉴定在原核表达scFv抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和昆虫杆状病毒载体技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。将该EV71抗体的轻链和重链的可变区基因插入杆状病毒载体pCMX2.51和pAc-L-CH3R,然后将构建好的重组质粒转染293T细胞和与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,通过IFA检测转染效果,接着对昆虫细胞表达上清进行纯化。利用SDS-PAGE、ELISA、IFA、Western Blot等方法检测纯化的抗EV71病毒IgG全抗的功能活性,结果表明该人源单克隆抗体特异性针对EV71病毒VP1蛋白。在和A型以及两株C4亚型EV71病毒进行中和试验,结果显示该抗体没有中和活性。综上所述,本研究运用噬菌体抗体库技术,成功构建了人源抗EV71病毒scFv噬菌体抗体库,筛选获得了1株特异性针对EV71病毒VP1蛋白的人源单链抗体。将该抗体构建为IgG全抗体,经IFA、Western Blot检测显示具有功能活性,与A型和C4亚型的病毒中和试验结果显示没有中和活性。
周伟[5]（2008）在《抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体在拟南芥中的表达及其免疫学特性的初步研究》文中研究指明汉滩病毒（HTNV）主要引起肾综合征出血热（HFRS）,迄今尚无特异、有效的治疗药物。抗HTNV鼠源性单克隆抗体（mAb）,虽然有较好的抗病毒作用,但应用于人体可能产生抗鼠抗体。而人源性mAb制备困难、产量低,目前也难以应用。基因工程抗体在原核系统中表达虽然产量较高,但由于其受加工修饰功能的限制,会影响表达产物的生物学特性;而真核表达又存在表达量低的难题。运用合适的植物表达系统表达抗体不仅表达产量高,而且由于植物表达系统有良好的加工修饰功能,其表达产物能保持良好的生物学特性。本研究用基因工程技术构建了鼠/人嵌合抗体基因,并将其导入拟南芥内,尝试在植物体内表达,主要方法和结果如下:1.将抗HTNV鼠源性mAb 3G1的可变区基因及人抗体恒定区基因进行拼接,构建了植物嵌合表达载体3G1MH-pCAMBIA2301,转化入根瘤农杆菌中,利用根瘤农杆菌介导的抽真空转基因技术转化野生型拟南芥,获得转基因植株。提取T0代转基因植株基因组DNA,应用针对轻、重链序列的特异性引物进行PCR检测,筛选出整合有目的基因的阳性植株。以轻、重链探针对RNA进行Northern Blot检测,检测出完整的轻、重链RNA,证明转基因植株构建成功。2.针对抗体轻、重链核苷酸序列设计特异性引物,对转基因植物的cDNA进行实时荧光定量PCR检测,结果显示不同转基因植株间的RNA转录量存在差异,挑选出轻、重链转录量较高的5株表达株系,通过以抗人Kappa链及抗人Fc段抗体分别做Western Blot检测,结果显示有目的蛋白的表达,但表达的蛋白分子量小于预期大小,实验提示抗体的Fc段可能存在一定程度的降解。3.以HTNV感染细胞为抗原,植物蛋白提取物为待测抗体,羊抗人Kappa链抗体为一抗,FITC标记的兔抗羊抗体为二抗做间接免疫荧光检测,结果证明目的蛋白具有与HTNV抗原的结合活性。本研究对基因工程抗体在植物体系中的表达进行了有益的探索,提供了有用的理论和实验依据。
陶泽新[6]（2007）在《汉坦病毒结构蛋白基因的克隆、序列分析和表达研究》文中认为汉坦病毒（hantavirus，HV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）汉坦病毒属。在临床上引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）和汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS）。汉坦病毒共有30多种基因型和血清型，但中国目前为止仅发现汉滩型（Hantaan，HTN）、汉城型（Seoul，SEO）和普马拉型（Puumala，PUU），均为HFRS的病原体。HFRS临床上以发热、出血和肾损害为主要特征，它包括朝鲜出血热、流行性出血热和流行性肾病，每年在欧洲和亚洲有近10万病例发生。较早的报道可追溯到苏联在1913和1932年，日本军队1932年在满洲里，瑞典在1934年的暴发流行。自从1978年李镐汪等从疫区的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来，各国学者相继分离到不同型别的汉坦病毒。引起HFRS的汉坦病毒包括HTN型、SEO型、多不拉伐—贝尔格莱德型（Dobrava，DOB）和PUU型，分别引起重度、中度和轻度的临床症状。1993年HPS首先在美国的四角地区暴发，临床上早期出现发热、寒战等前驱症状，然后是突发性的呼吸困难，严重者导致死亡，病死率高，震惊了美国的公共卫生官员和病毒学家。研究表明该病毒病原为SN型汉坦病毒，由鹿鼠携带，随后又从不同地区的HPS病人体内分离到NY、BCC、BAY、AND等不同型别汉坦病毒。在我国尚未有HPS病例的报道。各种鼠类是汉坦病毒重要的宿主和传染源，他们各自携带不同的型别汉坦病毒。携带HTNV的黑线姬鼠主要在东亚和东欧，携带DOBV的黄颈喉姬鼠出现在南斯拉夫及邻近地区，携带PUUV的欧洲棕背鼠存在于西北欧地区，而由褐家鼠携带的SEOV在世界范围内广泛存在。汉坦病毒引起的HFRS在我国发病率高，是重点防治的传染病之一。中国HFRS病人总数占世界发病人数的90％以上，每年新发病例数4～6万。而山东省是HFRS的高发省份，年发病人数在我国常年位于前3位，2003年前则为全国第一位。山东省已发病例数占全国总病例数的1／3。可见山东省防治HFRS的工作具有极为重要的现实意义。山东引起HFRS的汉坦病毒以SEO型为主，也有HTN病毒存在，是混合疫区。对HFRS的诊断和防治归根结底取决于对其病原学的研究进展，包括病毒分离、病毒基因及蛋白质的结构与功能的研究、分子流行病学、新型疫苗、新型诊断试剂的研究与开发等，其中对汉坦病毒的基因进行分析和分子流行病学研究又是最根本和最基础的研究。而山东省分离全片段测序的病毒株太少，对它们的分子生物学性质尚缺乏深入研究。汉坦病毒颗粒为圆形或卵圆形，外层是包膜，表面有突起，由G1和G2糖蛋白（glycoprotein，GP）组成。包膜内为病毒核酸、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）和RNA聚合酶组成的核衣壳，病毒体中核衣壳蛋白成分很高。病毒基因组为单股负链RNA，由长（L）、中（M）、短（S）三个节段组成，分别编码依赖RNA的RNA多聚酶，G1和G2包膜糖蛋白和核衣壳蛋白。G1、G2包膜糖蛋白对病毒的致病性起重要作用，包含了病毒的中和抗原位点、受体结合位点、融合肽和血凝位点。M片段中G1、G2的编码顺序为NH2-G1-G2-COOH。M片段首先编码产生一个126 kD的糖蛋白前体（glycoprotein precursor，GPC），然后在翻译的同时被细胞内的信号肽酶切割成G1、G2两个蛋白，组成异二聚体表达在内膜系统，部分转运至细胞膜表面，切割位点为一段绝对保守的WAASA的氨基酸序列。G1、G2共表达是二者在胞内有效转运和行使功能的基础。G1、G2富含半胱氨酸残基，维持了异源二聚体在内膜系统管腔内高度有序的空间结构。G1、G2蛋白共有5～7个N—连糖基化位点，在二聚体蛋白的正确折叠中起一定作用。G1、G2蛋白N-端都有典型的信号肽序列，C-端为跨膜区和膜内区，但至今尚未能确定G1蛋白的C-端的真正构成，因为HV的G1蛋白C-端在胞内容易被蛋白酶降解，这也成为细胞中糖蛋白表达水平低的原因之一。病毒的糖蛋白在高尔基体膜表面累积成熟后，包裹由N蛋白和基因组RNA形成的核衣壳，在高尔基体膜上出芽，通过内膜系统的转运释放到胞外。M片段基因的变异速度是三个节段中最快的，是决定HV毒力的主要因素。HV的核衣壳蛋白在感染的细胞中高度表达，形成大颗粒状或丝状的包涵体，在包裹病毒基因组RNA、组装病毒颗粒中起重要作用。核衣壳蛋白的氨基酸序列较为保守，其免疫原性很强。其N-端的氨基酸主要是亲水性的，具有高度的抗原保守性，几乎所有的人类HV血清抗体都能识别此区；中间部分主要是亲水性区域，在不同的HV中变异较大，含有RNA结合部位。C-端则较为保守。核蛋白刺激机体产生的抗体效价比G1、G2糖蛋白高。HFPS病人血清中抗核蛋白抗体出现最早，1周后，几乎所有病人的抗核蛋白抗体均为阳性。因此，利用分子生物学技术，体外获得核蛋白的工程蛋白，并在此基础上建立新的血清学方法，是新型诊断试剂研究的热点之一。HV的膜融合方式为pH依赖型，即HV先以受体介导的内吞方式进入细胞后，在胞内体低pH值环境下，包膜糖蛋白G1、G2结构发生变化，暴露出内部融合肽，从而触发融合。国内外学者先后证明了体外培养的不同类型的HV病毒株在酸性条件下都能引起Vero E6细胞的融合。HTN型HV致细胞融合作用的是包膜糖蛋白G1、G2，NP的共表达与否不会增减G1、G2的融合活性。在传代细胞株中，仅有40代以内的Vero E6细胞可以在HV感染后或重组表达G1、G2后产生细胞融合现象，而BHK-21、Vero细胞和过度传代（＞150）的Vero E6细胞则不会产生融合。目前尚没有确定SEO型HV糖蛋白在细胞内的重组表达是否能够引起细胞融合现象的产生。细胞融合作用是多种病毒增殖、扩散和致病过程中不可缺少的一步，因此对汉坦病毒膜融合的研究具有广泛的意义。本研究构建了汉坦病毒ZB8株M片段和JUN5-14株S片段的克隆载体，测定了基因序列，研究了山东分离的汉坦病毒毒株的遗传和变异的分子水平特点；通过M和S片段对山东分离的汉坦病毒毒株进行系统发生树分析，阐述汉坦病毒，尤其是山东株的分子流行病学特点，了解HV的变异规律，为进一步采取免疫和预防措施提供理论基础；将NP基因在BHK21细胞上做瞬时表达，对其表达特点进行了研究，并观察其做为底物检测流行性出血热病人血清中抗体的效果；构建了NP基因的酵母表达载体，并让其在毕赤酵母中得到稳定表达，检测表达特点，为构建以重组NP为底物的血清学检测试剂盒奠定基础；构建糖蛋白基因的真核表达载体，并使糖蛋白基因在Vero E6细胞中表达，观察其细胞融合现象，为糖蛋白结构和功能关系的研究、研制汉坦病毒基因工程亚单位疫苗奠定基础。一、山东株M和S片段的基因克隆和序列分析本研究为避免病毒在细胞传代引起的突变，直接从汉坦病毒感染鼠的鼠肺标本中，提取病毒RNA，根据SEO型HV的核苷酸序列及相关文献，设计引物，利用RT-PCR的方法，扩增出ZB8株HV全M片段和JUN5-14株HV S片段的NP全编码序列。并将PCR扩增片段连接T载体，并转化感受态大肠杆菌DH5α。酶切结果鉴定正确。测序后证实为SEO型HV序列。M和S片段的克隆，为研制新型诊断试剂，开发基因工程疫苗，以及结构蛋白的功能研究奠定了基础。我们对获得的M和S片段序列特征进行了分析。ZB8株的M片段基因序列测定长度为3651bp，其中A碱基1107个，T碱基1097个，C碱基682个，G碱基765个，GC含量为39.6％。开放性阅读框架（open reading frame，ORF）的位置位于47～3448 bp，编码由1133个氨基酸组成的包膜糖蛋白前体。JUN5-14株的S片段编码区基因序列测定长1290bp，其中A碱基403个，T碱基292个，C碱基257个，G碱基338个，GC含量为46.1％。编码由429个氨基酸组成的NP。我们还利用TmPred和DNAStar等软件预测了GP和NP的跨膜区、二级结构及其他蛋白质信息。我们使用DNAStar软件将测序结果与GenBank中国内外病毒株的相应序列进行了同源性分析。结果表明，JUN5-14株S片段的核苷酸序列与SEO型的各毒株的同源性在87.6～97.8％之间；ZB8株M片段的核苷酸序列与SEO型的各毒株的同源性在84.1～99.0％之间；M片段3′NCR的核苷酸序列是整个M片段中变异最频繁的部位，而5′NCR的核苷酸序列是最为保守的。虽然JUN5-14和ZB8与SEO其他各株的核苷酸序列相比变异较大，但是其氨基酸序列高度保守，同源性分别高达98.1～99.8％和96.9～99.6％之间。系统发生树分析表明：山东株JUN5-14和ZB8株均属于SEO病毒第三亚型。与浙江分离株（Z37、ZT10、ZT71、Zy27），北京分离株BiHD01，以及河北分离株93HBX12序列相近。其中在基于M片断序列的发生树上，ZB8株与山东GM04-38株亲缘关系最近。序列分析研究探讨了山东HV变异规律，为检测和控制HV的流行提供了有力的分子水平的依据。二、汉坦病毒JUN5-14株NP基因在BHK21细胞中的表达和重组NP的抗原性分析本研究通过基因克隆的方法，以质粒pUCm-S为模板，应用PCR方法扩增出NP的全长基因，并在基因两端创建相应的酶切位点，重组入质粒pBluscriptⅡSK+载体的T7启动子下游。酶切和测序鉴定正确，重组载体称为pBSK-NP。将重组载体转染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞中，表达2～3天后，用间接免疫荧光实验（indirect immunofluorescence assay，IFA）与SDS-PAGE和免疫印记观察蛋白的表达情况。IFA结果显示NP基因在BHK21细胞中得到了表达，在细胞中呈核周分布。SDS-PAGE和免疫印记也在48kD分子量处观察到了阳性条带。蛋白具有良好的免疫反应性，能与抗汉坦病毒特异性抗体发应。在IFA实验中，我们用重组蛋白，检测了17份HFRS病人血清和20份正常对照血清，结果显示该法检测血清抗体的敏感性为94.1％，特异性高达100％。证明了JUN5-14株NP是良好的诊断用靶抗原，为NP功能的研究，以及下一步NP基因的稳定表达和诊断试剂盒的研制奠定了基础。三、汉坦病毒JUN5-14株NP基因在毕赤酵母表达系统中的表达和抗原性分析以质粒pUCm-S为模板，应用PCR方法扩增NP的全长基因，并在基因两端创建相应的酶切位点。NP基因与pGAPZαA载体均经双酶切后连接，转化大肠杆菌DH5α，经Zeocin筛选并测序，建立了表达载体pGAPZ-NP，并酶切、测序鉴定。结果显示双酶切出现相应长度的片段，测序证实NP基因无任何突变，插入了表达载体启动子下游，并与上游信号肽序列和下游C-Myc和His6序列编码框融合。NP基因的表达质粒pGAPZ-NP经AvrⅡ线性化后用LiCl法转化酵母菌，在YPD（含100μg／ml Zeocin）平板上两次筛选，挑出单菌落，于液体YPD中培养，并在不同时点收集培养物，用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。SDS-PAGE分析显示NP基因在毕赤酵母中得到高效稳定表达，在48h时表达量达到最高，之后趋于稳定，上清和细胞中均有蛋白表达。Western-blot分析结果表明上清和细胞中的重组NP都能与抗HV的阳性血清反应。证明所表达的NP一部分在信号肽的引导下分泌出细胞外，并经过折叠形成了正确的构象。提示NP基因在酵母菌中成功表达，且免疫反应性良好，为血清学诊断的研制奠定基础。四、糖蛋白基因的瞬时表达本研究采用PCR和基因克隆技术，将ZB8株G1、G2基因分别克隆到表达载体pCAGGS／MCS，酶切和测序鉴定正确后，将表达载体pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共转染Vero E6细胞，酸性MEM处理后观察细胞融合现象的产生。并以IFA观察糖蛋白的表达情况。结果显示在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2，IFA显示荧光信号分布在细胞浆中。二者的共表达可以产生良好的生物学活性，在酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合，而转染pCAGGS-NP的细胞没有融合现象发生。共表达也未出现明显的促进效应。本研究首次从基因水平证实了SEO型HV产生细胞融合现象的结构存在于糖蛋白G1和G2中，为糖蛋白结构与功能研究，制备有效的亚单位疫苗奠定了科学基础。从本实验结果可得出结论：本实验成功构建了含有汉坦病毒ZB8株全M片段核苷酸序列的克隆以及JUN5-14株全S片段编码区的克隆。两株病毒均是SEO型汉坦病毒，为第三亚型。表达载体pBSK-NP能在感染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞内有效地表达出NP，蛋白具有良好的免疫反应性，在IFA实验中用来检测血清抗体的敏感性和特异性均比较高，是良好的诊断用靶抗原。成功构建了含有HV NP全基因的酵母表达载体，所表达的蛋白免疫反应性良好。在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2，二者的共表达可以产生良好的生物学活性，在酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。本课题为阐明SEO型HV的遗传和变异规律，检测和控制HV的流行提供了有力的分子水平的依据，为进一步研究开发新型HV诊断试剂创造了有利条件，并且为进一步研究GP的结构与功能，制备有效的亚单位疫苗奠定了坚实基础。
刘兵[7]（2007）在《人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体研究》文中认为前言肾综合征出血热（HFRS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属（Hantavirus）的病毒引起的一种高病死率的传染病。我国是受其危害最严重的国家，大约90％的病例发生在我国，由于其临床表现复杂，并发症多，尚无特效治疗方法，其病死率可达5％。目前，汉坦病毒的检测方法还存在许多缺陷，不能为临床治疗提供及时可靠的早期诊断依据，因而，常常错过最佳治疗时机。HFRS致病机理的研究更是进展缓慢，HFRS致病机理还不清楚。因此，研究汉坦病毒的检测和HFRS的治疗与致病机理具有重要的实际意义。应用噬菌体抗体库技术可筛选出人源抗汉坦病毒抗原抗体，经载体表达出可溶性scFv。可溶性scFv具有穿透力强、容易到达靶细胞等优点，可广泛应用于汉坦病毒的检测及HFRS的治疗和致病机理研究。因此，为表达可溶性抗NP抗原scFv，并初步用于诊断汉坦病毒感染，本研究拟将提取的肾综合征出血热患者外周血淋巴细胞总RNA，扩增VH和VL抗体基因，并合成scFv基因，与T7噬菌体载体连接，构建T7噬菌体抗体库，用汉坦病毒76-118核衣壳蛋白（NP）抗原筛选出特异性噬菌体抗体。并从阳性克隆中扩增出scFv基因，克隆入表达载体pGEX-6p-1，表达出可溶性scFv，再初步应用可溶性单链抗体制备双单链抗体夹心试剂，检测血清中汉坦病毒NP抗原，建立敏感特异的肾综合征出血热诊断方法。实验方法一、scFv抗体基因的合成应用淋巴细胞分离液常规分离HFRS恢复期患者外周血淋巴细胞，用RNAout提取总RNA。以总RNA为模板，以oligo（dT）为引物，反转录合成VH基因和VL基因的cDNA第一条链。设计并合成VH基因和VL基因两端简并引物，并在VH基因5’端引物引入EcoRⅠ，在VL基因引物3’端引入HindⅢ酶切位点。PCR合成VH基因和VL基因，以VH基因和VL基因为模板，SOE PCR拼接scFv抗体基因。二、T7噬菌体抗体库的构建回收SOE PCR扩增scFv基因，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切scFv基因，电泳后凝胶回收双酶切scFv基因与已用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的T7 Select10-3b噬菌体载体的2个臂，经T4DNA连接酶连接。用T7噬菌体包装提取物包装连接反应产物，铺板测定包装效率和scFv基因插入率。接种宿主菌BLT5403，增殖重组T7噬菌体，铺板测定抗体库的滴度。三、T7噬菌体抗体库的筛选以重组汉坦病毒76-118 NP抗原包被酶标板，BSA封闭，加入T7噬菌体抗体库，室温孵育30 min，TBST洗涤5次，1％SDS洗脱抗体库，所得噬菌体抗体即为次级噬菌体抗体库，感染宿主菌BLT5403扩增后，可用于下一轮筛选。滴定次级噬菌体抗体库的滴度，并计算每一轮筛选噬菌体投入／产出比（回收率）作为特异性噬菌体抗体富集的指标，重复上述步骤4次。四、酶免疫实验检测抗体活性将上述筛选所得的抗体库铺板，随机选取噬菌斑，在BLT5403内扩增，以NaCl和PEG 8000纯化噬菌体抗体。用1％戊二醛偶联噬菌体抗体和辣根过氧化物酶（HRP），加过量10％甘氨酸封闭未反应的戊二醛。同时，将野生噬菌体与辣根过氧化物酶偶联，作为阴性对照。将酶偶联噬菌体抗体和阴性对照，分别加入汉坦病毒G1、G2包膜蛋白和NP抗原包被的酶标板，37℃孵育1h，TBST洗涤5次，加邻苯二胺和H2O2底物，37℃作用15min，2M H2SO4终止反应，在492nm波长用酶标仪检测OD值，样品A492／阴性对照A492＞2者，为阳性。五、pGEX-6P-1-scFv重组质粒的构建选择抗体活性最高T7噬菌体抗体在BLT5403中增殖，酚氯仿法提取T7 DNA，对T7噬菌体中scFv进行测序。设计并合成scFv基因简并引物，并在其5’端和3’端引物中引入BamHⅠ和SalⅠ切酶位点。以提取的T7噬菌体DNA为模板，以合成的scFv简并引物为引物，PCR扩增scFv基因。回收PCR扩增的scFv基因，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切scFv基因和pGEX-6p-1载体，电泳后凝胶回收双酶切scFv基因和pGEX-6p-1载体大片段，16℃连接4小时，转化E．coli BL-21（DE3）感受态菌。涂于Amp平板培养基，37℃培养过夜。六、重组质粒的筛选及鉴定挑取单个菌落，Amp LB液体培养基培养，碱裂解法粗提质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳初筛阳性质粒，再用BamHⅠ和SalⅠ分别双酶切及PCR扩增法对重组质粒进行鉴定并对scFv测序。七、scFv融合蛋白的表达和纯化及SDS-PAGE检测和酶免疫检测LB（含50μg／ml Amp）液体培养基培养含有pGEX-6P-1-scFv质粒的E．coliBL-21（DE3）菌株。加入IPTG至终浓度为1mM，诱导scFv融合蛋白表达。离心收集菌体，悬浮于PBS，超声破碎。GST凝胶亲和层析纯化scFv融合蛋白。常规SDS-PAGE检测scFv融合蛋白。酶免疫鉴定可溶性单链抗体scFv生物活性，方法同四、。八、酶标抗体的制备和血清标本检测1％戊二醛偶联辣根过氧化物酶和纯化的可溶性单链抗体，并用聚乙二醇浓缩。以可溶性抗NP单链抗体包被酶标板，BSA封闭酶标板。样品血清每孔加样50μl，37℃反应1h，PBST洗涤5次，加酶标抗体100μl，PBST洗涤5次。显色及结果判断同步骤四、。结果一、scFv抗体基因的合成用淋巴细胞分离液共分离得到1.5×107肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞。RNAout提取总RNA，电泳后呈明显的3条带，即28 S RNA，18 S RNA和5 S RNA，A260nm／A280nm的比值为1.8，说明提取的总RNA完整且纯度好。RT-PCR扩增VH基因和VL基因，两者分子大小约为400bp，与理论估计值大小一致，用SOE PCR将VH基因和VL基因连接成scFv基因，分子大小约为750bp，与理论估计值大小一致。二、T7噬菌体抗体库的构建噬菌体抗体库构建后，测定DNA包装效率为1.5×107／μg DNA。测定scFv基因的插入率为90％，其库容为1.35×107。初级噬菌体抗体库滴度为2.12×1010PFU／mL。三、T7噬菌体抗体库的筛选用NP抗原对噬菌体抗库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，噬菌体抗体得到约60倍的富集。四、酶免疫实验检测抗体活性随机挑取第4轮筛选产物23个克隆，与辣根过氧化物酶偶联，与用汉坦病毒G1、G2包膜蛋白和NP抗原包被的酶标板特异性反应。酶免疫结果显示，19株具有抗原特异性结合活性，其中有2株具有较高的NP抗原特异性结合活性。五、pGEX-6P-1-scFv重组质粒的构建将亲和力最高的T7噬菌体抗体，在BLT5403中增殖。提取T7噬菌体DNA，干燥后溶于TE，1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见36 kbT7 DNA噬菌体。测序证实获得scFv序列。以T7噬菌体DNA为模板，PCR扩增scFv基因，经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测为750bp，与预期的scFv片段大小相同。六、重组质粒的筛选及鉴定碱裂解法粗提质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳初筛阳性质粒，阳性质粒经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后，成5.0kb和750bp两条明显条带，酶切鉴定结果表明成功构建了pGEX-6P-1-scFv重组质粒。同时通过PCR扩增方法对重组质粒进行了鉴定，获得了750bp扩增产物，证实获得了含scFv基因片段的重组质粒。测序结果显示，质粒中scFv与T7噬菌体相同。七、scFv融合蛋白的表达和纯化及SDS-PAGE检测和酶免疫检测将含有pGEX-6P-1-scFv质粒的E．coliBL-21（DE3）菌株培养，加入IPTG诱导，诱导融合蛋白表达，超声破碎菌体，GST凝胶于层析柱纯化单链抗体融合蛋白。10％SDS-PAGE凝胶电泳，检测到纯化的融合scFv分子量大小为56KDa，与预期的结果相同，酶免疫检测具有NP抗原结合功能。八、酶标抗体的制备和血清标本检测以1％戊二醛溶液偶联纯化的可溶性scFv和HRP，聚乙二醇浓缩酶标记抗体至1 ml。双单链抗体夹心法检测56份HFRS患者血清中，检测出29例阳性，阳性率为51.79％，对照组66例，检测结果均为阴性。讨论本研究所构建噬菌体抗体库库容为1.35×107，scFv基因的插入率为90％，测定DNA包装效率为1.5×107／μg DNA，初级噬菌体抗体库的滴度为2.12×1010PFU／mL，经过4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选噬菌体得到约60倍的富集，酶免疫实验显示有2株具有较高的NP抗原特异性结合活性。这些数据与国内姚龙泉等学者所建文库非常相似。T7噬菌体优点是所展示的蛋白质的分子量很大，其最大展示蛋白的分子为1200氨基酸，这是M13噬菌体无法达到的。T7噬菌体的另一大优点是它极为稳定，能在各种严酷的条件下不被破坏，而其它噬菌体常在亲和淘洗过程中失活。此外，T7生长极为迅速，T7噬菌体形成噬斑仅需3小时，这可以大大缩短研究周期。在引物设计方面，设计一对VH简并引物扩增出大部分VH基因，设计一对VL简并引物扩增出大部分VL基因，既最大限度地扩增出了多样的抗体基因，又减少了引物的使用，简化了操作，节约了时间。同时在VH的羧基端基因和VL的氨基端基因引入编码连接肽（Gly4Ser）3序列，通过SOE PCR法直接将VH基因和VL基因拼接成VH-（Gly4Ser）3-VL形式的scFv，这样大大简化了基因重组过程。目前大多数研究只是从噬菌体库中筛选出相映抗体。而本研究进一步将scFv基因克隆到pGEX-6P-1上，表达出可以最终应用的可溶性单链抗体。融合scFv分子量约为56Kda，包括30Kda单链抗体和26Kda载体蛋白，载体蛋白一般不影响单链抗体的功能，而且载体蛋白有利于蛋白纯化，必要时可以被蛋白酶完全切掉。双单链抗体夹心法，与传统的双抗体夹心法相比其最大优势之一是其造价低廉。通过基因工程技术，在大肠杆菌中生产出单链抗体比通过杂交瘤技术在培养细胞中生产的单克隆抗体更节约时间且成本低廉，还容易操作。双单链抗体夹心法检测56份患者血清和对66例对照，在56份HFRS患者血清中，检测出29例阳性，阳性率为51.79％，在对照组中为检测结果均为阴性。目前认为，病程早期以病毒血症为主，在肾综合征出血热的病程晚期，机体免疫功能发挥作用，病毒逐渐被清除，不易在患者血清中检出病毒抗原。由此推测，本研究中25例未检出NP抗原标本可能在病程晚期。结论本研究运用噬菌体抗体库技术构建了人源单链T7噬菌体抗体库，库容量为1.35×107，初级噬菌体抗体库的滴度为2.12×1010PFU／mL。经酶免疫实验筛选到2株具有较高的与NP抗原特异性结合活性噬菌体抗体。研究中成功构建了融合蛋白表达载体pOEX-6P-1-scFv，获得了高效表达的可溶性scFv，酶免疫实验显示，可溶性scFv具有较高的NP抗原特异性结合活性。首次用大肠杆菌表达的抗NP单链抗体，成功制备了双单链抗体夹心诊断试剂，成功用于诊断汉坦病毒感染。
朱艳[8]（2006）在《抗人CD28单链抗体和嵌合抗体转移载体的构建及单链抗体基因在BmN细胞中的表达》文中研究指明CD28分子是表达于T淋巴细胞表面的跨膜糖蛋白,参与介导T细胞活化所需的协同刺激信号,属于免疫球蛋白超家族。已有的研究表明,CD28单克隆抗体对肿瘤、自身免疫性疾病及移植排异等均具有重要的治疗意义,但体内长期使用会降低治疗效果。为了降低人抗鼠免疫反应,必须在临床应用前对CD28单克隆抗体进行改造。本研究在对抗人CD28单克隆抗体进行改造的基础上,成功构建了杆状病毒转移载体,并在BmN细胞中进行表达。主要成果如下:1、将抗人CD28鼠源性单抗的可变区基因和人IgG1的恒定区基因,采用一种不需要限制性核酸内切酶和连接酶的新方法——三引物PCR（TP-PCR）法拼接成嵌合抗体基因,分别插入杆状病毒转移载体pAcUW3的ph和p10启动子后,成功构建了抗人CD28的重组转移载体pAcUW3/CD28-vH-γ1,vL-κ。2、采用TP-PCR法,将抗人CD28单抗的重、轻链可变区基因和人工设计的昆虫杆状病毒多角体蛋白基因偏好的连接肽序列,拼接成抗人CD28单链抗体基因,并将其插入昆虫杆状病毒转移载体pBacPAK8的ph基因启动子后,构建成重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv。基因拼接时,在抗体链段的C端增加了6×His tag序列,便于表达产物的纯化。3、采用脂质体介导的方法将重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv和线性化的Bm-BacPAK6共转染BmN细胞,利用空斑分析以及蓝白斑筛选相结合的方法,筛选出重组杆状病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv,并用PCR方法对此重组病毒进行了鉴定。4、将重组病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv接种BmN细胞,定期收取感染细胞,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blotting分析。结果表明,在分子量约为28kD处有一清晰的亮带,说明抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞中得到了特异性表达。表达始于24h,表达峰在72h。抗人CD28单链抗体和嵌合抗体基因转移载体的成功构建及抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞中的表达为抗人CD28基因工程抗体的研制奠定了基础。
陈佳[9]（2005）在《应用蛋白芯片和免疫PCR技术高效检测汉滩病毒的研究》文中指出肾综合征出血热（HFRS）是我国广泛流行的一种人兽共患的急性病毒性传染病,目前该病在我国的发病率占全球总数的90%,病死率为3%～10%,是除病毒性肝炎外危害最大的一类病毒性疾病。肾综合征出血热（HFRS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属病毒引起的自然疫源性传染病,临床表现复杂多样,病情变化较快,给临床诊断带来一定困难。目前,血清学检测方法仍然是HFRS的主要检测手段,但是以往的血清学诊断方法,如间接免疫荧光试验、斑点免疫结合试验、带状免疫斑点试验等敏感性和特异性不够高,因此有必要建立一种高灵敏的、高特异的、简便的HFRS辅助诊断技术。汉坦病毒核蛋白抗原（NP）在人体液免疫反应中起重要作用,据此本研究针对上述需求发展了由单链抗体（scFv）介导的免疫荧光蛋白质芯片和免疫PCR检测方法。将抗汉滩病毒核蛋白的单链抗体基因与碱性磷酸酶基因融合,获得了碱性磷酸酶介导的检测抗体;将单链抗体用Cy3 标记以及将抗体基因C 末端融合SBP基因,表达出的融合蛋白可以与链霉亲和素修饰的荧光纳米颗粒结合,实现了在蛋白质芯片上检测汉滩病毒核蛋白。本研究由单链抗体介导的免疫荧光蛋白质芯片检测方法,可在短时间内检测到10 pg/ml 的核蛋白;通过应用免疫-PCR方法检测到了更低浓度的核蛋白（10 fg/ml）,这些方法的灵敏度都高于传统的ELISA（1 μg/ml）检测方法。另外,我们初步尝试了应用荧光高聚物实施NP 的均相检测,相比于其他方法,它是非常简便迅速,几分钟内可检测到10 ng/ml的核蛋白。
李先富,唐家琪,王长军,白薇,潘秀珍[10]（2004）在《抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析》文中指出目的 克隆和分析抗汉滩病毒单克隆抗体 （McAb）H7可变区基因。方法 根据鼠源抗体可变区 （V）氨基酸序列 ,设计合成一组抗体重、轻链可变区 （VH/VK）简并引物。采用一步法提取McAbH7细胞总RNA ,通过RT-PCR扩增V基因 ,并进行核苷酸序列测定和分析。结果 通过RT -PCR成功克隆了H7可变区重轻链基因 ,序列分析表明均为开放阅读框 ,符合小鼠抗体框架结构 ,含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区 ,与抗体二硫键形成有关的两个特征性半胱氨酸亦高度保守。同源对比表明 ,H 7-VK长 3 57bp ,编码 119个氨基酸 ,属JK4重排 ;H 7-VH长 3 60bp ,编码 12 0个氨基酸 ,属JH4重排。经GenBank查询证实为新基因 ,登记号为AY 2 4560 1和AY2 4560 2。结论 McAbH7可变区基因的获得 ,为有目的地开展HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究奠定了基础
二、抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析（论文提纲范文）
（1）F型肉毒毒素单克隆抗体的制备及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肉毒毒素 |
| 1.2 BoNT/F |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 单克隆抗体 |
| 1.5 鼠源抗体的人源化 |
| 1.6 M13辅助噬菌体 |
| 1.7 噬菌体抗体库技术 |
| 1.8 本课题研究目的及意义 |
| 1.9 本课题研究内容 |
| 第2章 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验动物及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液、培养基 |
| 2.1.4 主要仪器及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠免疫 |
| 2.2.2 间接ELISA测定小鼠尾血血清效价 |
| 2.2.3 骨髓瘤细胞的处理 |
| 2.2.4 饲养层细胞的制备 |
| 2.2.5 细胞融合 |
| 2.2.6 阳性细胞的筛选 |
| 2.2.7 有限稀释法克隆化 |
| 2.2.8 抗体亚型鉴定 |
| 2.2.9 抗体的制备及纯化 |
| 2.2.10 Lowry法测定抗体的浓度 |
| 2.2.11 抗体中和效价测定 |
| 2.2.12 抗体亲和力常数测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠尾血效价测定结果 |
| 2.3.2 细胞融合率及阳性率 |
| 2.3.3 抗体亚型鉴定结果 |
| 2.3.4 SDS-PAGE鉴定腹水中抗体的表达 |
| 2.3.5 SDS-PAGE鉴定抗体的纯化结果 |
| 2.3.6 抗体的浓度 |
| 2.3.7 抗体中和效价测定结果 |
| 2.3.8 抗体亲和力常数测定结果 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 抗体人源化质粒的构建 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 3.2.2 1E2(A)人源化质粒的构建 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定抗体的可变区基因 |
| 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定人源质粒的酶切 |
| 3.3.3 人源化质粒的鉴定结果 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 噬菌体抗体库的构建及筛选 |
| 4.1 实验仪器及材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 溶液的制备 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 小鼠脾脏RNA的提取 |
| 4.2.2 cDNA的合成 |
| 4.2.3 抗体可变区基因的扩增 |
| 4.2.4 scFv基因的制备 |
| 4.2.5 噬菌体质粒的扩增 |
| 4.2.6 scFv基因和噬菌体载体的酶切与连接 |
| 4.2.7 感受态的制备 |
| 4.2.8 感受态电转效率测定 |
| 4.2.9 质粒的电转 |
| 4.2.10 辅助噬菌体的制备 |
| 4.2.11 辅助噬菌体的滴度测定 |
| 4.2.12 噬菌体抗体库的筛选 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠脾脏RNA的提取结果 |
| 4.3.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定抗体的可变区基因 |
| 4.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定scFv基因 |
| 4.3.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定噬菌体质粒的酶切 |
| 4.3.5 TG1感受态的电转效率 |
| 4.3.6 噬菌体抗体库库容量 |
| 4.3.7 辅助噬菌体的滴度 |
| 4.3.8 噬菌体抗体库的筛选结果 |
| 4.3.9 测序结果的比对与分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
（2）人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 汉坦病毒概述 |
| 2 汉坦病毒人工制备抗体研究进展 |
| 3 病毒感染与内质网应激 |
| 第一部分 HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化 |
| 实验一 国产与进口人HFRS IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能比较 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 利用EBV转化技术建立HFRS疫苗接种者BLCLs |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 中国西部地区人群HFRS疫苗接种后的抗体反应 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 具有潜在中和活性的HTNV噬菌体抗体库的构建及筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达及中和活性的检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 HTNV感染巨噬样人急性单核白血病细胞（dTHP-1）诱导内质网应激（ER stress）反应的初步探讨 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（3）PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 P CR扩增可变区基因 |
| 2.2 原核重组表达质粒的构建 |
| 2.3 s cFv基因诱导表达 |
| 2.4 重组蛋白s cFv的复性及鉴定 |
| 2.4.1 重组蛋白scFv的western blot分析 |
| 2.4.2 重组蛋白scFv的IFA鉴定 |
| 3 讨论 |
（4）人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人源抗EV71病毒scFv噬菌体抗体库的构建与筛选 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 人源抗EV71病毒全抗体表达及功能鉴定 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 人源抗发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒基因工程抗体的研究 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（5）抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体在拟南芥中的表达及其免疫学特性的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 汉坦病毒结构蛋白免疫学特性分析 |
| 2 HTNV 抗体研究的现状 |
| 3 植物抗体的研究现状 |
| 4 农杆菌在转基因植物研究中的应用 |
| 正文 |
| 实验一 抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因植物载体的构建 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体在拟南芥中的表达、鉴定及其免疫学特性初步研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）汉坦病毒结构蛋白基因的克隆、序列分析和表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、汉坦病毒简介 |
| 二、国内外对HV结构蛋白的研究情况 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 结果 |
| 一、M、S片段的扩增及克隆载体构建结果 |
| 二、序列分析 |
| 三、核衣壳蛋白基因的瞬时表达 |
| 四、核衣壳蛋白基因在毕赤酵母细胞中的稳定表达 |
| 五、包膜糖蛋白基因的瞬时表达 |
| 讨论 |
| 一、汉坦病毒ZB8、JUN5-14株的序列分析 |
| 二、核衣壳蛋白基因的真核瞬时表达 |
| 三、核衣壳蛋白基因在毕赤酵母细胞中的表达和检测 |
| 四、糖蛋白基因在Vero E6细胞中的表达和细胞融合现象的观察 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 附录、附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（7）人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体研究（论文提纲范文）
| 一、摘要 |
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 二、英文缩略语 |
| 三、论文 |
| 论文一 人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白T7 噬菌体抗体库的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文二 可溶性抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆及表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文三 双单链抗体夹心法检测汉坦病毒感染的初步研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 四、本研究创新性自我评价 |
| 五、参考文献 |
| 六、附录 |
| 综述 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）抗人CD28单链抗体和嵌合抗体转移载体的构建及单链抗体基因在BmN细胞中的表达（论文提纲范文）
| 学位论文独创性声明 |
| 学位论文使用授权声明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 综述 |
| 第一部分 昆虫杆状病毒表达载体系统的研究与应用进展 |
| 第二部分 基因工程抗体的研究进展及临床应用 |
| 第二章 抗人CD28嵌合抗体重组转移载体的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三章 抗人CD28单链抗体重组转移载体的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第四章 抗人CD28 ScFv重组杆状病毒的构建、筛选和鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第五章 抗人C28单链抗体（ScFv）基因在BmN细胞中的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 1 研究成果及创见 |
| 2 存在问题与工作展望 |
| 在读期间公开发表的研究论文 |
| 致 谢 |
（9）应用蛋白芯片和免疫PCR技术高效检测汉滩病毒的研究（论文提纲范文）
| 第1章 引言 |
| 第2章 汉滩病毒HTNV76-118 株S 片段的克隆及高效表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 S 基因的 PCR 扩增 |
| 1.3 表达质粒的构建和转化 |
| 1.4 核蛋白在 E.coli 中的诱导表达 |
| 1.5 核蛋白的Ni~(2+)-NTA 亲和柱纯化 |
| 1.6 Western blot 检测 |
| 1.7 ELISA 检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 汉滩病毒 S 基因的 PCR 扩增及表达载体的构建 |
| 2.2 核蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 2.3 免疫学检测结果 |
| 3 讨论 |
| 第3章 抗汉滩病毒核蛋白(NP)scFv 融合蛋白的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 试剂与材料 |
| 1.1.4 PCR primers |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 PCR 扩增碱性磷酸酶的编码基因 |
| 1.2.2 融合蛋白表达载体的构建 |
| 1.2.3 大肠杆菌的转化 |
| 1.2.4 融合蛋白的诱导表达 |
| 1.2.5 融合蛋白的纯化 |
| 1.2.6 融合蛋白质生物活性的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 融合蛋白表达载体的构建 |
| 2.2 融合蛋白大肠杆菌中的高效表达 |
| 2.3 融合蛋白质双功能生物活性的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 连接肽在融合蛋白表达中的作用 |
| 3.2 融合蛋白scFv-EAP 的作用 |
| 3.3 融合蛋白scFv-SBP的作用 |
| 第4章 汉滩病毒的蛋白芯片检测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 刻孔芯片的制备 |
| 1.2 扫描芯片的制备 |
| 1.3 抗原片的制作 |
| 1.4 利用scFv-EAP 在蛋白芯片上检测汉滩病毒核蛋白 NP |
| 1.5 利用Cy3标记的scFv检测汉滩病毒核蛋白 |
| 1.6 基于单链抗体与荧光纳米颗粒检测汉滩病毒核蛋白 |
| 1.7 基于单克隆抗体与荧光纳米颗粒检测汉滩病毒核蛋白 |
| 1.8 直接 ELISA 检测汉滩病毒核蛋白 |
| 1.9 实际样品的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 利用scFv-EAP 在蛋白芯片上检测汉滩病毒核蛋白NP |
| 2.2 利用 Cy3 标记的单链抗体在蛋白芯片上检测汉滩病毒核蛋白 |
| 2.3 利用scFv-SBP和纳米荧光颗粒在蛋白芯片上检测汉滩病毒核蛋白 |
| 2.4 利用单克隆抗体和荧光纳米颗粒在蛋白芯片上检测汉滩病毒核蛋白 |
| 2.5 ELISA 检测结果 |
| 2.6 实际样品的检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 蛋白质芯片的制作 |
| 3.2 信号检测分子 |
| 3.3 实际样品的检测 |
| 第5章 免疫PCR检测汉滩病毒核蛋白 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 单克隆抗体的纯化和生物素化修饰 |
| 1.2 生物素化 Marker DNA 的制备 |
| 1.3 免疫 PCR 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第6章 基于水溶性荧光聚合物快速灵敏检测汉滩病毒的初步研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pH 值对聚合物 MPS-PPV 荧光强度的影响 |
| 2.2 聚合物的表征 |
| 2.3 生物传感器的构建 |
| 3 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表和待发表文章 |
| 致谢 |
（10）抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 引物设计 |
| 1.2 杂交瘤细胞 |
| 1.3 质粒和受体菌 |
| 1.4 主要试剂 Reverse transcription kit及Taq DNA聚合酶为Promega产品;mRNA |
| 1.5 总RNA提取 |
| 1.6 逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) |
| 1.7 重组体构建及序列测定[8] |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞总RNA提取 |
| 2.2 可变区基因克隆 |
| 2.3 重组克隆序列测定和氨基酸推导分析 |
| 3 讨论 |
四、抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析（论文参考文献）
- [1]F型肉毒毒素单克隆抗体的制备及鉴定[D]. 许永亮. 辽宁大学, 2020(01)
- [2]人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓. 第四军医大学, 2017(05)
- [3]PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定[J]. 于颖,王刚,宋腾飞,孔宁,马晓春,姚永红,肖一红,周恩民. 中国预防兽医学报, 2011(06)
- [4]人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究[D]. 张黎. 中国疾病预防控制中心, 2011(04)
- [5]抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体在拟南芥中的表达及其免疫学特性的初步研究[D]. 周伟. 第四军医大学, 2008(02)
- [6]汉坦病毒结构蛋白基因的克隆、序列分析和表达研究[D]. 陶泽新. 山东大学, 2007(04)
- [7]人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体研究[D]. 刘兵. 中国医科大学, 2007(05)
- [8]抗人CD28单链抗体和嵌合抗体转移载体的构建及单链抗体基因在BmN细胞中的表达[D]. 朱艳. 苏州大学, 2006(12)
- [9]应用蛋白芯片和免疫PCR技术高效检测汉滩病毒的研究[D]. 陈佳. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2005(02)
- [10]抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析[J]. 李先富,唐家琪,王长军,白薇,潘秀珍. 中国公共卫生, 2004(01)