PCR和PCR-RFLP对常见皮肤癣菌的临床鉴定

PCR和PCR-RFLP对常见皮肤癣菌的临床鉴定

一、Clinical Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR and PCR-RFLP(论文文献综述)

袁飞飞[1](2020)在《青岛市528例浅部真菌病及其致病菌种分析》文中研究说明目的:调查青岛大学附属医院皮肤科就诊患者浅部真菌病及其致病菌种的构成与分布情况,分析浅部真菌病在不同性别、年龄及季节中的分布特点。从而为浅部真菌病的预防、临床诊断及合理用药提供科学参考依据。方法:收集2018年5月~2019年5月在青岛大学附属医院3个院区(市南院区、崂山院区、黄岛院区)皮肤科门诊就诊、具有典型浅部真菌病临床特征的患者,取其患处的皮屑、甲屑及病发等进行真菌镜检和真菌培养,选取镜检和培养结果均为阳性的病例纳入研究对象;对培养阳性的菌株通过观察菌落颜色及其形态进行初步鉴定,进一步通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测系统进行准确鉴定,质谱检测系统未鉴定出的少见疑难菌株行核糖体DNA(rDNA)ITS区序列测定,记录菌种的鉴定结果。对病种和病原菌种的构成情况进行统计,并从性别、年龄、季度方面分别进行整理,通过SPSS 25.0统计软件对所得结果进行统计分析。结果:分离鉴定出的致病真菌中皮肤癣菌371株(70.27%),酵母菌146株(27.65%),曲霉菌8株(1.52%),其他条件致病菌3株(0.57%);其中皮肤癣菌中红色毛癣菌250株(47.35%),须癣毛癣菌92株(17.42%)。收集的528例皮肤浅部真菌病依次为甲真菌病132例(25.00%)、足癣115例(21.78%)、股癣83例(15.72%)、花斑糠疹61例(11.55%),体癣57例(10.80%),手癣32例(6.06%),马拉色菌毛囊炎29例(5.49%),皮肤黏膜念珠菌病13例(2.46%),头癣6例(1.14%)。甲真菌病患者标本中主要分离出红色毛癣菌78株(59.09%),酵母菌25株(18.94%),须癣毛癣菌22株(16.67%);手癣和足癣患者标本中主要分离出红色毛癣菌86株(58.50%),须癣毛癣菌42株(28.57%),酵母菌10株(6.80%);体癣和股癣患者标本中主要分离出红色毛癣菌85株(60.71%),须癣毛癣菌28株(20.00%),酵母菌8株(5.71%);头癣的主要病原真菌为:犬小孢子菌5株(83.33%),红色毛癣菌1株(16.67%)。不同性别、年龄段、季节中浅部真菌病的分布特点存在一定差异。股癣(χ2=33.905,P<0.05)及体癣(χ2=8.705,P=0.003)患者中男性构成比明显高于女性,甲真菌病(χ2=22.381,P<0.05)及足癣(χ2=-9.488,P=0.002)患者中女性构成比高于男性,差异具有统计学意义;股癣(χ2=14.568,P=0.024)、马拉色菌毛囊炎(χ2=22.067,P=0.001)、甲真菌病(χ2=14.102,P=0.029)及花斑糠疹(χ2=15.709,P=0.015)在不同年龄段之间构成比的差异具有统计学意义,股癣、马拉色菌毛囊炎患者在21~30岁年龄组所占比例最大,甲真菌病及花斑糠疹在31~40岁年龄组所占比例最大,而头癣(χ2=92.281,P<0.05)患者多集中在≤10岁年龄组;足癣(χ2=14.257,P=0.025)、股癣(χ2=11.152,P=0.048)及花斑糠疹(χ2=12.458,P=0.039)在不同季节构成比的差异具有统计学意义,足癣、股癣及花斑糠疹在夏季所占比例大于其他三个季节,而甲真菌病(χ2=4.425,P=0.219)在不同季节间的分布差异无统计学意义。结论:本院皮肤科浅部真菌病就诊患者的致病真菌以皮肤癣菌为主,其中红色毛癣菌为首位致病菌,须癣毛癣菌次之。甲真菌病为最常见浅部真菌病病种,其次为足癣及股癣。皮肤浅部真菌病各病种的致病菌分布特点不同,其中甲真菌病病原菌中酵母菌所占比例上升,体癣及股癣致病菌种的构成与本地区之前报道相比有所变化。男性患者多于女性;其中股癣及体癣患者男性明显多于女性,而甲真菌病及足癣患者中女性多于男性。股癣、马拉色菌毛囊炎、甲真菌病及花斑糠疹患者多见于中青年,头癣患者主要为青少年。足癣、花斑糠疹及股癣在夏季最为常见,而甲真菌病在每个季节的分布差别不大。

葛力瑜[2](2020)在《许兰毛癣菌的表型与基因型研究及其基因组和转录组学研究》文中进行了进一步梳理第一部分许兰毛癣菌的表型与基因型研究目的:了解我国新疆和华东地区许兰毛癣菌的分子流行病学特征,并研究其基因型与表型和地域来源之间联系。方法:(1)收集我国新疆和华东地区的头癣患者的53株许兰毛癣菌临床分离株,对rDNA内转录间隔区(ITS)、翻译延伸因子1-α(TEF1-α)、钙调蛋白(CaM)和大亚基D1/D2区(LSU)基因进行PCR扩增、测序、序列鉴定和系统发育分析。(2)在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)平板上28℃培养14天,观察其菌落形态特征。采用尿素培养基、牛血清白蛋白培养基、吐温80和吐温20培养基分别检测其产生尿素酶、蛋白酶和脂肪酶的能力。(3)采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术分析了许兰毛癣菌临床分离株的遗传多样性,并探讨了基因型与表型和地域来源之间联系。结果:(1)我国不同区域收集的许兰毛癣菌ITS、TEF1-α、CaM和LSU基因片段种内个体间无序列差异。许兰毛癣菌及其近缘种ITS基因的核苷酸多态性水平最高。(2)许兰毛癣菌临床株根据菌落形态分为三型。尿素酶试验分别有16.7%阳性、31.5%弱阳性和51.8%阴性。吐温80和吐温20脂肪酶试验分别有85.2%和92.6%阳性。蛋白酶的活性均为阳性。(3)基于AFLP数据的UPGMA聚类分析,许兰毛癣菌临床株分为6个基因型,与其表型和地域来源无显着相关性。结论:本研究结果表明ITS基因更适合作为分子标记应用于许兰毛癣菌及其近缘种的分子鉴定和分类。许兰毛癣菌具有表型和基因型多样性,但是基因型与其表型和地域来源无显着相关性。第二部分许兰毛癣菌的基因组和转录组学研究目的:通过基因组和转录组学研究许兰毛癣菌利用角蛋白(角化组织的主要成分)的关键基因和通路,预测潜在的毒力因子和新的治疗靶点。方法:(1)联合二代和三代高通量测序数据获得许兰毛癣菌T2s全基因组。预测并注释编码基因、非编码RNA,预测分泌蛋白组。(2)利用RNA-seq技术检测许兰毛癣菌在角蛋白、大豆蛋白和沙氏葡萄糖液体培养基中生长的mRNA表达谱。(3)对差异表达基因进行分析,初步推断出其利用角蛋白的关键基因和通路,开发新的治疗靶点。结果:(1)T2s全基因组包含16条scaffold,全长序列为23.4Mb。T2s基因组中预测到7474个编码基因和167个非编码基因,424个编码分泌蛋白的基因。(2)以沙氏葡萄糖液体培养基为对照组,在角蛋白培养基中2394个基因上调,614个基因下调;在大豆蛋白培养基中1943个基因上调,356个基因下调。(3)许兰毛癣菌在角蛋白培养基中生长时,编码蛋白酶、氨基酸通透酶和小肽转运蛋白的基因表达显着上调。此外,潜在的毒力因子ABC转运蛋白和MFS转运蛋白也被强烈激活。同时,碳同化作用相关的基因被抑制,氮同化作用相关的基因被激活。随着角蛋白培养基变碱性,pH响应信号转导途径被激活。编码麦角甾醇生物合成途径中关键酶的基因ERG3、ERG4、ERG6、ERG27和ERG11/CYP51显着上调。结论:我们使用二代和三代测序数据进行联合组装,获得了一个高质量的许兰毛癣菌基因组。但是皮肤癣菌的比较基因组学研究结果显示它们的基因组组成和含量差异不大,这表明基因调控和转录机制的差异可能是其表型差异的原因。许兰毛癣菌通过分泌蛋白酶水解蛋白质变为游离氨基酸和寡肽,然后通过转运蛋白将游离氨基酸和寡肽转运至细胞内。因此蛋白水解酶和膜转运蛋白可能是许兰毛癣菌潜在的毒力因子。许兰毛癣菌的能量代谢特点有利于其适应并成功定植于宿主的角化组织。

刘加[3](2020)在《絮状表皮癣菌基因组、转录组及与宿主相互作用机制的研究》文中研究表明皮肤癣菌病为全球第四大常见疾病,且皮肤癣菌感染后极易复发。絮状表皮癣菌为临床上常见的皮肤癣菌之一,易感染皮肤以及甲,头发感染甚为少见。在印度、伊朗等国家其感染发病率可高于红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌等常见皮肤癣菌。絮状表皮癣菌在分类学上单独成属,其在致病性和生态习性上也有着独特的一面。因絮状表皮癣菌为亲人性皮肤癣菌,缺乏相应的动物模型,现有的分子、组学等研究工具也仅应用于毛癣菌属和小孢子菌属的皮肤癣菌,目前有关絮状表皮癣菌的基本特征,包括分子生物学、组学、致病机制等研究还有很多空白,因此本文主要侧重从这些方面对絮状表皮癣菌展开系统的研究,以揭示絮状表皮癣菌的生物学特征以及与宿主相互作用的具体机制。首先我们对本实验室收集到的19株絮状表皮癣菌进行体外形态和酶解反应的分析,结果表明絮状表皮癣菌在土豆培养基上可呈现4种不同的形态特征,角蛋白酶和脂酶活性比其他临床常见皮肤癣菌弱可能与其易感部位、生态习性有一定的相关性。利用多基因位点(ITS、CHS-1、BT2、LSU)分型和AFLP的方法将絮状表皮癣菌分为四种主要的基因型,但未能证实这种分型与形态、酶解活性以及地域有相关性。在本文的第二章中我们联合二代和三代测序技术完成了对絮状表皮癣菌的高质量全基因组测序,对基因组进行功能注释发现絮状表皮癣菌自身有一套完整的能量和核酸代谢系统以适应不同的环境。通过比较基因组分析发现絮状表皮癣菌基因组为现有皮肤癣菌基因组中最大的,且存在方向的不一致性,推测这种现象与其基因组中的Tf2和Tc1-mariner转座子相关。在全基因组水平进行系统进化分析发现絮状表皮癣菌与石膏样奈尼兹皮菌系统发育关系最近,进一步比较分析得出絮状表皮癣菌的生态习性和致病特点可能与以下因素有关:1)黏附因子的种类和数量尤其是 1,3-beta-glucanosyltransferase gel3;2)角蛋白水解有关的 Cdo1、sub1、sub3、sub7的数量;3)CAzy家族中的CEs和CBMs的数量;4)LysM结构域的种类和数量;5)丝氨酸/苏氨酸蛋白结构域。另外我们在分子和基因组的水平揭示了絮状表皮癣菌采用经济节约的无性繁殖的方式进行繁殖,交配型为MAT1-2型。最后我们利用RNA-seq和dual RNA-seq技术对絮状表皮癣菌在体外以及与人HaCaT细胞互作的基因表达进行分析研究,主要目的是为了揭示絮状表皮癣菌的蛋白水解及与宿主相互作用过程中的关键调控基因,为临床上的分子标记和靶向治疗奠定基础。研究结果表明与起源关系最近的石膏样奈尼兹皮菌相比,絮状表皮癣菌在蛋白水解的各个环节都有其独特的调控机制。金属蛋白酶和DPPV为絮状表皮癣菌蛋白水解的关键调控基因,FAD、MFS转运蛋白、磷脂酶D为絮状表皮癣菌入侵宿主细胞的重要毒力因子,KRT75基因的表达可能与毛发的感染有关,CDC7蛋白激酶可能为无性繁殖的关键调控机制之一。对于细胞而言,絮状表皮癣菌的入侵造成了其结构和功能的破坏,与此同时,与细胞增殖分化、细胞骨架、细胞外基质重塑等有关的基因表达上调以对抗絮状表皮癣菌造成的损伤。

杨婷[4](2020)在《伊曲康唑联合特比萘芬乳膏治疗泛发性皮肤癣菌病疗效观察》文中进行了进一步梳理目的:观察伊曲康唑联合特比萘芬乳膏治疗泛发性皮肤癣菌病的疗效。方法:收集2019年1月至2019年12月就诊于川北医学院附属医院皮肤科并诊断为泛发性皮肤癣菌病患者的临床资料;将泛发性皮肤癣菌病患者随机分为实验组及对照组。实验组给予口服伊曲康唑胶囊100mg 2次/d,共2周,同时外用1%特比萘芬乳膏2次/d,共4周;对照组单独外用1%特比萘芬乳膏2次/d,共4周。在治疗2周后、4周后分别对两组患者的临床疗效、真菌清除率及安全性进行综合评估。结果:入选患者共计55例,其中男性36例,女性19例,男女比例为:1.89:1;年龄9-72岁,平均年龄为36.56±18.78岁;病程1-48月,平均病程10.52±11.33月;病情积分6-10分,平均病情积分8.00±0.94分;实验组28例,对照组27例。治疗前实验组和对照组性别、年龄、病程、病情积分比较,结果无统计学意义,具有可比性;治疗2周后,实验组有效率为32.14%,对照组有效率为11.11%,两组有效率比较有统计学差异(P<0.05),实验组有效率高于对照组。治疗4周后,实验组有效率为100%,对照组有效率为88.89%,两组有效率比较无统计学差异(P>0.05)。治疗2周后,实验组真菌清除率为35.71%,对照组真菌清除率为11.11%,结果有统计学差异(P<0.05),实验组真菌清除率高于对照组。治疗4周后,实验组真菌清除率为96.43%,对照组真菌清除率为88.89%,两组真菌清除率比较无统计学差异(P>0.05),但实验组轻微高于对照组。两组患者治疗后均无明显不良反应发生。结论:对于泛发性皮肤癣菌病,采用口服伊曲康唑联合特比萘芬乳膏治疗相较单独外用特比萘芬乳膏治疗而言,改善症状较为迅速,有利于快速清除真菌,安全可行。但足疗程后两组患者疗效无明显差异。

徐娟,吴伟伟,郑文爱,赵飞,张玲,龚杰,张建中[5](2019)在《基于高分辨率熔解曲线的常见五种皮肤癣菌分子鉴定》文中研究表明皮肤癣菌是浅表真菌感染的重要致病菌,常见致病菌种包括红色毛癣菌、趾间毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌和内弯小孢子菌。本研究基于实时荧光PCR的高分辨率熔解曲线分析技术,以几丁质合成酶1为目标基因设计扩增引物,对经测序鉴定的上述5种皮肤癣菌进行熔解曲线分析,并在方法建立后,对已鉴定的临床菌株进行验证。实验结果表明,使用该方法上述5种皮肤癣菌均能扩增,并表现出不同的熔解曲线和熔解温度值,可有效区分;对其余对照菌及人基因均无法扩增,特异性为100%;临床菌株的熔解曲线分析结果与DNA测序结果一致。本研究提供了一种快速、准确鉴别5种常见皮肤癣菌的方法,可为临床应用和分子流行病学研究提供参考。

姜伟伟[6](2019)在《常见皮肤癣菌感染LAMP-微流控高通量诊断芯片的研发》文中提出皮肤癣菌是临床常见的浅部真菌,它是一种丝状真菌,常侵入富含角蛋白的基质中生长,病变累及人的皮肤、毛发和指甲(趾甲)等。临床上常见的皮肤癣菌分为3个属:毛癣菌属(Trichophyton spp.)、小孢子菌属(Microsporum spp.)和表皮癣菌属(Epidermophyton spp.),主要包括红色毛癣菌(T.rubrum)、须癣毛癣菌(T.mentagrophyte)、紫色毛癣菌(T.violaceum)、断发毛癣菌(T.tonsurans)、疣状毛癣菌(T.verrucosum)、许兰毛癣菌(T.schoenleinii)、犬小孢子菌(M.canis)、石膏样小孢子菌(M.gypseum)、铁锈色小孢子菌(M.ferrugineum)和絮状表皮癣菌(E.floccosum)等30余种致病菌种。皮肤癣菌引起的皮肤感染是最高发的浅部真菌病,随着我国人口逐渐进入老龄化状态、临床免疫抑制剂的广泛应用,以及外用糖皮质激素制剂的滥用,浅部真菌病的发病率呈逐年升高趋势。目前,临床针对皮肤癣菌感染的诊断仍以镜检+培养为主,通过显微镜观察有无孢子或菌丝,培养之后主要依赖总菌落形态和分生孢子及其他菌丝结构的显微特征帮助鉴别,并辅之以交配实验和生化测试,如脲酶测试或营养测试等。但镜检阳性率低,且对技术人员操作要求较高,无法将真菌鉴定至种属水平。而培养耗时较长,一般要2周左右。组织病理检查对于浅部的皮肤癣菌感染无实际临床意义,患者主观上很难接受。临床皮肤癣菌感染的样本量巨大,急需一种既能快速诊断、又兼顾成本效益的早期诊断方法。为了更好的解决临床真菌感染的早期诊断需求,一系列针对病原真菌核酸、蛋白的分子诊断技术已进入实验研究阶段,其中部分技术在临床中已经获得一定的应用。分子诊断技术通过针对病原微生物自身蛋白、核酸等具有特异性成分或序列片段的分析鉴别到达准确诊断的目的,此类技术特异性强、灵敏度高、从取材到报告整个流程耗时短,可在1天内,甚至数小时完成诊断。本研究将环介导等温扩增技术与微流控芯片载体相结合,试图开发一套能实现早期快速诊断,同时高效、价廉的诊断方法。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种可以在恒温条件下实现核酸高倍扩增的技术,该扩增技术消除了聚合酶链式反应(PCR)所需的温度循环,同时获得了类似的扩增产量。LAMP技术不仅特异性强、敏感度高,而且因其恒温扩增的原理对实验条件要求不高,便于临床推广。目前,LAMP技术已经被应用于多种真菌、病毒、细菌以及分枝杆菌等病原微生物的诊断。而微流控芯片技术是使用微管道进行实验反应和样本检测等,具有微型化、集成化等特点。根据通道的设计,可以在芯片上产生所需的微环境条件,利用微流控芯片技术可以实现短期内数十甚至上百例样本的同时鉴定。本研究是针对皮肤癣菌的三个属分别设计对应的三套属引物,引物的设计首先通过Pubmed将各属内的皮肤癣菌菌种rDNA(包括18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S等)序列下载下来,经Geneious软件分析比对,寻找属内各菌种高度近似的目的靶基因,该靶基因片段要与其他属的菌种序列或者系统进化树上临近菌种的序列明显不同。然后利用LAMP引物设计软件Primer ExplorerV4设计引物(两个外引物,F3和B3;两个内引物,FIP和BIP,为缩短反应时间时可增加环引物LB和LF)。然后筛选引物,优化反应体系,并测试体系的特异性和敏感性,接着将验证后的体系装入微流控芯片中进一步验证,最后利用搜集的临床标本进行临床验证。研究共用菌株113株,其中包括红色毛癣菌20株、须癣毛癣菌20株、紫色毛癣菌11株、断发毛癣菌4株、疣状毛癣菌3株、许兰毛癣菌8株、犬小孢子菌16株、铁锈色小孢子菌3株、絮状表皮癣菌6株,常见念珠菌5株,马拉色菌5株,曲霉4株,青霉2株,红酵母2株,细菌4株,和人DNA(sigma)1份。各属内菌种核酸为对应属引物的阳性样本,其他菌株核酸为对照样本。经研究发现LAMP技术对毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属内的常见皮肤癣菌鉴定特异性可以达到100%,在敏感性上可以达到1×102拷贝/μL左右。验证后反应体系在微流控芯片中也得到了很好的验证,特异性与敏感性同LAMP技术。

孙瑞晗[7](2018)在《金属蛋白酶1在皮肤癣菌鉴定中的应用研究》文中进行了进一步梳理目的:比较通用引物ITS序列和金属蛋白酶1在皮肤癣菌属、酵母菌属、霉菌属扩增的敏感性;探讨金属蛋白酶1联合限制性内切酶Hinf I在皮肤癣菌菌种鉴定中的敏感性和特异性,为临床诊治提供理论依据。方法:1、采集2016年11月至2017年5月在山西医科大学第二医院门诊拟诊手足癣、体癣和甲真菌病的患者125例,记录患者一般信息情况,用75%的酒精消毒皮损后,用钝刀刮取患处和正常皮肤交界处的皮屑或者甲屑,将标本大致分为两份,一份滴加10%KOH液,光镜下观察;另一份接种于含氯霉素的沙堡弱培养基置于25℃恒温培养箱中培养,培养两周至四周,分别观察结果并记录;2、统计镜检阳性的病例数,培养阳性的病例数并记录结果;3、培养阳性的菌株纯化后用传统的氯化苄方法提取DNA。再分别用ITS4、ITS86和金属蛋白酶1特异性引物扩增并进行比较分析。金属蛋白酶1联合限制性内切酶Hinf I对目的片段进行酶切,并依据酶切后的片段大小进行菌种的鉴定。结果:1、共收集临床病例125例,其中确诊真菌感染的病例62例,临床标本中镜检阳性标本31例(35.2%),培养阳性菌株57例(64.7%)。其中菌落形态似皮肤癣菌属45例,酵母菌属12例,霉菌属5例。经限制性内切酶酶切鉴定红色毛癣菌40例,犬小孢子菌5例。2、临床菌株在培养基上菌落形态多样,大致可分为三种:酵母菌属菌落呈柔软、光滑、奶酪状;皮肤癣菌属菌落形态呈白色绒毛状、羊毛状、粉末状,部分菌落基底有不同的色素沉着;霉菌属菌落形态呈疏松、干燥、不透明,棉絮状、网状、灰黑色,灰绿色等有颜色的菌落。3、ITS4、ITS86通用引物扩增培养阳性标本均出现大约300-400bp左右大小的片段,但片段大小差异不大,不能具体鉴定到种;通用引物对不同属的临床真菌扩增具有普遍适用性;菌落形态似皮肤癣菌属的菌株经金属蛋白酶1基因设计的特异性引物扩增后出现大约700bp左右的条带,而菌落形态学似酵母菌属和霉菌属的菌株均未扩增出明显的目的条带。4、金属蛋白酶1基因设计的特异性引物扩增产物采用Hinf I酶切后可将红色毛癣菌切为133bp、255bp、358bp三条片段;犬小孢子菌则切为277bp、447bp两条片段。结论:1、我们采用镜检和培养进行临床诊断,镜检方法方便、快速,但阳性率较低,培养方法阳性率比镜检结果高,相比文献报道阳性率低,该方法可以鉴定到属,但不能到种,仍具有一定的临床诊断价值;2、在我科临床浅部真菌病感染中红色毛癣菌仍是最常见、最主要的致病菌;3、通用引物具有普遍适用性,对常见的皮肤癣菌属、酵母菌属、霉菌属均具有敏感性;但具体鉴定到菌种需联合限制性内切酶酶切;4、首次采用金属蛋白酶1对于临床常见的皮肤癣菌进行鉴定,结果具有较高的敏感性,联合特异性限制性内切酶Hinf I酶切后可以具体鉴定到菌种,对于临床中常见的皮肤癣菌感染诊断价值更高,可以作为传统方法的辅助性诊断方法。

朱仁衡[8](2017)在《泛发性皮肤癣菌病病原菌鉴定与致病因素分析》文中研究表明目的:对泛发性皮肤癣菌病患者进行致病菌种鉴定及临床分析,观察泛发性皮肤癣菌病患者与体(股)癣患者致病菌种分布有无区别,探讨引起泛发性皮肤癣菌病的可能致病因素。方法:1、搜集2016年1月至2016年12月就诊于川北医学院附属医院皮肤科并临床诊断为体(股)癣(对照组)及泛发性皮肤癣菌病患者(实验组)的临床资料,进行真菌镜检及培养,使用真菌通用引物ITS1及ITS4扩增核糖体基因,对PCR产物进行序列测定,将测序结果与GenBank数据库比对。最终对比分析实验组及对照组致病菌种分布的差异性。2、搜集体(股)癣患者及泛发性皮肤癣菌病患者临床资料,探讨引起泛发性皮肤癣菌病的可能致病因素。结果:1、在37例泛发性皮肤癣菌病患者中,年龄分布于3岁到85岁之间,平均年龄39.86?3.37岁,平均病程584.92?132.52天,男女比例为1∶0.54,40岁以上患者占51.4%,城镇农村比为1∶1.18;在35例体(股)癣患者中,年龄分布于2岁到70岁之间,平均年龄31.20?3.01岁,平均病程67.37?14.54天,男女比例为1∶1.19,40岁以上患者占31.4%,城镇农村比为1∶0.75。2、所有实验组患者不同皮损处致病菌种均一致。实验组共鉴定出四种皮肤癣菌,红色毛癣菌25例,须癣毛癣菌9例,石膏样小孢子菌2例,断发毛癣菌1例。对照组共鉴定出三种皮肤癣菌,红色毛癣菌27例,须癣毛癣菌7例,石膏样小孢子菌1例。3、对实验组患者做临床分析得出:32例患者有长期使用糖皮质激素史(外用29例,口服1例,口服加外用1例,吸入加外用1例);8例患者长期亲密接触动物;7例糖尿病患者;3例高血压患者;2例系统性红斑狼疮患者;1例哮喘患者;1例肿瘤化疗后患者。对照组患者临床分析:5例短期使用糖皮质激素乳膏,5例接触动物,3例糖尿病患者。结论:1、泛发性皮肤癣菌病患者不同部位皮损致病菌种均一致;2、泛发性皮肤癣菌病致病菌种和普通体(股)癣患者致病菌种无差异性,不是特定种类的皮肤癣菌感染才导致泛发性皮肤癣菌病的发生。3、泛发性皮肤癣菌病患者和体(股)癣患者在年龄、病程、使用糖皮质激素及基础疾病等方面有差异。这些因素可能为泛发性皮肤癣菌病发生的相关因素。

刘月[9](2016)在《兔须癣毛癣菌的鉴定及快速诊断方法的建立》文中认为兔皮肤真菌病是由皮肤癣菌引起的一类传染性很强的接触性传染病。在世界范围内广泛流行。兔须癣毛癣菌病不仅严重影响养兔业经济效益,还是人畜共患传染病,引起人皮肤真菌病,严重危害养殖生产者及公众健康。因此,对须癣毛癣菌进行准确鉴定,并建立特异,敏感的,快速的诊断方法,筛选出有效的抗真菌药物,对于养殖生产及公众健康具有重要意义。采用r DNA-ITS序列分析结合真菌形态学和生理学试验对兔须癣毛癣菌进行鉴定。从疑似患兔采集皮屑样品接种沙保弱培养基,观察菌落特征及菌丝显微结构,并进行尿素酶和毛发穿孔试验。提取分离株(29株)DNA,利用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,扩增产物测序后在GenBank核酸数据库中进行同源性比对,结果显示,分离株的菌落形态为白色粉末状,背面有色素沉着,培养可见大量葡萄状小分生孢子,螺旋菌丝及棒状大分生孢子;尿素酶和毛发穿孔试验阳性;rDNA-ITS序列比对结果显示,分离株与须癣毛癣菌复合体中的万博节皮菌同源性在99.2%以上;从形态学和生理学试验符合须癣毛癣菌的特点,结合分子生物学试验将29株分离株鉴定为万博节皮菌。利用几丁质酶基因(CHS1)序列分析结合菌落特征对兔须癣毛癣菌分离株(31株)进行分型。结果显示菌落特征分为颗粒型、粉末型和绒毛型3种表型,其中多数为颗粒型和粉末型,占87.09%(27/31),基于CHS1序列同源性差异,分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5种基因类型,其中Ⅰ型和Ⅱ型是优势菌株,占54.84%(17/31),这些提示CHS1序列分析可以用于须癣毛癣菌的基因分型。采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对兔须癣毛癣菌进行定量检测。结果表明,利用此方法可以检测病原菌DNA的最低稀释度为10-10,而常规PCR检测病原菌DNA最低稀释度为10-8。并且,特异性强,与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应;对于须癣毛癣菌分离株阳性检出率为100%(10/10),临床分离须癣毛癣菌阳性检出率为86%(54/63)。证明采用荧光定量PCR方法对须癣毛癣菌进行快速诊断具有良好的可行性。对31株须癣毛癣菌对药物的敏感性进行了研究。我们采用了11种常用抗真菌药物利用纸片扩散法进行了药敏试验,结果表明:特比萘芬、克霉唑、伏立康唑对须癣毛癣菌的抑制作用最强,31株菌对这三种药物敏感率为100%,抗菌效果最好;其次为伊曲康唑、酮康唑、益康唑、两性霉素-B、制霉菌素、咪康唑,31株菌对这几种药物的敏感率分别为93.55%、90.32%、83.87%、48.39%、32.26%、12.90%;5-氟胞嘧啶、氟康唑的抑菌效果最差,31株菌对其敏感率都为0%。通过对兔场须癣毛癣菌病原菌的分离培养及rDNA-ITS序列分析,对兔须癣毛癣菌进行了鉴定;并基于几丁质酶基因对分离到的31株兔须癣毛癣菌进行了基因分型;建立了兔须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法;通过进行兔须癣毛癣菌药物敏感性试验,进一步了解了兔须癣毛癣菌对抗真菌药物的敏感性,为临床用药提供参考。

谈燕[10](2014)在《PCR快速鉴定皮肤癣菌病》文中进行了进一步梳理研究目的目前实验室常用的皮肤癣菌病的诊断方法为镜检和培养,该方法对操作人员的专业性要求较高,而且培养耗时较长,在皮肤癣菌病的快速鉴定方面,虽然国内已有相关的分子研究报导,但都难以应用于临床。本研究通过对皮肤癣菌菌株以及临床诊断为皮肤癣菌病患者的皮屑标本进行研究,将PCR方法与传统诊断方法的诊断结果进行统计学对比,探索临床皮肤癣菌病的快速简便特异的新型诊断方法。研究方法第一部分使用65株皮肤癣菌临床株以及50株非皮肤癣菌临床株和2例人DNA用于PCR体系的优化及CHS1(Chitin synthase1)引物的评估。采用1步法处理皮肤癣菌及非皮肤癣菌菌株获得菌株DNA,然后用皮肤癣菌特异性引物CHS1(panDerm1:5’G A A G A A G A T T G T C G T T T G C A T C G T C T C3’,panDerm2:5’C T C GAG G T C AAAAG C AC G C C AGAG3’)对获得的DNA产物进行PCR扩增。皮肤癣菌通用引物的敏感性测定:将获得的菌株DNA以及人DNA进行PCR扩增后跑电泳,观察是否出现特定大小的阳性条带。 PCR反应体系的敏感性测定:用超微量分光光度计测量皮肤癣菌菌液的DNA浓度,再将皮肤癣菌菌液的DNA进行10倍连续稀释,获得不同浓度的皮肤癣菌菌液,随后进行PCR扩增,记录特定大小的阳性条带出现时的最小的皮肤癣菌DNA浓度值,PCR重复3次。第二部分,将临床收集的119例皮屑标本,均匀分成三份,分别进行镜检、培养和PCR鉴定。采用Brillowska-Dabrowsk的2步提取法从临床标本中快速提取皮肤癣菌DNA,对临床标本的DNA产物进行PCR扩增时,为了防止体系中PCR抑制物造成的假阴性结果,设计了IC(Internal control内部对照),内部对照为大肠杆菌质粒,该质粒可与皮肤癣菌CHS1特异性引物反应,产生510bp的内部对照条带。我们设计并合成了特异性引物,其序列为For:5-G AAGAAGAT T G T C G T T T G C AT C GT C T C AG G G T T T GAT T C T G G C T C AG-3,Rev:5-C T C GAG G T C AAAA G C A C G C C AG A G G TAT TA C C G C G G C G G C T G G-3,该引物能与大肠杆菌DNA反应,生成510bp片段,该片段被插入大肠杆菌质粒,合成本实验所需的质粒。根据电泳结果判断是否为皮肤癣菌感染,若电泳结果出现366bp的条带,则为皮肤癣菌感染,若未出现此特异性条带且出现了510bp的内部对照条带,则能判断为非皮肤癣菌感染,若未出现此特异性条带且未出现510bp的内部对照条带,则为假阴性结果。最后将临床标本的PCR结果与传统诊断方法进行一致性比较。结果第一部分:所有皮肤癣菌菌株经PCR扩增后均出现366bp的阳性条带,非皮肤癣菌菌株及人DNA经PCR扩增后均未出现任何条带。将浓度为600ng/ul的皮肤癣菌DNA浓度经10倍连续稀释后,得到7个浓度的菌液:600ng6pg经PCR扩增后出现366bp的阳性条带,第8个600fg浓度经PCR扩增后未出现任何条带。第二部分:在119例临床标本中,PCR与传统诊断方法的一致性检验Kappa值为0.910,P<0.01,两种方法在诊断结果方面具有较高的一致性。然而PCR方法在5小时内即可完成从标本处理至结果判读的全过程,且操作简便,判断结果客观。结论皮肤癣菌通用引物CHS1具有较高的特异性,可用作检测皮肤癣菌的特异性引物,本实验PCR体系的敏感度较高,为6pg。PCR在临床标本的皮肤癣菌检测方面更加简便快速,可替代现有皮肤癣菌病的传统诊断方法。

二、Clinical Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR and PCR-RFLP(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、Clinical Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR and PCR-RFLP(论文提纲范文)

(1)青岛市528例浅部真菌病及其致病菌种分析(论文提纲范文)

摘要
abstract
引言
研究对象与方法
    1 研究对象
    2 研究方法
        2.1 真菌镜检及培养
        2.2 真菌鉴定
    3 统计分析
结果
    1 皮肤浅部真菌病病种及病原菌分布
    2 皮肤浅部真菌病各病种的主要致病菌构成情况
    3 患者性别与浅部真菌病病种的关系
    4 患者年龄与浅部真菌病病种的关系
    5 季节与浅部真菌病病种的关系
讨论
结论
参考文献
综述
    综述参考文献
攻读学位期间的研究成果
缩略词表
致谢

(2)许兰毛癣菌的表型与基因型研究及其基因组和转录组学研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1. 许兰毛癣菌的概况
        1.1 分类地位及命名
        1.2 形态学特征
        1.3 流行病学及致病性
        1.4 防治和药敏实验
    2. 皮肤癣菌的分子鉴定及基因分型研究进展
    3. 基因组和转录组在皮肤癣菌研究中的应用
    4. 研究内容和意义
第二章 许兰毛癣菌的表型与基因型研究
    1. 引言
    2. 材料与设备
        2.1 菌株
        2.2 主要材料与试剂
        2.3 仪器设备
    3. 实验方法与步骤
        3.1 培养基的制备
        3.2 真菌培养和基因组DNA提取
        3.3 PCR扩增
        3.4 PCR扩增产物测序、拼接与校正
        3.5 菌落形态
        3.6 胞外水解酶活性检测
        3.7 AFLP实验方法
        3.8 数据分析
    4. 结果与讨论
        4.1 基因序列进化分析
        4.2 许兰毛癣菌的表型特征
        4.3 AFLP分析
    5. 小结
第三章 许兰毛癣菌基因组和转录组学研究
    1. 引言
    2. 材料与设备
        2.1 主要材料与试剂
        2.2 仪器设备
        2.3 菌株
    3. 实验方法与步骤
        3.1 培养基的制备
        3.2 实验菌株的培养和传代
        3.3 基因组测序及组装
        3.4 基因组结构预测及注释
        3.5 分泌蛋白预测
        3.6 比较基因组
        3.7 转录组实验的培养条件
        3.8 转录组测序
        3.9 转录组分析流程
    4. 结果与讨论
        4.1 许兰毛癣菌基因组特征
        4.2 许兰毛癣菌分泌蛋白组
        4.3 蛋白酶编码基因
        4.4 基因组重要通路的注释
        4.5 转录组序列比对分析
        4.6 差异表达基因分析
        4.7 差异表达基因富集分析
    5. 小结
第四章 总结与展望
附录
综述 皮肤癣菌病发病机制研究进展
    1. 皮肤癣菌因素
        1.1 皮肤癣菌的分类和致病特征
        1.2 致病过程
        1.3 适应宿主环境
    2. 宿主因素
        2.1 宿主免疫反应
        2.2 危险因素
    3. 结语
参考文献
发表论文与学术交流情况
致谢

(3)絮状表皮癣菌基因组、转录组及与宿主相互作用机制的研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 絮状表皮癣菌体外酶解反应及分子分型研究
    前言
    第一节 探讨絮状表皮癣菌种内形态和酶解反应差异
    第二节 絮状表皮癣菌多基因位点种内分型研究
    第三节 絮状表皮癣菌AFLP种内分型研究
第二章 絮状表皮癣菌基因组学及比较基因组学研究
    前言
    第一节 絮状表皮癣菌基因组学数据分析研究
    第二节 絮状表皮癣菌比较基因组学分析研究
第三章 絮状表皮癣菌转录组学分析研究
    前言
    第一节 絮状表皮癣菌体外转录组分析研究
    第二节 絮状表皮癣菌与HaCaT细胞互作转录组分析研究
全文总结
参考文献
论文相关综述 互作转录组(dual RNA-seq)技术在病原真菌中的应用及展望
    参考文献
在读期间发表文章
参加学术会议
致谢

(4)伊曲康唑联合特比萘芬乳膏治疗泛发性皮肤癣菌病疗效观察(论文提纲范文)

摘要
Abstract
前言
1 材料与方法
2 结果
3 讨论
4 结论
参考文献
综述:皮肤癣菌病的研究进展
    参考文献
个人简历
致谢

(5)基于高分辨率熔解曲线的常见五种皮肤癣菌分子鉴定(论文提纲范文)

1 材料与方法
    1.1 材料和试剂
        1.1.1 实验菌株:
        1.1.2 主要仪器与试剂:
    1.2 方法
        1.2.1 临床分离株的培养与DNA提取:
        1.2.2 临床菌株DNA测序鉴定:
        1.2.3 HRM引物设计:
        1.2.4 实时荧光PCR与HRM分析:
2 结果与分析
    2.1 五种常见皮肤癣菌的HRM分析方法建立
    2.2 菌株验证
3 讨论

(6)常见皮肤癣菌感染LAMP-微流控高通量诊断芯片的研发(论文提纲范文)

摘要
Abstract
缩略词表
前言
材料与方法
结果
讨论
参考文献
全文总结
综述
    参考文献
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
致谢

(7)金属蛋白酶1在皮肤癣菌鉴定中的应用研究(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
常用缩写词中英文对照表
前言
第一章 菌株的收集、ITS引物扩增与菌种鉴定
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
第二章 MEP1特异性引物扩增与皮肤癣菌菌种鉴定
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
承担/参与的科研课题
研究成果
个人简历

(8)泛发性皮肤癣菌病病原菌鉴定与致病因素分析(论文提纲范文)

摘要
abstract
前言
第一部分 泛发性皮肤癣菌病病原菌鉴定
    1 材料与方法
    2 结果
第二部分 泛发性皮肤癣菌病致病因素分析
    1 材料与方法
    2 结果
讨论
结论
参考文献
综述:泛发性皮肤癣菌病研究进展
    参考文献
附录
个人简历
致谢

(9)兔须癣毛癣菌的鉴定及快速诊断方法的建立(论文提纲范文)

摘要
Abstract
第1章 须癣毛癣菌的研究进展
    1.1 兔须癣毛癣菌病的概述
    1.2 须癣毛癣菌分类方法的研究进展
    1.3 兔须癣毛癣菌国内外流行状况
    1.4 常规实验室检测方法
        1.4.1 形态学鉴定
        1.4.2 免疫学方法
    1.5 分子生物学检测方法
        1.5.1 全基因序列测定
        1.5.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)
        1.5.3 限制性片段长度多态性(RFLP)分析
        1.5.4 微卫星引物PCR
        1.5.5 核糖体DNA (rDNA)ITS序列分析
    1.6 兔须癣毛癣菌的快速诊断方法
    1.7 本研究的目的及意义
    1.8 技术路线
第2章 兔须癣毛癣菌的鉴定
    引言
    2.1 材料和方法
        2.1.1 材料
        2.1.1.1 试验主要试剂
        2.1.1.2 试验主要仪器
        2.1.1.3 病料采集
        2.1.2 方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 形态学观察
        2.2.2 生理学试验
        2.2.3 回归试验
        2.2.4 ITS 基因 PCR 扩增结果
        2.2.5 目的片段序列分析
    2.3 讨论
    2.4 小结
第3章 基于几丁质酶基因对兔须癣毛癣菌分型
    引言
    3.1 材料和方法
        3.1.1 试验主要仪器
        3.1.2 试验菌株来源及DNA提取
        3.1.3 引物设计及目的基因扩增
        3.1.4 PCR 产物序列测定
        3.1.5 目的片段序列分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 PCR扩增结果
        3.2.2 分离株CHS1序列比较及分型
    3.3 讨论
    3.4 小结
第4章 兔须癣毛癣菌的快速诊断方法
    引言
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 显微镜镜检结果
        4.2.2 基因组DNA
        4.2.3 PCR扩增结果
        4.2.4 标准品的构建及标准曲线的建立
        4.2.5 定量PCR特异性试验
        4.2.6 定量PCR敏感性试验
        4.2.7 定量PCR重复性试验
        4.2.8 病料和分离株定量PCR诊断结果
    4.3 讨论
    4.4 小结
第5章 兔须癣毛癣菌的体外药敏试验
    引言
    5.1 材料和方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 方法
    5.2 结果与分析
    5.3 讨论
    5.4 小结
结论
总结与展望
致谢
参考文献
作者简历

(10)PCR快速鉴定皮肤癣菌病(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
英文缩写表
前言
    参考文献
第一部分 PCR 体系敏感性及特异性测定
    实验材料
        实验菌株及人 DNA
        实验所用引物
        实验所用试剂
        实验所用器械
    实验方法
        菌种的复活
        沙保氏培养基的配置
        菌株 DNA 的提取
        PCR 反应
        不同 DNA 浓度梯度的稀释液
        通用引物特异性测定
    实验结果
        用引物的特异性结果
        PCR 体系的反应敏感性测试
    讨论
第二部分 皮肤癣菌病传统诊断方法与 PCR 方法的对比
    实验材料
        临床皮屑标本
        实验所用试剂
        实验所用引物
        实验所用器械
    实验方法
        皮屑的收集
        皮屑的分配
        皮屑的 DNA 提取
        内部对照(Internal control IC)的构建
    实验结果
        皮屑标本的传统诊断方法与 PCR 诊断方法的结果对比
        传统方法与 PCR 诊断法检出率的对比
        皮屑标本的 PCR 检测结果
        临床标本电泳图
        统计学分析
    讨论
全文小结
参考文献
综述
    参考文献
在读期间发表论文和参加科研工作情况
致谢

四、Clinical Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR and PCR-RFLP(论文参考文献)

  • [1]青岛市528例浅部真菌病及其致病菌种分析[D]. 袁飞飞. 青岛大学, 2020(01)
  • [2]许兰毛癣菌的表型与基因型研究及其基因组和转录组学研究[D]. 葛力瑜. 北京协和医学院, 2020(05)
  • [3]絮状表皮癣菌基因组、转录组及与宿主相互作用机制的研究[D]. 刘加. 北京协和医学院, 2020(05)
  • [4]伊曲康唑联合特比萘芬乳膏治疗泛发性皮肤癣菌病疗效观察[D]. 杨婷. 川北医学院, 2020(04)
  • [5]基于高分辨率熔解曲线的常见五种皮肤癣菌分子鉴定[J]. 徐娟,吴伟伟,郑文爱,赵飞,张玲,龚杰,张建中. 菌物学报, 2019(08)
  • [6]常见皮肤癣菌感染LAMP-微流控高通量诊断芯片的研发[D]. 姜伟伟. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(10)
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PCR和PCR-RFLP对常见皮肤癣菌的临床鉴定
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